代謝的に健康な肥満表現型と不健康な肥満表現型における腸内細菌叢と糞便揮発性物質プロファイルの検査

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代謝的に健康な肥満表現型と不健康な肥満表現型における腸内細菌叢と糞便揮発性物質プロファイルの検査



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概要

背景

代謝的に健康な肥満（MHO）と代謝的に不健康な肥満（MUO）では、それぞれ心代謝合併症の有無が異なる。

目的

これらの違いに基づいて、これらの肥満表現型が微生物叢やメタボロームプロファイルの変化と関連しうるかどうかを深めることに関心がある。この点に関して、微生物叢の分類群構成と相対的な代謝プロファイルの明白な役割は完全には理解されていない。そこで、MHOおよびMUO患者を対象に、1日の摂取カロリーを800～1200kcalに制限した食事療法を行い、生化学的および栄養学的パラメータ、糞便微生物叢、メタボロームおよびSCFA組成を調べた。

方法

健常対照者（HC）およびMHOとMUOの両患者からなる肥満コホートから、血液、糞便サンプルおよび食物アンケートを収集した。先験的なサンプルの層別化から、最も影響を与える生化学的/人体計測的変数を、バックグラウンドノイズを下げるのに有効なロバスト統計学的アプローチを適用して検出した。細菌分類と揮発性代謝物は、それぞれqPCRと質量分析計を組み合わせたガスクロマトグラフィーによって評価された。また、SCFAを対象としたGC-MS分析も実施した。

結果

MHOとMUOの患者には、1日の摂取カロリーを制限するよう指導したところ、代謝、腸内細菌、揮発性代謝物のシグネチャーに違いがみられた。我々のデータから、MUOサブセットでは、特定の炎症性分類群（すなわち、Desulfovibrio属とPrevotella属）の量が多く、Clostridium coccoidesグループの量が少ないことが明らかになった。アルカン、ケトン、アルデヒド、インドールのVOCクラスが多く、ブタン酸の量が少ないことがMUO糞便メタボロームの特徴であった。

結論

MHOと比較して、MUOサブセットの症状像は、代謝的に不健康な状態への進行や肥満に関連した心代謝性疾患の発症に関与する可能性のある、腸内炎症性分類群および代謝産物における特異的な差異によって特徴づけられる。このアプローチは、代謝異常関連の炎症、栄養摂取、ライフスタイル、腸内細菌異常の間に存在するクロストークをよりよく説明するのに適している。

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はじめに

肥満は、世界的に広がっている慢性疾患であり、エネルギー摂取量と消費量のアンバランスを特徴とし、脂肪組織の過剰な膨張を引き起こすだけでなく、低悪性度の炎症状態や長期的な代謝の影響を引き起こす。肥満の罹患率は増加の一途をたどっており、2025年には成人の5人に1人がこの病態に罹患するといわれている [1] 。このような状態では、脂肪組織の膨張性が制限されるため、内臓および異所性領域への脂肪蓄積が増加し、冠動脈性心疾患、高血圧、脳卒中、がん、2型糖尿病（T2D）、脂質異常症などの代謝異常のリスクが高まる [2] 。肥満下では、大栄養素の利用や自己免疫・炎症反応 [3] に関わるいくつかの重要な生化学的経路が障害されるが、すべての肥満患者が炎症や代謝異常を発症するわけではない。実際、最近の知見では、肥満の2つの異なる表現型が記述されている。代謝の変化がないことを特徴とする代謝的に健康な肥満（MHO）と、少なくとも2つの合併症を伴う内臓脂肪の存在を特徴とする代謝的に不健康な肥満（OB）である [4] 。

肥満は多因子性疾患であり、その発症と進行はしばしば腸内細菌のα多様性の減少や特定種の存在量の変化と関連している。様々な研究から、エネルギーバランスの維持と脂肪組織への脂質沈着には、ユビオシスが必要であることが報告されている [5] 。実際、腸内細菌叢に異常があると、エネルギーの吸収と蓄積が顕著になり、その結果、体重が増加することが観察された [6]。エネルギーバランスと体重の主な微生物叢由来調節因子は短鎖脂肪酸（SCFAs）であり、ペプチドYYY（PYY）、グレリン、インスリン、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）の放出を促進することにより、満腹感や空腹感をコントロールする。SCFAはまた、タイトジャンクションとムチン層を調節することによって腸の機能性に影響を与え、長期的には慢性炎症と代謝機能障害を引き起こす可能性がある [8]。さらに、これらの化合物は、代謝異常や炎症が存在する場合、臨床的なパラメータ [9] （トランスアミナーゼ、HbA1c、コレステロールなど）やBMIや体重などの身体測定パラメータと相関することが知られている [10] 。

現在では、MHOとMUOにおける腸内細菌叢と便中代謝産物の違いについては、まだ深く研究されていない。間違いなく、VOCプロファイルをターゲットにすることは、代謝異常に関連する炎症、栄養摂取、ライフスタイル、腸内細菌叢異常の間のクロストークを解明するのに役立つ[8]。この目的のため、我々はMHO、MUOに罹患した被験者と健常対照者（HC）を対象に、臨床パラメーターと食事パラメーター、腸内細菌叢と糞便揮発性物質を調査した。本研究で初めて、同じカロリー制限摂取を行ったMUO患者とMHO患者の間で、代謝、分類学的および揮発性細菌叢の特徴に統計学的に有意な差があることを明らかにした。

研究方法

研究グループ

代謝的に健康な肥満（MHO）と代謝的に不健康な肥満（MUO）を対象とした横断的前向き観察研究を行った。より正確には、MHOとMUOのサブセットはそれぞれ18人と27人で構成された。12人の健常対照群（HC）も含まれた。すべてのボランティアは、独立倫理委員会（IEC）によって承認されたプロトコルに基づき、包括的な臨床評価を受けることに同意した。本研究およびインフォームド・コンセントのプロセスは、ヘルシンキ宣言、規則（EU）2016/679、立法令101/2018、被験者を対象とする生物医学研究に関する国際倫理指針CIOMS-WHO（2016）、ヒト由来生物材料研究に関する勧告Rec（2006）の倫理原則に従って実施された。被験者は、バーリの大学病院コンソーシアムポリクリニック、精密・再生医学部門およびイオニア地域、内科、内分泌学、アンドロロジーおよび代謝性疾患部門に所在する臨床センターから募集した。

HC対象者は以下の登録基準に従って登録された： 18～70歳、BMIは18.5～27.0kg/m2、雑食。肥満の被験者も同じ年齢と食事の基準に従ったが、BMIは30kg/m2以上であった。さらに、MUO患者は、インスリン抵抗性、糖尿病前症またはT2D、脂質異常症、心血管疾患（高血圧）、呼吸器疾患（閉塞性睡眠時無呼吸）を含む他の併存疾患を特徴としていた。一方、MHO患者の定義は、心・代謝性疾患または呼吸器疾患を1つだけ合併しているか、合併していないことであった[4]。さらに、除外基準として 現在または過去の感染症（HAV、HBV、HCV、HIV、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルスによる）、慢性肝疾患、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染歴、最近の薬物療法（研究開始3ヵ月前）、免疫抑制療法、 化学療法、プロトンポンプ阻害薬による慢性療法、最近のプロバイオティクスの使用（試験3ヵ月前）、下剤、薬剤またはサプリメントの使用、臓器移植の既往、最近の下痢の出現、慢性下痢、慢性便秘、胃腸手術の既往（例：胃バイパス術）。 胃バイパス術など）、尿路感染症の再発（年間3例）。さらに、上記のプロトコールに従い、試験参加者は急性心血管系疾患（心筋梗塞、脳卒中）、動脈性高血圧症、慢性消化器疾患、全身性炎症性疾患に罹患していないこと、推定糸球体濾過量（eGFR）が60mL/分未満でないこと、腎症の診断を受けていないこと、悪性腫瘍の既往歴（5年未満）、自己免疫疾患または慢性・全身性自己免疫疾患の既往歴、精神疾患を伴う神経変性疾患の既往歴がないこと。さらに、妊娠中または授乳中の女性、医療従事者、動物を扱う人は研究対象から除外された。ここに列挙した組み入れ／除外基準に加え、登録されたすべての対象者は、1日の平均摂取カロリーが800～1200kcalの食事療法を受けていた（図1）。これは、腸内細菌叢の代謝に及ぼす食事の影響を被験者ごとにバランスさせるのに有効であった。一般的に健康な被験者は、座りがちな生活習慣を持つMHOおよびMUO患者[11]よりもエネルギー代謝が高いことを考慮し、摂取カロリーの閾値を1000kcal/日とした。この閾値は、HC患者と肥満患者の層別化に用いられた。

図1

実験デザイン。健常人（HC）、代謝的に健康な肥満（MHO）、代謝的に不健康な肥満（MUO）の3つの異なるコホートにおいて、横断的前向き観察研究を行った。初診時、被験者は臨床評価と低カロリー食（800～1200kcal）を摂取した。14日後、SARS-COV-2検査、血液検査、糞便検体採取のための再診を受けた。

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臨床生化学分析

最初の診察で、ボランティアは署名入りのインフォームド・コンセントを提供し、アナムネスティックな質問票に記入した。対象者には、糞便サンプル採取用のキットが配布された。糞便サンプルは、RNAlater™ Stabilization Solution（Sigma-Aldrich社製）を用いて、1：1の割合で2つの器具に採取された。1つのサンプルは、ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）を用いた揮発性プロファイルの分析と、定量的PCR法による微生物叢組成の特徴付けの両方に使用された。さらに、参加者は週末を含む3日間の食事アンケートに回答し、食事摂取量の登録方法について説明を受けた。

2回目の検査では、参加者は糞便サンプルを提出し、記入済みの3日間の食事記録を提出した。さらに、血液検査の分析、新たな徴候や症状の評価（新しい問診票の記入）、SARS-COV-2の分子検査が行われた（図1）。適切なボランティアからの生物学的材料は、バイオバンクのストックと実験研究目的に使用された。医療センターは糞便アリコートを-80℃でストックし、ドライアイスでバーリ大学土壌・植物・食品科学科（DiSSPA）に移送した。

食品アンケート分析

微生物叢の組成に影響を及ぼす可能性のある外因性の交絡因子を避けるため、被験者募集の14日前に全対象者に約1000kcalの食事カロリー摂取を求めた。MUOとMHOの両患者は、超低カロリー食による術前の体重減少が必要な肥満手術の候補者であったため、食事に対する高いコンプライアンスを示した。さらに、食習慣を調査するために、被験者は3日間の食事アンケートを作成した（2週間の営業日2日と週末1日）。食事アンケートはWinFood®ソフトウェアを使って分析された。食事の栄養価（1日のカロリー摂取量、多量栄養素、微量栄養素）の平均値が出力として返された。

糞便揮発性測定、リアルタイムPCR、および統計解析

糞便揮発性物質分析、リアルタイムPCR、および使用した統計手法に関する詳細は、Online Supporting Informationに記載されている。

結果

被験者の特徴

採用した組み入れ基準に従って、12人のHC、18人のMHO、27人のMUOが我々の横断的前向き観察研究に登録された。患者の人体計測値と生化学的パラメータを表1に示す。

表1 登録された57人の人体計測および生化学的変数の群間比較

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参加者の平均年齢は32〜53歳であった。両肥満表現型間で年齢分布に有意差は認められなかったが、MUO群ではMHO群に比べ年齢が高い傾向がみられた。とはいえ、各群の標準偏差の高さが示すように、年齢値には高い異質性が認められた。加えて、MUOとMHOの両群は、5年までの肥満症患者を登録したことを考慮すると、疾患経過の長さはほぼ同じであった。2群補正統計比較を行った結果、MHOとMUOではHCと比較して体重とBMI値が有意に高かった（表1）。

HCとMHOの生化学的パラメータを比較したところ、有意差はわずかであったが、α2グロブリンとβ1グロブリンはMHOで高かった。興味深いことに、いくつかのパラメータは2つの肥満患者サブセットを区別した。詳細には、MUOサブセットでは、糖化ヘモグロビン（HbA1c）、インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（HOMA-IR）指数、総コレステロール、トリグリセリド、ASTおよびALTアミノトランスフェラーゼ、空腹時血糖（FBG）が有意に高値であったのに対し、MHOではGFRとアルブミンが高値であった。注目すべきは、MUOはHCと比較して、白血球、血小板、インスリン血症、C反応性蛋白（CRP）、高感度CRP（hs-CRP）で統計学的に有意な差を示したことである、 赤血球沈降速度（ESR）、HOMA-IR指数、アルブミン／クレアチニン比（ACR）、トリグリセリド、ASTおよびALTアミノトランスフェラーゼ、カルシウム血症、甲状腺刺激ホルモン（TSH）は、MUO被験者で高値を示した。逆に、25-OHビタミンD、アルブミン/グロブリン比（A/G比）、アルブミンは、MUOではHCに比べて低値であった。

次に、分析されたサンプルの層別化に最も影響を与える変数を強調するために、パターンマトリックス分析が行われた。

したがって、回転因子負荷量に基づき、16の同定された潜在変数のセットは、異なるプロセス/プロファイルに帰属することができる3つの因子に縮小された（表2）。我々は、負荷量が0.5より大きく、一意性が0.5より小さい変数を議論することにした。測定されたパラメータは異質であるため、ホルモン変数、人体測定変数、生化学変数の混合物が、同定された各因子を構成している。

表2 回転因子分析

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主成分の判別分析

主成分の判別分析（DAPC）は、変数負荷に基づいて、グループ割り当てなしに標本の層別化が成り立つかどうかを理解するために行われた。BIC曲線（補足図S1）から明らかなように、より良いモデルは、サンプルを3つのアプリオリクラスターに分離する。サンプルを "事後的に "群に割り当てると、被験者の3つのコホート（HC、MHO、MUO）は3つの分化した群にプロットされ（図2A）、アプリオリな群層別化が確認された。DAPC負荷プロットは、BMI、血糖値、赤血球沈降速度（ESR）、CRP、総テストステロン（TT）、遊離テストステロン（T）、サイロキシン（FT4）、卵胞刺激ホルモン（FSH）など、最も大きな影響を及ぼす変数を証明した（図2B）。

図2

事後的」サンプル割り当てに基づくDAPC。2つの固有値に基づき、"a posterior "グループ帰属を用いてサンプルをクラスターに割り当てた。BDAPC負荷量。任意のしきい値（0.01）よりも高い影響を与える変数の大部分。

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食品アンケート分析

ボランティアの食事の栄養価が推定され、結果は補足表S1に報告された。予想されたように、全体の平均カロリー摂取量は3群で同程度であった（P値＞0.05）。

大栄養素と微量栄養素については、統計的に有意な差が見られた。詳細には、2群間統計により、MUOおよびMHO食は、HC食と比較して、デンプン、可食部、総ミネラル塩、ビタミンB1（チアミン）、C18:1オレイン酸の量が多く、マンガンの量が少ないことが明らかになった。さらに、MUO飼料はコントロールと比較して、ナトリウム、カリウム、ヨウ素、α-トコフェロールの量が有意に少なく、システインが多かった。

2つのサブ集団の食餌を比較すると、MUOはシスチンとC22:0ベヘン酸の量が多く、MHO食はチロシン、ビタミンB3（ナイアシン）、ビタミンB6（ピリドキシン）の量が多いという特徴がみられた。

糞便揮発性物質

HS-SPME GC-MS分析を用いて、糞便サンプルのVOCを分析・定量した。アルデヒド、エステル、ケトン、インドール、テルペン、アルカンの各クラスに分類される揮発性代謝産物177種が同定された。具体的には、HCが112種類、MHOが98種類、MUOが96種類であった。そのうち89化合物はすべての評価群に関して100％の有病率を示したが、7化合物（すなわち、2-メチル-1-ブタノール、トリメチル-ピラジン、プロパン酸ブチルエステル、ブタン酸-2-メチルプロピルエステル、ジメチルペンタスルフィド、酢酸ブチルエステル、3-フェニルプロパノール）は肥満の2つのコホートで認められなかった。

ノンパラメトリックのウィルコクソン順位和検定とフォールドチェンジ（FC）分析を併用したグループ比較では、統計的に有意なVOCのリストが出現した。さらに、ボルケーノプロット（図3A）に示すように、MHO群はHC群と比較して、テトラデカン、2H-インドール-2-オン-1,3-ジヒドロ、2-トリデカノン、ベンゼンアセトアルデヒド、ブタナール-3-メチル-2、ガンマターピネンの量が少なかった。健常群に比べ、MUO群ではノナン酸、γ-テルピネン、シクロヘキサンカルボン酸、ペンタン酸、ブチルエステル、α-フェラドレン、フムレンの量が多く、2-ペンタデカノン、2-ウンデカノン、2-ヘキサデカノンの量が増加した（図3B）。最後に、ノナデカン、インドール、1H-ピロール-2,5-ジオン、3-エチル-4-メチル、2-ペンタデカノン、2-ウンデカノン、2-ヘキサデカノンは、MUOと比較してMHOでは低レベルであった（図3C）。

図3

ノンパラメトリックのウィルコクソン順位和検定と変化倍率（FC）分析から、統計的に有意なVOCが現れた。比較の方向を MHO/HC (パネル(A))、MUO/HC (パネル(B))、MHO/MUO (パネル(C))としたため、HC、MUO、MHO 群の代謝物濃度の増加および減少は、それぞれ下降 (青)、上昇 (赤) と表示された。log10（p値）は、各VOCの有意水準を意味し、log2 fold changeに対してプロットされている。これは2群間の各VOCの発現レベルの差を表している。

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SCFAの定量

SCFAのGC-MS分析が行われた。詳細には、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、イソ酪酸、およびイソ吉草酸が分析され、MHO群と比較してMUO群で濃度が低い（p値＜0.05）ブタン酸を除き（p値＞0.05）、統計学的な差は認められなかった（補足図S2）。

リアルタイムPCR

腸内細菌叢をできるだけ代表する常在菌を調べるために、ヒト腸内に生息する既知の属、群、種を同定するためのqPCRプライマーを選択した。qPCRコピー数の対数値は補足表S2に報告されている。調査した分類群間で有意差のあるものはほとんどなかった（図4）。

図4

健常人（HC）、代謝的に健常な肥満（MHO）、代謝的に不健康な肥満（MUO）の各サンプルコホート間の一対比較から得られた、統計的に有意なqPCR検査対象分類群。グループはBenjamini-Hochberg補正Welch'検定を適用して比較し、補正P値（q値）を報告した。

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詳細には、C. coccoides群はHC群よりも肥満群でCNのlog値が低かった。MHO群の腸内細菌叢は、HC群に比べLactobacillus属とLp.plantarumが増加していた。最後に、MUO群では、HC群およびMHO群に比べ、Prevotella属とDesulfovibrio属が多く、Lp. plantarumのCN logはHC群に比べ高かった。

考察

この観察的臨床研究は、統計的多変量解析の威力を利用したもので、影響の少ない変数ノイズを減らし、MHO、MUOおよびHCコホートを識別する最も寄与の大きい変数を選択するのに有用である。加えて、今回初めて、肥満患者と健常者のグループが、1日800＜x＜1200kcalの範囲のカロリー制限食に従った。これにより、検討されたサンプル層別化における食事療法の影響を低くすることができた。MHOとMUOの間では、BMIや体重を含むいくつかの重要な変数が共有されていたが、代謝プロファイルでは、2つの肥満表現型間のよく知られた違いが確認された。具体的には、MUOではHbA1c、HOMA-IR、総コレステロール、トリグリセリド、AST、ALT、FBGのレベルが高く、GFRとアルブミンレベルが低いことが検出され、内臓脂肪がインスリン感受性の低下、代謝の変化、低悪性度炎症と関連していることが裏付けられた。GFRの低下と低アルブミン血症も病的肥満と相関することが知られており、慢性腎臓病の発症リスクを高める。さらに、HCやMHOと比較してMUOで観察されるASTやALT酵素の高値は、肝疾患の存在と肝機能障害の進行を示している [13] 。

病的肥満の患者では、インスリン感受性が低下し、糖尿病予備軍やT2D糖尿病の診断マーカーであるHbA1cの値が高くなることが特徴である [14] 。

さらに、HOMA-IRはMHO患者に比べMUO患者で高く、我々の回転因子分析では2番目の高負荷因子（0.7以上）の一部として含まれていた。

MUOはMHOに比べてアルブミン値が低いことが報告された。血清アルブミン値の低下は、エネルギー摂取代謝の変化や肝障害のマーカーとして重要視されている。さらに、MUOではHCと比較して脂質異常症（トリグリセリドとコレステロールの増加）が認められた。

その他の炎症マーカーは、肥満患者における全身性炎症に関連する第一回転解析因子の一部、すなわちCRP、hsCRP、ESRであり、MUOではHCに比べて増加していた。これらの病的状態において、白血球と血小板がHCと比較して有意に増加したことがさらなる証拠となる。炎症に由来するサイトカインは、レプチンのようなアディポカインとともに、TSHの下垂体分泌増加とともに白血球増加を誘導する。このホルモンは、脂肪率、脂肪形成調節、食欲、インスリン抵抗性、および体重増加に影響を及ぼす [15] 。

さらに、予想されたように、MUO患者ではHCと比較してインスリンレベルが高く、肥満や炎症と関連していることが検出された [16]。

最後に、抗炎症および抗脂肪生成因子である25-OHビタミンDのレベルは、MUOではHC群と比較して有意に低下していた。ビタミンDは主に脂肪組織に貯蔵される脂溶性のメディエーターであり、肥満におけるその循環レベルの低下は、脂肪区画における体積希釈を反映している可能性がある［17］。注目すべきことに、MHO患者の25-OHビタミンD濃度は、HC被験者と比較して統計学的に有意な差を示さなかった。このことは、2つの肥満表現型において、脂肪組織の分布が異なることを示しており、このことは、因子の放出に異なる影響を与える可能性がある。

3群のカロリー範囲は同等であったが、特定の栄養素については統計学的に有意な差が見られた。肥満の両グループは、HCグループと比較して、デンプンとマンガンの摂取量が多かったが、総ミネラル塩、チアミン、オレイン酸の摂取量は少なかった。マンガンの過剰な血中濃度は内臓脂肪組織量の増加と正の相関を示し[18]、またMUFAの低摂取は肥満および代謝の高リスクと相関した[19]。

興味深いことに、MUO患者では、いくつかの微量栄養素の摂取量に差がみられた。甲状腺の問題を高めることが知られているヨウ素の摂取量が少なく [20]、血糖コントロールに有効なビタミンであり、病的肥満のBMIと逆相関するα-トコフェロールの摂取量も減少していた [21]。逆に、MUOでは、HCと比較して、脂肪形成特性を有し、脂肪蓄積と頻繁に関連するアミノ酸であるシスチン [22] の摂取量が多いことが観察された。興味深いことに、MUOではMHOと比較してシスチンの摂取量も多かったことから、このアミノ酸がこれら2つの異なる肥満表現型を区別する可能性が示唆された。MHOとHCの間では、代謝に有効なビタミンであるピリドキシン[23]と、心血管リスクと脂質異常症[24]を改善する潜在的な役割を持つナイアシンの摂取量は同等であったが、MUOではそうでなかった。

腸内微生物集団をターゲットとしたqPCR分析により、MHO個体はHC個体と比較してラクトバチルス属の存在量が高いという特徴が示された。MUOとMHOの微生物叢は、HCと比較してLactiplantibacillus plantarumの高いレベルを示した。ラクトバチルス属に含まれる種は有益な効果や抗肥満特性を発揮するが、いくつかの種は肥満と関連していることが研究で明らかになった [25]。Armougomら[26]は、肥満患者における乳酸菌の濃度と体重増加との間に、健康な被験者や拒食症の被験者と比較して相関関係があることを報告している。

さらに、MUOはMHOおよびHCと比較して、プレボテラ属およびデスルホビブリオ属の量が多いという特徴があった。先行研究では、肥満患者におけるPrevotella属の高い有病率が示され、代謝性肥満の両クラスで存在量の違いが観察された[27]。最近の文献では、制限的な地中海食がインスリン抵抗性の改善を伴うプレボテラ属菌の減少を示すことが報告されており [28]、同時に、プレボテラ属菌/バクテロイデス属菌比の増加が糖質代謝の重要な変化を含む代謝の変化を反映することが示されている [29,30]。

注目すべきは、BMIとウエスト周囲径の減少を含む食物繊維強化食の効果の検査で、プレボテラ属の増加量との強い相関が明らかになったことである [31,32,33]。

体重減少に対するこのような作用は、肝臓におけるプレボテラ属の活性の亢進に伴うSCFA、特にプロピオン酸［31］の高レベルに依存すると考えられる。さらに、プレボテラ属は血清コレステロールと肝脂肪生成を減少させる活性があり、抗炎症経路に作用するため、ヒトやげっ歯類の体重増加を防ぐことができる [34]。従って、我々のコホートではカロリー制限を行ったため、MUOではMHOやHCに比べてプレボテラが確実に増加した。

ラットモデルにおいて、プレボテラは空腹感を刺激することで知られるグレリンなどの食欲調節ホルモンと正の相関を示し、食欲不振ホルモンであるレプチンと負の相関を示したことから、摂食行動を制御しているようであった［35］。さらに、上述したように、レプチンは顆粒球の分化を促進し、病的肥満の低グレードの炎症を伴うよく知られたプロセスである白血球増加を誘導する [36]。一方、デスルホビブリオは様々な代謝異常と正の相関関係がある。さらに、この属はNAFLDの発症に関与しており、腸管透過性の亢進や肝細胞の脂肪蓄積に関与する遺伝子のアップレギュレーションを引き起こす可能性がある。

特筆すべきことに、肥満群では、HC群と比較してクロストリジウム・コッコイデス群の濃度が低いことが観察された。C.コッコイデスの役割についてはまだ議論の余地がある。ある研究では、肥満の悪化と正の相関があると報告され [39]、またある研究では、高脂肪食に暴露したマウスでは存在量が少ないと論じられている [40]。さらに、インスリン値およびHOMA-IRとの負の相関を越えて、この分類群はグレリン値と負の相関があることが判明した[7]。また、酪酸産生菌としてのこの分類群の有益な役割を支持する証拠もある [41]。実際、MUOで観察されたC. coccoides群の減少は、MHOと比較して糞便中のブタン酸量の減少を伴っていた。ブタン酸は、i)レプチン放出とインスリン感受性の増加、ii)高コレステロール血症と肝脂肪症の減少、iii)HOMA-IR指数の減少、iv)リポタンパク質の集合と運搬を制御する細胞イベントの調節に影響を与える。

糞便中の揮発性成分プロファイルによると、MUO被験者では、2H-インドール-2-オン-1,3-ジヒドロおよびノナン酸の濃度がHCと比較して有意に低いことが報告された。ノナン酸は、有益な効果と抗菌性に関連している[42]。2H-インドール-2-オン-1,3-ジヒドロは、アリール炭化水素受容体を活性化することが報告されており [43]、その活性化はサイトカインの誘導を防ぎ、肥満における損傷から腸管バリアの完全性を守る [44]。主要な有害心血管イベント [45] に関連する化合物であるインドールは、MHO群と比較してMUO群で高値を示した。

さらに、HCと比較してMUOでは、抗酸化作用、抗炎症作用、抗肥満作用を持つハーブに含まれるフムレン、γ-テルピネン、α-フェランドレンの量が少なかった[46]。

MUOグループは、有害な脂質や炎症メディエーターの合成を増加させることにより、インスリン抵抗性やT2Dと相関することが知られている2-ヘキサデカノンの誘導体であるヘキサデカン酸の濃度が高いことを報告した[47]。同様に、2-ウンデカノンは、L. plantarum[48]が産生する抗炎症作用や抗酸化作用を媒介する健康的な代謝産物であり、MUOで増加する。このケトンは、抗酸化反応に関与する核因子-kB（NF-kB）経路に関連するいくつかのタンパク質やサイトカインを阻害する[49]。したがって、MUOで観察された2-ウンデカノンとL. plantarumの多量摂取は、おそらく病的肥満に関連した炎症性環境と関連している可能性がある。ケトン化合物のうち、2-テトラデカノンは、対照群と比較して、MHO患者の糞便サンプルにはあまり含まれていなかった。そのエステル誘導体であるトリデカン酸エチルの抗酸化作用、抗炎症作用、抗糖尿病作用が報告された証拠もある[50]。さらに、トリグリセリドの生合成に関与する酵素であるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1を阻害することが知られている4-フェニルピペリジン-1-カルボニルシクロヘキサンカルボン酸の誘導体であるシクロヘキサンカルボン酸の濃度が、HCと比較してMUO群で低かった [51]。最後に、MUOではHCよりもペンタン酸ブチルエステル量の減少が観察された。この化合物は脂肪酸エステル誘導体クラスに属し、血清脂質プロフィールを調節し、脂肪細胞のアポトーシスを誘導することにより、肥満に対して有益な効果が報告されている[52]。

予備的ではあるが、われわれの調査方法にはいくつかの限界がある。ここで適用した分析戦略は、3日間の食事アンケートとして収集されたカロリー摂取量データに基づくもので、非摂食習慣のある被験者に関連するバイアスの導入を防止している。サンプル数に関しては、その説明的な性質から、MUOおよびMHO肥満患者を対象としたこの試験的調査は、統計的検出力計算に依存していない。

間違いなく、報告されたリアルタイムPCRの知見は、VOCsと糞便分類群との関連を決定的に強化するメタタクソノミクスの配列解析から得られるであろう。

結論

今回の観察研究では、1日の摂取カロリーを特定の範囲に設定した健康な対照ボランティアと比較して、代謝的に健康な肥満の被験者と不健康な肥満の被験者との臨床生化学的パラメータ、選択した腸内微生物分類群、および揮発性有機化合物における有意差を初めて分析した。強力な統計的根拠に基づいて行われたすべての解析により、MUOに特異的な臨床シグネチャーが確認され、代謝的に健康な肥満がいかに一過性の肥満表現型である可能性が高いかが強調された。これらのデータは、肥満に伴う代謝性合併症のモニタリングに有用な予後マーカーツールとなりうる。今後、肥満の発症と進行における腸内細菌異常症以外の分子メカニズムを解明するための研究が必要である。

データの利用可能性

本研究で使用されたデータセットおよび/または解析されたデータセットは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。

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資金提供

バーリ・アルド・モーロ大学（Università degli Studi di Bari Aldo Moro）のCRUI-CARE契約によるオープンアクセスファンドの提供。本論文は、イタリア大学研究省および欧州連合FSEより、PON Ricerca e Innovazione 2014-2020プログラムおよびFSC, Asse 2, Azione II, 2 Cluster - Ricerca industriale e sviluppo sperimentale - Area di specializzazione "Salute"-プロジェクト名の助成を受けた： BIOMIS - Costituzione della biobanca del intestinale microbiota salivare umano: dalla disbiosi alla simbiosi（助成金番号ARS0101220）。

著者情報

著者ノート

  1. F. M. CalabreseとV. A. Genchiは本論文に等しく貢献した。

著者および所属

  1. イタリア、バーリ・アルド・モーロ大学土壌・植物・食品科学部
    F. M. Calabrese、N. Serale、G. Celano、M. Vacca & M. De Angelis

  2. バーリ・アルド・モーロ大学、イタリア、バーリ、内科、内分泌学、アンドロロジー、代謝疾患部門-精密再生医学・イオニア地域学科
    V. A.ゲンキ、G.パルマ、F.ジョルジーノ、S.ペリーニ

  3. イタリア、バーリ・アルド・モーロ大学、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・環境学部
    M. スベルト

  4. イタリア、バーリ・アルド・モーロ大学、腎臓・透析・移植ユニット、精密・再生医療・イオニア地域学科
    L. ゲスアルド

貢献

構想およびデザイン： GF、PS、GL、SS、MDA。データの解析と解釈： FMC、GC、NS、VAG、MV、GP、SP。重要な知的内容についての論文の批判的修正： FMC、VAG、NS、SP。論文の最終承認： FMC、SP。

執筆者

M. De AngelisまたはF. Giorginoにご連絡ください。

倫理申告

利益相反

全著者を代表して、利益相反がないことを表明する。

倫理的承認

倫理委員会承認番号 0771/ 2020 project BIOMIS-endo n. 6278 (Project Code: ARS01_01220) ヒト腸内・唾液微生物バイオバンクの構築-肥満症。ClinicalTrials.GOV： NCT04698135。

インフォームド・コンセント

本試験は、試験実施前にインフォームド・コンセントを締結したヒト被験者を対象とした。

追加情報

出版社ノート

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補足情報

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権利と許可

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Calabrese、F.M.、Genchi、V.A.、Serale、N.ら代謝的に健康な肥満と不健康な肥満の表現型における腸内細菌叢と糞便揮発性分画の検査。J Endocrinol Invest(2024). https://doi.org/10.1007/s40618-024-02379-2

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  • 受理2024年1月11日

  • 受理2024年4月18日

  • 2024年6月21日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1007/s40618-024-02379-2

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