腸におけるミトコンドリア摂動は微生物叢に依存した傷害を引き起こし、炎症性疾患を識別する遺伝子シグネチャーを示す
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腸におけるミトコンドリア摂動は微生物叢に依存した傷害を引き起こし、炎症性疾患を識別する遺伝子シグネチャーを示す
https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00231-2
オープンアクセス掲載:2024年7月15日DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.06.013
ハイライト
-腸管上皮のミトコンドリア障害は組織傷害を引き起こす
-IL-10とAhRに関連した宿主機構の喪失が傷害と炎症を加速する
-ミトコンドリア機能不全はバクテロイデス属菌の増殖とディスバイオシスを誘導する
-代謝傷害遺伝子シグネチャーは炎症性IBDサンプルと非炎症性IBDサンプルを識別する
まとめ
ミトコンドリア機能障害は炎症性腸疾患（IBD）と関連している。微生物-代謝回路が腸傷害にどのように寄与するかを理解するために、ミトコンドリアのシャペロンである熱ショックタンパク質60（Hsp60Δ/ΔIEC）を欠損させることにより、上皮のミトコンドリア機能を破壊した。この代謝擾乱は、自己修復性の組織傷害を引き起こす。腸のホメオスタシスに関与するアリール炭化水素受容体（Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-）や炎症制御因子のインターロイキン（IL）-10（Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-）がない場合には再生が阻害され、IBD様の病態を引き起こす。無菌（GF）Hsp60Δ/ΔIECマウスの遠位結腸では傷害が認められず、代謝傷害を細菌が制御していることが明らかになった。GFHsp60Δ/ΔIECマウスに合成群集OMM12をコロニー形成させると、代謝的に柔軟なバクテロイデスの増殖が認められ、B. caecimurisの単コロニー化が傷害を再現した。代謝障害上皮の転写プロファイリングにより、酸化ストレスに関与する遺伝子シグネチャー（Ido1、Nos2、Duox2）が明らかになった。これらのシグネチャーはクローン病患者のサンプルでも観察され、炎症の活発なものと不活発なものを区別している。このように、上皮のミトコンドリア擾乱は、IBDに関連する識別可能な炎症遺伝子プロファイルを持つ微生物叢依存性の傷害を引き起こす。
グラフィカル抄録
キーワード
はじめに
腸管上皮は粘膜界面において多様で複雑な微生物環境に曝されている。上皮バリアーの破綻は炎症性病態と関連している。
上皮バリアの破綻は炎症性病態と関連しており、治癒のためには上皮の再生バランスを微調整する必要がある。特に、炎症粘膜の高エネルギー需要には、宿主とマイクロバイオーム間の代謝回路の中心的調整役としてミトコンドリアが必要であり、「エネルギー欠乏」仮説に新たな側面を加えている。
ミトコンドリアは、酸化的リン酸化（OXPHOS）を含む腸管上皮細胞（IEC）の代謝を制御し、IECの運命や性質に影響を与える。
この恒常性制御の要となるのが、ミトコンドリアマトリックスにおけるタンパク質の凝集やミスフォールディングの際に引き起こされる、保存されたシグナル伝達経路であるミトコンドリア未完了タンパク質応答（MT-UPR）である4。
この自己調節機構の重要な分子は、MTの熱ショックタンパク質60（Hsp60）であり、輸入されたタンパク質やミスフォールディングしたタンパク質のリフォールディングを制御するシャペロンである。
MT-UPRシグナル伝達が活性化され、それに伴ってHsp60の発現が増加すると、上皮の自己再生を制御することにより、急性ストレス時の恒常性の回復を目指す、
その持続的な活性化は疾患発症に関連している。
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微生物-宿主相互作用は腸のホメオスタシスに必要であり、その破綻は疾患の発症や進行に関与している、
炎症性腸疾患（IBD）を含む、
移植片対宿主病
および2型糖尿病を含む。
同定された240以上のIBD遺伝的リスク遺伝子座のうち、MT機能に関連する遺伝子はIBDへの関与を示唆している。
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これに関連して、我々は以前に、マウス小腸におけるHsp60の条件付き欠失がMT障害を引き起こし、幹細胞性の喪失と上皮傷害につながることを示した。
さらに、活性化されたMT-UPRシグナルが、IBD患者の炎症と関連していることも明らかにした14。
MTタンパク質であるprohibitin 1の欠損は、マウスのパネス細胞におけるMT障害とそれに続く回腸炎を誘発する、
腸管幹細胞（ISC）ニッチにおけるMT機能障害は、クローン病（CD）患者の疾患再発を予測する。
IBDにおけるマイクロバイオームの関与が広く研究されているにもかかわらず、MTの機能障害と微生物組成との関連に関するデータは乏しい。興味深い新しい概念は、IECの代謝的再プログラミングが微生物のディスバイオシスに寄与することを示唆している、
は、マイクロバイオームと宿主の双方向のクロストークを強調している。私たちは、ミトコンドリアが食事や微生物の代謝産物の感知に関与することで、上皮が腸管内腔環境に機能的に適応できるようになると仮説を立てている。Toll様受容体などの細胞受容体
やアリール炭化水素受容体（AhR）のような細胞性受容体がある、
などの細胞受容体がIECの恒常性とMT代謝の制御に関与しているが、MTシグナル統合の分子機構はまだ解明されていない。われわれは、腸管界面におけるMTの機能不全と微生物-代謝回路の破綻が、腸内細菌叢の形成異常と慢性腸炎に関与していると推測している。
上皮再生障害の仮説として、微生物-宿主のクロストークと代謝障害への寄与を調べるため、マウスIECにおいてHsp60を特異的に欠損させることでMT機能障害を誘導した。MTの機能障害は、AhRやインターロイキン（IL）-10の非存在下で、代謝傷害（組織傷害の細胞自律的メカニズム）を引き起こし、微生物叢依存性のIBD様大腸病態を加速させることを示した。驚くべきことに、MTの摂動は、代謝的に柔軟なバクテロイデス・カエシムリス（Bacteroides caecimuris）の生物学的適応不全を引き起こし、時間的・空間的に制御された組織傷害を引き起こす。最後に、CD患者のコホートにおける組織炎症を識別する、代謝傷害のマウス遺伝子シグネチャーを同定した。結論として、これらのデータは、ミトコンドリアが細胞の代謝と機能を制御する要であり、微生物-代謝回路の喪失が腸組織のホメオスタシスを破壊し、IBD様病態を加速することを示している。
研究結果
MT機能障害はIL-10関連IBD病態を加速する
MT機能は幹細胞のホメオスタシスを制御しており、腸管上皮における代謝回路の崩壊は、再発性炎症の発症における新たなメカニズムである。
IECにおけるMT機能障害の機能的帰結を明らかにするため、特定病原体フリー（SPF）条件下で飼育したマウスでHsp60（Hsp60Δ/ΔIEC）を欠失させ、一過性の体重減少を引き起こした（図1Aおよび1B）。遺伝子発現解析により、一過性のHsp60欠失（図S1A）と、結腸におけるマーカー遺伝子Tribbles pseudokinase 3（Trb3）を介して測定されたMT-UPRシグナル伝達の活性化（図S1B）が確認された。
図1代謝傷害がIL-10関連IBD病態を加速する
興味深いことに、大腸の病理組織学的評価では、Hsp60の消失後、上皮構造が時間依存的に再構築され（0日目に最大）、8日目には異常陰窩が出現することが明らかになった（図1Cおよび1D；図S1C）。この代謝傷害の表現型に続いて、再生反応とHsp60陽性陰窩の回復が起こり（図1E；図S1D）、Hsp60Δ/ΔIEC動物では14日目に組織の修復と治癒に至った（図1Cおよび1D；図S1C）。腸オルガノイドにおけるex vivoHsp60欠失はまた、MT-UPRシグナル（Trb3）の活性化、幹細胞性（Lgr5）の減少、およびATP産生の減少をもたらし（図S1E～S1I）、細胞レベルでの上皮恒常性に対するHsp60喪失の影響を確認した。
分子レベルでは、Hsp60欠損結腸細胞のマイクロアレイ解析により、制御因子である活性化転写因子5（Atf5）を含むMT-UPR誘導が確認され、MT機能不全が代謝リプログラミング（OXPHOSの減少、解糖の増加）と関連していることが強調された（図S1J）。驚くべきことに、腸上皮におけるAtf5の誘導性過剰発現（Atf5IEC；図S1K）は、MT-UPRシグナル（Trb3）の誘導を確認したが、Atf5IECトランスジェニックマウスは大腸組織傷害を発症しなかったことから（図S1L-S1Q）、ミトコンドリアのストレス応答ではなく、機能障害が組織傷害の原因であることが示唆された。
代謝障害による大腸の形態学的変化をよりよく理解するために、上皮バリアの主要な特徴を明らかにした。再生能力に関しては、Hsp60陽性細胞で構成される非常に増殖性の高い陰窩小節（Ki67陽性およびブロモデオキシウリジン［BrdU］陽性の陰窩；図S2A-S2D）が観察された（図1F）。後者はHsp60欠失を免れた幹細胞に由来すると推定される
上皮の再増殖に貢献した。これと並行して、Hsp60と増殖マーカーKi67（図1F）ともに陰性の低栄養性休止陰窩がわずかに観察された。表面上皮と陰窩小節にタイトジャンクションタンパク質Zonula occludens-1 (ZO-1)とオクルジンが正しく局在していることからわかるように、代謝傷害の間にもバリアの完全性が維持されていたことは注目に値する（図S2E）。Tjp1とOclnの発現レベルは、14日目の治癒中にさえ上昇した（図S2FとS2G）。さらに、炎症マーカー遺伝子Serum amyloid A 3(Saa3)とTumor necrosis factor(Tnf)の転写レベルの中程度の上昇にもかかわらず、この組織再編成は上皮細胞のアポトーシスを伴わなかった（図S2H）（図S2IとS2J）。
IBD関連の炎症および病態の発症における上皮のMT障害および代謝傷害の寄与をより明確にするために、Hsp60Δ/ΔIECマウスとIL-10欠損マウス（Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-; 図1G）を交配させた。Hsp60/ΔIEC;Il10+/+マウスとは対照的に、Hsp60/ΔIEC;Il10-/-マウスは体重減少から回復しなかった（図1H）。注目すべきことに、IL-10の欠乏は、遺伝学的に誘導されたTrb3の活性化にそれ以上の影響を与えなかった（図1I）。最も注目すべきは、14日目に、Hsp60Δ/ΔIEC;IL10-/-マウスは遠位結腸の上皮再構築が破綻していることである（図1J）。これは組織病理学的指標の上昇（図1K）と陰窩の伸長（図1L）によって裏付けられ、IL-10非存在下で代謝傷害に対する再生反応が破綻していることを示している。注目すべきことに、Hsp60の回復は組織再生とは無関係であった（図1M）。組織傷害と、崩壊したタイトジャンクション複合体（図S2E）によって示されるバリア完全性の障害に伴い、Tnfの遺伝子発現と血清アミロイドA（SAA）の血清タンパク質レベルが上昇した（図1Nと1O）。Hsp60fl/fl;Il10-/-コントロールマウスは、このような早い時点では大腸炎を発症しなかったことから、これらのデータは、代謝傷害がIBD感受性宿主における慢性炎症の発症または再発を促進し、その後、上皮再生が障害されることを示すさらなる証拠となる。
代謝傷害は腸内細菌叢の生物学的変化を促進する
微生物異常はIBD発症の礎石であるため、代謝傷害の経過における腸内細菌叢を解析した。大腸内容物の16S rRNAアンプリコンシークエンシングにより、代謝傷害は、種の豊富さの低下（図2A）、および群集プロフィール（β多様性）の変化（図2B）を含む、微生物叢組成の急速だが一過性の変化と関連していることが明らかになった。有意に豊富な分類群を解析したところ、バクテロイデス属を含む6つの属が有意に変化していた（図2C）。興味深いことに、バクテロイデス属は全体的な相対存在量が最も高く、代謝障害時に一過性に増加したことから、IECの代謝障害に対する微生物叢の迅速な適応が示された。シャローショットガンメタゲノミクスにより、B. caecimuris、B. uniformis、Phocaeicola vulgatusの存在が正確に明らかになった（図2D）。粘液バリアーの障害はIBD発症の特徴であり、Hsp60Δ/ΔIECマウスでは4日目以降、粘液で満たされた杯細胞（GC）の数が強く減少していた（図S3AおよびS3B）。
図2代謝傷害による腸内細菌叢の変化
このような微生物叢の変化はHsp60Δ/ΔIECマウスでは一過性であったが、種の豊富さとβ多様性の変化は8日目により顕著になり（図S3C-S3E）、Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスでは14日目も続いた（図2Eおよび2F）。驚くべきことに、バクテロイデス属の相対存在量の増加はHsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスでも持続しており（図2G）、管腔環境の持続的な変化がこれらの細菌の選択的な拡大に有利であることを示唆している。再生反応の破綻と一致して、Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスはGC数の持続的な減少を示した（図2Hおよび2I）。
AhRシグナル伝達は代謝傷害を制御する重要な経路である
宿主センサーであるAhRは、腸のホメオスタシスにおける主要な調節因子である。AhRの活性化は、様々な研究で腸の炎症に対して保護的であることが証明されている
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その欠乏はIBDの発症に関与している。
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さらに、AhRはISCニッチを障害から維持することにも関与している。
最近、MTの機能を調節することが示されている。
このような背景から、我々は、傷害および再生過程の調節におけるAhRの関与を調べることを目的とした。そこで、全身AhRノックアウトマウス（AhR-/-）とHsp60Δ/ΔIECマウス（Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-、 図3A）を交配した。SPF飼育したHsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスは、重度の体重減少（図3B）を示し、0日目から2日目の間に流産基準に達する生存率の低下を示した（図S4A）。0日目の病理組織学的評価では、Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスの回腸で上皮構造が著しく喪失しており（図S4BおよびS4C）、AhRシグナル非存在下で死に至る組織病理が劇的に加速したことが示された。
図3代謝傷害時のAhR欠損は致死的であり、抗生物質によるバクテロイデス属菌の駆除は生存を救う。
AhRの保護的役割をさらに解明するために、AhRの主要な下流シグナル伝達経路であるIL-22の関与に取り組んだ。IL-22は代謝傷害時に大腸組織で増加したため（図S4D）、全身IL-22受容体サブユニット-α1ノックアウトマウス（Il22ra1-/-）をHsp60Δ/ΔIECマウス（Hsp60Δ/ΔIEC;Il22ra1-/-）と交配させた（図S4E）。興味深いことに、IL-22受容体の欠如は、代謝傷害中の体重の発達に影響を及ぼさなかった（図S4F）。これと一致して、組織学的評価はIL-22ra1の有無にかかわらず上皮異常に差がないことを示し（図S4G-S4I）、このサイトカイン経路が代謝傷害および再生の調節に関与していないことを示している。
興味深いことに、抗生物質への曝露はHsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスの致死的表現型を初期段階で消失させたが（図3Aおよび3B；図S4A）、組織傷害は対照同腹子と異なり、8日目および14日目でも維持された（図3Cおよび3D）。Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスでは、種の豊富さが水コントロールと比較して強く減少し（下痢による可能性が高い）、予想通り、抗生物質の投与により、全群で低い群集の豊富さが維持された（図3E）。驚くべきことに、Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスおよびHsp60Δ/ΔIEC;AhR+/+マウス（水群）で観察されたバクテロイデス属菌の絶対量（図3F）および相対量（図3G）の持続的増加は、抗生物質投与動物では完全に消失した（図3Fおよび3G）。これらのデータは、バクテロイデス属が腸傷害の発症と重症化に寄与しているという仮説を明確に支持している。さらに、468人のIBD患者から採取した糞便サンプルの細菌プロファイリングも行った
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は、健常対照群と比較して、腸の炎症に関連するバクテロイデス属細菌の相対量が増加していることを示し（図3Hおよび3I）、IBDにおけるこれらの細菌の重要性を裏付けている。
代謝傷害の細菌制御
代謝傷害の際に生じるディスバイオーシスと抗生物質の顕著な減弱効果を考慮し、我々はさらに無菌（GF）Hsp60Δ/ΔIECマウスを作製することで、代謝傷害における細菌の原因的役割を評価した（図4A）。SPF飼育と比較すると、GFHsp60Δ/ΔIECマウスの体重減少は軽度であったが（図4B）、MT-UPRシグナル伝達（Trb3）が活性化され（図4C）、細菌が存在する場合のこれまでの結果と比較して、細菌非存在下での陰窩上皮におけるHsp60の回復は同程度であった（図4Dおよび4E；図S5A）。これは、Atf5IECマウスにおけるMT-UPRシグナルの誘導だけでは組織傷害には至らなかったという我々の所見と一致している。病理組織学的評価とTnfおよびSaa3遺伝子発現の解析により、中・遠位結腸では代謝傷害および炎症がないことが確認され（図4F-4H；図S5BおよびS5C）、細菌が代謝傷害の制御に関与しているという仮説を支持した。近位結腸と回腸では、上皮構造の異常はほとんど見られなかったことから（図4Gと4H；図S5D-S5F）、細菌に依存しないメカニズムがこれらの組織セグメントの傷害表現型を駆動していることが示唆された。GF条件下では組織の病理学的変化は認められなかったが、上皮のKi67およびBrdU染色は、対照動物と比較してHsp60Δ/ΔIECマウスで大腸増殖の増加を示した（図S5G-S5J）；しかしながら、SPF飼育マウスよりも程度は低かった（図S2A-S2D）。Hsp60Δ/ΔIECマウスの粘液バリアの解析では、以前にSPF飼育下で見られたのとは異なり、コントロール同腹子と比較してGC数の軽度な減少しか示さなかった（図S5KおよびS5L）。上皮の接合複合体はタンパク質レベルでも転写レベルでも変化せず（図S5M-S5O）、細菌非存在下でも代謝傷害時に腸管バリアが維持されることを示している。
図4細菌による代謝傷害の制御
Hsp60欠損マウスと同様に、炎症性疾患感受性が亢進しているにもかかわらず、GF Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスでは重度の体重減少は認められなかった（図4Iおよび4J）。重要なことに、病理組織学的評価では、GFHsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスの遠位結腸に組織傷害（図4K-4M）および炎症（図4Nおよび4O）がないことが確認され、代謝傷害および慢性炎症表現型の制御における細菌の極めて重要な役割が支持された。
代謝的に柔軟なB. caecimurisは大腸傷害を誘導する
遠位結腸の傷害制御における細菌の重要性を考慮し、次に合成最小細菌群集Oligo-Mouse-Microbiota 12（OMM12）を用いた。
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GF Hsp60Δ/ΔIECマウスにOMM12をコロニー形成させたところ（図5A）、Hsp60の消失（図5B；図S6A）およびMT-UPR活性化（Trb3）（図5C）には影響がなかった。重要なことに、病理組織学的解析では、Hsp60陽性の過増殖陰窩だけでなく、Hsp60陰性の低栄養陰窩の存在を含む、遠位結腸の代謝障害が示された（図5D；図S6A）。上皮異常、組織病理、陰窩の深さが上昇し（図5Eおよび5F；図S6B）、遠位結腸の代謝傷害を誘発するには単純化された細菌群集で十分であるという概念実証が得られた。16S rRNA標的qPCRを用いて全12株の細菌量を定量したところ、B. caecimurisは4日目以降に増加しており（図5G）、マウスおよび患者の複雑な腸内細菌群集におけるこれまでのデータを裏付けている。
図5Bacteroidescaecimurisによる代謝傷害の誘発
代謝傷害の発症に対する異なる細菌の寄与をさらに明らかにするために、GF Hsp60Δ/ΔIECマウスをB. caecimurisで単コロニー化し（図5A）、Hsp60欠失によりMT-UPR活性化を誘導した（図S6CおよびS6D）。驚くべきことに、B. caecimuris単独で遠位結腸の代謝傷害を誘導するのに十分であり、異常増殖した陰窩（図5Hおよび5I；図S6E-S6H）と組織の炎症（図5J）の存在によって明らかになった。
OMM12誘発代謝傷害の間、Akkermansia muciniphilaの存在量がわずかに上昇したため（図S7A）、B. caecimurisと A. muciniphilaの二重コロニー形成を行った（図5A）。興味深いことに、A. muciniphilaの存在はB. caecimurisの存在量を減少させ（図5K）、代謝傷害の誘導を完全に阻止した（図5H-5J）。注目すべきことに、B. caecimurisと A. muciniphilaの細菌量は、両遺伝子型において同程度であった（図5K；図S7B）。
リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）によるGFHsp60Δ/ΔIECマウスの単コロニー化（図5A）は、その存在量がOMM12誘導代謝傷害（図S7A）中に変化しなかったが、遺伝子型間でL. reuteriの存在量レベルが再び同程度であった（図S7C）。重要なことは、L. reuteriは遠位結腸の組織傷害を誘導しなかったことである（図5H-5J）。
最後に、単独飼育マウスと二重飼育マウス（それぞれB. caecimurisまたはB. caecimurisと A. muciniphila）の大腸内容物サンプルのメタプロテオミクス解析を通して、代謝傷害時のB. caecimurisのプロテオーム適応を調べた。Hsp60fl/flマウスと比較して、単コロニー化Hsp60Δ/ΔIECマウスでは60の異なるタンパク質群（16が発現上昇、44が発現低下）が同定された（図5L；図S6I）。興味深いことに、A. muciniphilaによる二重コロニー化では、傷害の抑制と相関して、B. caecimurisのプロテオーム変化が抑制された（図5M）。加えて、COGs（cluster of orthologous groups）カテゴリーにマッピングされた発現量の異なるタンパク質群のアノテーションは、細菌の代謝に関連しており（図5N；表S1）、B. caecimurisがMTの擾乱と組織傷害に応答して代謝的に適応する能力を強調していた。
上皮におけるMT機能障害は、IBDにおける炎症状態を識別する転写シグネチャーを規定する。
代謝傷害時の分子変化を評価するため、SPFマウスとGFHsp60Δ/ΔIECマウスの大腸組織を用いて、代謝過程と免疫代謝に関与する約800遺伝子を標的としたRNA NanoString解析を行った。0日目には、45の遺伝子がSPF条件下で±2倍以上の変化を示し、そのうち10はミトコンドリア関連であった（図6A）。細胞の変化を反映するパターンは8日目にも存在したが（溶質キャリアファミリーやアポリポタンパク質の遺伝子を含む）、特に酸化ストレスや免疫・抗菌反応に関与する遺伝子のアップレギュレーションが顕著で、Dual oxidase 2(Duox2)、Inducible T-cell costimulator(Icos)、Toll-like receptor 4(Tlr4)、Nitric oxide synthase 2(Nos2)などがその例であった。一方、GF条件下で0日目に±2倍以上の変化を示した遺伝子はわずか10個であり（図6B）、細胞代謝の変化が細菌のシグナルに依存していることを示している。SPF条件下で制御された45遺伝子のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイ解析により、最も濃縮されたパスウェイとしてトリプトファン代謝が同定された（図S8A）。
図6IBDの炎症状態を識別する転写シグネチャーを規定する上皮のミトコンドリア機能障害
インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（Ido1）は、宿主関連トリプトファン分解キヌレニン経路に関与する重要な酵素であり、SPF条件下では0日目と8日目に発現が上昇している。免疫蛍光分析により、SPF飼育したHsp60Δ/ΔIECマウスの陰窩では代謝傷害時にIdo1の発現が一過性に増加し、Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスでは発現が持続することが確認された（図S8B、上下のパネル）。逆に、Ido1の発現はGF条件下では全く見られず（図S8B、中段）、宿主のトリプトファン代謝を再配線する微生物シグナルの重要性が浮き彫りになった。組織傷害におけるIdo1の寄与をより明確にするため、全身Ido1ノックアウトマウス（Ido1-/-）とHsp60Δ/ΔIECマウス（Hsp60Δ/ΔIEC;Ido1-/-）を交配させた（図S8C）。驚くべきことに、Hsp60Δ/ΔIEC;Ido1-/-マウスは、Hsp60Δ/ΔIEC;Ido1+/-同腹体と比較して、体重減少（図S8D）、組織傷害（図S8EおよびS8F）、または炎症（図S8G〜S8I）に差を示さなかった。さらに、Ido1は炎症性サイトカイン（TnfおよびIfnγ）に応答して腸オルガノイドで誘導されたが、リポ多糖（LPS）や糞便水などの管腔因子には応答しなかった（図S8JおよびS8K）。これらのデータを総合すると、Ido1が代謝傷害の発症に因果的に関与していないことは明らかであり、Ido1は代謝傷害に対する宿主免疫応答の結果として制御されていることが示唆される。
代謝傷害に対する細胞応答をより明確にするため、次に、8日目のHsp60Δ/ΔIECおよびHsp60fl/flマウスの大腸組織からIECに濃縮したサンプルについて、シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）を適用した。主要なIECサブタイプを含む16の異なる細胞クラスターを同定した（図S9A）。最も豊富な細胞集団（クラスター1、図S9A）は、8日目のHsp60Δ/ΔIECマウスでかなり拡大し（図S9B）、高増殖細胞に相当した（表S2）。腸細胞（クラスター4および6）、腸内分泌細胞（EEC、クラスター15）、房細胞（クラスター12）など、特殊な機能を持つ分化細胞の追加クラスターは、Hsp60Δ/ΔIECマウスで減少した（図S9B）。より小さなクラスター、特に上皮再生をサポートする間質の特徴を持つ細胞集団
(クラスター16）と抗菌応答（クラスター5、7、11）を持つ細胞集団が、代謝傷害を受けたIECで拡大した（図S9B；表S2）。興味深いことに、主にクラスター5、7、11において、Ido1、Nos2、Duox2など、NanoString解析ですでにHsp60Δ/ΔIECマウスで増加が同定されていた遺伝子の発現上昇が観察された（図6C）。これと一致して、Hsp60Δ/ΔIECマウスのscRNA-seq集団の擬似バルク解析では、対照と比較してMT-UPRマーカー遺伝子Trb3の発現増加とIdo1、Nos2、Duox2のレベル上昇（図6D）が確認され、代謝傷害に関連するマウス転写遺伝子シグネチャーの発生が強調された。
代謝傷害に反応する転写適応の一貫性を考慮し、CD患者におけるこの代謝遺伝子シグネチャーのヒトでの関連性を検討した（図6E）。外科的治療を受けたCD患者343人（合計204人）の切除組織標本から得られたトランスクリプトームデータを用いた、
代謝遺伝子シグネチャーに基づいて、疾患の活動状態と非活動状態を区別することを目指した。32のマウス遺伝子（8日目SPF、図6A）の発現パターンを、外科的に切除された炎症性回腸組織サンプル（M0I）と非炎症組織辺縁部（M0M、対照サンプルとして使用）における対応するヒトオルソログにマッピングした（図6F）。139検体がペア（同一患者からのM0IとM0M）であり、57人がM0Iにのみ、8人がM0Mにのみ出現した。32遺伝子のうち24遺伝子は、マウスとそれぞれのヒト組織切片の間で類似した発現パターンを示した（図6F、黒く太字で強調表示）。より正確には、Hsp60Δ/ΔIECマウスで発現が上昇した14の遺伝子（図6Fで黄色で強調表示）も、M0Mに対してM0Iで高い発現レベルを示した（図6F）。同様に、Hsp60Δ/ΔIECマウスで発現低下していた10遺伝子（図6Fで青く強調表示）は、炎症を起こしたヒト組織で一致して発現レベルが低かった（図6F）。対照的に、8つの遺伝子はマウスとヒト組織の間で反対の発現パターンを示した（図6F、灰色）。一致した24遺伝子と不一致の8遺伝子の相互情報量（関連性のノンパラメトリック尺度）は0.13（p値0.005、10.000モンテカルロ順列に基づく）であり、代謝傷害シグネチャーの有意に多くの遺伝子が、CDコホートにおいてその相対的発現パターンが保たれていたことを示している。さらに、32個のシグネチャー遺伝子のうち26個がM0MとM0Iの間で有意差を示し（図6G）、IBD発症における代謝傷害シグネチャーの関連性がさらに強調された。これらのデータを総合すると、IECにおけるMT障害が、IBDに適用可能な転写反応シグネチャーを転写し、IBD患者の炎症粘膜と非炎症粘膜を識別できるという証拠が得られた。
考察
ミトコンドリアは細胞の代謝と機能を制御する要である。
我々は以前、小腸上皮のHsp60を条件付きで欠失させると、幹細胞の消失と陰窩の吸収が始まることを証明し、ミトコンドリアの擾乱が組織傷害に寄与することを実証した13。
本研究では、微生物-代謝回路が大腸組織傷害の根本原因であることを明らかにし、炎症再発のメカニズムを示唆した。注目すべきは、再生組織の再構築にもかかわらず、代謝的に疲弊したIECsがバリアの完全性を維持していることである。このような背景から、代謝性傷害の際に増殖が亢進するIECの集団が同定され、おそらく上皮を再増殖しているものと思われる。興味深いことに、このクラスター（Kcnq1+; Kcne3+; Cftr+）は、IBDに関与することが示されているクロライドチャネルやカリウムチャネルをコードする遺伝子に富んでいる。
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創傷関連細胞の特徴を示す別の小さな細胞群もまた、上皮の修復に寄与している。
,
それとは逆に、IBD様炎症の易感染性モデルでは、代謝傷害の解消が阻害され、上皮の再生が阻害され、組織病理が加速される。GCの消失と粘液産生、そして持続的な微生物異常は、MTの擾乱が慢性炎症の病因に寄与しているという仮説を支持している。IBDは、創傷と不完全治癒の繰り返しが特徴であり、ISCニッチとMT代謝の柔軟な調節が組織再生に不可欠である。
これと同様に、CD患者の術後再発リスクは、ISCニッチにおけるMTの機能障害と関連している。
IBD関連マウスモデルおよび患者の上皮におけるHsp60の持続的発現に関連する持続的なMT-UPRシグナル伝達
は、慢性炎症におけるMT障害の役割の可能性を示唆している。ß酸化とそれに続くOXPHOSは、微生物叢由来の短鎖脂肪酸（SCFA）を用いた、細菌に暴露された結腸細胞の主要なエネルギー源である。
,
Hsp60欠損上皮の解糖およびATP産生低下への代謝リプログラミングに伴い、大腸MTのリモデリングとエネルギー産生の適応が、大腸炎後の粘膜治癒を維持することが報告されている。
AhRは腸管免疫とバリア機能に重要な役割を果たす環境センサーである。
大腸炎モデルマウスにおけるAhR活性化は、T細胞の制御プロファイルを促進することにより、保護効果を示すことが報告されている36。
,
およびIL-22シグナル伝達の制御プロファイルを促進することによる、大腸炎マウスモデルにおけるAhR活性化保護効果について述べている。
興味深いことに、IL-22の欠損は代謝傷害に影響を与えないことから、MTの擾乱と代謝傷害に応答するAhRの下流シグナルとしてのIL-22の役割は除外される。マウスIECにおけるAhRの欠損は、その分化能を低下させ、バリア機能の障害とCitrobacter rodentium感染時の致死率の上昇につながると報告されている。
AhRは宿主と腸内細菌環境からの多くのシグナルを統合するため、この化学受容体の腸管恒常性と疾患感受性への寄与は複雑なままである。最近の研究では、AhRがISCニッチの恒常性制御に寄与していることが示されている、
Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスの死亡表現型を裏付けている。それにもかかわらず、これらのマウスに抗生物質を投与すると、バクテロイデス属は根絶され、Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスは救済されることから、代謝傷害には異なる細菌分類群が不可欠であることが明らかになった。Atf5によるMT-UPR活性化、IL-22シグナル伝達、またはIdo1関連代謝の寄与をそれぞれ取り上げた、選択的トランスジェニックまたはノックアウトマウスモデルにおける我々の結果は、孤立した経路が必ずしも組織傷害の病因を制御しているわけではないことを示し、代謝傷害は代謝-微生物回路の複雑な相互作用から生じることを強調している。AhRシグナルの寄与を完全に解明することはできないが、我々は、AhRシグナルと細菌シグナルの複雑な相互作用が、代謝的に疲弊した上皮の再生幹細胞能力を制御していると推測している。MT機能を制御するAhR関連シグナル統合のメカニズムをより正確に解明するためには、さらなる研究が必要である。
Hsp60Δ/ΔIECおよびHsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスにおける代謝傷害は、GFマウスの遠位結腸では認められず、Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-マウスで抗生物質を投与すると、疾患の重症度が改善することから、炎症に伴う組織傷害および宿主によるそれらの統合における微生物-代謝回路の重要性が浮き彫りになった。Hsp60欠損下での組織傷害は、小腸や結腸近位部では細胞自律的なプロセスであり、微生物環境の影響がコンパートメント化されていることを示していることは注目に値する。これと同様に、IECにおけるHsp60欠損は、細菌の豊かさの喪失と微生物叢プロフィールの変化、特にバクテロイデス属の拡大を引き起こす。Hsp60Δ/ΔIECマウスではディスバイオーシスが組織傷害の発症に先行し、Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスでは持続することから、微生物-宿主相互作用の因果関係が示唆された。Hsp60Δ/ΔIECマウスをOMM12で選択的にコロニー化すると、傷害の表現型が再現され、B. caecimurisの絶対的な増殖が起こる。最後に、B. caecimurisの単独コロニー形成は代謝傷害を誘発し、MTの摂動に応答して上皮傷害を開始する常在細菌の原因的役割を実証した。これらのデータは、バクテロイデスを含むグラム陰性菌がIBDに豊富であることを報告した研究を裏付けるものである。
,
興味深いことに、A. muciniphilaは常在菌であり、B. caecimurisの存在下で代謝傷害を抑制する。A.ムチニフィラはムチンを分解してSCFAを産生し、粘液の厚さと宿主のエネルギー基質を調節する。
健康な対照群は有益なAkkermansiaspp.と関連している、
A.muciniphilaはIBD患者では減少すると報告されている。
A. muciniphilaによる二重コロニー形成は、組織傷害を抑制し、B. caecimurisの適応的代謝反応を減弱させる。
大腸上皮代謝の変化による内腔酸素の増加は、IBD患者の特徴的な特徴である。最近の研究では、MTの機能を高めることが、内腔の酸素漏出を減少させることにより、疾患に伴う腸内細菌叢の異常を緩和することが示されている。
このことは、Hsp60Δ/ΔIECおよびHsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-マウスにおける代謝傷害に伴う代謝異常の仮説的メカニズムを示唆している。嫌気性菌、特にバクテロイデス属は、好気性菌と同様に酸素暴露に適応し、H2O2を消去することが研究で示されている46。
我々の結果は、Duox2や誘導性一酸化窒素合成酵素（Nos2がコードするiNOS）のような酸化ストレスや抗菌反応に関与する酵素をコードする遺伝子の転写誘導と、結腸細胞の代謝、特にトリプトファン関連経路の変化を一貫して示している。従って、上皮コンパートメントにおける複雑な変化が、バクテロイデス種の増殖に有利な内腔環境条件を形成していると考えられる。実際、B. caecimurisは、OMM12コンソーシアムで示されたように、食餌や栄養源の変化に素早く適応する、
そしてバクテロイデス属は、複雑なネズミの腸内生態系において、亜株生態型へと進化する、
代謝の可塑性を示している。このことは、MTの摂動や傷害に対するB. caecimurisの代謝の柔軟性を強調するメタプロテオミクス解析と一致している。上皮のMT障害に反応したバクテロイデス属細菌の代謝適応と潜在的な菌株進化、および腸管ホメオスタシスへの機能的影響、組織傷害につながる結果をより明確にするためには、さらなる研究が必要であろう。
最後に、今回の知見の応用可能性にとって非常に重要なことであるが、我々は、外科的治療を受けるCD患者において、炎症組織と非炎症組織を識別できる代謝遺伝子シグネチャーをマウス粘膜で同定した。
この転写パターンは主に、Hsp60欠損後0日目にほとんどの遺伝子がすでに変化しているという事実によって概説される、IECにおける初期のMT障害に対する適応的応答を反映している。8日目における複雑な再生宿主応答は、代謝適応だけでなく、免疫応答や抗菌応答も統合している。我々の結果は、CD患者の活動性疾患とともに拡大し、LCN2、NOS2、DUOX2（LNDと命名）の高発現によって定義されるIEC集団を同定した最近発表されたscRNA-seqデータと一致している。
これらの知見を総合すると、IBD発症における上皮のMT機能不全の寄与が強く支持される。
マウスでは、代謝遺伝子シグネチャーは細菌の存在に依存しており、IBDの疾患感受性に微生物が寄与していることを裏付けている。同じ切除組織領域から得られたペアサンプルを用いることで、薬物曝露、病歴、疾患部位などの交絡因子を部分的に除外することができ、炎症の有無が強調された。上皮におけるHsp60の欠損は、マウスの回腸および大腸領域で同様の組織傷害表現型を引き起こすことから、このマウスシグネチャーが異なるIBDの形態に普遍的に関連することが示唆される。とはいえ、マウスとヒトで得られたデータは異なる組織領域から得られたものであることを考慮する必要がある。このシグネチャーが、小腸と大腸の疾患部位間でどの程度共有されているのか、また、IBDを代表するものなのか、より一般的には炎症を代表するものなのかについては、まだ解明されていない。
まとめると、細菌群集が上皮代謝の変化に適応し、腸内細菌叢の生物学的適応異常を作り出しているという証拠が得られた。上皮における代謝の変化が、どのようにして細菌群集の異なるメンバーの増殖を選択するのかについては、まだ解明されておらず、さらなる解析が必要である。ここでは、B. caecimurisの代謝柔軟性が代謝傷害と一致することを示したが、このような不利な微生物-代謝回路における細菌経路の明確な寄与はまだ明らかにされていない。MTの擾乱と細菌のシグナルは代謝傷害の発症に協力し、宿主由来の代謝遺伝子シグネチャーはIBD患者における炎症プロセスの活性化と不活性化を識別する。したがって、特定のMT経路あるいは微生物-宿主回路を標的とすることで、腸の再発性炎症病態における治療オプションが得られる可能性がある。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
抗Hsp60 (ヤギ; IF; 1:150) Enzo Cat#ADI-SPA-828-F; RRID:AB_11181901
抗 Hsp60（ウサギ；IHC；1:400） Cell Signaling Technology Cat#12165; RRID:AB_2636980
抗 Ido1 （ラット；1:200） Enzo Cat#ALX-804-901-0100
抗 Ki67（ウサギ；1:300） Cell Signaling Technology Cat#12202; RRID:AB_2620142
抗 ZO-1 （ウサギ、1:200） Invitrogen Cat#61-7300; RRID:AB_2533938
抗オクルディン（ラット；1:10） 古瀬博士より提供
該当なし
Alexa Fluor anti-goat 488 (donkey; 1:200) Life Technologies Cat#A-11055; RRID:AB_2534102
Alexa Fluor anti-rabbit 488 (donkey; 1:200) Life Technologies Cat#A32790; RRID:AB_2762833
アレクサ蛍光抗ラット 594（ロバ、1:200） Life Technologies Cat#A-21209; RRID:AB_2535795
アレクサ蛍光抗ウサギ 647（ロバ、1:200） Life Technologies Cat#A32795; RRID:AB_2762835
抗ウサギ HRP（ロバ、1:300） Dianova Cat#711-035-152; RRID:AB_10015282
細菌株
Akkermansia muciniphila(YL44) Stecher教授より提供
DSM#26127
Turicimonas muris(YL45) Stecher教授より提供
DSM#26109
Acutalibacter muris(KB18) Stecher教授より提供
DSM#26090
Bacteroides caecimuris(I48) Stecher教授より提供
DSM#26085
Blautia coccoides(YL58) Stecher教授より提供
DSM#26115
Enterocloster clostridioformis(YL32) Stecher教授より提供
DSM#26114
Clostridium innocuum(I46) Stecher教授より提供
DSM#26113
エンテロコッカス・フェカリス（KB1） Stecher教授より提供
DSM#32036
Flavonifractor plautii(YL31) Stecher教授より提供
DSM#26117
リモシラクトバチルス・ロイテリ（I49） Stecher教授より提供
DSM#32035
Muribaculum intestinale(YL27) Stecher教授より提供
DSM#28989
ビフィズス菌（YL2） Stecher教授提供
DSM#26074
生物学的サンプル
ヒト便サンプル（Biotherapyコホート） Allez教授（Hôpital Saint-Louis、パリ） 臨床試験番号：NCT02693340
ヒト便サンプル（有効コホート） Brandl et al.
Reitmeier et al.
臨床試験登録番号（DRKS-ID）： DRKS00009797
ヒト便サンプル（スペイン造血幹細胞移植コホート） Metwaly et al.
臨床試験番号：NCT00297193観察試験番号（Trim）： SAF2012-33560
ヒト便サンプル（ドイツUCコホート） Langhorst et al.
臨床試験番号：NCT02721823
重要な市販アッセイ
NucleoSpin® RNAII キット Macherey-Nagel REF： 740955.250
マウスSaa ELISAキット ICL Inc. Cat#E-90SAA
MultiTox-Fluor 細胞毒性アッセイ Promega Cat.#G9200
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay プロメガ社 Cat#G7570
死細胞除去キット Miltenyi Cat#130-090-101
BrdUIn Situ検出キット BD Pharmingen™ Cat#550803; RRID:AB_2868903
nCounter® 代謝経路パネル NanoString Technologies, Inc. Cat#XT-CSO-MMP1-12
寄託データ
Biotherapy cohorts 16S rRNAアンプリコンシーケンスデータセットのデマルチプレックスリード： PRJNA701749
生シングルセルRNAシーケンスデータ この研究 EMBL-EBI ArrayExpressリポジトリ E-MTAB-14206
質量分析プロテオミクス生データ PRIDEリポジトリ PXD052829
生データ ドイツUCコホート Langhorst et al.
EMBL-EBI BioStudiesデータベース： S-EPMC7599849
生データ スペイン造血幹細胞移植コホート Metwaly et al.
NCBIシーケンスリードアーカイブ PRJNA565903
生データ 有効コホート Brandl et al.
Reitmeier et al.
NCBI Sequece Read Archive： PRJNA701859
実験モデル 生物／系統
マウス Hsp60flox/floxxVillinCreERT2-Tg(SPF) Berger et al.
該当なし
マウス Hsp60flox/floxxVillinCreERT2-Tg(GF) 本研究 N/A
マウス Atf5flox/floxxVillinCreERT2-Tg 本試験 N/A
マウス Hsp60flox/floxxVillinCreERT2-Tgx Il10-/-（SPFおよびGF） 本試験 N/A
マウス Hsp60flox/floxxVillinCreERT2-Tgx AhR-/- この試験 N/A
マウス Hsp60flox/floxxVillinCreERT2-Tgx Il22ra1-/- この試験 N/A
マウス Hsp60flox/floxxVillinCreERT2-Tgx Ido1-/- この試験 N/A
オリゴヌクレオチド
HprtForward Sigma TCCTCCTCAGACCGCTTTT
HprtReverse シグマ CCTGGTTCATCGCTAATC
UPL プローブ #95 Roche N/A
Hsp60/Hspd1フォワードSigma TCTTCAGGTTGTGGCAGTCA
Hsp60/Hspd1Reverse シグマ CCCCTCTTCTCCAAACACTG
UPL プローブ #1 Roche N/A
TnfフォワードSigma TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC
TnfReverse シグマ GAGGCCATTTGGGAACTTCT
UPLプローブ#49 Roche N/A
Trb3Forward Sigma GTCGCTTTGTCTTCAGCAACT
Trb3逆進Sigma TCATCTGATCCAGTCATCACG
ロシュ N/A
Ido1Forward Merck ACACGAGGCTGGCAAAGA
Ido1Reverse Merck GACTGGGGAGCTGACTCTA
UPLプローブ#19 Roche N/A
Saa3Forward Merck ATGCTCGGGGAACTATGAT
Saa3逆順 Merck ACAGCCTCTCTGGCATCG
UPLプローブ#26 Roche N/A
At5 OEフォワードSigma AGCCATGGCATCCCTACTC
At5 OE逆進Sigma AAGTGGGCATCAAGGAAG
UPL プローブ #17 Roche N/A
Tjp1Forward Sigma AGGCAGCTCACGTAGTCTC
Tjp1逆進Sigma GGTTTTGTCTCATCATTTCTTCAG
UPL プローブ #12 Roche N/A
OclnForward Sigma CCTCTGGTGCCTGAAGTGG
Ocln逆進Sigma GCTGCCTGAAGTCATCCACA
UPLプローブ#6 Roche N/A
341F-ovh Reitmeier et al.
CCTACGGGGCWGCAG
785R-ovh Reitmeier et al.
ガクタックVGGGTATCTAATCC
オリゴマウス-微生物群 12 株特異的プライマー Brugiroux et al.
該当なし
ソフトウェアとアルゴリズム
GraphPad Prism (v.8.0) GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/; RRID:SCR_002798
Light Cycler® 480 ソフトウェア Roche Diagnostics N/A
ViewPoint Light ソフトウェア PreciPointhttps://precipoint.com/en/products/viewpoint-viewer-software
ImageJ (v1.54f) Schindelin et al.
http://imagej.org; rrid:scr_003070
IMNGS Lagkouvardos et al.
https://www.imngs.org/
Rhea Lagkouvardos et al.
https://github.com/Lagkouvardos/Rhea
EvolView Subramanianほか。
https://www.evolgenius.info/evolview/
nSolver Analysis Software NanoString Technologies, Inc.https://nanostring.com/products/ncounter-analysis-system/ncounter-analysis-solutions/; RRID:SCR_003420
EggNOG-mapper Cantalapiedra et al.
http://eggnog-mapper.embl.de/; RRID:SCR_021165
10x Genomics Cell Ranger ソフトウェア (v.3.1.0) 10x Genomicshttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest; RRID:SCR_017344
DAVID Functional Annotation Clustering or Chart Tool (v2023q4) Sherman et al.
Huang et al.
https://david.ncifcrf.gov/home.jsp; RID:SCR_001881
RStudio (v4.3.3) RStudiohttps://posit.co/products/opensource/rstudio/; RRID:SCR_000432
R package DIA-NN (v1.8.2 beta 27) Demichev et al.
https://github.com/vdemichev/diann-rpackage; RRID:SCR_022865
R パッケージ Seurat (v5.0.1) Butler et al.
https://satijalab.org/seurat/; rrid:scr_016341
R パッケージgprofiler2(v0.2.3) Kolberg et al.
https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost; rrid:scr_006809
R パッケージComplexHeatmap(v2.14.0) Gu
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ComplexHeatmap.html; rrid:scr_017270
R パッケージinfotheo(v1.2.0.1) N/Ahttps://cran.r-project.org/package=infotheo
R パッケージ LIMMA (v3.54.2) Ritchie et al.
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html; rrid:scr_010943
その他
研究に含まれるマウスモデル表S3 該当なし
リソースの有無
代表連絡先
さらなる情報およびリクエストは、リードコンタクトのProf. Dr. Dirk Haller(dirk.haller@tum.de)までお願いします。
資料の利用可能性
本研究で生成された全てのユニークなリソースは、材料移転契約に基づき、リードコンタクトから入手可能である。
データおよびコードの利用可能性
-Biotherapyコホートの16S rRNAアンプリコンシーケンスデータセットのdemultiplexedreadsはNCBI Sequence Read Archiveに寄託され、PRJNA701749のプロジェクト番号で一般公開されている。造血幹細胞移植コホートおよびイネーブルコホートの生データは、それぞれアクセッション番号PRJNA565903およびPRJNA701859でNCBI Sequence Read Archive[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra]に寄託されている。UCコホートのデータはEMBL-EBI BioStudiesデータベースにアクセッション番号S-EPMC7599849で寄託されている。データ解析に使用したソフトウェアは、フリーまたは市販のものである。ソースコードのデータは、対応する著者からリクエストに応じて入手可能である。アクセッション番号は主要リソース表に記載。
-細菌メタプロテオミクスの生の質量分析プロテオミクスデータは、PRIDEパートナーリポジトリ(https://www.ebi.ac.uk/pride/)を介してProteomeXchange Consortiumに寄託され、データセット識別子PXD052829で公開されている。アクセッション番号は主要リソース表に記載されている。
-マウス大腸組織のシングルセルRNAシーケンス生データは、EMBL-EBI ArrayExpressリポジトリ（https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress）に寄託され、公開日現在、アクセッション番号で公開されている。E-MTAB-14206 で公開されている。アクセッション番号は主要リソース表に記載されている。
-本論文はオリジナルコードを報告していない。使用したツールはすべて、それぞれのメソッドとキーリソースの表に引用されている。
-本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要請があれば主担当者から入手可能である。
実験モデルと研究参加者の詳細
ヒトコホート
3つのIBD患者コホートから得られた便サンプルの微生物プロファイリングが含まれる： フランスのBiotherapyコホート（N=147）および過去に発表された2つのスペインの造血幹細胞移植コホート（N=153）、
およびドイツのUCコホート（N=168）である。
イネーブルコホート
,
Freising（南ドイツ）で募集された、人生の様々な段階にある健康な非喫煙者を含むコホート（N=817）を比較の対象とした。生物学的治療コホートは、生物学的治療（CD患者：N=41、UC患者：N=39）を受けたIBD患者80人からなる縦断的コホートである： CD患者：Infliximab N=9、Vedolizumab N=5、Ustekinumab N=12、Adalimumab N=13、NA=2；UC患者： インフリキシマブN=11、ベドリズマブN=10、ゴリムマブN=9、アダリムマブN=2、NA=7）。性別は全例で、患者は民族や社会経済的地位に関係なく18歳以上であった。臨床的疾患モニタリングとサンプリングは3つの時点（治療後0週目、14週目、52週目）で行われた。この研究は、パリのサン・ルイ病院（Hôpital Saint-Louis）のMatthieu Allez教授によって実施された（ClinicalTrials.gov [NCT: 02693340]）。多施設共同前向き研究（ClinicalTrials.gov[NCT03458195]）から得られたヒト生検のトランスクリプトーム解析は、REMINDグループによって調整され、以前に発表されている。
マイクロアレイの生データはNCBIのGene Expression Omnibusで公開されており、GEOシリーズのアクセッション番号GSE186582からアクセスできる。すべての研究方法は病院の倫理委員会の承認を得ており、ヒト研究参加者を対象とした研究に関するすべての関連倫理規定に準拠している。すべての被験者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
倫理声明
すべての動物実験、およびマウス系統の維持と繁殖は、オーバーバイエルン州（Regierung von Oberbayern; AZ ROB-55.2-2532.Vet_02-14-217, AZ ROB-55.2-2532.Vet_02-20-58, AZ ROB-55.2-2532.Vet_02-18-37）の動物医療および使用委員会（Committee on Animal Health Care and Use）によって承認され、実験動物の世話と使用に関するEEC勧告（1986年11月24日の欧州共同体理事会指令（86/609/EEC））を厳守して実施された。
動物および飼育条件
すべてのモデルマウスを表S3に示し、それぞれの遺伝子型に基づいて実験群に割り当てられた雄性動物のみを使用した。簡単に説明すると、Hsp60flox/floxマウスおよびHsp60flox/flox xVillinCreERT 2-Tgマウスは、前述したように作製した
タモキシフェン誘導によるIEC特異的Hsp60ノックアウトマウス（Hsp60Δ/ΔIEC）を作製した。さらに、Hsp60Δ/ΔIECマウスを、それぞれ全身IL-10ノックアウトマウス（Il10-/-）、AhRノックアウトマウス（AhR-/-）、IL-22ra1ノックアウトマウス（Il22ra1-/-；Prof. S. Huberの好意により提供された）と交配した。Hsp60Δ/ΔIEC;Il10-/-, Hsp60Δ/ΔIEC;AhR-/-,Hsp60Δ/ΔIEC;Il22ra1-/-およびHsp60Δ/ΔIEC;Ido1-/-マウスをそれぞれ作製した。IEC特異的で誘導可能なAtf5の過剰発現、Atf5IEC（Atf5flox/flox xVillinCreERT 2-Tg）を作製するために、CAGプロモーターとN末端HAタグ（核内移行と転写因子としてのAtf5の阻害されない活性を可能にする）を持つベクター構築物がRosa26遺伝子座に組み込まれた。トランスジェニック動物をVillinCreERT 2-Tgと交配した。タモキシフェン投与による誘導性Cre媒介組換えは、プロモーターに関連するSTOP配列の欠失をもたらし、Atf5の発現を妨げる。従って、Creを介した組換えにより、Atf5は発現し、核に移行する。すべてのマウスとそれぞれの遺伝子型は、C57Bl/6NとC57Bl/6Jの自家交配で作製され、維持された。すべてのマウスは、ミュンヘン工科大学（School of Life Sciences Weihenstephan）のマウス施設において、FELASA（Federation for Laboratory Animal Science Associations）の基準（24～26℃で12時間の明暗サイクル）に従い、特定病原体フリー（SPF）または細菌フリー（GF）の条件下で飼育された。GFマウスは、22±1℃でHEPAフィルターで換気されたフレキシブルフィルムアイソレーターに収容された。すべてのマウスは、標準食（オートクレーブ処理したV1124-300、Ssniff）とオートクレーブ処理した水を自由摂取し、CO2またはイソフルランで犠牲にした。GFの状態は、実験開始前とサンプリング時点に、5%羊血入りコロンビア寒天培地（BD™）で糞便を培養することでコントロールした。すべてのマウスは、遺伝子型に関係なく、10週齢までそれぞれの同腹子と一緒に飼育された。タモキシフェン投与開始時（10週齢）からサンプリング時点までは、すべての動物を単独飼育した。
出生後の組換え誘導とマウスのモニタリング
条件付きHsp60flox/flox×VillinCreERT2-Tg、Hsp60flox/flox×VillinCreERT2-Tg×Il 10-/-、Hsp60flox/ flox×VillinCreERT2 -Tg×AhR-/-、Hsp60flox/flox×VillinCreERT2-Tg×Il22ra1-/-の場合、 Hsp60flox/flox×VillinCreERT 2-Tg×Ido1-/-およびAtf5flox/flox×VillinCreERT2 -Tgマウスと適切なコントロールマウスを、SPFまたはGF条件下で4週間、植物エストロゲン低減食（V1154-300、Ssniff）で飼育した（生後6週目から10週目まで）。その後、10週齢のマウスにクエン酸タモキシフェン400mg/kg 飼料（CreActive T400（10mm、Rad）、Genobios社製）を7日間自由摂取させた。誘導期の後、タモキシフェン食餌を植物エストロゲン低減食餌に置き換えた。誘導期中および誘導期後、マウスを毎日モニターし、体重減少、便の硬さの変化、一般行動、一般健康状態を考慮した複合スコアに達した時点で中止した。動物は指示された時点で犠牲にした。タモキシフェン摂取のため、実験には雄のみを用いた。
一次小腸陰窩の単離と腸オルガノイド培養
マウス（10～20週齢の雌雄Hsp60flox/flox xVillinCreERT 2-Tgマウスおよびコントロールマウス）の一次小腸陰窩を単離し、腸組織（6～10cm）を反転し、エチレンジアミン四酢酸（EDTA、2mM、30分、4℃）で消化し、機械的に解離した。上清を70μmのセルストレーナーで濾過し、遠心分離でペレット化し、マトリゲル®（BD Biosciences）に包埋した。25μlのマトリゲル®-オルガノイド懸濁液を48ウェルプレート（エッペンドルフ社製）にプレーティングし、IntestiCult™ オルガノイド増殖培地（STEMCELL Technologies社製）中、加湿5%CO2雰囲気下、37℃で培養した。その後7-10日ごとに継代培養を行うため、オルガノイドを20Gの針をつけた1mlシリンジで機械的に破砕し、遠心分離でペレット化し、新鮮なマトリゲルに包埋した。実験手順の間、オルガノイドは実験開始の3日前に継代し、自作のクリプト培養培地（CCM）で培養した。CCMは高度DMEM/F12培地（Gibbco）、2mM GlutaMax（Gibbco）、10mM HEPES、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシン（すべてSigma-Aldrich）を含み、N2（1:100）、B27（1:50）（Gibbco）、1mM N-アセチルシステイン（Sigma-Aldrich）、50ng/ml EGF（ImmunoTools）、100ng/mlノギン、0. 5μg/ml R-スポンジン1（いずれもPeproTec）。
オリゴマウス-微生物叢（OMM12）合成細菌群
無菌マウスにオリゴマウス-微生物叢（OMM12）合成細菌群を選択的にコロニー形成させるためのガベージを調製する、
各細菌をハンゲートチューブで嫌気性アッカーマンシア培地（AAM）中で培養した。
で24～48時間培養した。使用した菌株は、主要リソース表に示した。菌の増殖はOD600で評価し、少なくとも3x107個/mlの密度で必要な各菌の同量を混合するように調整し、グリセロールを添加した（最終濃度20% v/v）。ガベージはN2ガス封入チューブにゴム製セプタムで密封し、gnotobiotic施設に移送するまで-80℃で保存した。
方法の詳細
無菌マウスの選択的コロニー形成
選択的コロニー形成のために、無菌雄性Hsp60flox/flox xVillinCreERT 2-Tgマウスとその適切な対照マウスを、6週齢で20ゲージガベージ針（Fine Science Tools）を用いて直腸ガベージを2回行い、Oligo-Mouse-Microbiota（OMM12）合成細菌群集を投与した、
Limosilactobacillus reuteriI49（DSM 32035）またはBacteroides caecimurisI48（DSM 26085）の単独またはAkkermansia muciniphilaYL44（DSM 26127）との組み合わせ。2回目のギャベージの後、生後10週齢で前述のように生後ゲノム組換えの誘導を行った。すべての細菌ギャベッジは、OMM12について前述したように調製した。
組織処理および病理組織学的解析
小腸および大腸組織は安楽死直後に摘出し、隣接組織から切り離した。消化管の異なる部分を縦に切り開き、内容物を除去し、組織を "スイスロール "として処理した。組織は4％リン酸緩衝ホルマリンで48時間固定し、脱水後、溶融パラフィンに包埋（FFPE）、または固定せずに光切断温度（OCT）培地に包埋した。病理組織学的評価のために、5μm切片を自動染色機（Leica）でヘマトキシリン（Mayer）と0.2％エオシン（エタノール溶液；いずれもMedite）で染色した。回腸と大腸の切片を、個々の壁層（粘膜、粘膜下層、筋層）への単核球の浸潤、陰窩の過形成と異型化、杯細胞の枯渇、上皮の損傷に基づいて炎症（組織病理学的指標）を盲検で評価し、0点（非炎症）から12点（重篤な炎症）までとした。さらに、回腸と大腸の切片について、陰窩構造の歪み（陰窩過形成、核-漿膜関係のシフト、核の肥大、核小体、先端シフト有糸分裂）による上皮構造の異常を盲検で評価し、0（通常の上皮）から4（高度に異常な上皮）までの異常上皮指数を算出した。画像はPreciPoint M8顕微鏡（Precipoint社製）で取得した。
アルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ（PAS-AB）染色
FFPEの組織切片（5μm）を、酸性ムチンの検出にはアルシアンブルー（Fisher）染色（3％酢酸中0.5％v/v、pH＝2.5、5分間）、中性ムチンの検出には過ヨウ素酸（0.5％v/v、10分間）をシッフ試薬（Sigma-Aldrich）と共染色した（15分間）。核はヘマトキシリンで対比染色した。画像はPreciPoint M8顕微鏡（Precipoint）で取得した。
Hsp60、Ki67およびIdo1のFFPE切片の染色手順
免疫組織化学（IHC）および免疫蛍光（IF）染色のために、腸の「スイスロール」（5μM）のFFPE組織切片を脱パラフィンし、自動染色機（Leica）で再水和した。10mMクエン酸緩衝液（pH=6；23分；900ワット）による熱媒介抗原回収後、切片をIHC染色専用に3％H202（Sigma-Aldrich）で10分間インキュベートした。その後、切片をブロッキングし（2.5mlの10xPBS、1.25mlの二次抗体と同種の血清、21.25mlのdH2O、75μlのTriton X-100（100％、Sigma-Aldrich）からなるブロッキングバッファー）、一次抗体を4℃で一晩塗布した。抗体濃度は、重要なリソースの表に記載されている（4ml 10x PBS, 36mldH2O, 0.4g BSA (Sigma-Aldrich), 120μl Triton X-100 (100%, Sigmal Aldrich)からなる抗体希釈バッファー）。数回の洗浄後、切片を二次抗体（フルオロクロムまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ結合）とインキュベートした。IF染色では、核染色に4′，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI；1：1000；Sigma-Aldrich）を用い、二次抗体溶液に添加した。IF染色はFluoview FV10i顕微鏡（Olympus）を用いて可視化し、画像はImageJ（1.54f;http://imagej.org）を用いて処理した。IHC染色では、3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)/metal concentrate (Fisher)により抗原検出を行い、核はヘマトキシリンでカウンター染色した。IHC染色は、PreciPoint M8顕微鏡（Precipoint）を用いてスキャンし、さらに解析した。
FFPE切片に組み込んだブロモデオキシウリジン（BrdU）の染色手順
BD Pharmingen™ BrdUIn SituDetection Kit (AB_2868903)を用いて、複製IECへの取り込みを評価するために、BrdU溶液（Invitrogen, Catalog#000103, 10μl/g体重）を全動物の犠牲の2時間前に腹腔内注射した。腸の「スイスロール」（5μM）のFFPE組織切片を脱パラフィンし、自動染色機（Leica）で再水和した。10mMクエン酸緩衝液（pH=6；加熱プレート上で90℃、10分間）による熱媒介抗原回収後、切片を20分間冷却し、3％H202（Sigma-Aldrich）で10分間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化抗BrdU抗体を加え、加湿した室温で1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、二次Streptavidin-HRPを加湿チャンバー内で室温、30分間インキュベートし、キットのDAB試薬で抗原検出を行った。核はヘマトキシリンで対比染色した。染色はPreciPoint M8顕微鏡（Precipoint社製）を用いてスキャンし、さらに解析した。
ヌクレオソーム間DNA断片化の染色手順
Apo-BrdUIn situDNA Fragmentation Assay Kit（BioVision、カタログ番号K401-60）を用いて、IECsのin situアポトーシスを評価した。腸管「スイスロール」（5μM）のFFPE組織切片を脱パラフィンし、0.85％NaClで5分間再水和した。4％パラホルムアルデヒドで15分間インキュベートした後、スライドを洗浄し、製造元の説明書に従って処理した。核の共染色にはDAPIを用いた。染色はFluoview FV10i顕微鏡（オリンパス）を用いて可視化し、画像はImageJ（1.54f;http://imagej.org）を用いて処理した。
タイトジャンクションタンパク質の染色手順
大腸の凍結切片（6μm）を4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定し、0.1％ Triton X-100で4℃で30分間透過処理し、室温で1時間ブロッキングした（2.5mlの10×PBS、1.25mlの二次抗体と同種の血清、21.25mlのdH2O、75μlのTriton X-100（100％、Sigma-Aldrich）からなるブロッキングバッファー）。その後、一次抗体を4℃で一晩塗布した（4ml 10x PBS, 36mldH2O, 0.4g BSA (Sigma-Aldrich), 120μl Triton X-100 (100%, Sigmal Aldrich)からなる抗体希釈バッファー）。抗体の希釈は、主要リソースの表に記載されている。数回の洗浄後、室温で30分間ブロッキングした後、切片を二次抗体（蛍光色素結合）とインキュベートした。核染色にはDAPI（1:1000；Sigma-Aldrich）を用い、二次抗体溶液に添加した。後固定（4%パラホルムアルデヒド、室温）後、スライドをAquatex® （Sigma-Aldrich）でマウントした。IF染色はFluoview FV10i顕微鏡（Olympus）を用いて可視化し、画像はImageJ（1.54f;http://imagej.org）を用いて処理した。
mRNA単離および定量的リアルタイムPCR
全大腸組織または小腸オルガノイドの mRNA を、NucleoSpin RNAII キット（Macherey-Nagel）を用いて、製造元の説明書に従って単離した。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）は、1μlのcDNAを用い、Light Cycler 480システム（Roche Diagnostics）を用いて、Universal Probe Libraryシステムを適用し、製造業者の指示に従って二重に行った。プライマー配列とプローブは主要リソース表に記載されている。遺伝子mRNA発現の相対的誘導は、ハウスキーパーHprtの発現を標準化に用いて、2-ΔΔCt法により算出した。
細菌16S rRNA遺伝子の定量的qPCR
10ngのgDNAを鋳型として、OMM12コンソーシアム由来の12種類の細菌の定量的PCRを行った。増幅には菌株特異的16S rRNAプライマーと加水分解プローブを用いた。
二重qPCRアッセイでは、加水分解プローブを6-カルボキシフルオレセイン（FAM）または6-カルボキシヘキサフルオレセイン（HEX）で5′標識した。qPCR標準曲線は、DNA鋳型として直鎖化プラスミドを用いて決定し、ライトサイクラー480システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）で二重に実行した。その後、標準曲線を用いて個々の菌株の 16S rRNA 遺伝子コピー数を絶対定量した。Acutalibacter murisKB18（DSM 26090）のシグナルは検出限界以下であった。
マウスELISA SAA
マウス血漿中のSAA濃度は、市販のELISAキット（ICL Inc.
大腸内容物からのメタゲノムDNA抽出
凍結したマウスの大腸内容物から、Reitmeierらのプロトコルを修正したビーズビート法でDNAを抽出した。
簡単に説明すると、600μl の DNA 安定化溶液（Stratec Biomedical）を、500mg の滅菌シリカビーズ（0.1mm 径、BioSpec Products）を入れた 2ml のスクリューキャップポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れた大腸内容物のアリコートに氷上で加えた。絶対分析用に、サンプルにスパイクを加えた（1.5 ng/μl）。250μlの4Mチオシアン酸グアニジン-0.1Mトリス（pH=7.5）および500μlの5％N-ラウロイルサルコシン-0.1Mリン酸緩衝液（pH=8.0）を加えた後、大腸内容物懸濁液をボルテックスし、70℃で1時間、一定に振盪しながらインキュベートした。24×2ml冷却アダプター付きFastPrep®-24ビーズビーター（MP Biomedicals社製）を用いて、6.5m/sの速度で40秒間ずつ3回、ビーズビートにより混合物を機械的に破砕した。ポリフェノール吸着剤としてポリビニルポリピロリドン（PVPP, Sigma-Aldrich）を15mg添加し、懸濁液を4℃で15,000g、3分間遠心分離した。上清を回収し、4℃で15,000g、3分間遠心した。細菌RNAを除去するため、500μlの透明上清に2μlのRNAse（10mg/ml）を加え、37℃で30分間、絶え間なく振盪しながらインキュベートした。最後に、ゲノムDNAをNucleoSpin® gDNA clean-up kit（Macherey Nagel社製）を用いて、製造元の指示に従って精製した。抽出したDNAの濃度と純度は、NanoDrop® Spectrophotometer ND-1000（ThermoFisher Scientific）を用いて測定した。
16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング
ゲノムDNA抽出後、アンプリコンライブラリー（V3/V4領域）をPCR（25サイクル）で増幅し、AMPure XPシステム（Beckmann社製）を用いて精製し、等モル量でプールし、MiSeqシステム（Illumina, Inc.社製）を用いてペアエンドモード（PE275）で、製造元の説明書と25%（v/v）PhiX標準ライブラリーに従って塩基配列を決定した。生配列は、UPARSEアプローチに基づくIMNGSを用いて処理した。
配列はデマルチプレックスされ、品質スコア<3で最初の塩基までトリミングされ、その後ペアリングされた。300塩基未満および600塩基以上の塩基配列と、予想誤差が3以上のペアリードは解析から除外した。残りのリードは、GCバイアスと非ランダム塩基組成を避けるために、両端を5ヌクレオチドずつトリミングした。キメラの存在はUCHIMEを用いて検査した。
ゼロ半径操作分類単位（zOTU）のクラスタリングは、97%の配列類似度で行った。分類学的ビニングは、RDP分類器を用いて信頼度80%で割り当てた。
SILVAリボソームRNA遺伝子データベースプロジェクトと比較した。
解析は R パッケージ Rhea を用いて行った。
zOTUカウントは正規化され、相対存在量のパーセンテージが計算された。または、正規化されていないzOTUカウントから絶対量を計算した。β多様性解析は、一般化UniFrac距離に基づいてグループ間の多様性を決定するために用いられた。種内の多様性は種の豊かさに基づいて計算された。系統樹の可視化には EvolView を用いた。
シャローショットガンメタゲノミクス
マウス大腸内容物から単離したgDNAを用い、NovaSeqマシン（1G raw data with paired-end 150bp）でシャローショットガンメタゲノムシーケンスを行った。データをデマルチプレックスした後、Trim Galore(https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)を用いて生シーケンスリードからアダプターをトリミングした。その後、KneadData quality control pipelineでリードを処理し、低品質リード塩基とマウスコンタミネーションを除去した（https://bitbucket.org/biobakery/kneaddata/wiki/Home）。分類学的プロファイリングはMetaPhlAn3.0.13分類器を用いて行った、
MetaPhlAn3.0.13は、17,000の微生物ゲノム（約13,500の細菌および古細菌、約3,500のウイルス、約110の真核生物）から得られたクレード特異的マーカー遺伝子のデータベースに基づいて、メタゲノムリードを分類群に明確に分類する。種レベルの割り当てが抽出され、データは対数比を中心にスケーリングされた。
RNAマイクロアレイ解析
Hsp60Δ/ΔIECおよびHsp60fl/flマウスの単離大腸上皮細胞から、2日目にカラムベースのNucleoSpin RNAIIキット（Macherey-Nagel）を用いて、製造元の指示に従って全RNAを調製した。RNA濃度と品質は分光光度分析（ND-1000、PEQLAB）によって決定した。RNA インテグリティナンバー（RIN）は全サンプルで>8であった（Agilent 1200 bioanalyzer, Alpha Metrix Biotech）。全RNA（100ng）の標識はAmbion WT Expression kit（Life Technologies）で行い、サンプルはAffymetrix GeneChip Mouse Gene 1.1 ST array（Affymetrix）にハイブリダイズし、Affymetrix GeneTitan装置でスキャンした。プローブセットはDai et al.
プローブはアノテーションされ、一意の遺伝子識別子（Entrez ID）に割り当てられた。Mouse Gene 1.1 STアレイに存在するプローブは21,225のEntrez IDに相当する。アレイはRobust Multi-array Average (RMA)法で正規化した。少なくとも5つのアレイで正規化シグナル強度が20以上、四分位範囲 > 0.2、プローブセットあたり少なくとも5つのプローブを持つプローブセットのみが、さらなる解析のために選択された。
マウス糞便水の調製
マウス糞便水を調製するため、約150mgの凍結糞便内容物を3個の滅菌ガラスビーズ（直径2mm；Glasschrott社製）および滅菌PBS（10% w/v）と混合し、1分間激しくボルテックスした。食物残渣を除去するため、サンプルを遠心分離し（5分、500g、4℃）、上清を新しいチューブに移した。2回目の遠心分離（5分、8000g、4℃）の後、細菌はペレット化され、上清は糞便水として区別された。
生体外組換えの誘導とオルガノイドの刺激
IECにおけるHsp60欠失の生体外誘導は、培養液に500nM (Z)-4-hydroxytamoxifen (4-OHT; LKT) を添加することで達成した。24時間後、オルガノイド培養液を新鮮なCCMに交換した。Hsp60は4日後にはタンパク質レベルで完全に消失した。生体外Hsp60欠失の5日後、オルガノイドをTnf（50ng/ml；PeproTech Inc.）、Ifnγ（1ng/ml；PeproTech Inc.）、リポ多糖（LPS；1μg/ml；Sigma-Aldrich）またはマウス糞便水（希釈度1：500）で24時間処理し、その後RNA単離のために回収した。
生細胞および細胞内ATP含量の測定
生細胞および死細胞のプロテアーゼ活性はMultiTox-Fluor Cytotoxicity Assayを用いて測定し、ATP含量はCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（いずれもPromega社製）を用いて、48ウェルフォーマットで製造者の指示に従って測定した。蛍光と発光は、Tecan infinite M200（Tecan Group Ltd.）とi-control™ Microplate Reader software（Tecan）を用いて測定した。
メタプロテオミクス解析のための大腸内容タンパク質の抽出と消化
マウスの大腸内容物からのタンパク質抽出は、以前に記載された方法で行った。
簡単に説明すると、各サンプル30mgを採取した（利用可能な物質が30mg未満の場合は、全サンプルを使用した）。サンプルを200μlの溶解バッファー（5% SDS, 2M Urea, 50mM Tris-HCl, Protease Inhibitor 1x）と混合し、1分間激しくボルテックスした。その後、サンプルをサーモミキサー（Eppendorf, Hamburg, Germany）に入れ、1,200 rpmの攪拌で70℃、15分間処理した。終了後、サンプルをBioruptor Pico（Diagenode, Seraing, Belgium；プログラム）を用いて超音波処理した： プログラム：30秒 "ON"、30秒 "OFF "を15サイクル、周波数レベル：Low、水温：25℃： 低、水温 +20°C). サンプルを室温で16,000g、5分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、同じ条件で再度遠心した。回収した上清は、さらに使用するまで-80℃で保存した。
タンパク質のクリーンアップと消化には、Hughesら（71）により記載されたシングルポット固相強化サンプル前処理（SP3）法を改良したものを用いた。
に記載されているシングルポット固相拡張サンプル前処理法（SP3）を改良したものを使用した。簡単に言うと、50μgのタンパク質を1.5mlのLoBindチューブ（Eppendorf, Hamburg, Germany）に取り、サンプル量を90μlまで溶解バッファーを加えた。大腸内容物タンパク質サンプルは、タンパク質還元（5mM Dithiothreitol, DTT, 60℃で30分間インキュベーション）に供され、続いてアルキル化（20mM Iodoacetamide, IAA, 暗所、室温で30分間）に供された。サンプル中に残ったIAAは、最終濃度5mMになるようにDTTを加えてクエンチした。50μgのタンパク質サンプルに10μlのSera-Mag SpeedBeadビーズ（50mg/ml, Cytiva, Marlborough, Massachusetts）を添加した。タンパク質のビーズへの結合を開始させるため、直ちに100μlの絶対エタノールを加え、次いでサーモミキサーで24℃、5分間、1,000rpmの攪拌でインキュベートした。マグネットラック上で2分間静置後、上清を除去し、ビーズを50μlの80％エタノールで3回すすいだ。すすいだビーズを50μ消化バッファー（50mM重炭酸アンモニウム、pH8）で再構成した。タンパク質消化は、2μgのsequencing-grade trypsin/LysC (Promega, Madison, USA)を用い、37℃で18時間、950rpmの攪拌で行った。消化後、各サンプルにACNを最終濃度95%まで添加した。混合物を室温で8分間インキュベートした後、マグネットラックに2分間置いた。上清を捨て、ビーズを900μLの100％ACNで洗浄した。洗浄したビーズを20μlのLC-MSグレードの水で再構成し、ペプチドを溶出した。ペプチド濃度はNanoPhotometer N60 (Serial number: TG2022, Implen, Munich, Germany)を用いて205nmで二重測定した。ペプチドサンプルはギ酸（FA）で最終濃度0.1%に酸性化し、LC-MS/MS分析まで-20℃で保存した。
液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC-MS/MS）のセットアップ
ナノフロー逆相液体クロマトグラフィー（Nano-RPLC）は、NanoEluteシステム（Bruker Daltonik, Bremen, Germany）で行った。250ngの消化ペプチドを、1.6μmのC18粒子（IonOpticks, Fitzroy, Australia）を充填した25cm×75μmのカラムで60分間のグラジエントで分離した。移動溶媒Aは100％水（LC-MSグレード）、0.1％FA、移動相Bは100％アセトニトリル、0.1％FAであった。流速は250nl/minに設定され、最後の7分間は400nl/minに設定された。移動相Bは最初の35分間で4%から20%まで直線的に増加し、その後17分間で35%までさらに直線的に増加し、0.5分間で85%まで急上昇した。その後、移動溶媒Bの85%で400nl/minの流速を7分間維持し、すべての疎水性ペプチドを溶出した。NanoElute LCは、CaptiveSprayイオン源を介してハイブリッドTIMS四重極TOF質量分析計（timsTOF Pro, Bruker Daltonik, Bremen, Germany）と結合した。サンプルは、パラレルアキュムレーションシリアルフラグメンテーション（PASEF）と組み合わせたデータ非依存捕捉（DIA）モードで分析した。捕捉のために、TIMSアナライザーは100%のデューティサイクルで、100msずつの等しいアキュムレーションとランプ時間で動作させた。イオンモビリティレンジは0.6～1.4(1/k0)に設定した。m/zが350から1100の前駆体は、各ステップで25 Thの分離ウィンドウを持つ30回の分離ステップを含む13回のスキャンで定義された。各DIA-PASEFスキャンの取得時間は100msに設定され、合計サイクル時間は約1.5秒となった。コリジョンエネルギーは、1/k0=1.6の59eVから1/k0=0.6の20eVまで直線的に傾斜させた。
scRNA-seqライブラリー調製と配列決定のためのマウス大腸組織からの上皮細胞単離
Hsp60Δ/ΔIECまたはHsp60fl/flマウスから結腸全体を摘出し、重量を測定してダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）に保存した。PBSで洗浄し、氷上でミンチにした後、組織標本を解離し、酵素消化した（Multi Tissue Dissociation Kit using gentleMACS™ Dissociator, Miltenyi Biotec）。遠心後、PBS+2% FCSに再懸濁し、細胞懸濁液を70μmストレーナーで濾し、スピンダウンしてRNase阻害剤（New England Biolabs、カタログ番号M0314L、1:100）を含む2% FCS/PBSに再懸濁した。Debris removal solution（Miltenyi Biotec、カタログ番号130-109-398）を用いて、解離組織から細胞残屑を除去した。その後、死細胞除去キット（Miltenyi、カタログ番号130-090-101）を用いて生細胞を濃縮した。CD45+細胞をCD45 Microbeads kit（Miltenyi Biotec、カタログ番号130-052-301）を用いて選別した。残った細胞を数え、2% FCS/PBSで希釈し、1レーンあたり30,000個までの細胞を10×Chromiumチップにロードし、エマルジョン中のゲルビーズ（GEM）を作製した。シングルセルGEMの作製、バーコーディング、ライブラリーの構築は、10×Chromium Single Cell 3′ v.3ケミストリーを用いて、製造元の指示に従って行った。相補的DNAと生成したライブラリーは、HS DNA Kit（Agilent）を用いてAgilent Bioanalyzer 2100でサンプルサイズと品質をチェックした。ライブラリーはIllumina NovaSeq 6000 S2 (Paired ends (PE), 28 + 94 bp)でシーケンスした。
定量と統計解析
Hsp60発現の定量
大腸組織切片のHsp60 IHC染色において、ViewPoint Lightソフトウェアを用いてHsp60タンパク質発現を定量した。陰窩におけるHsp60発現を分類するため、50個の良好な向きの陰窩をHsp60発現陽性、半陽性、陰性に分類した。半陽性の陰窩は、陰窩の左側または右側のみに陽性シグナルを持つ陰窩であった。
杯細胞の定量
PAS-AB染色に基づいて杯細胞の数を数えた。方向性のよい陰窩を50個選び、PAS陽性細胞を数えた。PAS陽性細胞の数は100μm2あたりの総数として計算した。
陰窩の深さの定量
大腸組織切片のH&E染色で陰窩の深さを分析した。50個の良好な向きの陰窩において、ViewPoint Lightソフトウェアを用いて陰窩底部から陰窩上部までの長さを測定し、各切片の平均長を算出した。
Ki67陽性細胞およびBrdU陽性細胞の定量化
増殖率を評価するため、大腸組織切片のKi67染色およびBrdU染色に基づいて、それぞれKi67陽性IECおよびBrdU陽性IECをViewPoint Lightソフトウェアを用いて定量した。Ki67陽性またはBrdU陽性の陰窩を決定するために、50個の良好な向きの陰窩（近位結腸に25個、遠位結腸に25個）をKi67発現陽性またはBrdU発現陰性に分類し、陰窩1個当たりのKi67陽性細胞数またはBrdU陽性細胞数を算出した。
NanoString®解析
nCounter® Metabolic Pathway Panel（NanoString Technologies, Inc.）を用い、768の代謝遺伝子パネルの多重遺伝子発現を製造元の説明書に従って解析した。簡単に説明すると、125ngの大腸全組織の単離RNAをコードセットハイブリダイゼーションし、nCounter® MAX/FLEX システム（NanoString Technologies, Inc.） 生データは品質管理された後、nSolver Analysis Software (NanoString Technologies, Inc.)を用いて正規化および解析が行われた。
DIA-PASEFデータ処理
DIA-NN
(バージョン1.8.2ベータ27）を用いて、3つの参照プロテオーム（20240105にUniprotからダウンロード）に対してライブラリフリーモードでDIA-PASEFデータを処理した： Mus musculus (UP000000589)、Akkermansia muciniphila(UP000001031)、Bacteroides caecimuris(UP000092631)。ディープラーニングベースの手法を用いて、ペプチドの保持時間やイオンモビリティとともに理論的なペプチドスペクトルを予測した。インシリコ消化にはTrypsin/Pを使用し、最大1回のミス切断を許容した。ペプチド上の可変修飾はメチオニン酸化とN末端アセチル化に設定し、N末端メチオニン切除とシステイン上のカルバミドメチル化は固定修飾とした。検索に用いたペプチドの長さは7から30アミノ酸の範囲であった。DIA-PASEFの取得メソッドに合わせ、m/z範囲は、プレカーサーが350から1100、フラグメントイオンが100から1700とした。MS1とMS2の質量精度はともに自動決定に設定した。タンパク質推論は "Protein names (from FASTA) "に設定し、"Heuristic protein inference "のオプションはオフにした。クロスラン解析ではMatch-between-run (MBR)をチェックした。定量にはRT-dependent cross-run normalizationとQuantUMS (high precision)オプションを選択した。
DIA-NN検索出力はさらにRパッケージDIA-NN(https://github.com/vdemichev/diann-rpackage)で処理され、前駆体およびタンパク質グループレベルでq-value≤0.01を基準として、同定されたすべてのペプチドおよびタンパク質グループの定量的強度またはその値を抽出した。
2つの細菌プロテオームの機能アノテーション
前述のAkkermansia muciniphilaと Bacteroides caecimurisのプロテオームFastaファイルをEggNOG-mapperにインポートした。
(http://eggnog-mapper.embl.de/)にインポートし、デフォルト設定でオルソログ機能アノテーションを行った。アノテーションされたタンパク質の機能は、DIA-PASEFの同定にマッピングされた。
scRNA-seq データの前処理、品質管理、解析
scRNA-seqデータのマウスリファレンスゲノム（mm10、リリース108.20200622）へのアライメント、フィルタリング、バーコードおよびユニーク分子識別子のカウントは、10x Genomics Cell Rangerソフトウェア（v.3.1.0）を用いて行った。さらなる解析はすべて、Seurat v5.0.1を用いてR v4.3.3で行った。
簡単に説明すると、10×パイプラインから生成されたデータを読み取り、3細胞未満で検出されたフィーチャーを削除した。検出されたフィーチャーが200以下の細胞は削除された。RNAデータはSeuratメソッドsctransformv2で正規化した。
ミトコンドリアDNAが30%以上という閾値を用い、損傷細胞をフィルターした。さらに、scDblFinderv1.16.0を用いてダブレットを除去した。
で除去した。サンプルはHarmony v1.2.0を用いて統合した。
Louvainアルゴリズムを用いてクラスターを同定した。
FindNeighbors()メソッドによって決定された）共有最近傍グラフに基づき、0.1の解像度でFindClusters()Seuratメソッドに実装された。その後、上記で説明したアプローチを用いて、より大きなクラスタのサブクラスタリングを行った。クラスターおよび条件ごとの差次的発現遺伝子は、MAST v1.27.1のFindMarkers()Seuratメソッドを用いて同定した。
クラスターの機能アノテーションのために、調整p_value<0.01かつlog_FC>1.5のすべての差次的発現遺伝子(DEG)を選択し、DAVID Functional Annotation Clustering or Chart Tool, v2023q4(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)を用いてアノテーションを行った。ターゲット遺伝子のPseudobulk解析はAggregateExpression()Seurat関数を用いて行った。
マウス粘膜シグネチャーのヒトクローン病サンプルへのマッピング
ヒトクローン病患者におけるマウスシグネチャーの発現を調べるために、RMA正規化、log2変換したマイクロアレイデータをNgollo et al.
手術時のサンプルは、炎症回腸[M0I](n=196)と回腸縁[M0M](n=147)の2つの異なる場所から採取した。後者は炎症を起こしていない組織のコントロールサンプルとした。
シグネチャー遺伝子は、Rパッケージgprofiler2[version 0.2.3]を用いて、マウスからヒトの遺伝子名にマッピングした。
35のシグネチャー遺伝子のうち、3つを除くすべてが、マイクロアレイデータ中のヒトのオルソログにうまくマッピングされた。3つの例外は、オルソログが見つからなかったH2-Q10と Scd1、そしてヒトマイクロアレイデータからオルソログが検出されなかったSlc16a3であった。シグネチャーのヒトオルソログの発現をヒートマップで可視化するために、発現値を遺伝子ごとにスケーリングした。その後、各位置（M0IとM0M）の平均発現値を計算した。ComplexHeatmap[version 2.14.0] Rパッケージ
を用いてヒートマップを作成し、ユークリッド距離と完全連鎖に基づいて遺伝子の階層的クラスタリングを行った。行は、Hsp60Δ/ΔIECマウスとHsp60fl/flマウスの間で観察された発現パターンに基づいて注釈付けされた。マウスとヒトで発現パターンが一致する遺伝子数の有意性を評価するために、infotheo[version 1.2.0.1] Rパッケージ（https://cran.r-project.org/package=infotheo）を用いて相互情報を計算した。相互情報量の経験的p値は、10,000回のモンテカルロ並べ替えにより求めた。M0I群とM0M群間の差次的発現遺伝子（DEGs）解析には、Benjamin-3.54.2]を用いた対のmoderated t-統計量に基づいて、LIMMA [version 3.54.2] Rパッケージを使用した。多重検定のためのRFDR補正。
DEGsは、調整済みPを使用して生物学的に有意なものとして選択された DEGsは、Benjaminiで調整されたものを使用して生物学的に有意なものとして選択された dnサンプルについては、GitHubリポジトリ(https://github.com/biomedbigdata/gene_signatures)に寄託され、公開されている。
統計解析
統計解析はGraphPad Prism（バージョン8.0）を用いて行った。使用した統計検定は、無対t検定、分散分析（ANOVA）に続く一対比較検定（Tukey）、またはKruskal-Wallis検定に続くDunnの多重比較。P比較検定（Tukey）、またはKrP比較P< 0.01;＊＊＊P< 0.001;＊＊＊P< 0.0001。データは平均値±s.d.または体重曲線の場合は平均値±semで示した。
謝辞
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG、ドイツ研究財団) - project number 395357507 (SFB 1371, Microbiome signatures) and project number 469152594 (HA 3148/15-1 - Mitochondrial function in the regulation of intestinal tissue regeneration and inflammation-related pathologies)の助成を受けた。アブストラクトはBioRender.comで作成した。
著者貢献
構想、E.U.、D.A.、D.H.、執筆-原案、E.U.、D.A.、D.H.、執筆-校閲・編集、E.U.、D.A.、N.M.、D.H.、調査、E.U.、D.A.、N.M.、T.K.、H.O.、M.R、 およびF.X.、方法論、E.U.、E.R.、S.B.、正式分析、A.M.、S.R.、T.F.、J.K.、Z.H.、F.X.、M.L.、D.G.-V. 資金獲得、E.U.、E.R.、D.H.、リソース、S.H.、D.S.、B.S.、M.L.、D.G.-V.、K.S.、M.A.。
利益申告
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
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資料S1. 図S1〜S9、表S1、S3
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表S2. 図6およびS9に関連する、すべてのルーヴァンクラスターにおける差次的発現遺伝子と、それぞれクラスター1、5、7、16の機能アノテーション
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論文情報
出版履歴
出版 2024年7月15日
受理 受理：2024年6月20日
改訂版受理 2024年5月13日
受理：2024年5月13日 受理日：2023年10月12日
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インプレス、修正校正
識別
DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.06.013
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図表
図表による要約
図1代謝傷害がIL-10関連IBD病態を加速する
図2代謝傷害は腸内細菌叢の生物学的変化を促進する
図3代謝傷害時のAhR欠損は致死的であり、抗生物質によるバクテロイデス属の除菌が生存を救う
図4代謝傷害を制御する細菌
図5代謝傷害を誘導するバクテロイデス・カエシムリス
図6IBDの炎症状態を識別する転写シグネチャーを規定する上皮のミトコンドリア機能障害
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