子羊のラムナル微生物叢から成長期の飼料効率形質を予測する

17巻6号、2023年6月、100824号
子羊のラムナル微生物叢から成長期の飼料効率形質を予測する

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1751731123001209?via%3Dihub

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https://doi.org/10.1016/j.animal.2023.100824Get 権利と内容
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ハイライト

ラムの飼料効率と生産量を予測するために、ルーメン微生物相を評価した。

ルーメン微生物叢から予測するためには、環境を考慮することが不可欠である。

ルーメン微生物叢は、飼料効率よりも飼料摂取量を予測する。

飼料効率を選択しても、ルーメン微生物叢は形成されなかった。

ルーメン微生物叢は、肉用羊の飼料効率の最適な代用品ではない。
概要
飼料効率の高い羊を選抜することで、畜産業の持続可能性を向上させることができる。しかし、ほとんどの羊の飼育会社は、飼料効率の良い動物を選択するために飼料摂取量を記録する余裕がない。過去の研究では、微生物叢のメタバーコードデータを含むオミックスデータが飼料効率の指標となる可能性が指摘されている。本研究では、残留飼料摂取量（RFI）について分岐選択された2つの系統のロマネ子羊277頭を対象としました。目的は2つあり、ルーメン微生物叢よりも飼料効率を選択した場合の結果を確認することと、宿主形質に対するルーメン微生物叢の予測能力を評価することであった。本研究では、対照的な2つの飼料（濃厚飼料と混合飼料）と2つの微生物群（原核生物と真核生物）を評価しました。判別分析では、残余飼料摂取量に関する羊の選択がルーメン微生物叢の組成に及ぼす有意な影響は強調されなかった。実際、原核生物および真核生物の微生物叢組成はRFI系統の識別に不十分であり、平均バランスエラー率は45%から55%であった。宿主形質（飼料効率および生産形質）と微生物叢データからの予測値との相関は、形質、飼料、シーケンスによって-0.07～0.56の間で変動した。飼料摂取量は最も正確に予測された形質であった。しかし、固定効果やBWからの予測は、微生物叢からの予測よりも正確であるか、それと同程度であった。環境効果は、微生物叢の組成の変動に大きく影響する可能性がある。微生物叢の予測能力を評価する際には、バッチ効果や環境効果を考慮することが最も重要である。本研究は、ルーメン微生物叢のメタバーコード化が肉用羊の生産形質を予測する最良の方法ではない理由を論証している。固定効果とBWはより費用対効果の高いプロキシであり、それらは微生物叢のメタバーコード化（16Sおよび18Sシーケンス）よりも同等以上の予測精度につながった。
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キーワード
肉用羊
マイクロビオーム
多変量解析
残留飼料摂取量
ルーメン
意味
小規模な企業では、個々の飼料摂取量の表現型が高価であるため、飼料効率を重視して羊を選択することは不可能な場合が多い。したがって、飼料効率の予測因子を探索することが重要である。本研究では、2種類の飼料を給与した277頭の成長期のロマーネ種羊を用い、ルーメン微生物相の飼料摂取量および効率に対する予測能力を証明した。しかし、ルーメン微生物叢のメタバーコード化は、飼料効率形質を予測するための最良の方法ではない。飼料効率を高めるための選抜は、微生物叢の存在量に影響を与えないようであった。
はじめに
飼料効率は畜産業において重要な要素であり、環境、経済、社会の多くの利害を包含している。反芻動物の飼料効率を向上させることで、飼料投入量を減らし、飼料と食品の競合を抑制し、羊の飼育による環境への影響を緩和することができる。さらに、飼料摂取量と給餌コストを下げることで、農家の収益性を向上させることができます（Cruz et al., 2010, Lima et al., 2017）。したがって、飼料効率の高い動物を選択することは、羊産業の持続可能性を向上させる1つの方法です。
残留飼料摂取量（RFI）は、Kochら（1963）によって提案された飼料効率基準である。この基準は、RFIが遺伝性形質であることから遺伝学でよく使用される。小型反芻動物における5つの研究のプールされたRFIの遺伝率は、0.32±0.15と見積もられている（Mucha et al., 2022）。しかし、飼料効率の基準が何であれ、摂取した飼料の量を個体レベルで知る必要があり、多くの羊の育種会社にとっては依然として高価すぎる。
飼料効率の高い羊の選択を広げるために、高価な飼料摂取量の記録を回避するための解決策として、プロキシを特定することができる。ウシやヒツジでは、ルミナルまたは血液中の代謝物が飼料効率と関連している（Artegoitiaら、2017、Goldansazら、2020、Touitouら、2022）。先行研究もメタバーコードデータに依存しています：18S（Zhangら、2020、Clemmonsら、2021）および16Sシーケンス（Ellisonら、2019、Marie-Etancelinら、2021）の両方で、反芻動物の飼料効率のバイオマーカーとして微生物クラスターをピンポイントで特定できました。
微生物叢データ（16Sまたは18S）を用いて羊の飼料効率のバイオマーカーを探す一方で、ほとんどの研究は少数の動物（<50）を対象としていました。これらの動物は、飼料効率の表現型に従って、より大きな集団から選択されることが多い。極端な表現型を持つ少数の子羊ではなく、多数の子羊を使用した場合の微生物叢データからの飼料効率の予測精度については、まだ知識のギャップが残っています。また、飼料効率の予測精度は、飼料（濃厚飼料か混合飼料かなど）によっても異なる可能性があります。さらに、異なる年に羊を飼育した場合に、一般化できる微生物の特徴を特定できるかどうかは不明である。予測因子の一般性を評価するには、数年にわたる研究が最も重要です：飼料、農法、または気候条件などの環境効果は、微生物叢の構成に影響を与える可能性があります（Hendersonら、2015、Belancheら、2019、Liら、2019、Andersonら、2021、Marie-Etancelinら、2021、Weiら、2021）。
本研究では、濃厚飼料下のRFIで乖離選抜された2つのRomane系統の雄羊を対象とした。この集団では、RFIの遺伝率は中程度であることが判明した（h2 = 0.45 ± 0.08, Tortereau et al., 2020）。
我々は、飼料効率を選択することで、ラムの消化に寄与するルーメン微生物叢を形成する可能性があり、ルーメン微生物叢は飼料効率の代理として考えることができるという仮説を立てた。したがって、我々の目的は、RFIを選択することで子羊のルーメン微生物叢が変化するかどうか、またルーメン微生物叢が飼料効率の妥当な代用品として考えられるかどうかを明らかにすることであった。これらの調査は、2つの対照的な食餌の下で行われた。
材料と方法
動物たち
本研究は、2018年から2020年にかけて、INRAE実験ユニットP3R（UE 332協定D18-174-01；Osmoy、フランス、https://doi.org/10.15454/1.5483259352597417E12）において、Romane雄の子羊について実施した。
異質な系統
研究対象となった動物は、RFIに関するより大規模な乖離性選択のデザインの一部であった。2009年以来、飼料効率は100％濃厚飼料下でRomane雄の子羊で表現型が決定された。2015年、分岐選択実験が開始された：Tortereauら（2020）に記載されているように、RFIの増加（最小飼料効率ライン、RFI+）またはRFIの減少（最効率ライン、RFI-）のために2つの分岐ラインが選択された。簡単に説明すると、100％濃厚飼料下でRFIについて動物を分岐選択した。遺伝的評価のために、2009年以降に表現型を決定した1900頭の雄羊と雌羊のRFIをTortereauら（2020）に従って算出した。そして、遺伝率0.45（Tortereau et al.、2020）、6 419頭の羊の血統を考慮し、PESTソフトウェア（Groeneveld et al.、1990）で推定繁殖価（EBV）を計算した。混合モデルでは、固定効果として、ペン、哺乳方法（母性または人工）、子羊のサイズ、表現型決定の年、性別を説明した。
2015年から毎年、濃厚飼料下でRFI繁殖値が最低と最高の10～14頭のラムを選抜し、次世代選抜を行うための交配を行った。交配は分岐系統内で計画された：極端なRFI値を持つ雄羊が選ばれ、近親交配を最小限に抑えるために選ばれた雌羊と交配された。1世代の選抜を完了するのに2年間が必要であった。
飼育方法および表現型決定プロトコル
本研究では、上記の分岐系統から得られたRomane雄羊の一部のみを対象とした。第2世代の一部は2018年（103匹の子羊）に、第3世代は2019年（101匹の子羊）および2020年（73匹の子羊）に表現型を決定した。2018年にフェノタイプされた子羊の一部は、2020年に調査された子羊に種付けされた。平均して、7.7頭の雄の子羊が、研究において同じ種牡馬を共有した。
実験デザインは図1に示されている。動物は木材チップのリターを用いた屋内で飼育され、2つの異なる飼料（1つ目は濃厚飼料のみ、2つ目は混合飼料）を連続的に与えた。
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図1. 子羊のフェノタイピングの実験デザイン。略号は以下の通り： C-diet： C-diet：100%濃厚飼料、EBV：推定育種価、M-diet：2/3の飼料と1/3の濃厚飼料を含む混合飼料、RFI：残留飼料摂取量、RFI-：残留飼料摂取量が少ない効率的な系統、RFI+：残留飼料摂取量が多い非効率な系統、w：週。濃厚飼料および混合飼料で順次表現型を決定した。混合飼料では、毎年2つの時期に2つのグループの動物が表現型判定を受けた。RFIのEBVは濃厚飼料下で計算された。濃厚飼料でRFIのEBVが低いラムを交配してRFI-系統とし、RFIのEBVが高いラムを選抜してRFI+系統とした。平均年齢は週単位で表示されています。
濃厚飼料下でのフェノタイピング-毎年、実験ユニットで生まれた子羊を約10週齢で実験牛舎に集めました。その後、子羊は100％濃厚飼料（ad libitum diet）と自動給餌器による分配に適応させた（飼料栄養価については補足表S1-Aを参照）。
飼料摂取量は、平均17週齢から23週齢までの6週間、自動濃厚飼料供給装置を用いて記録された（図1）。年によって異なるが、子羊は喧嘩を防ぐために、同程度の体重を持つ約20頭の子羊からなる4～6個のペンにグループ分けされた。濃厚飼料供給装置は1ペンにつき1台用意された。2018年から2020年まで、合計277頭の子羊が濃厚飼料下で表現型判定を受けた。
飼料組成の年次変動を考慮し、飼料摂取量と飼料エネルギー密度から正味エネルギー摂取量を計算した。飼料のエネルギー密度はINRA 2007システム（Baumont et al.、2007）を用いてメガジュールの純エネルギーで推定した。濃厚飼料による1日平均エネルギー摂取量（ADEIC）は、6週間にわたる1日のエネルギー摂取量の平均値として算出した。記録期間終了時に、背部超音波測定を行い、最長筋深度（MDC）および背部脂肪厚（BFTC）を評価した。開始時および終了時の体重を記録し、6週間の平均日増体量（ADGC）の算出に使用した。2つの飼料効率特性を計算した：飼料転換率（FCRC）はADGCに対するADEICの比率として、REICは特徴的なエネルギー吸収源に対するADEICの線形回帰の残差として（式（1））：（1）ADEIC=μC+β1,CADGC+β2,CfinalBWC 0.75+β3,CMDC+β4,CBFTc+REIC ここでμCは平均ADEICを示す．β1,C～β4,Cはそれぞれ、以下の4つの共変量効果を表す： ADGC、最終代謝体重（finalBWC0.75）、MDCおよびBFTCである。最後に、REIcは1日あたりの摂取純エネルギーのメガジュールで表される残余エネルギー摂取量である。
混合飼料下でのフェノタイピング - 最初の6週間試験の後、動物は自動給餌器によって供給される混合飼料に6週間適応させた。2018年には、制限付き濃厚飼料フィーダーは利用できず、したがって、飼料フィーダーは、自由行動的な総混合飼料（33％の濃厚飼料、67％の乾草）を供給した。2019年と2020年には、自動濃厚飼料フィーダーが濃厚飼料への制限されたアクセスを確保し（最大700g/日）、飼料フィーダーはアドリビタムの乾草を別々に供給した（飼料栄養価は補足表S1-Bを参照）。
施設の制限（同時に最大35〜40頭の子羊）により、濃厚飼料下で極端なRFI EBVを有する子羊のみが、その後、混合飼料下で表現型判定された。2018年と2019年には、1年に2つの異なる期間、すなわち夏期（期間1、29週齢から35週齢まで）または秋期（期間2、37週齢から43週齢まで）に動物を分割しました（図1）。2020年は、秋（期間2）に1群のみ表現型検査を行った。1つの期間内に、動物はBWごとに2つのペンに振り分けられ、1ペンあたり平均16匹が飼育された。各ペンは、2019年と2020年には、2つのフォレージフィーダーと1つの濃厚フィーダーを備えていた。3年間で、166頭の子羊を混合飼料下で表現型判定した。
ADEIM、ADGMおよびREIMは、以前の濃厚飼料下で行われたように、混合飼料下で推定された。しかし、この6週間の間にADGMがゼロまたはマイナスとなった個体がいたため、混合飼料ではFCRMは算出されなかった。
データクリーニングと宿主表現型の概要
飼料効率（REI、FCR）、エネルギー摂取量（ADEI）、成長率（ADG）および体組成（MD、BFT）形質に基づいて、1つの飼料下で異常値を特定した。表現型の1つが範囲[μ - 3 SD; μ + 3 SD]の外にあるとき、その動物を飼料データサブセットから除外した（ここで、μは平均表現型である）。濃厚飼料で8頭（277頭の子羊のうち）、混合飼料で3頭（166頭のうち）がフィルターにかけられた。
線形回帰は、Rソフトウェア（バージョン4.1.2）（R Core Team, 2021）に含まれるlm関数を用いてフィッティングした。濃厚飼料下で記録されたすべての形質（Trait�）を以下のように回帰した：（式（2））TraitC＝μTraitC＋β1，Cline＋β2，Cage＋β3，Csuckling＋β4，Cyear＋β5，Cpen|year＋εC ここでμTraitCは形質平均を表す。β1,C〜β5,Cはそれぞれ、系統、年齢、哺乳、年、年に入れ子になっているペンの効果を表している。最後に、εCはモデル残差を表す。
混合飼料で記録された形質も同様に回帰した（式（3））：(3)TraitM=μTraitM+β1，Mline+β2，Mage+β3，Mear+β4，Mperiod|year+β5，Mpen|period|year+εM ここでμTraitMは形質平均を表している．β1,M〜β5,Mはそれぞれ、系統、年齢、年、年に含まれる期間、期間と年に含まれるペンの効果を表し、εMはモデル残差である。次に、回帰解（式（2）、（3））を用いて、emmeans Rパッケージ（バージョン1.7.3）（Lenth、2022）を用いてラインおよびホスト形質ごとの最小二乗平均を算出した。RFI系統間の形質の比較は、Tukey検定で行った。多重検定を考慮し、P値はBenjamini-Hochberg手順（Benjamini and Hochberg, 1995）で飼料ごとに補正した（濃厚飼料では7形質、混合飼料では6形質）。
16Sおよび18SリボソームRNA遺伝子の塩基配列決定
毎年、各飼料摂取記録試験の終了時にルーメン液サンプルを採取した。サンプリングは、訓練を受けたスタッフが、医療用胃管を真空ポンプに接続して実施した。ルーメン液サンプルは、直ちに液体窒素で凍結した。
DNA 抽出および塩基配列決定
微生物液サンプルのDNA抽出、増幅および配列決定は、2つの異なるバッチで実施した：2018年および2019年のサンプルを含むバッチと、2020年のサンプルを含むバッチであった。各バッチ内で、FastPrepデバイス（MP Biomedicals, Illkirch, France）を用いてビーズビーティングステップを実施した。その後、85μLのラムネ液からQIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen Ltd, West Sussex, UK）を用いてDNAを抽出した。
16SリボソームRNA遺伝子のV4-V5領域を、フォワード515F（5′-CTCCCTACGACCTTCCGATCTGTGYCAGCMGCCGCGGTA-）で増幅させた。 3′）およびリバース928Rプライマー（5′-GGAGTTCAGACGTGCTTCCGATCTCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′）（Wang and Qian．2009）を用いて30回のPCRサイクルを行った。サンプルをバーコード化するために、フォワードプライマー（5′-GTGYCAGCMGCC-3′）とリバースプライマー（5′-CCCGYCAATT-3′）、およびアダプターを用いた2度目の増幅（12サイクル）中に、6塩基対のインデックスを928Rプライマーに追加した。250塩基対のオーバーラッピングペアエンドリードを作製し、Illumina MiSeqテクノロジー（Illumina, San Diego, CA, USA）でアライメントして全長リードを得た。
18SリボソームRNA遺伝子のV4領域は、フォワード566F（5′-CTCCCTACGACGCTTCCGATCTCAGCAGCCGCGTAATTCC-）で増幅した。 3′）およびリバース1200Rプライマー（5′-GGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCTCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGC-3′）（Hadziavdic et al. , 2014）で30PCRサイクルを行った。サンプルをバーコード化するために、フォワードプライマー（5′-CAGCAGCCGCGTAATTCC-3′）およびリバースプライマー（5′-CCCGTGTTGAGTCAAATTAAGC-3′）による第2の増幅（12サイクル）中に、6塩基対のインデックスを1200Rプライマーに付加した。250塩基対のオーバーラップおよび非オーバーラップペアエンドリードが生成されました。
多重化および増幅後、16Sおよび18Sリードを精製し、Illumina MiSeqカートリッジ（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）にロードして、Genomic and Transcriptomic Platform（INRAE、トゥールーズ、フランス）で配列決定された。
配列のバイオインフォマティクス処理
配列決定後、16Sおよび18SリードをFROGSツール（バージョン4.0.1）で別々に処理した（Escudié et al.、2018）。しかし、両方の配列セット内では、異なる飼料および配列決定バッチからのリードを一緒に処理した（ステップ1、図2）。リード処理は、以下のパイプラインで行った：（i）脱多重化；（ii）18Sアンプリコン配列のみの再構成；（iii）プライマーの存在、曖昧塩基、サイズに基づくアンプリコンの品質管理（16Sアンプリコンについては380塩基対以上および500塩基対未満；18Sアンプリコンについては200塩基対以上および490塩基対）；（iv）各集合ステップにおける配列間の差1を用いたSwarmアルゴリズムによる運用分類単位（OTUs）へクラスタリング（Mahé et al、 2014）、（v）キメラ除去、（vi）全配列の0.005％未満を集約したOTUを除去したプレフィルタ、（vii）BLAST+（Camacho et al., 2009）および細菌と古細菌についてはSilva 132 16S参照データベース、真菌と原虫についてはSilva 138.1 18Sデータベースによる所属分類（Quast et al., 2013）.
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図2. ラム微生物群のデータ処理から統計的学習・推論までのワークフロー。略語 OTU: operational taxonomic unit、PCA: principal component analysis、RFI: residual feed intake、sPLSDA: sparse partial least squares discriminant analysis、sPLSR: sparse partial least squares regression. 微生物叢の前処理ステップには1から6までの番号を付けている。微生物叢の組成をOTUレベルで調査した。組成の主な変動因子はPCAで同定した。予測モデルには、sPLSDAとsPLSRの2種類を使用した。精度は、補正t検定で比較した。RFI系統は、RFIの推定育種価が低下または上昇するように選抜された。宿主形質には、飼料効率、飼料摂取量、成長および体組成形質が含まれる。
シーケンスデータのクリーニングと概要
データクリーニングとその後の解析（ステップ2-6、図2）のために、4つの異なる組成データセットを考慮した：飼料（濃厚飼料または混合飼料）および増幅遺伝子（16Sまたは18S）ごとに1つ。次に、シーケンスデータをサンプルとOTUレベルでフィルタリングした。シーケンスの深さが小さいサンプルは、低いOTUリッチネスと、観察されたOTUの数の間の小さな変動と関連していた（補足図S1）。したがって、7 500リードより小さい深さのサンプルは破棄された（ステップ2、図2）。OTUフィルタリングは、考慮した食事の下で20％より低い有病率を持つOTUを除去することによって行われた（ステップ3、図2）。データクリーニング前後のシーケンスリードとOTUの数は、補足表S2に報告されている。
微生物叢の組成を概観するために、OTUの種の配列と記述統計は、補足表S3（16Sデータ）および補足表S4（18Sデータ）にある。また、phyloseq Rパッケージ（McMurdie and Holmes, 2013）を用いてOTUをフィラごとに再グループ化した後、フィラ平均相対存在量を計算した。次に、OTUレベルで、教師なし学習を用いて、微生物の存在量を駆動する主な変動パターンを特定した（解析A、図2）。主成分分析（PCA）の前に、組成と配列の影響を考慮するために、いくつかの前処理を実施した。OTUのNull存在量は、Geometric Bayesian Multiplicative replacement procedure（ステップ4、図2）でインプットした（Martín-Fernández et al.、2015）。次に、OTUの存在量を用いてCentered LogRatio（CLR）変換を実施した（ステップ5、図2）。CLR座標値は、ロバストMM回帰（Maechler et al.、2017）を用いてシーケンシング効果について一変的に調整した（式（4）、ステップ6、図2）。ロバストMM回帰は、最小二乗直線回帰よりも外れ値の影響を受けにくいので好まれた。 (4)����=�0,�+�1,�seqdepth+�2,�seqbatch+�3,�seqbatch|����+�� ここで���は第i OTUのCLR 値を示す。そして、�0,�は切片を表している。また、�1,�から�3,�は、それぞれシーケンスの深さ、シーケンスのバッチ（n＝2）、バッチにネストしたシーケンスプレート（n＝5）の影響を表しています。最後に、��は残差（residuals）を表す。残差は、mixOmics Rパッケージ（バージョン6.18.1）（Rohart et al., 2017）を用いて主成分（PC）を定義するための調整CLR値として使用された。
スパース部分最小二乗法による判別分析および回帰分析による予測
スパース部分最小二乗判別分析（sPLSDA）または回帰分析（sPLSR）を行い、多変量解析を用いて、微生物叢データを用いてRFI系統および宿主形質をどの程度予測できるかを評価した（解析B、図2）。
前処理について
sPLSDAおよびsPLSRは、シーケンシング効果について調整したCLR値について、mixOmics Rパッケージ（バージョン6.18.1）（Rohart et al., 2017）を用いて実施した（ステップ4-6、図2）。
スパース部分最小二乗法判別分析
sPLSDAをRFIラインの予測に実施し、ルーミナルマイクロバイオータが効率的な動物対非効率的な動物を予測できるかどうかをチェックした。
sPLSDAでは、グリッド検索とクロスバリデーションを通じて、2つのハイパーパラメータを調整した：成分の数と成分ごとの選択変数の数。1～20成分の保持を、1のステップでテストし、成分ごとに2～9の変数を選択し、1のステップで、10～最大数の変数を選択し、10のステップでテストしました。ハイパーパラメーターを評価するために、5重のクロスバリデーションを50回繰り返した。RFIラインと同時期のグループを示す結合因子は、createMultiFolds関数（Kuhn, 2008）によりクロスバリデーション集合を層別化するために使用された：つまり、すべてのライン、ペン、年がすべての集合で、同様の割合で表現されている。チューニング基準はバランスエラー率（BER）で、RFIラインのエラー率の平均として計算した（式（5））：（5）BER=12×�＋�＋�で、a、b、c、dはそれぞれ偽予測RFI-、真の予測RFI＋、偽予測RFI＋、真の予測RFI-を示す。
最終的なハイパーパラメータの選択には、以下の経験則が用いられた：平均BERが1標準誤差減少した場合、より複雑なモデル（すなわち、より多くのコンポーネントおよび/またはより多くの選択変数を有する）が保持された（Kuhn and Johnson, 2013）。選択されたモデルの平均BERを報告する。
スパース部分最小二乗法回帰
sPLSRは、連続的な子羊の形質：飼料効率（REI、FCR）、エネルギー摂取量（ADEI）、成長率（ADG）、体組成形質（MD、BFT）の予測に使用した。その目的は、各飼料の下で飼料効率とその構成要素をどれだけ正確に予測できるかを確認することでした。
sPLSRでは、sPLSDAと同じ2つのハイパーパラメータをチューニングする必要があった。したがって、同じグリッドサーチとクロスバリデーション戦略を実施した。チューニングの基準は、二乗誤差の平均値の平方根であるRMSEであった。平均した RMSE が 1 標準誤差だけ減少した場合、より複雑なモデル（より多くのコンポーネント、またはコンポーネントごとにより多くの変数を持つモデル）が保持されました。異なる精度基準を計算し、折り目と繰り返しについて平均化した： 選択したモデルの真の値と予測値の間のピアソンおよびスピアマン相関、RMSE、平均絶対誤差、決定係数、およびバイアス。すべてのメトリクスは、補足表S5に報告されている。
異なる予測因子セットからの予測精度の比較
ラム系統または形質を予測するために、3つの予測因子セットを検討した：(i) 第1セットは、16Sまたは18S調整されたCLR値のいずれかを含む。(ii) 第2のセットは、系統的効果：哺乳方法（濃厚飼料のみ）、表現型決定期間（混合飼料のみ）、年、ペン、年齢、最終BWを含む。(iii) 最後に、3つ目の予測変数のセットは、16Sまたは18S OTUの系統的効果およびCLR値を含んでいた。
異なる予測変数のセットで適合したモデルは、予測される形質とデータサブセットごとに比較された。モデル精度間の差は、補正t検定（Bouckaert and Frank, 2004）で検証した（解析C、図2）。そして、P値は予測形質とデータサブセットごとにBenjamini-Hochberg手順で調整した。
結果
データ概要
子羊の表現型形質
飼料効率形質とその構成要素について、記述統計は、2つのRFI分岐系統について計算された最小二乗平均値とともに、表1に示されている。
表1. 羊肉形質の統計的概要と残余飼料摂取量系統の最小二乗平均値。
空セル空セル母集団統計4ライン最小二乗平均5空セル食事1
(n2)Trait3MeanSDMinMaxRFI-RFI+Adj. P6C-diet (269)REIC, MJ/day0.0000.756−1.7012.070−0.3530.337<0.001FCRC, MJ/g0.0340.0060.0210.0550.0320.035<0. 001ADEIC, MJ/day10.981.387.3714.1410.5011.45<0.001Final BWC, kg56.626.7139.7478.8555.6957.49<0.001ADGC, g/day331581505013333310.927BFTC, mm5.70.83.98.35. 85.80.927MDC, mm28.12.222.135.028.028.60.029M-diet (163)REIM, MJ/day0.0000.899−2.7402.222−0.2030.1250.013ADEIM, MJ/day8.061.224.3110.507.778.230. 008最終体重、kg64.495.8047.8077.9063.7464.720.196ADGM、g/日12367-582641211280.386BFTM、mm4.50.82.96.94.64.40.196MDM、mm27.32.420.834.027.5270.496
略号 ADEI：1日平均エネルギー摂取量、ADG：1日平均増体量、BFT：背脂肪厚、C-diet：濃厚飼料、FCR：飼料転換率、M-diet：混合飼料、MD：筋肉深度、REI：残留エネルギー摂取量、RFI-：残留飼料摂取量が少なく効率の良いライン、RFI＋：残留飼料摂取量が多く非効率なライン．
1
C-diet：羊に100％濃厚飼料を給与、M-diet：羊に2/3の飼料と1/3の濃厚飼料を含む混合飼料を給与。
2
頭数。
3
添え字は、形質食を表す： CはC-diet、MはM-diet。
4
交絡効果を調整しない、生の表現型に基づく記述統計。
5
最小二乗平均は、残留飼料摂取量について分岐選択された子羊の系統について計算したものである。形質は、年齢、哺乳方法（C-dietのみ）、年、ペン、表現型決定期間（M-dietのみ）で調整した。
6
Tukey's testで調整したP値。Benjamini-Hochberg手順は、飼料ごとに適用した。
濃厚飼料（17～23週齢）のもとで、子羊は1日あたり平均10.98MJの純エネルギーを摂取し、330.91g/日成長した。その結果、平均 FCRC は 0.03 MJ/g となった。混合飼料（29～35週齢、または37～43週齢）では、羊は1日あたり平均8.06MJの純エネルギーを消費した。混合飼料では、ADGMの値がマイナスとヌルの場合があったため、FCRは計算されなかった。濃厚飼料では-0.95 MJ/日、混合飼料では-0.46 MJ/日の減少で、飼料に関係なくRFI-動物の摂取量は有意に少なかった。
研究対象の動物を考慮すると、2つのRFI系統間の乖離は、RFIC最小二乗平均値の1.86遺伝的SDに等しかった。飼料に関係なく、RFI系統の動物はより飼料効率が高く、RFI系統間の残留エネルギー摂取量の差は、混合飼料では0.33MJ/日に対し、濃厚飼料では0.69MJ/日の純エネルギーに等しかった。濃厚飼料では、FCRcの差も大きく、RFI+はRFI-より0.31MJ/日の正味エネルギー摂取量が多く、100g/日成長した。
飼料にかかわらず、成長（ADGCまたはADGM）およびほとんどの身体組成形質（BFTC、BFTM、またはMDM）について、2つのRFI系統間に有意差は見られなかった。MDCのみ2系統間で有意差があった： RFI-動物ではMDが0.56mm低くなっていた。濃厚飼料を与えた場合の最終的な体重は、RFI-系統が有意に軽かった（約23週齢の時点で平均-1.8kg）。その後、混合飼料で飼育した場合、両系統の体重の差はもはや有意ではなかった（調整P値=0.196）。
微生物叢のデータ
データクリーニング後、16Sシーケンスの582および1148のOTUが濃厚飼料および混合飼料下でそれぞれ残り、一方、18Sシーケンスの場合は、2つの飼料下でそれぞれ124および183のOTUが残された。
OTUはその門派の所属によってクラスタリングされ、平均門派相対存在量は図3に報告されている。16S配列決定では、濃厚飼料ではバクテロイデーテス門（図3A）、混合飼料ではファーミキューテス門（図3C）が最も多く、ユーラシア門はいずれの飼料でも3番目に多い門であった。18S配列決定では、飼料に関係なく（図3BとD）、繊毛虫門が大部分を占め、相対量は87〜96％であった。
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図3. ラムのラム液における、シーケンシングおよび食餌ごとの平均的な門類存在量。相対的な門の存在量は、データクリーニング後に、飼料とシーケンスごとに計算した。(A）濃厚飼料での16Sシーケンス、（B）濃厚飼料での18Sシーケンス、（C）混合飼料での16Sシーケンス、（D）混合飼料での18Sシーケンス。分類学的所属は、Silva 132 16SおよびSilva 138.1 18Sデータベースに基づいています。古細菌、細菌、真菌、原生動物に属する分類群は、それぞれ青緑、紫、濃紺、赤で表されている。
PCAにより、微生物叢組成の主な変動パターンを特定することができた（図4）。濃厚飼料では、2番目のPCの変動は、16Sデータで子羊の表現型を決定した年と関連していた（分散の5%を説明、図4A）。混合飼料では、シーケンスに関係なく、第一のPCの変動は、ほとんどが表現型決定期間と関連し、その後、より少ない程度で年と関連するようであった（図4C、D）。記録された変数（サンプリング時年齢、離乳時年齢、サンプリング順序、ペン、哺乳方法、RFIライン）はいずれも、他のPCと関連していなかった。濃厚飼料下での18Sデータについては、変動の主な要因は特定できなかった（図4B）。
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図4. 子羊のルーミナル微生物群の主成分分析（飼料およびシーケンサーごと）。略語： CLR：中心対数、expl.var：説明済み分散、OTU：運用分類学的単位、PC：主成分。解析は、シーケンス効果で調整したOTU CLR値で、食事およびシーケンスごとに実施した。(A）濃厚飼料下での16Sシーケンス；（B）濃厚飼料下での18S；（C）混合飼料下での16S；（D）混合飼料下での18S。2018年、2019年、2020年に表現型決定された動物は、それぞれ、点、十字、菱形で表される。混合飼料下では、第1期と第2期に表現型を決定した動物をそれぞれ紺色と赤色で表しています。
スパース部分最小二乗モデルの予測精度
残留飼料摂取量の行の予測
予測因子、食餌、シーケンスにかかわらず、RFIラインを予測する場合、sPLSDAのBERは常に高かった（0.35から0.55まで）（表2）。
表2. 固定効果、BWおよび/または微生物相データから子羊のresiduaI飼料摂取ラインを予測する際のバランスエラー率
空セル予測因子セット3Diet1シーケンス（n2）MSS + MC-diet16S（269）0.46a (0.06)0.38a (0.05)0.46a (0.06)18S (205)0.47b (0. 07)0.35a (0.06)0.43ab (0.06)Mダイエット16S (160)0.55a (0.08)0.47a (0.07)0.53a (0.08)18S (161)0.45a (0.08)0.49a (0.07)0.45a (0.08)
略号 C-diet：濃厚飼料、M：微生物群、M-diet：混合飼料、S：系統的効果、S＋M：微生物群＋系統的効果。
予測は、スパース部分最小二乗法による判別分析で実施した。バランスエラー率は、50回繰り返した5倍クロスバリデーションの平均値である。SDは括弧内に示す。
1
食事療法 C-diet：羊に100％濃厚飼料を与え、M-diet：羊に混合飼料（2/3が飼料、1/3が濃厚飼料）を与えた。
2
サンプル数。
3
予測因子のセット。M：16Sまたは18S操作分類単位の調整済み中心化対数値；S：系統効果、すなわち固定効果と最終BW；S + M：系統効果と16Sまたは18S操作分類単位の調整済み中心化対数値．
a,b
文字が異なるバランスエラー率は有意に異なる（補正t検定P値＜調整後0.05）。比較およびBenjamini-Hochberg調整は、食餌および配列ごとに行った。
系統効果には固定効果および最終BWを含む。系統的効果からのRFIラインの予測は、微生物叢データからの予測より有意に悪いことはなかった（すなわち、平均化されたBERがより高い）。固定効果およびBWデータに微生物叢データを加えても、BERが有意に低下することはなかった。
宿主形質の予測
固定効果とBWおよび/または微生物相のデータを用いて、sPLSRで宿主形質を予測した。実際の形質と予測値の間のピアソン相関は図5に、その他の指標は補足表S5に記載されている。
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図5. 子羊の飼料効率、生産形質、系統的効果および/または微生物相データからの予測との間の平均ピアソン相関。略語 ADEI：1日平均エネルギー摂取量、ADG：1日平均体重増加、BFT：背脂肪厚、FCR：飼料転換率、M：微生物叢、MD：筋肉深度、REI：残留エネルギー摂取量、S：系統効果、S＋M：微生物叢＋系統効果。予測は、スパース部分最小二乗回帰で実施した。ピアソン相関は、50回繰り返した5倍クロスバリデーションの平均値である。エラーバーは1SDに相当する。(A)濃厚飼料での16Sシーケンス；(B)濃厚飼料での18Sシーケンス；(C)混合飼料での16Sシーケンス；(D)混合飼料での18Sシーケンス。M：16Sまたは18S操作分類単位の調整済み中心化対数値（緑）、S：固定効果と最終BWを含む系統効果（青緑）、S＋M：系統効果と16Sまたは18S操作分類単位の調整済み中心化対数値（紫）で、3セットの予測因子がテストされました。形質は濃厚飼料（C 添え字）または混合飼料（M 添え字）で記録した。 a,b,c 文字が異なる相関は有意に異なる（補正 t-test P-value < 0.05 after adjustment）。比較およびBenjamini-Hochberg調整は、形質、食餌および配列ごとに行った。
微生物叢データのみからの予測 - 濃厚飼料で、16S（図5A）または18S（図5B）データから宿主の飼料効率を予測した場合、実際の形質と予測値の平均相関は、REICではほぼゼロ（16Sでは0.11、18Sでは0.06）、FCRCでは低から中程度（16Sでは0.35、18Sでは0.16）だった。混合飼料では、REIMを予測すると平均相関が低くなった（16Sで0.35、18Sで0.17）（図5C、D）。
飼料効率の各要素を予測した場合も、飼料とシーケンスデータセットによって、平均ピアソン相関が異なる結果となった。16Sまたは18Sのデータで摂取量（ADEIC、ADEIM）を予測すると、相関の幅は大きく、濃厚飼料では18Sで0.05、混合飼料では16Sで0.56となりました。同様の結果が成長形質（ADGCまたはADGM）でも得られ、相関は濃厚飼料での18Sデータとの0.15から混合飼料での18Sデータとの0.38までであった。最後に、体組成形質（BFTC、BFTM、MDC、MDM）と微生物叢予測との平均相関は、ほぼゼロと中程度の値の間で変動した：18Sデータから予測されたBFTCの-0.07から16Sデータから予測されたBFTMの0.45まで。
系統的効果からの予測 - 食事、形質、シーケンスに関係なく、系統的効果からの予測の平均相関は0.31から0.84の範囲であった。さらに、ほぼすべての記録された形質について、相関は16Sまたは18Sデータのみから得られた予測値よりも有意に高かった。例外は3つだけで、FCRCとMDMを16Sまたは系統的効果から予測した場合と、ADGMを18Sまたは系統的効果から予測した場合で、同様の精度に達した。
微生物叢と系統的効果からの予測 - 最後に、微生物叢データを固定効果および最終的なBWと組み合わせても、固定効果およびBWからの予測と比較して、相関が有意に改善することはありませんでした。ほとんどの相関は、有意な差はなかった。しかし、16Sデータと系統的効果を組み合わせて予測した場合、いくつかの相関は有意に低下した： ADEIC（平均-0.05単位）、ADEIM（-0.11）、ADGC（-0.19）。同様の減少は、18SデータでFCRC（-0.18）、ADEIC（-0.04）、ADGC（-0.24）を予測する際にも観察された。
考察
肥育羊のルーメン液から抽出したDNAは、原核生物の検出のために16SリボソームRNA遺伝子を、真核微生物の研究のために18SリボソームRNA遺伝子の塩基配列を決定しました。これにより、本研究は、対照的な2種類の飼料を連続して与えた150頭以上の子羊において、両方のタイプの微生物を同時に定量化した数少ない研究のひとつとなりました。
ルーメン微生物叢は飼料効率化の選択によって変化しなかった
我々の結果は、飼料に関係なく、RFIの継続的な選択によってルーメン微生物叢の存在量（原核生物または真核生物の両方）が変化しないことを示唆しています。
RFIラインを予測するために、複数のOTUを組み合わせた微生物シグネチャーを、sPLSDA多変量フレームワークを用いて調べたところ、低い予測能力（BER > 0.45）も確認されました。ルーメン微生物相が選択されたラインをうまく予測できないことから、ルーメン微生物相とRFIラインの関係は疑われます。同様に、乳用羊では、乳汁中の体細胞数または乳汁持続性についての分岐選択は、ルーメン微生物相を変更しなかった（平均BERは0.50～0.71）（Martinez Boggio et al.、2021）。私たちの結果は、2世代および3世代の選抜後に得られたものであるため、RFIのための長期的な羊の選抜もルーメン微生物叢を大きく変化させることができるかどうかは、まだ確認されていない。
単胃では、9～10世代にわたって豚をRFI用に分岐選択した結果、RFI系統間で52の糞便細菌属の存在量に有意差が生じた（Aliakbari et al.、2021）。ウサギでは、主成分の判別分析により、9世代の間にRFIが低下するように選択された系統と祖先の系統を、その糞便細菌の系統型に基づいて判別することができました（Drouilhet et al., 2016）。これらのmonogastricsの結果と我々の結果の不一致は、はるかに高度な分岐、または研究された微生物叢の腸内局在によるものかもしれません。
飼料効率と関連形質の予測は、ルーメン微生物叢のデータでは改善されない
ルーメン微生物叢の宿主形質の予測能力の評価
ルーメン原核生物または真核生物の微生物叢から宿主形質を予測する能力は、形質によって非常にばらつきがありました。
微生物叢組成のみからの予測-大多数の著者が行ったように、飼料効率形質を予測するために微生物叢の変数のみでモデルを当てはめた。微生物叢データからのsPLSR予測値と実際の形質との平均ピアソン相関は、飼料（濃厚飼料または混合飼料）、飼料効率形質（FCRC、REIC、REIM）、予測因子として使用したシーケンスデータ（16Sまたは18S）によって変化した。実際の残留摂取量（0.06-0.35）と微生物叢データからの予測値との相関は、ゼロから低い相関が得られた。この結果は、実際の羊のRFIと16Sデータからの予測との間に強い相関を見出したEllisonら（2019）の結果と矛盾する（REIMについては、我々の研究では0.71対0.35）。我々の結果との不一致は、2つの主な違いによって説明されるかもしれません。1つは、REIMが使用した動物の数が少なく（トレーニングセットでは16頭、テストセットでは20頭）、より大きな集団の変動性を十分に反映していない可能性があることです。第二に、より大きな集団の中から、極端なRFI表現型と平均的なRFI表現型を持つ動物を選んでテストセットを構築したことである。不連続で対照的なグループを選択することで、ピアソン相関を人為的に膨らませる可能性がある（Aggarwal and Ranganathan, 2016）。さらに、RFIのような連続的な形質の変動性を反映しない可能性もある。混合飼料を与えた乳牛（トレーニングセットに30頭、テストセットに31頭）では、飼料摂取量に対する乳生産量の比率と全メタゲノム配列データからの予測との間に低い相関（0.19）があった（Delgado et al.、2019）。この結果は、濃厚飼料を与えた肉用羊で16Sまたは18SデータからFCRを予測したときの予測精度（0.16～0.35）の中間である。
微生物予測因子のみを予測因子として使用した場合、最高の予測精度は摂取形質（ADEICまたはADEIM）で得られた：相関は平均で0.05から0.56の間で、18Sよりも16S予測因子の方が高い相関を示した。Delgadoら（2019）は、実際の摂取量と全メタゲノム配列データからの牛のDM摂取量の予測との間に0.39の中間の相関を見出した。
以前、異なる文脈で観察されたように、微生物相データ単独でエネルギー摂取量を予測することは、中程度の精度で可能かもしれませんが、飼料効率形質については、予測の精度は非常に低いです。
微生物叢と系統的効果の組み合わせによる予測-微生物叢データと系統的効果の組み合わせで宿主形質を共同で予測した著者は少ないです。ペレットを与えられたウサギでは、実際のRFIと系統的効果と16SデータからのsPLSR予測との平均相関は0.17と低かった（Velasco-Galileaら、2021）。羊飼料濃縮物では、REICと類縁予測因子からの予測値との間にやや低い相関が得られた（平均相関は0.11）。
また、本研究では、系統的効果と16S予測因子を組み合わせて、飼料効率形質だけでなく、その構成要素も予測した。これらの予測因子を用いた場合、濃厚飼料を給与した羊のADEI予測精度は、単胃動物における過去の知見と同様であった：羊における我々の平均相関0.79は、ウサギにおける0.73に近い（Velasco-Galilea et al., 2021）. 16Sデータと系統的効果からのADG予測精度についても同じことが言えます：ウサギの0.51に対して我々の研究では平均0.41（Velasco-Galilea et al.、2021）、BFT予測精度について：サンプリング時間によっては豚の0.50を超える平均に対して我々の研究では平均相関0.62（Maltecca et al.、2019）です。
したがって、宿主形質の予測因子として系統的効果と微生物相を組み合わせた場合、低～高予測精度に達することができる。しかし、微生物叢の変数を含めることで予測が利益を得ることを実証しているわけではありません。予測モデルは、微生物叢の変数よりも、生体重のような系統的効果に依存する可能性がある。実際、本研究では、微生物予測因子と系統的効果を統合したモデルが、系統的効果のみによる予測値を有意に上回ることはなかったことが示されている。したがって、微生物叢予測因子は、予測精度を向上させるための付加価値を提供しなかった。予測精度は、微生物、固定効果、BW予測因子の間のいかなる相乗効果からも利益を得られなかった。さらに、系統的効果（すなわち、ここでは固定効果およびBW）は、メタバーコード変数よりも安価な予測因子を表していた。対照的に、Velasco-Galileaら（2021）は、sPLSRモデルが、系統的効果のみのモデルよりも、微生物学的変数を含む場合にウサギRFIをより正確に予測することを実証した。同様に、Malteccaら（2019）は、豚の成長および枝肉形質を予測するために微生物叢のデータを含めることによって、機械学習の精度が向上することを示しました。これは、形質、マイクロバイオータシーケンス、または食餌にかかわらず、私たちの研究ではそうではありませんでした。
羊のルーメン微生物叢は、飼料効率やその構成要素に対する予測能力を無視できないかもしれません。しかし、本研究は、動物の体重や環境影響などの系統的な影響を記録することは、ルーメン液をサンプリングしてメタバーコード化するよりも効果的である可能性を示唆しています。ほとんどの研究では、ベースラインを確立し、宿主形質予測における微生物叢の有用性を証明するために、系統的効果の予測能力を考慮していなかった。宿主形質予測は、微生物叢予測因子を組み込んでも、より効果的または同程度と証明された安価な予測因子と比較されたため、恩恵を受けなかったと結論付けています。
ルーミナルの微生物叢組成と環境を切り離すことが重要である
今回の実験では、表現型を決定した年や期間などの環境効果が、子羊のラムナーマイクロバイオータ組成を形成することが示されました（図4）。環境効果が腸内細菌叢に及ぼす影響は、地理的な場所、ペン、食事、農作業の影響によって示されるように、すでに十分に立証されている（Thompson and Holmes, 2009, Henderson et al., 2015, Siegerstetter et al., 2017, Belanche et al., 2019, Bi et al., 2019, Marie-Etancelin et al., 2021, Wen et al., 2021）。例えば、Ellisonら（2017）は、RFI状態に関連するOTUよりも食事に有意に関連するOTUが4倍多いことを発見しました。Marie-Etancelinら（2021）は、RFI形質と細菌属の間に有意な関係が見られなかったのに対し、食事が114のうち91の細菌属に影響を与えることを強調しました。反芻動物の上部腸では環境の影響が強いこともあり、宿主形質とルーメン微生物叢の間に有意な関連を特定することは困難かもしれません。
したがって、科学者は、微生物叢データを予測に使用する場合、系統的効果の予測可能性も評価する必要があります。時空間変化を反映する共変量や因子は、微生物叢の組成（Maltecca et al.、2019）や予測される表現型に影響を与える可能性があるため、含めることが望ましいだろう。例えば、動物の表現型は、動物の割り当てによりペン間で、または実験的変動により年間で均質でない場合がある。ペンや年に関連する微生物叢の変動は、宿主の表現型とスプリアスに相関している可能性がある。したがって、系統的な影響を無視することは、羊の飼料効率を予測する微生物叢の可能性について過大評価することにつながる可能性がある。
宿主表現型予測への展望
ルーメン微生物叢のメタバーコード化は、現在ヒツジで検討されている生産形質を予測する上で効率的ではないかもしれない。しかし、メタンがルーメン微生物による繊維発酵の直接的な副産物であることを考えると、温室効果ガス排出量の予測にはより有用かもしれません（Hill et al.、2016）。さらに、以前、乳牛では、メタン生成量の変動の約13％がマイクロバイオームの変動と関連していると推定されました（マイクロバイオアビリティは0.13±0.08）（Difford et al.、2018）。羊では、メタン収量の微生物率の推定値は、0.19（±0.07）から0.41（±0.08）まで、配列決定方法とパイプラインによって変化しました（Hess et al.、2020年）。
羊の飼料効率、摂取量、成長または体組成形質を予測するには、異なるオミックスアプローチがより良い結果をもたらすかもしれません。以前、私たちのRFI系統は、ルーメンメタボロミクスに基づくよりも血漿メタボロミクスに基づく方が識別性が高かったが、予測能力は評価されなかった（Touitou et al.、2022）。このことから、上部腸のルーメンは、飼料効率の変動を予測するのに最適な宿主成分ではないだろうと考えられる。別の腸管セクションの消化性微生物叢をシーケンスすることは有用かもしれない。これは、豚の形質を予測するために糞便微生物叢ですでに検討されました（Malteccaら、2019、Aliakbariら、2022）。反芻動物では、動物栄養学において中心的な役割を果たすことから、ルーミナルの微生物叢に焦点を当てました。しかし、消化プロセス全体の終着点である糞便微生物叢も関連する可能性があります。我々の知る限り、反芻動物において、テストセットを用いて、ルーメンおよび糞便微生物叢から得られる複合形質の予測精度を評価した査読済みの研究はない。それにもかかわらず、Andradeら（2022）は、牛肉のRFIと有意に関連する糞便およびルミナルの微生物を特定した。さらに、Monteiroら（2022）は、乳牛の糞便微生物叢は、ルーメン微生物叢よりも飼料摂取量との相関が低く、糞便微生物叢は生産効率との相関が高いことを示唆しました。彼らは、より効率的な動物は、ルーメン内の異なる発酵プロファイルと関連している可能性があると仮定した。そして、宿主による栄養素の取り込みが、下部腸の微生物にとっての栄養素の利用可能性の違いにつながるかもしれない（Monteiro et al.、2022）。ルーメンに加えて、消化や同化の違いが消化管全体に蓄積されることで、宿主の効率に影響するのかもしれない。また、下部消化管の微生物が利用できる栄養素にも影響を与えるかもしれない。その結果、宿主の飼料効率と糞便微生物相の間に相関関係が生じるかもしれない。最後に、糞便サンプリングはルーメン液サンプリングよりも侵襲が少ないと思われる。
補足資料
本論文の補足資料は、https://doi.org/10.1016/j.animal.2023.100824 でオンライン公開されています。
倫理的承認
動物は、実験ユニットP3R（Osmoy、フランス、実験承認C18-174-01）において、研究目的のための動物のヒトケアおよび使用に関するフランス国内規則に準拠して飼育された。プロトコルは、フランス高等教育・研究・イノベーション省に代わって倫理委員会（APAFIS #12682 -2017121509105248 v3）により評価・承認されました。
データおよびモデルの利用可能性に関する声明
生の微生物相の配列は、サンプリング条件に関する情報とともにNCBIデータベース（アクセッション番号：PRJNA880038）で公開されています。動物実験データは公式リポジトリに寄託されていないが、合理的な要求があれば、著者から入手可能である。
著者ORCID
Quentin Le Graverand: https://orcid.org/0000-0002-7995-694X.
Christel Marie-Etancelin: https://orcid.org/0000-0001-8950-0420.
Annabelle Meynadier: https://orcid.org/0000-0003-0631-6949.
Jean-Louis Weisbecker: ORCIDなし。
Didier Marcon: ORCIDなし。
Flavie Tortereau: https://orcid.org/0000-0003-1444-4481.
著者の貢献
Quentin Le Graverand： Data curation, Formal analysis, Writing - Original Draft; Christel Marie-Etancelin： 概念化、データキュレーション、執筆-レビューと編集、監督、資金獲得、Annabelle Meynadier： Data curation; Writing - Review and Editing; Funding acquisition; Jean-Louis Weisbecker： データキュレーション、調査、リソース、Didier Marcon： 調査、資料、監督、Flavie Tortereau： Flavie Tortereau：概念化、データキュレーション、執筆-レビューと編集、監修、資金獲得。
利害関係の宣言
ありません。
謝辞（Acknowledgements
動物の世話をしてくれたP3Rの仲間（https://doi.org/10.15454/1.5483259352597417E12）、サンプル収集に協力してくれた仲間に感謝したい。M-L Chemitには、飼料栄養価の推定、DNA抽出および増幅について感謝する。バイオインフォマティクスのGéraldine Pascalの協力により、Frogsツールで配列ファイルを処理できたことに感謝する。Genotoulバイオインフォマティクスプラットフォーム（フランス、トゥールーズ）およびSigenaeグループのコンピューティングとストレージリソース（Galaxy instance https://vm-galaxy-prod.toulouse.inra.fr）の提供に感謝します。
財政的支援に関する声明
著者らは、GrassToGasプロジェクトについて、Cofund ERA-Nets FACCE ERA-GAS (Grant No. 696356), ICT-AGRI 2 (Grant No. 618123) and SusAn (Grant No. 696231) の2018 Joint Callのパートナーを通じた財政支援を感謝する。また、本研究は、欧州連合の研究・イノベーションプログラム「Horizon 2020」の助成金協定番号772787（SMARTER）の助成を受けた。
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