糞便微生物叢移植は抗PD-1阻害薬不応の切除不能または転移性固形がんにおける抗PD-1阻害薬の効果を改善する
臨床・トランスレーショナルレポート|オンライン版
糞便微生物叢移植は抗PD-1阻害薬不応の切除不能または転移性固形がんにおける抗PD-1阻害薬の効果を改善する
https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00228-2
Published:July 25, 2024DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.06.010
ハイライト
-抗PD-1に抵抗性の進行固形がんに抗PD-1併用FMTが有効であることが示された。
-FMTはR7レシピエントにおいて抗PD-1に対する部分奏効を誘導し、免疫力を増強した。
-Lactobacillussalivariusと Bacteroides plebeiusはT細胞の活性を阻害する可能性がある。
-プレボテラ・メルダエ（Prevotellamerdae）イムノアクティスはT細胞活性を高め、腫瘍増殖を抑制する
まとめ
腸内細菌叢は免疫応答と免疫チェックポイント阻害剤の有効性に大きく影響する。我々は、抗PD-1抵抗性の進行固形がん患者13人を対象に、抗プログラム死-1（PD-1）阻害剤と抗PD-1レスポンダーからの糞便微生物叢移植（FMT）を併用する臨床試験（NCT04264975）を実施した。FMTにより13例中6例で持続的な微生物叢の変化と臨床的効果が得られ、部分奏効1例、病勢安定5例で、客観的奏効率7.7％、病勢コントロール率46.2％を達成した。臨床効果は、血液中および腫瘍中の細胞傷害性T細胞および免疫サイトカインの増加と相関している。われわれは、FMT反応者からPrevotella merdaeImmunoactisを単離し、この菌はT細胞活性を刺激し、細胞傷害性T細胞の浸潤を増強することによってマウスの腫瘍増殖を抑制した。さらに、Lactobacillus salivariusと Bacteroides plebeiusは抗腫瘍免疫を阻害する可能性があることがわかった。我々の知見は、有益な微生物叢を用いたFMTが、進行固形癌、特に消化器癌における抗PD-1阻害剤に対する抵抗性を克服できることを示唆している。
グラフィカル抄録
キーワード
はじめに
細胞傷害性Tリンパ球抗原（CTLA-4）またはプログラム死-1/プログラム死リガンド1（PD-1/PD-L1）経路を標的とする免疫チェックポイント阻害剤（ICI）は、様々ながん種におけるがん治療に変革をもたらした。しかし、ICIはすべてのがん種で普遍的に有効な結果を示しているわけではなく、胃食道がん、肝臓がん、膀胱がん、頭頸部がんなど、成功を示しているがん種での有効性はまだわずかである。
初期にICIに反応した患者のほとんどは、二次抵抗性により最終的に病勢進行に直面する。
最近の研究では、予測バイオマーカーの解明、免疫腫瘍学における耐性メカニズムの解明、ICIと他の治療法の併用による治療成績の改善などが進んでいるが、一次耐性や二次耐性の克服は依然として大きな困難を伴う。
,
,
腸内細菌叢は免疫応答を形成し、ICIの有効性に影響を及ぼす重要な因子として浮上している。患者の便検体中の特定の常在菌の存在は、ICIに対する臨床的反応と相関することが研究で示されている5。
,
,
前臨床実験では、ICIに反応した患者の糞便を用いた特異的な腸内細菌叢または糞便微生物叢移植（FMT）が、腫瘍の退縮を誘導し、T細胞応答を増強し、ICIの抗腫瘍効果を改善することが証明されている。
,
,
最近のパイロット臨床試験では、抗PD-1阻害薬とFMTの併用により、抗PD-1治療抵抗性の悪性黒色腫患者のサブセットにおいて、腸内細菌叢を変化させ腫瘍微小環境を再プログラムすることで、抗PD-1治療抵抗性を克服できる可能性が示された。
,
本研究では、抗PD-(L)1阻害薬に抵抗性の進行固形がん患者（NCT04264975）において、FMTが抗PD-(L)1阻害薬に対する抵抗性を克服する可能性を評価し、FMTおよびICI治療の有効性に因果的な役割を果たす特定の常在細菌を同定することを目的とした。
試験結果
試験デザインと参加者の特徴
このFMT試験は、FMTと抗PD-(L)1阻害薬の併用に関する前向き単群単施設試験であった（図1A）。この試験には、ドナーとレシピエントという2つの異なる参加者カテゴリーがあった（図1AおよびS1）。ドナーは、切除不能または転移性の固形がんに対する抗PD-(L)1単剤療法後、RECIST(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)v1.1に従って少なくとも6カ月間、持続的完全奏効（CR）または部分奏効（PR）を示したことを特徴とする。一方、レシピエントは、切除不能または転移性固形がんに対する抗PD-(L)1ベースの治療、単剤療法、または併用療法中に病勢進行が確認された個体とした。常在腸内細菌叢を除去するため、レシピエントにはFMT前（初回FMT前のみ）にアモキシシリン・クラブラン酸塩の抗生物質を5日間経口投与した。FMTは大腸内視鏡検査により実施され、その後、許容できない毒性または病勢進行のいずれかが起こるまで、抗PD-(L)1阻害剤（標準用量およびスケジュールで投与）を継続または再導入した。同一または異なるドナーからのその後のFMTセッションは、治験責任医師の裁量で、初回奏効評価の2～4週間前、または臨床的奏効が明らかでない場合の時間間隔を空けて許可された。血液、便、腫瘍生検は、FMTの前後に連続して採取された。奏効判定は、RECIST v1.1に従い、コンピュータ断層撮影（CT）スキャンを用いて6～8週間ごとに行われた。
図1ニボルマブ抵抗性の進行固形がん患者におけるFMTとニボルマブの併用による臨床効果
2019年1月から2020年8月にかけて、転移性胃がん（GC）（n＝4）、食道扁平上皮がん（ESCC）（n＝5）、肝細胞がん（HCC）（n＝4）のFMTレシピエント13人を募集した（表1、S1）。年齢中央値は60歳（範囲、38-76）で、全例が重篤な前治療を受けていた（全身治療の中央値10、範囲、4-34）。全例がニボルマブ単剤療法で病勢進行が確認され、6例（46.2％）が一次耐性、7例（53.8％）が二次耐性を示した。登録は病勢進行が確認された直後に行われ、ニボルマブを継続しながらFMTが施行された。レシピエントの腫瘍はすべてマイクロサテライト安定（MSS）であり、7人（53.8％）がPD-L1陽性（combined positive score［CPS］≧1）、4人（30.8％）がPD-L1 CPS≧5であった。われわれは6人のFMTドナーを募集した。HCCが4人、GCとESCCが各1人であった。これらのドナーはニボルマブまたはペムブロリズマブで少なくとも1年間CR（n=4）またはPR（n=2）を達成・維持した。ドナーの腫瘍は、PD-L1低発現（CPS 7）の1人を除き、すべてMSSでPD-L1陰性であった。ドナーの腫瘍変異負荷（TMB）中央値は10.9変異/メガベース（範囲、9.4-37.5）であった。
表1FMTにおけるレシピエントのプロフィール（n=13）
年齢 性別 ECOG performance status 癌の種類 疾患の状態 FMT前に投与されたICIの治療ライン FMT前のICIのサイクル数 FMT前およびFMT試験中のICIの種類 FMT前のICIに対する最良の反応 PD-L1の状態 TMB（突然変異/Mb） マイクロサテライトの状態
レシピエント#1 76歳 男性 1 ESCC 転移性 4 5 ニボルマブ PD TPS 0% CPS 1 12.5 MSS
レシピエント#2 女性 50 人 1 ESCC 転移性 3 4 ニボルマブ PD TPS 0% CPS 0 15.6 MSS
ニボルマブ PD TPS 0% CPS 0 20.3 MSS
55 女性 1 ESCC 転移性 4 13 ニボルマブ PR TPS 0% CPS 0 12.5 MSS
ニボルマブ SD TPS 0% CPS 0 12.5 MSS
ニボルマブ PD TPS 1% CPS 3 12.5 MSS
ニボルマブ PR TPS 0% CPS 0 15.6 MSS
ニボルマブ PD TPS 1% CPS 1 12.5 MSS
ニボルマブ PR TPS 30% CPS 60 17.2 MSS
ニボルマブ SD TPS 0% CPS 0 10.9 MSS
ニボルマブ PD TPS 30% CPS 30 15.6 MSS
ニボルマブ PR TPS 15% CPS 15 28.1 MSS
ニボルマブ PR TPS 0% CPS 5 20.3 MSS
ECOG：Eastern Cooperative Oncology Group、ICI：免疫チェックポイント阻害薬、FMT：糞便微生物叢移植、PD-L1：programmed death-ligand 1、TMB：腫瘍変異負荷量、Mb：メガベース、ESCC：食道扁平上皮がん； PD、進行性病変、TPS、腫瘍割合スコア、CPS、複合陽性スコア、MSS、マイクロサテライト安定、HCC、肝細胞がん、PR、部分奏効、SD、病勢安定、GC、胃腺がん。
表2FMT試験におけるドナーのプロフィール（n= 6）
年齢 性別 癌種 抗PD-1反応性 DoR（月） 遺伝子変異 TMB（/Mb） マイクロサテライトの状態 PD-L1の状態 EBVの状態
ドナー#1 男性78人 HCC ペムブロリズマブ CR 58.7+ ARID1A S634∗変異、 NFE2L2 G81C変異、 MCL1増幅、 MDM4増幅、 AKT3増幅 9.4 MSS TPS 0% CPS 0 N/A
ドナー#2 66歳 男性 GC ニボルマブ CR 72.7+ ERBB2増幅、 TP53 Q192∗変異 37.5 MSS TPS 7% CPS 7 陰性
ドナー#3 男性 63 人 HCC ニボルマブ PR 7.9 発がん性変異なし 15.6 MSS TPS 0% CPS 0 N/A
ニボルマブ PR 15.4 FBXW7 X327_splice 変異、 TP53P223Afs∗3変異、 MYC 増幅、 CDKN2A 欠失、 CDKN2B 欠失 10.9 MSS TPS 0% CPS 0 N/A
ドナー#5 62歳 男性 HCC ニボルマブ CR 31.5+ N/A (QC failed due to low tumor cellularity) N/A MSS TPS 0% CPS 0 N/A
ニボルマブ CR 25.7+ TP53 P278R 変異 10.9 MSS TPS 0% CPS 0 N/A
PD-1、programmed death-1、DoR、奏効期間、TMB、腫瘍変異負荷量、Mb、メガベース、PD-L1、programmed death-ligand 1、EBV、Epstein-Barrウイルス、HCC、肝細胞がん、CR、完全奏効、MSS、マイクロサテライト安定、TPS、腫瘍割合スコア、CPS、複合陽性スコア、N/A、入手不可能、GC、胃がん、PR、部分奏効、ESCC、食道扁平上皮がん、QC、品質管理。
試験治療の実施と治療関連AE
全例にニボルマブとFMTの併用療法が行われ、ニボルマブ前治療不成功後もニボルマブ治療が継続された。FMT後のニボルマブ投与サイクルの中央値は5サイクルであった（範囲、1～27）。13人のレシピエントのうち、7人は最初のFMT後に同じドナー（n=4）および／または異なるドナー（n=4）からFMTを受けた。このうち、1人のレシピエントは、最初に同じドナーから、次に異なるドナーからFMTを受けた。
安全性プロファイルに関しては、治療に関連した有害事象（AE）は最小限であった（表S2）。13人の患者のうち、7人（53.8％）が少なくとも1つの治療関連AEを経験したが、グレード3の免疫関連胃炎を経験した1人の患者を除き、すべてグレード1または2であった。最も一般的な治療関連AEは皮膚そう痒症（n=5、38.5%）であり、次いで皮疹（n=2、15.4%）、甲状腺機能低下症（n=2、15.4%）であった。内分泌系AEはホルモン補充療法で管理され、免疫関連胃炎（CTCAE；Common Terminology Criteria for Adverse Events、グレード3）は全身性副腎皮質ステロイドで管理された。
FMTの効率とFMT後の臨床効果
FMTの生着効率を評価するため、レシピエントとドナーの両方から得られた便検体について16S rRNA配列決定を行った。Bray-Curtis distance（BCD）を用いた解析により、ほとんどのレシピエントの微生物組成が、FMT後にベースライン組成から有意に変化したことが明らかになった（図1BおよびS2）。これらの変化を定量化するために、レシピエントサンプルとドナーサンプルのベースライン間のBCDに基づいて移植距離（ED）を計算した（図S3）。ベースラインからのEDの減少は、微生物組成の変化を示す。私たちのFMT試験では、すべてのレシピエントがEDの減少を示したので、このことは、私たちのFMT試験がすべてのレシピエントの微生物組成の変化を誘導したことを示している（図1C）。驚くべきことに、レシピエント#7（R7）の微生物組成は、1回目および2回目のFMT処置の両方から1日後という早い段階で、それぞれのドナーのものと密接に類似しており、この類似性は2回目のFMT処置から282日間持続した（図1B）。
13人のレシピエントのうち、1人はPRを達成し、5人はニボルマブ治療の継続とFMT後に病勢安定（SD）を示した。これらの結果は、客観的奏効率7.7％（1/13人）、病勢コントロール率46.2％（6/13人）に相当し、FMTと継続的免疫療法の複合的治療効果を強調するものである（図1D）。注目すべきは、当初ニボルマブに一次耐性を示した転移性肝細胞癌であったR7が、免疫療法を継続したFMT後にPRを達成し、腫瘍サイズの有意な縮小を示したことである（図1Dおよび1E）。われわれの解析は、免疫療法を併用したFMTがレシピエントの腸内細菌叢を効果的に変化させ、特にR7の顕著な症例に例証されるように、有意な臨床効果をもたらすことを示している。
FMT後の全身および腫瘍微小環境における免疫変化と臨床転帰
われわれはR7に注目し、いくつかの因子における経時的変化を観察した。当初、R7はドナー#1（D1）からの1回目のFMT後6週間で標的病変が22.4％増加し、進行性病変（PD）を示した（図2Aおよび2B）。ドナー#5からの2回目のFMT（D5）の後、腫瘍の進行は遅くなり、最初のPD評価と比較して標的病変の増加は13%にとどまった。2回目のFMTから8週間後、腫瘍の大きさが30.5％有意に縮小した（図2Aおよび2B、上）。最終的にR7はPRを達成し、最初のFMT前のベースラインから最大47.7％の腫瘍サイズ縮小を示した（図2Aおよび2B）。血清α-フェトプロテイン（AFP）およびビタミンK欠乏またはアンタゴニスト-II（PIVKA-II）によって誘導されるタンパク質を含む腫瘍マーカーも、2回目のFMTから8週間後に有意に減少した（図2B、下）。
図2レシピエント#7における縦断的腫瘍縮小と免疫関連変化の解析
CyTOF（Cytometry by time of flight）を用いて、ニボルマブと併用したFMTの反応に伴う全身の免疫変化を評価した。R7では、ベースラインからCD8+T細胞およびCD8+CCR7-CD27-終末エフェクターT（Tte）細胞が徐々に増加し、CD4+CD25+CD127-CCR4+制御性T（Treg）細胞が減少した（図2Cおよび2D）。2回目のFMT後23週で、Tte細胞は255％増加し、Treg細胞は81％減少した（図2C）。これらの免疫変化はR7の臨床反応と相関し、2回目のFMT後により顕著であった（図2D）。このような免疫活性化は、他の患者では見られないか、緩やかであった（図S4）。Simoa HD-1 AnalyzerとSimoa SP-Xを用いると、インターフェロン（IFN）-γ、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン（IL）-2、IL-7、IL-15、IL-6のレベルが、2回目のFMT後に特にR7で上昇したが、1回目のFMT後には上昇せず、臨床反応と相関していた（図2E）。一方、SDを達成したR6、R9、およびR14では、FMT後にIL-6を含むこれらのサイトカインの一部のレベルが上昇傾向を示した（図S5）。このことは、これらの患者ではFMTが腫瘍サイズの有意な縮小にはつながらなかったが、それでもこれらのサイトカインのレベルがある程度上昇したことを示唆している。抗PD-1療法に対する反応に重要な役割を果たす腫瘍浸潤免疫細胞を、multiplex免疫組織化学（IHC）を用いて評価したところ、R7で顕著な変化が観察された。2回目のFMTから4週間後、R7は腫瘍浸潤性細胞傷害性T細胞（14から361細胞/mm2）と主要組織適合性複合体（MHC）-II+ M1マクロファージ（25から174細胞/mm2）の有意な増加を示したが、CD4+FOXP3+CD8-CD20-Treg細胞の数は極めて少ないままであった（5から4細胞/mm2）。対照的に、最初のFMTの後には、同等の免疫活性化は認められなかった（図2Fと2G）。このことは、2回目のFMT後に特筆すべき免疫活性化が見られたことを強調している。R7の免疫反応の亢進は、すべての患者で再現されたわけではない。R8（最良奏効、PD）およびR14（最良奏効、SD）では、細胞傷害性T細胞の増加も観察されたが、M1マクロファージの増加はないか、あるいはわずかであった（図S6）。全体として、R7は2回目のFMT後に顕著な腫瘍縮小と免疫応答の増強を示し、全身性免疫細胞と腫瘍浸潤免疫細胞に有意な変化が認められた。
2回目のFMTと免疫療法の継続後、R7は顕著な腫瘍縮小と免疫応答の亢進を示した。CTスキャンではびまん性胃壁肥厚が認められ、食道胃十二指腸内視鏡検査（EGD）では多発性胃潰瘍が認められ、急性リンパ性胃炎であることが確認され、治療後8週目にPRが得られた。しかし、2回目のFMT後11週目に、患者は進行性の上腹部痛と吐き気を訴え、EGDと腹部CTスキャンにより免疫関連胃炎と診断された（図S7A、S7B）。CTスキャンではびまん性胃壁肥厚が、EGDでは多発性胃潰瘍が認められ、急性リンパ性胃炎と確定された（図S7B）。このことから、腸における過剰な免疫反応が示唆された。患者の症状を管理するため、2回目のFMTから約12週間後に全身性コルチコステロイド治療が開始され、症状が変動するため長期にわたって継続された。ステロイドの長期使用による潜在的な悪影響にもかかわらず、R7は2回目のFMT後、PFS（無増悪生存期間）が8.7カ月となり、病勢が進行した。同じD5糞便材料を用いた次のFMTが計画された。残念なことに、患者は手術を必要とする大腿骨骨折を負った。回復後、3回目のFMTではSDが得られたが、4回目のFMTでは腫瘍の成長を止めることができなかった（図S7AおよびS7C）。3回目のFMT前後の腫瘍生検のマルチプレックスIHC分析では、2回目のFMT後ほど顕著ではなかったが、細胞傷害性T細胞、MHC-II+ M1マクロファージ、ヘルパーT細胞の軽度の増加が認められた（図S7D）。したがって、潜在的な原因菌株を同定することを目的としたその後の解析では、3回目と4回目のFMTを除外して、2回目のFMT中に生じた変化を調べることに集中するつもりであった。
FMT後の臨床転帰に関連する菌株の発見
抗PD-1阻害剤を併用したFMTの臨床的有益性の原因となる特定の微生物叢を同定するために、16s rRNAシーケンスを用いてR7における微生物の変化を解析した。解析の結果、D1からの最初のFMT後、バクテロイデスレベルは2.87％から6.4％に増加し、プレボテラレベルは19.75％から0％に減少した（図3A）。逆に、D5からの2回目のFMT後、バクテロイデス菌量は6.4%から0.92%に減少し、プレボテラ菌量は0%から38.48%に増加した（図3A）。この変化により、Prevotellaと Bacteroidesの間の相互傾向が浮き彫りになった（図3B）。抗PD-1療法によるFMTの良好な有効性に寄与している細菌を特定するため、D1よりもD5で有意に多い細菌、および1回目のFMT後と比較して2回目のFMT後のR7で有意に出現した細菌を同定した。その結果、47の一般細菌が同定された（図3C）。R7のベースライン便サンプルに存在した細菌を除くと、34のユニークな細菌に絞られた。Prevotella merdae（タイプ株；sp. Marseille-P4119）
およびPrevotella stercoreaがLDA（線形判別分析）スコアに基づいて最上位にランクされた（図3C；表S3）。これらの種は、2回目のFMT後のD5およびR7では、1回目のFMT後のD1およびR7と比較して、それぞれ有意に豊富であった（図3DおよびS8A）。第2回FMT後の便検体でP. merdaeが顕著であったこと，LDAスコアが高かったことから，本菌種を優先的に調査し，P. merdaesp. Marseille-P4119と同定した。ショットガンメタゲノムシーケンスによるクレード特異的マーカー遺伝子解析を用いた。
図3レシピエント#7におけるFMT後の臨床転帰に影響を及ぼす主要細菌の発見
P. merdaeの新菌株発見の可能性を探るため、R7の便サンプルからP. merdaeを分離し、全ゲノムシークエンシングを行った。比較ゲノム解析の結果、分離されたP. merdaeは P. merdaeに属するが（表S4）、P. merdaesp. Marseille-P4119との平均ヌクレオチド同一性は97.41％であり、区別できる可能性が示唆された。系統解析により、保存マーカーに1,980以上の一塩基多型（SNP）が同定され、P. merdaesp. Marseille-P4119の参照ゲノムとは大きく異なっていた（図3E）。これらのマーカー遺伝子におけるゲノムの違いは、P. merdaeImmunoactisと名付けた新菌株の発見を示唆している。この菌株が、2回目のFMT後のR7における良好な臨床的・免疫的反応に寄与したと考えられる。
同様の論理的枠組みに従い、臨床反応に悪影響を及ぼす可能性のある細菌を同定した。D5よりもD1で、2回目のFMTと比較して1回目のFMT後のR7の便でより流行している細菌に注目した。この解析により16の一般細菌が同定された（図3F；表S5）。これらの細菌のうち、Bacteroides plebeius（B.plebeius）が最も高いLDAスコアを示し、D1およびR7ではそれぞれ2回目のFMT後よりも1回目のFMT後の方がより豊富であった（図3FおよびS8B）。B. plebeiusは、免疫抑制作用により臨床的に好ましくない反応を引き起こす可能性が示唆された。
同じD5からの糞便材料で2回目のFMTを受けたにもかかわらず、R6は無増悪生存期間が2.1ヵ月と短期間のSDしか経験しなかった。R6とR7の間でさらに微生物を比較したところ、免疫増強株と疑われるP. merdaeがD5からのFMT後に両者で定着していた（図S8C）。免疫抑制作用を示す可能性のあるB. plebeiusは、R6では全く検出されなかった（図S8C）。このことから、P. merdaeが存在するにもかかわらず、R6で期待された治療効果が得られなかった理由を調査することになった。我々はR6とR7の間に有意な細菌の違いを確認した。R6の便とR7の同じD5からの2回目のFMTの便を比較すると、R7の便と比較して、R6の便サンプルにはラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）がより多く存在していた（図3G；表S6）。興味深いことに、L. salivariusはD5と比較してD1において、また2回目のFMTと比較して1回目のFMT後のR7の便サンプルにおいてより豊富であった（図3GおよびS8D）。これらの所見から、L. salivariusは B. plebeiusと同様に免疫抑制作用を有する可能性があるため、好ましくない臨床反応に関連している可能性が示唆された。
さらなる検討として、3つの細菌の比率（P. merdae/(B. plebeius+L. salivarius)）が臨床的意義と関連するかどうかを調べた。まず、ニボルマブ単剤療法を受けた切除不能または転移性固形がん患者の独立したコホートにおいて、この比率が生存確率に影響を及ぼすかどうかを調べた（表S7；STAR Methods参照）。このコホートはマイクロバイオームバイオマーカー研究のために特別に構築されたもので、合計72人の患者が含まれていた。対象となった患者は全員、ベースラインの糞便サンプルが入手可能で、治療前4週間以内に抗生物質を投与されていなかった。興味深いことに、われわれの観察では、比率が高いほど生存期間が延長することが確認された（図S9A-S9C）。さらに、2回目のFMT後のR7では、微生物比率が増加する傾向が観察され、これはエフェクターCD8+T細胞およびトレグ集団の比率と正の相関があった（図3HおよびS9D）。実際、これらの微生物学的および免疫学的傾向はいずれも2回目のFMT後に強まった。これらの所見は、FMTと抗PD-1療法の有効性に対する腸内細菌叢の複雑な影響を強調している。これらの細菌の具体的な役割と臨床転帰への影響を調べるためには、さらなる研究が必要である。
P.merdaeイムノアクティスが免疫応答と細胞毒性活性の増強に及ぼす影響
我々の包括的なメタゲノム解析から、P. merdae Immunoactisは抗PD-1阻害剤に対する耐性を克服する上で極めて重要である可能性が示唆され、一方、B. plebeiusと L. salivariusは相反する効果を持つ可能性がある。これらの細菌の免疫関連作用を調べるため、ヒトT細胞をそれぞれの細菌の調整上清で処理した。以下の文脈で "上清 "と呼ぶ場合は、条件付き細菌上清を意味する。P. merdaeImmunoactisの上清はCD4+およびCD8+ T細胞の増殖を有意に促進したが（図4Aおよび4B）、B. plebeiusおよびL. salivariusの上清はT細胞の増殖を阻害した（図S10AおよびS10B）。さらに、P. merdaeImmunoactisの上清で処理したCD8+ T細胞は、コントロールと比較してIFN-γ分泌の増加を示したが、B. plebeiusまたはL. salivariusの上清はIFN-γ分泌の減少をもたらした（図4C）。この2つの非有効株がP. merdaeImmunoactisの有効性を妨げているかどうかを調べるため、3菌種混合株を用いた並行実験を行った。この混合菌の割合は、R6の2回目のFMT後の糞便サンプルと、3つの菌株が共存するD5の糞便サンプルから得られたものである。これらの菌株は平均してP. merdaeの約10分の1のレベルで存在していたため、3菌混合物はP. merdaeImmunoactis：B.plebeius：L. salivarius＝10：1：1の割合で構成された（図S10C）。このことは、非有効菌株がP.merdae Immunoactisによって誘発されるT細胞増殖を抑制したことを示している。
図4P. merdaeImmunoactisの投与は免疫細胞の活性を高めることにより腫瘍の増殖を抑制する。
IFN-γの分泌には3つの株で有意な差が認められたことから（図4C）、IFN-γ経路の発現の変化を調べた。OT-1マウスと呼ばれるC57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crl由来のOT-1細胞をOva-ペプチドで活性化し、各系統の上清で処理した。その結果、「Ova act +P. merdaeImmunoactis」群で主要な免疫サイトカインが有意に増加した。IFN-γ経路関連遺伝子の発現を比較したところ、明らかな違いが見られた。Irf-1とStat-2を除き、P. merdae処理で増加し、B. plebeius処理で減少した（図S10E）。このことは、2つの株によるIFN-γ経路の活性化が異なり、免疫応答の結果が異なることを示している。
P.merdaeイムノアクティス上清処理後、グランザイム発現量が有意に増加したことから、細胞毒性が増強された可能性が示唆された（図S11A）。このことから、OT-1細胞細胞傷害性アッセイを用いて、CD8+T細胞の細胞傷害活性に対するP. merdaeImmunoactisの影響を調べた（図S11B）。P. merdaeImmunoactisの上清によって活性化されたT細胞は、事前に播種したMC38細胞に著しいアポトーシスと細胞死を誘導し（図4DおよびS11C）、がんに対するCD8+T細胞の細胞傷害性を増強する可能性を示した。その後のin vivoでの検討では、P. merdaeImmunoactis治療と抗PD-1阻害剤の併用は、どちらか一方の治療のみの場合と比較して、腫瘍体積をより有意に減少させた（図4E）。逆に、2つの非有効株はin vivoでの腫瘍増殖を有意に増加させ、P. merdaeImmunoactisの特異的な抗がん作用をさらに支持した（図S12A）。また、2つの非有効株がP.merdae Immunoactisと抗PD-1によって誘導される相乗効果を阻害するかどうかも検証した。P. merdaeImmunoactisは有意な相乗効果を示したが、3菌混合株は腫瘍増殖を促進した（図S12B）。さらに、P.merdae Immunoactisと抗PD-1の併用により、非免疫原性4T1モデルにおいても腫瘍増殖が有意に抑制されることが観察された（図S12C）。まとめると、P. merdaeImmunoactisは免疫を増強することによって抗PD-1療法に対する反応性を高めるが、非有効株の存在はこれらの相乗効果を減弱させる可能性がある。
P. merdaeImmunoactis投与による免疫応答の増強の可能性を評価するために、腫瘍組織とリンパ節における免疫遺伝子発現と免疫細胞集団の変化を解析した。P. merdaeImmunoactisと抗PD-1阻害剤の両方を投与した腫瘍では、抗PD-1阻害剤単独で投与した腫瘍と比較して、Ifn-γと Cxcl10の発現が増加し、Ccl22の発現は減少した（図4F）。P. merdaeImmunoactisと抗PD-1阻害剤の併用投与では、腫瘍組織内の腫瘍浸潤T細胞が有意に増加したが、CD45+ T細胞中のTreg細胞の割合は変化しなかった（図4G）。注目すべきことに、抗PD-1阻害剤とP. merdaeイムノアクチスの併用療法は、抗PD-1単独療法と比較して、腫瘍微小環境内のCD8+T細胞、CD8+CD44+CD62L-（CD8+Effector）T細胞、およびCD8+PD-1+T細胞の集団を有意に増加させた（図4H-4J）。さらに、P. merdaeImmunoactis投与により、活性化ナチュラルキラー（NK）（NKAct）と疲弊NK（NKEx）の比率が増加することが観察された（図4K）。しかし、これらの細胞集団はリンパ節では変化しなかった（図S12D）。これらの所見を総合すると、P. merdaeImmunoactisは、特に抗PD-1阻害剤と組み合わせた場合、免疫細胞の増殖を刺激して細胞傷害活性を増強し、腫瘍微小環境内でより効果的な抗腫瘍免疫応答を促進する可能性を示唆している。
考察
我々の知見は、有効な微生物叢を組み込んだFMTが、進行固形がんにおける抗PD-1阻害薬に対する耐性を克服する可能性があることを示している。本研究は特に、免疫学的に治療が困難であることが知られているGC、ESCC、HCCを含む消化器癌の治療に重点を置いている。本研究は、抗PD-1治療抵抗性のメラノーマ患者における抗PD-1阻害剤とFMTの併用療法の有効性を示した過去のパイロット試験を発展させ、メラノーマ以外の固形がんにおける抗PD-1阻害剤とFMTの併用療法の有効性の概念実証を提供するものである。
,
13人のレシピエントのうち、肝細胞癌1人がPR、5人がSDを達成し、奏効率は7.7％、病勢コントロール率は46.2％であった。この有効性がFMTによるものか、NSCLC（非小細胞肺癌）やメラノーマのような特定の癌で知られている進行期以降のICIの継続によるものかが懸念される。
ICIは、偽増悪や奏効遅延などの非典型的な腫瘍反応を誘発する可能性があり、治療継続の有益性に寄与する。しかし、本研究の全患者は、抗PD-1療法で病勢進行が記録されており、少なくとも4週間間隔で連続したCT検査によって確認され、PDが進行していることが示された。FMT前の腫瘍生検では、偽増悪に典型的な大量の免疫浸潤はみられず、抗PD-1単独療法における偽増悪は否定された。ニボルマブによるFMT後にSDを示した5人の患者のうち、1人（R6）はHCCであり、4人（R2、R5、R9、R14）はESCCであった。これらのがん種では、SDがどの程度一般的に発生し、進行後もICIを継続した場合にどの程度持続するかについての文献はまばらである。小規模のレトロスペクティブ研究で、進行期を超えて治療を受けた進行HCC患者（n=34）における奏効率は5.8％、SD率は38％、無増悪生存期間は3.7ヵ月であったと報告されている。
しかし、この研究では抗PD-(L)1阻害薬だけでなく、抗PD-L1＋抗VEGF（血管内皮増殖因子）阻害薬も含まれており、われわれの研究のようにその後のCT検査で初期の病勢進行が確認されたわけではない。食道癌では、進行後もICIを継続することの有益性を示唆する文献はない。前治療歴の多いESCC患者4例（すべて4次または5次治療）の無増悪生存期間は、それぞれ2.8ヵ月、2.8ヵ月、2.7ヵ月、4.6ヵ月であった。FMT前の連続CT検査で確認されたニボルマブ単独療法での腫瘍増殖は、FMT＋ニボルマブ併用療法後に減速し、併用療法の実際の効果が示唆された。また、3次治療としてFMT＋ニボルマブ療法を受けた肝細胞癌患者（R6）も、FMT＋ニボルマブ療法後に3.1カ月の無増悪生存期間と腫瘍縮小を示した。これらの所見から、本試験でFMT後に観察された臨床的有用性は、抗PD-1阻害剤の継続のみによるものではなく、FMTと抗PD-1阻害剤の併用による有益な効果であることが示唆された。
FMTとがん免疫療法に関する先行研究では、マイクロバイオームの変化が治療成績に及ぼす一般的な影響について洞察が得られており、Routy et al、
のように、メラノーマにおいて抗腫瘍免疫を促進する個々の細菌株を単離したものもある。
,
我々の研究は、この分野をHCCのような非黒色腫がんにも拡大するものである。しかしながら、われわれの研究では、HCCでのみ反応が観察された。3つのがん種を含み、HCCの反応者は1例のみというサンプル数の少なさから、この反応がHCCに特異的であるかどうかを判断することは困難である。さらに、FMT前にどのドナーがFMTの有効性の原因となるマイクロバイオームを持っているか不明であったため、6人のドナーを対象とした。さらに、可能な限りレシピエントとドナーのがん種の一致を試みた。その結果、GCおよびESCCの患者は、HCC患者であり、FMT試験において腫瘍反応を誘発した唯一のドナーであるD5からの便サンプルを用いたFMTを受けなかった。これらのがん種におけるFMTとICIの併用の有効性をさらに明らかにするためには、さらなる臨床研究が必要であるが、それにもかかわらず、われわれの研究は、FMTを非黒色腫がんに適用できる可能性を示している。このことは、より広範な治療応用に向けた重要な一歩であり、治療戦略を最適化するためのさらなる調査の必要性を強調している。
さらに、P. merdaeImmunoactis、L. salivarius、B. plebeiusのような特定の細菌株を同定し、抗PD-1療法の文脈におけるそれぞれの免疫学的役割を検討した。その結果、FMTに優れた効果を示した患者（R7）からPrevotella merdaeImmunoactis株を発見・分離し、FMTの治療効果の原因菌となる可能性を示唆した。さらに、非有効株としてL. salivariusと B. plebeiusの2株を同定し、T細胞の活性化を阻害し、FMTや抗PD-1阻害薬の効果を損なう可能性があることを明らかにした。また、これら3つの細菌の比率（P. merdae/(B. plebeius+L. salivarius)）が、生存の可能性など臨床的な意味を持つことも確認した。この微妙な理解により、治療結果を決定する腸内細菌叢内の有益菌と有害菌の複雑な相互作用が浮き彫りになった。これらの特定の菌株を分離し、その特性を明らかにすることによって、これらの細菌が免疫療法の有効性に影響を及ぼす直接的なメカニズムを明らかにし、腫瘍微小環境の免疫原性を高めるための潜在的な標的を提供した。このアプローチにより、一般的な関連性から具体的な因果関係へと移行することができ、微生物叢が介在するがん治療の調節について、より詳細な見解が得られた。このことは、がん患者の治療成績を最適化するためには、腸内細菌叢を標的として操作する必要があることを強調している。
R7の場合、抗PD-1療法による2回目のFMT後に腫瘍サイズの顕著な縮小と免疫反応の亢進が観察されたものの、後期には大きな課題があった。2回目のFMTから約11週間後、患者は進行性の心窩部痛と吐き気を経験し、ICI治療患者ではまれだが知られている免疫関連AE（irAE）である免疫関連胃炎と診断された。
irAEの正確な病態生理、特に臓器特異的な病態生理はまだ不明であるが、過剰な免疫反応以上のものが関与しているようである。これらの症状を管理するために、2回目のFMT後12週目頃から長期の副腎皮質ステロイド全身投与が開始され、治療の長期的影響に未知の変数が導入された。同じD5の糞便を用いた3回目のFMTを計画していたところ、患者は転倒により大腿骨骨折を起こし、手術が必要となった。術後、同じドナーの糞便材料を用いたその後のFMTでは、期待された結果は得られなかった。3回目のFMTで病状は安定したが、4回目では腫瘍の成長を止めることはできなかった。これらのFMTの効力の低下は、ステロイドの長期使用に起因すると考えられる。ステロイドは免疫抑制作用があることで知られている、
,
,
は腸内細菌叢を大きく変化させる可能性がある、
,
,
は、全身の免疫反応に重要な腸管免疫軸に影響を与えている。
,
さらに、複数の菌株の相乗的相互作用が結果に影響を及ぼす可能性があり、他の未同定菌株が3回目と4回目のFMTの有効性に影響を及ぼした可能性が示唆された。
結論として、今回の知見は、メラノーマ以外にも、進行固形がんにおけるICIに対する反応性を高めるFMTの可能性を示唆している。患者間の反応を比較することにより、我々はP. merdaeImmunoactisを有効な株として同定し、効果のないB. plebeiusや L. salivariusとは対照的であった。IFN-γシグナル伝達経路の解析により、これらの菌株による免疫調節のメカニズムが明らかになった。本研究は、免疫療法の有効性を高めるためにFMTが広く応用可能であることを示すだけでなく、がん治療における標的微生物介入の新たな道を開くものである。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
InVivoMAbラット IgG2a アイソタイプコントロール、抗トリニトロフェノール（クローン2A3） BioXCell Cat# BE0089; RRID: AB_1107769
InVivoMAb抗マウス PD-1 (CD279) (クローン RMP1-14) BioXCell Cat# BE0146; RRID: AB_10949053
OPAL ポリマー HRP Ms+Rb アコヤバイオサイエンス Cat# ARH1001EA; RRID: AB_2890927
抗ヒト CD3e 抗体 BioLegend Cat# 317325; RRID: AB_11147370
抗マウス CD3e 抗体 BioLegend Cat# 100340; RRID: AB_11149115
抗マウス CD28 抗体 BioLegend Cat# 102116; RRID: AB_11147170
ヒト TruStain FcX (Fc 受容体ブロッキング) BioLegend Cat# 422302; RRID: AB_2818986
抗マウス CD16/CD32（Fcレセプターブロッキング） BioLegend Cat# 101330; RRID: AB_2561482
APC/シアニン7 抗マウス CD45 抗体 BioLegend Cat# 103116; RRID: AB_312981
PerCP/シアニン5.5 抗マウス CD3 抗体 BioLegend Cat# 100218; RRID: AB_1595492
PE/シアニン7 抗マウス CD4 抗体 BioLegend Cat# 100422; RRID: AB_312707
APC 抗マウス CD62L 抗体 BioLegend Cat# 104412; RRID: AB_313099
PE 抗マウス CD279 (PD-1) 抗体 BioLegend Cat# 109104; RRID: AB_313421
APC/シアニン7 抗マウス/ヒト CD45R/B220 BioLegend Cat# 103224; RRID: AB_313007
APC 抗マウス CD25 抗体 BioLegend Cat# 101910; RRID: AB_2280288
PE 抗マウス IFN-γ 抗体 BioLegend Cat# 163503; RRID: AB_2890730
BV421 抗マウス F4/80 抗体 BD Bioscience Cat# 565411; RRID: AB_2734779
APC 抗マウス TNF-α 抗体 BioLegend Cat# 506308; RRID: AB_315429
BV510 抗マウス CD8a 抗体 BD Bioscience Cat# 563068; RRID: AB_2687548
BV421 抗マウス CD44 抗体 BD Bioscience Cat# 563970; RRID: AB_2738517
APC 抗マウス NK-1.1 抗体 BD Bioscience Cat# 550627; RRID: AB_398463
BV421 抗マウス CD11c 抗体 BD Bioscience Cat# 562782; RRID: AB_2737789
BB700 抗マウス CD11b 抗体 BD Bioscience Cat# 566416; RRID: AB_2744272
BV421 抗マウス Foxp3 抗体 BD Bioscience Cat# 562996; RRID: AB_2737940
FITC 抗マウス NKG2A/C/E モノクローナル抗体 eBioscience Cat# 11-5896-82; RRID: AB_465305
細菌およびウイルス株
P. merdaeImmunoactis 本著作物 KCTC14922BP
バクテロイデス・プレベウスKCTC5793 韓国株培養コレクション（KCTC） KCTC5793
ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）KCTC43133 韓国株培養コレクション（KCTC） KCTC43133
生物試料
ヒト糞便
ヒト血液サンプル
ヒト腫瘍組織
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
脳心筋注入（BHI）ブロス BD Biosciences Cat# 237500
強化クロストリジウム培地（RCM）ブロス BD Biosciences Cat# 218081
デマン、ロゴサ、シャープ（MRS）ブロス BD Biosciences Cat# 288130
酵母エキス BD Biosciences Cat# 212750
L-システイン塩酸塩一水和物 Merck Cat# C7880
ヘミン Sigma-Aldrich Cat# H9039
ビタミン K1 Sigma-Aldrich Cat# 95271
カナマイシン Rd-tech Cat# HKA01
脱脂ヒツジ血 KisanBio Cat# S1876
DMEM 培地 ThermoFisher Cat# 11965-118
RPMI 1640 培地 Corning Cat# 10-040-CV
ウシ胎児血清（FBS） MP Biomedicals Cat# 92916754
PBS ThermoFisher Cat# 10010-049
ペニシリン-ストレプトマイシン ThermoFisher Cat# 15140-122
NEAA（MEM 非必須アミノ酸溶液） ThermoFisher Cat# 11140-050
HEPES ThermoFisher Cat# 15630-080
ピルビン酸ナトリウム ThermoFisher Cat# 11360070
L-グルタミン ThermoFisher Cat# 25030-081
2-メルカプトエタノール ThermoFisher Cat# 21985-023
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE） ThermoFisher Cat# C34554
EDTA ThermoFisher Cat# AM9260G
フィコール® パケプラス Merck Cat# GE17-1440-02
赤血球溶解バッファー BioLegend Cat# 420301
オバルブミン（323-339） Merck Cat# O1641
TRIzol 試薬 Invitrogen Cat#15596026
コラゲナーゼ I ThermoFisher Cat# 17100-017
コラゲナーゼ II 型 ThermoFisher Cat# 17101-015
コラゲナーゼ IV 型 ThermoFisher Cat# 17104-019
DNase type I Merck Cat# 10104159001
ヒアルロニダーゼ IV-S 型 Merck Cat# H3884
固定／透過バッファーセット BioLegend Cat# 424401
Leica Bond Dewax solution Leica Biosystems Cat# AR9222
ボンド エピトープ回収 1 Leica Biosystems Cat# AR9961
Bond エピトープ検索 2 Leica Biosystems Cat# AR9640
抗体希釈液／ブロック Akoya Biosciences Cat# ARD1001EA
DAPI および Hoechst 核酸染色剤 ThermoFisher Cat# 62248
プロロングゴールド退色防止試薬 ThermoFisher Cat# P36935
Maxpar 細胞染色バッファー Fluidigm Cat# 201068
Cell-ID Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192A
Maxpar Fix and Perm Buffer Fluidigm Cat# 201067
重要な市販アッセイ
Simoa CorPlex ヒトサイトカイン 10 プレックスパネル 1 キット Quanterix Cat# 85-0329
Maxpar ダイレクト免疫プロファイリングアッセイキット Fluidigm Cat# 201334
土壌用 FastDNA® SPIN キット MP Biomedicals Cat# 116560200-CF
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix ロシュ Cat# 07958927001
TruSeq Nano DNAサンプル前処理キット、セットA イルミナ Cat# TG-202-1001
TruSeq Nano DNAサンプル前処理キット、セットB イルミナ Cat# TG-202-1002
ヒトCD4+T細胞単離キット Miltenyi Biotec Cat# 130-096-533; RRID: AB_2916089
ヒト CD8+T 細胞単離キット Miltenyi Biotec Cat# 130-096-495; RRID: AB_3073903
マウス CD8+T 細胞分離キット Miltenyi Biotec Cat# 130-104-075
ヒト IFN-γ ELISA キット ThermoFisher Cat# 88-7316-88
アネキシン V-PI 染色キット Enzo Life Science Cat# ALX-850-020-K101
TOPscript™ RT DryMIX キット Enzynomics Cat# RT200
TOPreal™ qPCR 2X PreMIX キット Enzynomics Cat# RT501M
寄託データ
生シークエンシングファイル 本試験 ENA: PRJEB48251
実験モデル 細胞株
MC38（マウス結腸がん細胞株） Lab stock ENH204-FP; RRID: CVCL_B288
4T1（マウス乳がん細胞株） Lab stock CRL-2539; RRID: CVCL_0125
実験モデル 生物／系統
雌性C57B6/Nマウス（7週齢） Orientbio RRID: MGI:5882838
雌Balb/cマウス（7週齢） Orientbio RRID: MGI:6323059
OT-1 マウス (Tg[TcraTcrb]1100Mjb/J) In-House Breeding RRID: IMSR_JAX:003831
オリゴヌクレオチド
TCGTCGCAGCTCAGATGTGTATAA
GAGACAGCCTACGGGGNGGCWGCAG 本研究 細菌16s rRNA V3-V4領域用フォワードプライマー
GTCTCGTGGCTCGGAGATGGTATAA
GAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC 本研究 細菌 16s rRNA V3-V4領域用リバースプライマー
GCTCAACCTGGGCATTGCA 本研究P. merdaeImmunoactis同定用フォワードプライマー
CATGTTTTAGGGATTCGAGCG 本研究P. merdae Immunoactis同定用リバースプライマー
ソフトウェアとアルゴリズム
GraphPad Prism 10 グラフパッドソフトウェアhttps://www.graphpad.com/
FlowJo v10.10.0 Treestar, Inc.https://www.flowjo.com/
FACS Diva 9 BD バイオサイエンスhttps://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Phenochart v2.2.0 アコヤバイオサイエンスhttps://www.akoyabio.com/support/software/
inForm 画像解析ソフトウェア v3.0 アコヤバイオサイエンスhttps://www.akoyabio.com/support/software/
FCS Express 7 Flow ソフトウェア De Novo Softwarehttps://denovosoftware.com/
phenoptrReportパッケージ アコヤバイオサイエンスhttps://akoyabio.github.io/phenoptrReports/index.html
Cutadapt バージョン 4.1 Martinl.
https://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200
QIIME2 バージョン 2022.8 Bolyen et al.
https://qiime2.org/
DADA2 ソフトウェアパッケージ Callahan et al.
https://github.com/benjjneb/dada2
RESCRIPt Robeson et al.
https://github.com/bokulich-lab/RESCRIPt
R (バージョン 4.2.1) R コアチームhttps://www.R-project.org/
ggpubr パッケージ（バージョン 0.6.0） Kassambarahttps://rpkgs.datanovia.com/ggpubr/
マイクロバイオーム組成解析（ANCOM） Mandal et al.
https://qiime2.org/
kneaddata (バージョン 0.12.0) Biobakery グループhttps://github.com/biobakery/kneaddata
HUMAnN 3 Beghini et al.
https://github.com/biobakery/humann
StrainPhlAn 4 Truong et al.
https://github.com/biobakery/biobakery/wiki/strainphlan4
Jalview Waterhouse et al.
https://www.jalview.org/
FastTree (version 2.1.11) Price et al.
http://www.microbesonline.org/fasttree/
FigTree (バージョン 1.4.4.) Rambaut
http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
BBDuk ブッシュネル
https://github.com/BioInfoTools/BBMap
Unicycler(バージョン0.5.0) Wick et al.
https://github.com/rrwick/Unicycler
Usearch (バージョン 11.0.667) Edgar
https://www.drive5.com/usearch/
JspeciesWS Richter et al.
https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/#home
OrthoANI Leeら
https://www.ezbiocloud.net/tools/orthoani
その他
嫌気性ジャー Oxoid Cat# HP0011A
アネロパック MGC Cat# A-06
ガスパック 100 システム BD Biosciences Cat# 260626
キュベット Ratiolab Cat# HRA-2712120
0.2 μm シリンジフィルター Satorius Cat# 17823-K
40 μm セルストレーナー Falcon Cat# 352340
70 μm セルストレーナー Falcon Cat# 352350
60 mm 無処理プレート SPL Cat# 11060
96 ウェル無処理プレート SPL Cat# 32096
セルカウンティングスライド Logos biosystems Cat# L12001
インスリンシリンジ 0.5mL、31G、8mm BD Cat# 328821
DNA/RNA シールド糞便採取チューブ Zymo Research Cat# R1101
リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるHansoo Park(hspark27@gist.ac.kr)までご連絡ください。
入手可能な材料
本研究で同定されたP. merdaeImmunoactisはKorean Collection for Type Cultures (KCTC)から入手可能である。詳細はKey resources tableを参照。
データおよびコードの利用可能性
本研究のマッチしたシークエンスファイルの臨床メタデータは、研究責任者の確認のもと、学術利用が可能である。
計算コードはすべて手作業で変更されていない。すべてのオリジナルコードはkey resources tableに記載されている各開発サイトから入手可能である。セッティングの詳細はメソッドの詳細に記載されている。
追加情報および再解析は、要求があれば、リードの連絡先の確認のもとで利用可能である。
実験モデルと被験者の詳細
倫理的承認および同意情報
本研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、Asan Medical CenterおよびGISTのIRBにより承認された（それぞれ2018-0608および20210416-HB-60-07-04）。すべての参加者は、血液、便、腫瘍組織生検を含む本試験について書面によるインフォームドコンセントを提供した。
臨床試験デザインおよび試験集団
本試験は牙山医療センターで実施され、clinicaltrials.govに登録された。登録番号はNCT04264975。
糞便微生物叢移植試験
本試験は、抗プログラム死-1/プログラム死-リガンド1（PD-1/PD-L1）阻害剤と同時に糞便微生物叢移植（FMT）を行う前向き単施設試験であった。主要目的は、抗PD-(L)1阻害剤に抵抗性の進行固形がん患者において、抗PD-(L)1阻害剤に良好な反応を示した患者由来のFMTと抗PD-(L)1阻害剤を併用することで、抗PD-(L)1阻害剤に対する抵抗性を克服できるかどうかを検討することであった。副次的目的は、FMTと抗PD-(L)1阻害薬の併用による安全性プロファイルの評価、全身および腫瘍内免疫効果の検討、および腸内細菌叢組成の解析によるFMTの有効性に寄与する潜在的原因菌の同定であった。
レシピエントの主な適格基準は、組織学的に確認された固形がんであった。ただし、肝細胞がん（HCC）については、米国肝臓病学会（AASLD）に従って臨床的に診断が確定していることが認められた。
切除不能または転移性固形がんに対する抗 PD-(L)1療法（単剤療法または併用療法）中に病勢進行が確認された場合；年齢が19歳以上；Eastern Cooperative Oncology Group（ECOG）のパフォーマンスステータスが0～2；RECIST（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）v1.1に従って測定可能な病変が1つ以上ある場合
試験参加前 3 年以内に他の活動性の悪性腫瘍の既往がないこと（根治的治療を受けた非黒色腫皮膚がん、表在性膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、乳がん、胃がんを除く）；活動性の感染症がないこと；1 型糖尿病または自己免疫性甲状腺疾患を除き、全身治療を必要とする活動性の自己免疫疾患の既往がないこと；免疫抑制剤を必要とする疾患を併発していないこと；大腸内視鏡検査の禁忌がないこと。
ドナーの主な適格基準は、組織学的に確認された固形腫瘍で、AASLDに従って臨床的に確認された診断が認められたHCCを除く
RECIST v1.1による持続的完全奏効または部分奏効が6ヵ月以上持続している。 切除不能または転移性固形腫瘍に対する抗PD-(L)1単剤療法を6ヵ月以上継続中であること、年齢が19歳以上であること、伝染性疾患を併発していないこと、ヒト免疫不全ウイルスやその他のウイルス感染症などの感染症の既往歴やリスク行動がないこと、下痢性疾患が流行している国や旅行者下痢のリスクが高い国に6ヵ月以内に最近渡航していないこと、炎症性腸疾患を含む慢性消化器疾患の既往歴がないこと、レシピエントアレルギーが判明しているアレルゲンを最近摂取していないこと。血清学的および便のスクリーニング検査に合格したドナーのみが、FMT移植のための便サンプルの提供に適していると考えられた。
検証のためのバイオマーカー試験
本試験は、切除不能または転移性の固形がん患者を対象に、腸内細菌叢と抗PD-(L)1阻害薬の臨床的有用性との関連を調査する単施設前向き非介入試験であった。主な適格基準は、組織学的に確定された固形がんであり、AASLDに従って臨床的に確定診断が認められたHCCを除く。
抗PD-(L)1単剤療法を受けた切除不能または転移性固形がん、年齢19歳以上、ECOG performance status 0-2、RECIST v1.1による測定可能または評価可能な病変が1つ以上ある。
試験参加前 3 年以内に活動性の悪性腫瘍の既往歴がないこと（根治的治療を受けた非黒色腫皮膚癌、表在性膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌、胃癌を除く）；活動性の感染症がないこと；1 型糖尿病または自己免疫性甲状腺疾患を除き、全身治療を必要とする活動性の自己免疫疾患の既往歴がないこと；免疫抑制剤を必要とする疾患を併発していないこと。
患者の便検体と末梢血検体は、抗PD-(L)1阻害薬による治療前のベースライン時、およびRECIST v1.1に従って6～8週間ごとにCTスキャンを用いて行われる腫瘍反応評価のたびに採取された。
FMT試験における治療
FMTインプラントの調製
排便直後のドナーから200～500mgの糞便を、試験担当者が用意した糞便容器に採取した。採取された便は、排便後4時間以内にできるだけ早く実験室に運ばれた。採取された各便について、便虫および寄生虫を含むスクリーニング便検査、サルモネラ、赤痢菌、カンピロバクター、エルシニア、腸管出血性大腸菌、クロストリジウム・ディフィシル、およびバンコマイシン耐性腸球菌カルバペネム耐性腸内細菌科細菌、および広域β-ラクタマーゼ産生腸内細菌科細菌を含む抗生物質耐性菌の便培養も行った。
FMTに使用されたドナーの糞便は、排便後6時間以内にできるだけ早く処理された。糞便は滅菌液（通常の生理食塩水0.9％）で希釈し、ピペットを用いて手作業で、あるいはブレンダーを用いて低速で少なくとも30秒間ホモジナイズした。糞便懸濁液を清潔な金属製コーヒーこし器でろ過し、食物残渣を除去した。ろ液を6000×gで15分間遠心分離し、滅菌液（0.9％生理食塩水／グリセリン、90/10 v/v比）で懸濁した。ろ液は滅菌バイアルに充填し（各バイアル50 mL）、-80℃で保存した。FMT当日、凍結懸濁液はFMT手順の約2時間前から37℃の温水浴を用いて解凍した。
FMT＋抗PD-(L)1阻害剤による治療
レシピエントは、FMT治療（D0）の前に、5日間（D-5～D-1）抗生物質（オーグメンチン®：アモキシシリン・クラブラン酸塩、625mg po tid）を経口投与する最初の常在細菌叢枯渇段階を受けた。オーグメンチンの最終投与は、FMTインプラント投与の少なくとも12時間前（±2時間前）に終了した。FMTは大腸内視鏡検査により実施され、施設のプロトコールに従い、処置前に2Lのポリエチレングリコール電解質溶液を用いた腸管洗浄により消化管を準備した。解凍した糞便懸濁液を大腸内視鏡で投与し、患者には処置後できるだけ長く懸濁液を保持するよう求めた。
FMT投与後、レシピエントはFMT翌日に標準用量の抗PD-1阻害薬を投与され、これは許容できない毒性または病勢進行が認められるまで継続された。同一または異なるドナーからのFMTの再施行は、初回奏効評価の2～4週間前、または臨床的奏効が明らかでない場合に、治験責任医師の判断で許可された。奏効判定は、RECIST v1.1に従って、6～8週間ごとに実施されたコンピュータ断層撮影（CT）スキャンを用いて行われた。
細菌の調製
以下の細菌株をKorean Collection for Type Cultures（KCTC）から入手した： Bacteroides plebeius（KCTC5793）およびLactobacillus salivarius（KCTC43133）。Prevotella merdaeImmunoactisは後述のように分離した。すべての細菌種は、嫌気ジャー（Oxoid）に嫌気パック（#A-06、MGC）を用いて作製した嫌気条件下、37℃で培養した。B. plebeiusはオートクレーブ滅菌した強化クロストリジウム培地（RCM）ブロス（#218081, BD Biosciences）で培養した。L. salivariusはオートクレーブ滅菌したDe Man, Rogosa and Sharpe (MRS) broth (#288130, BD Biosciences)で培養した。P. merdaeImmunoactisは、0.5%酵母エキス（#212750, BD Bioscience）、0.05%L-システイン塩酸塩一水和物（#C7880, Merck）、0.005%ヘミン（#H9039, Sigma-Aldrich）、および0.0001%ビタミンK1（#95271, Sigma-Aldrich）を添加したオートクレーブ処理したBrain Heart Infusion（BHI）ブロス（#237500, BD Biosciences）で培養した。T細胞に対する培地の影響を排除するため、コンディショニング細菌上清を調製した。一晩培養した細菌培養物（1mL）を9mLのRoswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培地（#10-040-CV、Corning）に接種し、24時間培養した。これらの培養物を6,000rpmで5分間遠心し、0.2μmのシリンジフィルター（#17823-K、Sartorius）を用いて上清をろ過した。各上清1mlは、使用するまで-80℃で保存した。P. merdaeImmunoactis培養液を6,000rpmで5分間遠心し、上清を捨て、ペレットをPBSに再懸濁した。600 nmでの懸濁液の光学密度（OD600）をOD600 = 6に調整した。
哺乳動物細胞培養
MC38（マウス結腸癌細胞株）および4T1（マウス乳癌細胞株）は、10％熱不活性化FBS（#92916754、MP Biomedicals社製）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific社製）を添加したDMEM（#11965-118、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、5％CO2雰囲気下、37℃で培養した。細胞は70-80％コンフルエントに達した時点で再培養した。
マウス実験
すべての動物実験は、GISTのInstitutional Animal Care and Use Committee（GIST-2021-096およびGIST-2024-011）の承認されたプロトコールに従って実施した。本研究は、動物の維持および取り扱いに関して承認された方針に従った。共 同腫瘍モデルでは、7 週齢の雌性 C57B6/N マウス（Orientbio 社製）に 2 ×105個の MC38 マウス結腸癌細胞を 0 日目に皮下注射し、7 週齢の雌性 Balb/c マウス（Orientbio 社製）に 5 ×105 個の4T1 マウス乳癌細胞を 0 日目に皮下注射した。腫瘍サイズを終点まで毎週3回測定し、縦×横2×0.5の式で腫瘍体積を算出した。各菌株、3菌混合株またはPBS（#10010-049、Thermo Fisher Scientific）を、腫瘍接種の14日前から腫瘍接種後3週間にわたって毎日経口投与した。各菌株は、マウス1匹あたり光学密度値10（OD600＝10）に相当する量を摂取できるように調製した。3菌混合液は、P. merdaeImmunoactis： B. plebeius： L.サリバリウス＝10：1：1の割合で混合した。併用療法の効果を調べるため、腫瘍接種後7、9、11、14、16、18日目に、2mg/kgのIgGアイソタイプ（クローン2A3、#BE0089、BioXCell）と2mg/kgの抗PD-1モノクローナル抗体（mAb）（クローンRMP1-14、#BE0146、BioXCell）を腹腔内注射した。細菌投与および抗PD-1 mAb注射の対照として、それぞれPBSおよびIgGアイソタイプを用いた。
方法の詳細
マルチプレックス免疫蛍光染色
マルチプレックスIHC染色、スキャン、解析は、PrismCDX Co. (Ltd.（京畿道、大韓民国）で行った。染色には、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックから厚さ4μmの切片を切り出した。スライドを60℃の乾燥オーブンで少なくとも1時間加熱し、Leica Bond Rx™ Automated Stainer（Leica Biosystems, Newcastle, UK）を用いて多重免疫蛍光染色を行った。染色に使用した抗体と蛍光色素のリストをTable S8にまとめた。簡単に説明すると、Leica Bond Dewax solution (#AR9222, Leica Biosystems) を用いてスライドを脱脂し、続いて Bond Epitope Retrieval 2 (#AR9640, Leica Biosystems) を用いて抗原を 30 分間回収した。染色は、抗体希釈液/ブロック（ARD1001EA、Akoya Biosciences, Marlborough, MA, USA）によるブロッキング、一次抗体の 30 分インキュベーション、OPAL polymer HRP Ms+Rb（#ARH1001EA, Akoya Biosciences）による 10 分インキュベーションを順次行った。その後、Bond Epitope Retrieval 1 (#AR9961, Leica Biosystems) で 20 分間処理し、結合した抗体を除去した。ブロッキングから抗原回収までの工程を各抗体染色について繰り返した。最後の抗原回収ステップの後、核を DAPI（#62248、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）でカウンター染色した。スライドにカバースリップを重ね、ProLong Gold antifade reagent（#P36935、Invitrogen、Waltham、MA、USA）を塗布した。
マルチスペクトルイメージングと解析
Vectra Polaris Automated Quantitative Pathology Imaging System（Akoya Biosciences）を用いて、Multiplex染色したスライドを倍率20倍でスキャンした。Phenochart（Akoya Biosciences社製）を用いてトレーニング用の代表画像を選択し、inForm Image Analysisソフトウェア（Akoya Biosciences社製）を用いてアルゴリズムを作成した。inFormソフトウェアのスペクトルライブラリを用いてマルチスペクトル画像の混合を解除し、サイトケラチン（CK）発現の有無に基づいて腫瘍組織をセグメント化した。各細胞はDAPI染色に基づいてセグメント化され、各マーカーの発現コンパートメントと強度に基づいて表現型分類が行われた。組織スライド上で解析する関心領域（ROI）を指定した後、このようにして作成したアルゴリズムをバッチ実行方式で適用した。エクスポートされたデータは、phenoptr（Akoya Biosciences）とphenoptrReportパッケージ（Akoya Biosciences）を用いて、Rソフトウェアで統合解析した。
複数サイトカインの検出（Simoa社製）
Simoa HD-1 アッセイ
血漿中のIL-2およびIL-15の濃度は、PrismCDX社製Simoa HD-1アナライザー（Quanterix社製、米国マサチューセッツ州）を用い、Simoa試薬キット（Quanterix社製、米国マサチューセッツ州）を用いて、臨床情報と盲検化された治験責任医師により測定された。血漿サンプルはQuanterixのガイドラインに従って1:4に希釈された。洗浄バッファー、96ウェルプレート、ディスク、キュベット、シーリングオイルを含むすべてのHD-1消耗品はQuanterix社から購入した。アッセイは、3ステップのプロトコルを用いて全自動のSimoa HD-1で行った。3ステップアッセイでは、常磁性ビーズでコートした標的抗体をサンプルとインキュベートし、サンプル中の標的分子がビーズコート抗体に結合するようにした。洗浄後、ビオチン化検出抗体と混合し、検出抗体を捕捉された標的に結合させるためにインキュベートした。洗浄後、複合体をストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ（SBG）と混合し、SBGをビオチン化検出抗体に結合させ、捕捉標的に酵素標識を生成させた。最終洗浄後、ビーズをRGP基質溶液に再懸濁し、シモアディスクに移した。β-ガラクトシダーゼがRGP基質を加水分解する間に、捕捉され標識された標的抗原が測定された。ビーズあたりの平均酵素数（AEB）は、分析物濃度と相関する活性ウェルの割合から算出した。血漿中IL-2およびIL-15の評価については、全サンプルを二重分析し、各サンプルの複製の平均値を算出した。
Simoa SP-X アッセイ
Simoa CorPlex Human Cytokine 10-plex Panel 1 kit (Quanterix, MA, USA)を用いて、10種類の血漿マーカーを測定した。10種類の標的は、インターフェロンガンマ（IFN-γ）、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-22、および腫瘍壊死因子α（TNFα）であった。96ウェルマイクロプレートの各ウェルにあらかじめタンパク質特異的抗体をスポットし、サンプル中の標的タンパク質を捕捉した。結合しなかったタンパク質を洗浄した後、ビオチン化検出抗体を加えて標的タンパク質の二次部位に結合させ、余分な検出抗体を除去するために洗浄した。最後に、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP）を加え、HRPを基質と反応させ、SP-Xイメージング・システム（Quanterix, MA, USA）で検出される発光シグナルを生成させた。シグナル強度に基づいて、存在するタンパク質の量を定量した。
マスフローサイトメトリー（CyTOF）
末梢血単核球（PBMC）は、Maxpar Direct Immune Profiling Assayキット（Fluidigm）を用いて、製造者の指示に従って染色した。PBMCアリコートを調製し、バッファーをMaxpar Cell Staining Buffer（Fluidigm）に交換した。Human TruStain FcX (BioLegend, San Diego, CA, USA)を各チューブに加え、Fcレセプターをブロックした後、19-24℃で10分間インキュベートした。その後、PBMCを乾燥抗体ペレット（Fluidigm）を含む5mLチューブに直接移し、室温で30分間インキュベートした。洗浄後、PBMCを1.6%ホルマリンで室温で10分間固定した。最後に、PBMCをMaxpar Fix and Perm Buffer（Fluidigm）中、Cell-ID Intercalator-Ir（Fluidigm）と共に4℃で約48時間インキュベートした。取得前に、PBMCをMaxpar Cell Staining Buffer（Fluidigm）で2回洗浄し、Heliosマスサイトメーター（Fluidigm）で取得する前に40μmのセルストレーナーで濾過した。マスサイトメトリーデータファイルは、FCS Express 7 Flow ソフトウェア（CAT #402001 , De Novo Software, Pasadena, CA, USA）を用いて解析した。各抗体のクローンと質量は表S9に記載されている。
糞便DNA抽出および配列決定
すべての糞便サンプルを採取し、DNA抽出まで採取チューブ（#R1101, Zymo Research）に保存した。糞便サンプルからDNAを抽出するには、FastDNA® SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals）を用い、製造者の指示に従って行った。DNA の純度と量は NanoDrop One Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）を用いて推定した。細菌の16S rRNA V3-V4領域は、Illuminaの16S Metagenomic Sequencing Library Preparation guide（Illumina）を用いて、アダプターオーバーハング配列を付加したプライマーを用いて増幅した。
フォワードプライマー：5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG -3'、リバースプライマー：5'- GTCTCGTGGCTCGAGATGTGTATAAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC -3'。PCR反応ミックスには、ゲノムDNA2μL、各プライマー0.5μL、2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix（Kapa Biosystems）12.5μL、蒸留水9.5μLを含み、総容量は25μLであった。使用したPCR条件は以下の通りである： 95℃、3分間でDNAを予備変性；95℃、30秒間でDNAを変性；50℃、30秒間でアニーリング；72℃、30秒間で伸長；72℃、5分間で最終伸長というサイクルを25回繰り返した。PCR産物はAMPure XP Beads（Beckman Coulter）を用いて精製した。PCR産物（5μL）、Illumina Nextera XT Index Primer 1（5μL、N7xx）、Nextera XT Index Primer 2（5μL、S5xx）、2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix（25μL）、およびヌクレアーゼフリー水（10μL）を用いて、以下のプロトコルでデュアルインデックスのアタッチメントおよびIlluminaシークエンシングアダプターを行った： 95℃、3分；95℃、30秒、55℃、30秒、72℃、30秒のサイクルを8回；72℃、5分。PCR産物からDNA残骸を除去し、正確なDNA断片を得るために、PCR産物をAMPure XPビーズ（Beckman社製）を用いて洗浄し、Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer（Agilent社製）を用いて16Sメタゲノムライブラリーの品質管理を行った。ライブラリーは標準化され、MiSeqプラットフォーム（Illumina）でのシーケンス用にプールされた。糞便サンプルのDNAは、TruSeq Nano DNA sample Prep Kit（Illumina, CA, USA）を用いて抽出し、Therragene Bio社（京畿道、大韓民国）のメーカーの指示に従ってショットガンメタゲノムシーケンスを行った。シーケンシングは、Therragene Bio社（京畿道、大韓民国）がIlluminaプラットフォーム（バージョン1.9）を用いて行い、ライブラリーは標準的なIlluminaシーケンシングプロトコールに従って鎖標準化した。
メタゲノム解析
ペアエンドリードのイルミナアダプター配列は、Cutadaptバージョン4.1を用いて除去した。
トリミング後、QIIME2バージョン2022.8を用いてリードを処理した。簡単に説明すると、まずユニークなインデックスに従ってリードを各サンプルに割り当て、QIIME2のインポートツールを用いて元のDNA断片からのリードのペアをマージした。
品質管理とトリミングは、フォワードリードとリバースリードの長さがそれぞれ230 bpと210 bpになるように行った。DADA2ソフトウェアパッケージ
QIIME2に同梱されているDADA2ソフトウェアパッケージを使用して、リードから低品質塩基を除去した。DADA2に実装されているコンセンサス法を用いて、FASTQファイルからキメラを除去した。QIIME2 diversity pluginのcore-metrics-phylogenetic analysisを用いて、αおよびβ多様性を解析した。アルファ多様性とベータ多様性は、それぞれQIIME2多様性プラグインのアルファ群有意性とベータ群有意性を用いて計算した。アルファ多様性は観察された種（観察された特徴）を用いて計算され、ベータ多様性はBray-Curtis距離（BCD）を用いた主座標分析によって比較された。FMTの生着率を評価するため、BCDtoDonor+ (1 -BCDtoBase)の式で「生着距離」を算出した。グループ間の類似性の有意性は、999通りの並べ替えを行った並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて評価した。分類学的アノテーションは、プライマー（フォワード、5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；リバース、5′-GACTACHVGGTATCTAATCC-3′）を用いてトレーニング参照セットをマッピングし、RESCRIPtを使用して手動で微生物相を追加したNCBI参照データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）を使用してV3-V4領域を抽出することにより実施した。
相関プロットと計算は、Rのggpubrパッケージ（バージョン4.2.1）を用いて作成した。
およびR Studio（2023.09.1+494）を用いて作成した。R6群とR7群間の微生物組成分析に取り組むため、Analysis of Composition of Microbiomes（ANCOM）を採用した。
さらに、16S rRNAとマーカー遺伝子に基づくショットガンメタゲノム解析を行った。hg37decデータベース(バージョン0.1.4)と-trimmomaticTrimmomatic-0.39オプションを用い、kneaddata(https://github.com/biobakery/kneaddata)を用いてシーケンスリードの品質チェックを行った。
その後、微生物アラインメントとアバンダンス計算をHUMAnN 3を用いてデフォルトオプションで行った。
連結マルチ配列アライメントのSNP計算は、StrainPhlAn 4をデフォルトオプションで使用した。
マルチ配列アライメントはJalviewを用いて可視化した。
連結したマルチシークエンスアラインメントの系統距離は FastTree を用いて算出した。
(バージョン 2.1.11)を用いて計算した。ツリーの可視化は FigTree
(バージョン 1.4.4.)を用いて行った。
ドナー便からのP. merdaeImmunoactisの分離
糞便サンプルを嫌気性PBSに懸濁し、0.5 %酵母エキス（#212750、BD）、0.05 %L-システイン塩酸塩（#C7880、Sigma-Aldrich）、0. 0005 %ヘミン（#51280、Sigma-Aldrich）、0.0001 %ビタミンK1（#95271、Sigma-Aldrich）、0.01 %カナマイシン（#HKA01、Rd-tech）、および5 %脱脂ヒツジ血（#S1876、KisanBio）。プレートはGasPak 100システム（#260626、BD）を用い、嫌気条件下37℃で培養した。プレートからコロニーを無作為に取り出し、プライマーセット、5'-GCTCAACCTGGGCATTGCA-3'および5'-CATGTTTTAGGGATTCGAGCG-3′を用いて、P. merdaeImmunoactis種特異的配列についてPCRで検査した。単離したP. merdaeImmunoactisのDNAを、TruSeq Nano DNA sample Prep Kit（Illumina、米国カリフォルニア州）を用いて調製し、Therragene Bio社（大韓民国京畿道）で全ゲノム配列を決定した。Theragene Bio社（京畿道、大韓民国）による標準化されたイルミナシーケンスプロトコルに従い、ライブラリーを標準化してプールし、イルミナプラットフォーム（バージョン1.9）でシーケンスした。シーケンスされたリードは、BBDukプラグインBBMapを用いて--trimq=30および--maq=30オプションで品質チェックした、
Unicyclerを用いて-min_dead_end_size1500 --depth_filter 0.5オプション35でアセンブルし、Usearchを用いてPhiXゲノムのフィルタリングを行った。
単離されたP. merdaeimmunoactisの最も近い正確な種を同定するために、アセンブルされたゲノムコンティグをJSpeciesWSのGenomesDBで検索した36。
のGenomesDBに対して、tetra correlation searchをデフォルトオプションで使用して検索した。P. merdaeImmunoactisとP. merdaesp. Marseille-P4119
OrthoANIを用いて行った。
T細胞増殖アッセイ
ヒトT細胞は、インフォームド・コンセントに基づき、20歳代の健康なドナーから採取した血液サンプルから単離した。この研究は、韓国の光州科学技術院（GIST）のInstitutional Review Board（20210416-HB-60-07-04）の承認を得た。PBMCは、Ficoll® Paque Plus（#GE17-1440-02、Merck社製）を用いて、密度勾配遠心法により40～50mLの血液サンプルから分離した。CD4＋T細胞およびCD8＋ T細胞は、それぞれCD4＋T細胞分離キット（#130-096-533、Miltenyi Biotec社製）およびCD8＋ T細胞分離キット（#130-096-495、Miltenyi Biotec社製）を用いて別々に分離した。単離したT細胞を、10%ウシ胎児血清（FBS）を添加したRPMI1640培地（#10-040-CV、Corning）に再懸濁した； 92916754、MP Biomedicals）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（#15140-122、Thermo Fisher Scientific）、1×NEAA（#11140-050、Thermo Fisher Scientific）、200mM HEPES（#15630-080、Thermo Fisher Scientific）、2mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン（#25030-081、Thermo Fisher Scientific）、および1×2-メルカプトエタノール（#21985-023、Thermo Fisher Scientific）を添加したRPMI1640培地（#10-040-CV、Corning）に懸濁した。さらに、T細胞をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE；#C34554、Thermo Fisher Scientific社製）で5％CO2雰囲気下、37℃で30分間染色した。96ウェル非処理プレート（#32096、SPL社製）に0.2μgの抗CD3e抗体（#100340、BioLegend社製）を各ウェルにプレコートし、4℃で一晩インキュベートした。その後、CFSE染色したT細胞を2×105細胞/ウェルの濃度でプレコートしたプレートに加え、単独または10%細菌上清もしくは3菌混合液とともに、5%CO2雰囲気下、37℃で72時間インキュベートした。3菌混合液は、P. merdaeImmunoactis： B. plebeius： L.サリバリウス＝10：1：1の割合で混合した。72時間後、T細胞を回収し、FACSバッファー（PBS＋10％FBS＋2mM EDTA）で洗浄し、BD FACS CANTO II（BD Bioscience社製）を用いて増殖を解析した。T細胞の上清も回収し、ELISAに使用するまで-80℃で保存した。上清中のIFN-γレベルは、ヒトIFN-γ ELISAキットを用いて、製造業者のプロトコールに従って測定した（#88-7316-88、Thermo Fisher Scientific）。データの解析にはFlowJoソフトウェア（Treestar）を用いた。
OT-1 T細胞細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイには、オバルブミン特異的CD8+ T細胞（OT-1 T細胞）を用いた。簡単に述べると、OT-1マウス（#003831、C57BL/6-Tg[TcraTcrb]1100Mjb/J、The Jackson Laboratory）から脾臓を単離し、3mLのPBSとともに70μmのセルストレーナー（#352350、Falcon）で粉砕した。細胞を10mLの1×RBC溶解バッファー（#420301、BioLegend）に再懸濁し、室温で10分間インキュベートした。CD8+T細胞分離キット（#130-096-495, Miltenyi Biotec）を用いてOT-1 T細胞を分離した。分離したOT-1 T細胞をT細胞培地に再懸濁した。60mmの非処理プレート（#32096、SPL）に5mgの抗CD3抗体（#100340、BioLegend）と0.5mgの抗CD28抗体（#102116、BioLegend）をプレコートし、4℃で一晩インキュベートした。さらに、OT-1 T細胞を1-2×106細胞/ウェルでプレコートした60mmプレートに10%細菌上清とともに分配し、5%CO2雰囲気下、37℃で48時間インキュベートした。48時間の培養後、OT-1 T細胞をRNA単離のために回収し、あるいはOva処理したMC38細胞とT細胞培地で5：1の割合で6時間共培養した。最後に、アネキシンV-PI染色キット（#ALX-850-020-K101、Enzo Life Science）を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析した。MC38細胞は、オバルブミン（323-339）（#O1641、Merck）を用いて処理し、OT-1 T細胞と共培養する前に、5％CO2雰囲気下、37℃で一晩インキュベートした。
相対遺伝子発現の比較（RT-PCR）
活性化したOT-1細胞を回収し、TRIzol試薬（#15596026、Invitrogen）を用いて、製造元のプロトコールに従ってRNAを抽出した。RNAの品質管理は、A260/A280比およびA260/A230比を評価することによって行った。その後、TOPscript™ RT DryMIX kit（#RT200、Enzynomics社製）を用いてcDNA合成を行い、続いてTOPreal™ qPCR 2X PreMIX kit（#RT501M、Enzynomics社製）とStepOnePlus（#4376600、Applied Biosystems社製）を用いてRT-PCRを行った。遺伝子発現レベルは "Ova act "グループで1に正規化し、相対発現レベルは他の実験グループ間で比較した。プライマー配列およびPCR条件は表S10に示す。
免疫細胞プロファイリング
MC38細胞接種21日後にマウスからリンパ節と腫瘍組織を単離した。分析した免疫細胞は、T細胞、NK細胞、樹状細胞（DC）、Treg、およびマクロファージであった。リンパ節からリンパ球を単離するために、1mLのPBS（#10010-049、Thermo Fisher Scientific）で70μmのセルストレーナー（#352350、Falcon）で粉砕し、細胞をPBSで洗浄し、数を数えた。腫瘍組織については、小片に切断し、5mLの解離培地中で37℃で40分間インキュベートした。解離培地は、2.5 mg/mL collagenase type I (#17100-017, Thermo Fisher Scientific)、1.5 mg/mL collagenase type II (#17101-015, Thermo Fisher Scientific)、1 mg/mL collagenase type IV (#17104-019, Thermo Fisher Scientific)、50 μg/mL DNase type I (#10104159001, Merck)、および0.25 mg/mL hyaluronidase type IV-S (#H3884, Merck)を添加したT細胞培地を用いた。解離工程の後、サンプルを遠心し、上清を捨てた。その後、細胞を5mLの1×RBC lysis buffer（#420301、BioLegend）に再懸濁し、室温で10分間インキュベートした。サンプルを70μmのセルストレーナーで濾過し、細胞数をカウントした。Fcレセプターをブロックするため、サンプルを抗マウスCD16/CD32（BioLegend、#101330）と室温で10分間インキュベートした。その後、抗体混合物を表面マーカー染色用サンプルに加え、4℃で1時間インキュベートした。Tregとマクロファージの場合、固定/透過化バッファーセット（BioLegend、#424401）を用いてサンプルを固定し透過化した後、マーカー内染色のためにAb混合物を加え、4℃で1時間インキュベートした。その後、染色した細胞をCANTO II（BD Biosciences）とBD-FACS Diva software v.8.0.2（BD Bioscience）を用いて取得し、FlowJo software（v.10, TreeStar）を用いて解析した。各細胞タイプに使用した染色マーカーは以下の通り： T細胞はCD45（#103116、BioLegend）、CD3（#100218、BioLegend）、CD4（#100422、BioLegend）、CD8a（#563068、BD Bioscience）、CD44（#563970、BD Bioscience）、CD62L（#104412、BioLegend）、PD-1（#109104、BioLegend）で染色した； NK細胞はCD45（#103116、BioLegend）、CD3（#100218、BioLegend）、NK1. 1（#550627、BD Bioscience）、NKG2A（#11-5896-82、eBioscience）；DCはCD11c（#562782、BD Bioscience）、CD11b（#566416、BD Bioscience）、B220（#103224、Biolegend）で染色した； トレグはCD45（#103116、BioLegend）、CD3（#100218、BioLegend）、CD4（#100422、BioLegend）、CD8a（#563068、BD Bioscience）、CD25（#101910、BioLegend）、Foxp3（#562996、BD Bioscience）、IFN-γ（#163503、BioLegend）で染色した； マクロファージはCD45（#103116、BioLegend）、CD11b（#566416、BD Biosciences）、F4/80（#565411、BioLegend）、TNF-α（#506308、BioLegend）で染色した。
定量と統計解析
統計計算は、Prism（バージョン9.2.0、GraphPad）を用いて行った。2変数間の差は、両側無対t検定またはWilcoxon-Mann-Whitney検定を用いて解析した。複数の変数は、Tukeyの多重比較検定による一元配置または二元配置ANOVAで評価した。相関分析はRバージョン4.1.0を用いて行った。統計的有意性はp値が0.05より低い場合に考慮した。
謝辞
本研究は、牙山医療院生命科学研究所（2018IT0608 to S.R.P.）、韓国国立がんセンター（NCC-1911267 to H.P.およびS.R.P.）、GIST研究院（GRI）の助成金（2020年および2023年にH.P.に支給）、および韓国政府科学ICT部のバイオ・医療技術開発プログラム（2022R1A2C2008976およびRS-2023-00228315）の支援を受けた。
著者貢献
構想、H.P.およびS.R.P.；リソース、S.-Y.K.、E.-J.D.、J.S.S.、S.H.P.、S.W.H.、M.-N. Kim、S.-H.K.、SR.P.；調査、G.K.、Yunjae Kim、Sujeong Kim、B.C.、Seungil Kim、M.-N. Kweon; data curation, G.K., Yunjae Kim, Seungil Kim, D.-J.B., and SR.P.; visualization, Yunjae Kim, G.K., Sujeong Kim, and D.-J.B.; writing - original draft, G.K., Yunjae Kim, Sujeong Kim, and S.R.P.; writing - review & editing, Yunjae Kim, Sujeong. Kim、G.K.、B.C.、Yeongmin Kim、K.M.およびS.R.P.、プロジェクト管理、Yunjae Kim、G.K.、Sujeong Kim、H.P.およびS.R.P.、監督、M.D.A.、C.L.、H.P.およびSR.P.、資金獲得、H.P.およびSR.P.。
利害関係
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
補足情報
pdfダウンロード (5.94 MB)
pdfファイルのヘルプ
ドキュメントS1. 図S1-S12および表S1-S10
参考文献
リバス A.
Wolchok J.D.
チェックポイント阻害を用いた癌免疫療法。
Science. 2018;359:1350-1355https://doi.org/10.1126/science.aar4060ViewIn Article免疫チェックポイント阻害剤に対する後天性耐性。
Cancer Cell. 2020;37:443-455https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.03.017Viewin Article免疫療法併用による抗腫瘍効果の増強。
Lancet. 2021;397: 1010-1022https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)32598-8論文で 見る免疫チェックポイント阻害に対する反応のゲノム相関。
Nat. Med. 2019;25:389-402https://doi.org/10.1038/s41591-019-0382-xView論文中上皮性腫瘍に対するPD-1ベースの免疫療法の有効性に腸内細菌叢が影響する。
Science. 2018;359:91-97https://doi.org/10.1126/science.aan3706View論文中腸内細菌叢はメラノーマ患者の抗PD-1免疫療法に対する反応を調節する。
Science. 2018;359:97-103https://doi.org/10.1126/science.aan4236View論文中常在細菌叢は転移性黒色腫患者における抗PD-1効果と関連している。
Science. 2018;359:104-108https://doi.org/10.1126/science.aao3290Viewin Article糞便微生物叢移植は免疫療法不応性黒色腫患者の反応を促進する。
Science. 2021;371:602-609https://doi.org/10.1126/science.abb5920ViewIn Article糞便微生物叢移植はメラノーマ患者における抗PD-1療法への抵抗性を克服する。
Science. 2021;371:595-602https://doi.org/10.1126/science.abf3363ViewIn Articleヒト糞便から分離された新種の細菌Prevotella merdae sp.
FEMS Microbiol. Lett.2022;369fnac066https://doi.org/10.1093/femsle/fnac066Viewin Articleペムブロリズマブ治療を受けた固形癌患者における病勢進行後の腫瘍動態。
Cancer Cell. 2023;41: 1680-1688.e2https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.08.004ViewIn Article肝細胞癌における抗PD-1遮断後の進行を超えた治療。
Cancer Res. Commun. 2023;3:1912-1916https://doi.org/10.1158/2767-9764.CRC-23-0025Viewin Article糞便微生物叢移植によるマイクロバイオーム改変は、免疫チェックポイント阻害剤誘発難治性大腸炎に有効である。
Sci. Transl. Med. 2023;15eabq4006https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abq4006View記事中免疫チェックポイント阻害薬に関連した胃炎の臨床的特徴と転帰：スコープレビュー。
J. Immunother. 2022;45:363-369https://doi.org/10.1097/CJI.0000000000000435ViewIn Articleグルココルチコイドによる免疫制御。
Nat. Rev. Immunol. 2017;17:233-247https://doi.org/10.1038/nri.2017.1View論文中細胞シグナル伝達におけるコルチコステロイド効果。
Eur. Respir. J.2006;27:413-426https://doi.org/10.1183/09031936.06.00125404Viewin Article漢方処方による2型糖尿病緩和における腸内細菌叢の構造変調。
ISME J.2015;9:552-562https://doi.org/10.1038/ismej.2014.177View論文中副腎皮質ステロイドを用いた腸内細菌叢の再構築：炎症性腸疾患への影響。
Inflamm. Bowel Dis. 2015;21:963-972https://doi.org/10.1097/MIB.0000000000000332ViewIn Articleチヌークサーモン（Oncorhynchus tshawytscha）におけるコルチコステロイド治療、罹患率、老化と腸内マイクロバイオーム組成との関連。
Sci. Rep.2023;13:2567https://doi.org/10.1038/s41598-023-29663-0Viewin ArticleMRL/lprマウスの治療におけるプレドニゾンの治療効果と副作用は腸内細菌叢が介在している。
Arthritis Res. 2021;23:240https://doi.org/10.1186/s13075-021-02620-wViewin Article炎症性腸疾患の病因と治療における腸内細菌叢。
Front. Microbiol. 2018;9:2247https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02247View論文中免疫と炎症における微生物叢の役割。
Cell. 2014;157: 121-141https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.03.011View記事中Cutadaptはハイスループットシーケンスリードからアダプター配列を除去する。
EMBnet. j.2011;17:3https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200View論文中QIIME 2： 再現可能、インタラクティブ、スケーラブル、拡張可能なマイクロバイオームデータサイエンス。
PeerJ. 2018; (Preprint at)View in ArticleDADA2：イルミナアンプリコンデータからの高分解能サンプル推定。
Nat. Methods. 2016;13:581-583https://doi.org/10.1038/nmeth.3869View論文中RESCRIPt：再現可能な配列分類学参照データベース管理。
PLoS Comput. 論文中マイクロバイオームの組成分析：微生物組成研究のための新しい方法。
Microb. Ecol. Health Dis. 2015;26:27663https://doi.org/10.3402/mehd.v26.27663View記事内多様な微生物群集の分類学的、機能的、株レベルのプロファイリングをbioBakery 3で統合。
eLife. 2021;10e65088https://doi.org/10.7554/eLife.65088Viewin Articleメタゲノムからの微生物株レベルの集団構造と遺伝的多様性。
Genome Res.2017;27:626-638https://doi.org/10.1101/gr.216242.116Viewin ArticleJalviewバージョン2-多重配列アライメントエディターおよび解析ワークベンチ。
Bioinformatics. 2009;25: 1189-1191論文で 見るFastTree 2-approximately maximum-likelihood trees for large alignments.
PLoS One. 2010;5e9490https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009490Viewin ArticleFigTree v1.
http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/Date: 2012
記事で見るBBMap：高速、高精度、スプライスを意識したアライナー。
Lawrence Berkeley National Lab. [LBNL],2014https://www.osti.gov/biblio/1241166View論文で 見るScholarUnicycler: 短いシーケンスリードと長いシーケンスリードから細菌ゲノムアセンブリを解決する。
PLoS Comput. Biol.2017;13e1005595https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1005595View論文中BLASTよりも桁違いに速い検索とクラスタリング。
Bioinformatics. 2010;26:2460-2461https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btq461View論文中JSpeciesWS：原核生物種のペアワイズゲノム比較に基づく種推定用ウェブサーバー。
Bioinformatics. 2016;32:929-931https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv681Viewin ArticleOrthoANI：平均ヌクレオチド同一性を計算するための改良されたアルゴリズムとソフトウェア。
Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2016;66:1100-1103https://doi.org/10.1099/ijsem.0.000760View論文中肝細胞癌の診断、病期分類、および管理：米国肝臓病学会による2018年診療ガイダンス。
Hepatology. 2018;68:723-750https://doi.org/10.1002/hep.29913View論文中固形がんにおける新しい奏効評価基準：RECISTガイドライン改訂版（バージョン1.1）。
Eur. J. Cancer. 2009;45: 228-247記事で 見る一般的な16SリボソームRNA遺伝子PCRプライマーの古典的および次世代シーケンサーに基づく多様性研究のための評価。
Nucleic Acids Res.2013;41:e1https://doi.org/10.1093/nar/gks808Viewin Articleggplot2： データ分析のためのエレガントなグラフィックス。
Springer, 2016記事で 見る
ボルジャー A.M.
ローゼ M.
ウサデル B.
Trimmomatic: イルミナ配列データ用の柔軟なトリマー。
Bioinformatics. 2014;30:2114-2120https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170View論文中
論文情報
出版履歴
出版 2024年7月25日
受理 受理：2024年6月10日
改訂版受理 2024年4月30日
受理：2024年4月30日 受理：2023年10月17日
出版段階
インプレス、修正校正
識別
DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.06.010
著作権
© 2024 Elsevier Inc. テキストマイニング、データマイニング、AIトレーニング、および類似の技術を含むすべての権利を留保します。
サイエンスダイレクト
図表
図1FMTの臨床効果
図1ニボルマブ抵抗性の進行固形がん患者におけるFMTとニボルマブの併用による臨床効果
図2レシピエント#7における縦断的腫瘍縮小と免疫関連変化の解析
図3レシピエント#7におけるFMT後の臨床転帰に影響を及ぼす主要細菌の発見
図4P. merdaeImmunoactisの投与は免疫細胞活性を増強することにより腫瘍増殖を抑制する
表
関連記事
研究ジャーナル
トレンドレビュージャーナル
パートナージャーナル
著者
査読者
ニュース＆イベント
マルチメディア
セルプレスについて
コンタクト
採用情報
アクセス
コレクション
インフォメーション
本サイトのコンテンツは、あらゆる分野の医療従事者および研究者を対象としています。
当サイトでは、サービスの提供・向上やコンテンツのカスタマイズのためにクッキーを使用しています。クッキーの設定を更新するには、このサイトのクッキーをご覧ください。
このサイト上のすべてのコンテンツ： Copyright © 2024 Elsevier Inc.、そのライセンサー、および寄稿者。
テキストマイニング、データマイニング、AIトレーニング、および同様の技術に関するものも含め、すべての権利はエルゼビア社に帰属します。
すべてのオープンアクセスコンテンツには、クリエイティブ・コモンズのライセンス条件が適用されます。
この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？