COVID-19後の持続的な嗅覚低下は、嗅上皮における免疫細胞の浸潤および遺伝子発現の変化と関連している

2022年12月22日 17:59

https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.add0484

JOHN B. FINLAY HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-3038-1276, DAVID H. BRANN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0001-8844-8886, [...], AND BRADLEY J. GOLDSTEIN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-9612-1696 +12 authorsAuthors Info & Affiliations
サイエンストランスレーショナルメディシン
2022年12月21日
第14巻第676号
DOI: 10.1126/scitranslmed.add0484
概要
COVID-19無嗅覚症の解明における嗅覚の活躍
イントロダクション
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料

参考文献と注釈
e Letters (0)
最新号
サイエンス・トランスレーショナル・メディシン表紙画像
非機能性クローディン-1を標的とするモノクローナル抗体は、細胞の可塑性を調節することにより患者由来モデルにおける線維化を抑制する
Natascha Roehlen Antonio Saviano et al.
ALDH1A2の変異が明らかにしたレチノイン酸の抗炎症作用と変形性関節症における新しい疾患修飾薬の役割
Linyi ZhuによってPragash Kamalathevanら。
ミトコンドリアDNA欠失症候群の小児における造血幹細胞のミトコンドリア増生
Elad Jacoby Omer Bar-Yosefらによるものです。
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推奨
レポート2015年12月
シングルセル・トランスクリプトームから嗅覚神経発生時の受容体の変容が明らかに
研究論文2020年7月号
SARS-CoV-2侵入遺伝子の嗅覚系における非神経細胞発現はCOVID-19関連無嗅覚症のメカニズムを示唆している
editors' choiceapril 2010
核の中の持続的なにおい
1997年11月号
嗅覚の "意識"？
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概要
SARS-CoV-2は、完全な嗅覚消失を含む、嗅覚における重大な変化を引き起こす。これらの変化はしばしば一過性であるが、COVID-19患者の多くは、数ヵ月から数年続く嗅覚障害を示す。動物およびヒトの剖検研究により、急性無嗅覚症を引き起こすメカニズムが示唆されているが、SARS-CoV-2が患者の一部で持続的な嗅覚消失を引き起こすメカニズムについては、依然として不明である。この問題を解決するために、我々は、COVID-19後に客観的に定量化された長期嗅覚消失を示す9人の患者を含む24の生検から採取した嗅上皮サンプルを分析した。この生検ベースのアプローチにより、インターフェロンγを発現するT細胞のびまん性浸潤と、CD207+樹状細胞の濃縮および抗炎症性M2マクロファージの枯渇を含む骨髄系細胞集団組成のシフトが明らかにされた。SARS-CoV-2 RNAやタンパク質が検出されないにもかかわらず、嗅上皮のバリア支持細胞であるサステンタキュラー細胞における遺伝子発現は、進行中の炎症シグナルに対する反応を反映していると思われ、これは嗅上皮サステンタキュラー細胞に対する嗅覚ニューロンの数の減少を伴うものであった。これらの知見は、SARS-CoV-2が組織から排除された後も、T細胞を介した炎症が嗅上皮に長期間持続していることを示し、COVID-19後の長期にわたる嗅覚消失のメカニズムを示唆している。
COVID-19による嗅覚異常の解明に成功
COVID-19による嗅覚障害は数カ月間続くことがあるが、その根本的な発症メカニズムは不明である。新しい研究では、Finlay <italic>et al.</italic>が、単一細胞のRNA配列決定と免疫組織化学を用いて、持続的な嗅覚消失を示すCOVID-19患者から採取した嗅覚粘膜の生検を解析しています。著者らは、対照群と比較して、低血糖患者の生検では、嗅覚ニューロンの減少、インターフェロンγを産生するT細胞、CD207<sup>+</sup>樹状細胞の濃縮、およびM2マクロファージの枯渇などの免疫細胞集団の変化を示したと報告している。これらの知見は、嗅覚上皮における免疫細胞集団の変化が、COVID-19後の長期的な嗅覚消失に寄与していることを示唆している。---OMS
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はじめに
嗅覚の喪失である無臭症は、コロナウイルス症2019（COVID-19）のほとんどの人に生じるが、回復後も持続することがある（1-5）。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）は、鼻腔の嗅覚裂に並ぶ嗅覚の末梢器官である嗅上皮に影響を与えることで無臭症を引き起こすと考えられている。嗅上皮には、匂いを感知する一次嗅覚ニューロン、サステイン細胞からなるバリア支持細胞層、および嗅上皮を継続的に更新する基底幹細胞または前駆細胞の集団が存在します（6-10）。一般に、呼吸器上皮のパッチは、嗅覚溝領域内に散在しており、分泌細胞、繊毛細胞、基底細胞から構成されている。嗅覚神経細胞は、鼻腔内の神経細胞繊毛に局在する嗅覚受容体を介して揮発性の臭気を感知する(11)。SARS-CoV-2感染動物モデルでは、嗅覚ニューロンの一過性の遺伝子発現変化、繊毛周囲の粘液層の性状変化、炎症が急性無臭症を引き起こすと考えられている(12)。動物モデルとヒトの剖検組織の両方において、神経細胞よりもむしろサステイン細胞がウイルスに感染することが証明されている（13, 14）。また、UGT2A1/UGT2A2遺伝子座の多型は、その遺伝子産物がsustentacular細胞で発現し、COVID-19関連の急性嗅覚・味覚障害のリスク上昇に関連している(15)。COVID-19関連嗅覚障害のほとんどの患者において、ウイルスの除去後、正常な上皮の修復過程により、嗅覚細胞集団（および付随的に損傷した神経細胞）が再構成され、機能が回復すると考えられている（8）。
しかし、COVID-19の患者さんのうち、嗅覚の機能低下が持続する人については、何が回復を妨げているのかがまだ不明である。相互に排他的でないいくつかの可能性がある。例えば、初期の重度の上皮損傷によって、通常は神経上皮を再構成する基底幹細胞プールが減少または消失する。他の可能性としては、神経炎症または自己免疫現象が、遺伝子発現の変化や他の手段を通じて、正常な嗅覚機能と恒常性を損なうような免疫細胞集団による嗅上皮への浸潤、または脳の嗅球または嗅皮質に異常を引き起こす中枢メカニズムが挙げられる。COVID-19の急性後遺症で死亡した患者由来のヒト剖検組織を調べると、嗅球細胞の持続感染、嗅覚ニューロンの感染の欠如、上皮の無傷の構造、嗅覚の検出に変化をもたらす可能性のある嗅覚ニューロンの多様な分子変化が明らかになるが、これらの患者のいずれでも匂いの評価は行われなかった（12, 16）。これらの知見は、COVID-19による急性嗅覚障害に関連するメカニズムを示唆していますが、COVID-19の急性後遺症（PASC）の特徴的症状である長期嗅覚障害に苦しむヒトの嗅覚組織の直接検査（単一細胞RNA配列決定（scRNA-seq）を含む）は現在までのところ行われていません。ここでは、客観的嗅覚検査によって定義された、持続的なPASC関連嗅覚喪失を有する9人の嗅上皮生検を入手し、免疫組織化学およびscRNA-seqを用いて、PASC関連嗅覚機能不全に関連する細胞および転写変化を同定した。対照として、新たに得られた正常な嗅上皮生検、粘液サンプル、および私たちが公表した対照のscRNA-seqデータセットを含み、合計44個の患者サンプルを用いた（表S1およびS2）。
結果
PASC低浸透圧嗅粘膜の組織学的評価により、T細胞浸潤の役割が示唆される
我々は、経鼻内視鏡手術を受けた患者から得た、非COVID正常血対照、COVID正常血後対照、およびCOVID-19低血糖後の9人の嗅上皮生検の最初の免疫組織化学評価を、以前に記載したように行った(9)。
嗅上皮を欠く生検は、疾病過程で嗅上皮が完全に破壊された場合、またはサンプリングエラーのために、組織が通常呼吸器表面上皮で裏打ちされた領域から採取された場合にしばしば起こる。私たちのサンプルでは、神経細胞マーカーTUJ1の染色により嗅覚神経細胞の存在が確認され、非感覚的な呼吸器上皮ではなく嗅覚上皮が捕捉されたことが証明された（Fig.1A）。

図1. PASC低血糖症患者の鼻腔嗅上皮生検におけるT細胞浸潤。
(A）正常な非COVID-19、正常なCOVID-19後、またはPASC低血糖患者からの鼻生検組織の代表的な免疫組織化学画像。組織切片はTUJ1神経細胞マーカー、CD45汎免疫細胞マーカー、CD3 T細胞マーカー、およびCD68骨髄系細胞マーカーで免疫染色された。PASC低血糖組織では、正常血糖群では見られなかった顕著なCD3+リンパ球浸潤を含む緻密なCD45+免疫細胞浸潤を示した。散在するCD68+細胞はすべての条件下で存在した。(B) (A)の拡大図（黄色枠）は、CD3+リンパ球を示し、嗅上皮への顕著な浸潤（白色矢印）を伴う；白色破線は基底膜を示す。スケールバー：50μm。(C）定量分析を可能にするために、追加の鼻腔生検をscRNA-seq用に処理した。16個のヒト鼻生検を統合したPASC低血糖および対照正常血糖scRNA-seqデータセットの均一多様体近似投影（UMAP）可視化により、強固な細胞クラスタ分析およびアノテーションが可能になった。RBCs、赤血球、pDC、形質細胞様DC。
ヌクレオカプシド蛋白に対する有効な抗体を用いた染色でSARS-CoV-2を検出できなかったにもかかわらず、COVID-19低血糖後の粘膜ではCD45+免疫細胞の広範囲の浸潤を観察したが、いずれのコントロール群でも見られなかった（表S1、図1A、および図S1）。骨髄系細胞（CD68陽性で評価）はPASC低血糖組織と正常対照組織で同様であった。CD3発現によって同定されるT細胞は、PASC低血糖症サンプルにおいてより広く存在しているように見え、これらの多くは、対照組織で観察されたように深い間質ではなく、上皮自体の上層内に局在していた（Fig.1B）。COVID-19正常発症後サンプルやCOVID-19非正常発症サンプルでは、これらと同じマーカーを発現する細胞を観察することはできなかった。
scRNA-seqを用いた嗅覚生検の解析
PASC嗅上皮へのT細胞浸潤の存在を考慮して、単一細胞配列決定による分析のために、COVID-19発症以来少なくとも4ヶ月間持続する嗅覚機能不全を報告した個体から鼻生検サンプルを追加で入手した（表S1）。これらの患者の低嗅症は、十分に検証された嗅覚識別テスト（5、17、18）を用いて術前に確認した。COVID-19患者の多くは、主観的にも何らかの低嗅症の要素や歪んだ嗅覚の知覚を報告していた。内視鏡的嗅粘膜生検は、耳鼻科クリニックで外科的または細胞学的ブラシ法を用いて、あるいは良性疾患のために下垂体にアクセスする無関係な経蝶形骨手術を受けている患者の手術室で行われた（図S2）。副鼻腔炎またはその他の既知の副鼻腔疾患は、内視鏡検査および画像診断により除外し、細菌感染、浮腫、およびポリープ症を除外した。患者はいずれも急性疾患や、長期の挿管などの医療介入を受けたことはなかった。
生検は、以前に説明したように、直ちに scRNA-seq 分析用に処理された（9, 19）。scRNA-seq用サンプルには、6人のPASC低血糖者（年齢範囲、22〜58歳；女性5人および男性1人、COVID-19発症後4〜16ヶ月）の生検が含まれていた。この生検ではSARS-CoV-2からの転写物は回収されず、継続的な感染や持続的なウイルス性RNA血症がないことと一致した（20, 21）。比較のために、3つの正常血対照サンプル（年齢範囲：51～71歳、女性2名、男性1名）を分析しました。これらの対照データを強化するために、正常血患者と老年病患者の既発表のデータセットと組み合わせ、合計16人からの統合単一細胞シーケンスデータセットを作成し、124000個以上の細胞から堅牢なクラスターアノテーションを可能にしました（図1C）。Uniform manifold approximation projection (UMAP) プロットにより、嗅覚、呼吸器、および免疫細胞の予想される分布が解析のために捕捉されていることが確認された。
PASC低血糖症の嗅覚サンプルでは、特定のT細胞亜集団が濃縮されている。
嗅覚上皮試料におけるT細胞浸潤の観察から、PASC低浸透圧嗅覚上皮に存在する特定の免疫細胞集団に量的な変化があるかどうかを検討した。標準的なマーカー（22）の発現に基づいて、対照およびPASC低浸透圧嗅上皮の両方に存在する多種多様なT細胞亜型を同定することができた（Fig. 2A）。特に、クラスター5（ここではCD8 Tres 5と呼ぶ）に属する常在CD8+ T細胞（CD8 Tres）の濃縮が見られた（図2B）。これは、免疫マーカーの遺伝子発現に基づいてγδT細胞と同定した（図2、CおよびD）（23）。γδT細胞は、表面上皮に存在し、サイトカイン産生、場所、活性化状態に依存した機能特化型の多様な特性を示す(24)。COVID-19におけるγδT細胞の特定の役割はまだ不明であるが、PASC低浸透圧嗅上皮における潜在的な機能は、上皮バリア機能の保護、組織のリモデリング、または重度の以前の損傷と上皮修復の必要性の状況における免疫応答の調節における継続的な役割に関与する可能性がある(23-25)。

図2. PASC低血糖患者の鼻嗅上皮生検では、CD8+ T細胞サブセットが濃縮されている。
(A）嗅覚生検scRNA-seqデータセットにおけるCD8+、CD4+、およびNK/NKT細胞クラスタからの全リンパ球のUMAP可視化、PASC低血糖症データセットと2つの正常血糖コントロールデータセットの比較。Olivaらのコントロール（19）は嗅覚識別テストのスコアによる正常値であり、Duranteらのコントロール（9）は主観的な報告による正常値であった。黒枠はPASC低血糖症サンプルに濃縮されたクラスターを示す。TeffはエフェクターT細胞、TresはレジデントT細胞、カテゴリー内のサブセットは番号で示す（すなわち、CD4 1からCD4 5まで）。(B）PASC低血糖生検では、両コントロールデータセットと比較して、CD8 Tresサブセット5の細胞集団が濃縮されていた（両側t検定、P = 0.0015）。(C) CD8 Tresサブセット5クラスターに濃縮されたトップランクの転写産物（調整P値、ウィルコクソン順位和検定、ボンフェローニ補正による）。(D）PASC低血糖特異的クラスターCD8 Tresサブセット5（黒枠）において有意に濃縮された遺伝子の選択的遺伝子発現プロット、γδT細胞マーカーおよび関連遺伝子（TRDC、TRGC2、KLRC1、およびKLRC2）含む。(E）公開されているマーカー遺伝子に基づくアノテーションを確認したリンパ球サブセット間の選択された遺伝子発現とデンドログラムクラスタリング。IFNG遺伝子はTresサブセット、特にCD8 Tresサブセット5で濃縮されている。(F）サステイン細胞または嗅覚ニューロンのCD8 Tres由来リガンドとその受容体のNicheNet解析による相互作用の可能性を示すCircos plot。オレンジ色の共通レセプターは、サスタキュラー細胞とニューロンの両方に存在する。(G）追加プロットにより、PASC低血糖γδT細胞は遺伝子発現差（SPRY2）またはNicheNet解析（SEMA4D）により同定されたT細胞リガンドを発現していることが確認された。
興味深いことに、ここで同定されたγδT細胞群は、炎症性サイトカインであるインターフェロン-γを発現している（図2E）。インターフェロン-γ（II型インターフェロン）は、免疫調節反応と適応免疫を媒介する。急性ウイルス感染に関連するI型インターフェロン（インターフェロン-αとインターフェロン-β）を発現する細胞タイプは確認できなかった（図S3）。サステイン細胞および嗅覚ニューロンの遺伝子発現解析により、CD8 Tres 5細胞によって発現される他の多くのシグナル伝達リガンドの受容体の発現に加え、インターフェロン-γの受容体の発現が明らかになった（図2、FおよびG）。γδ T細胞受容体に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析により、PASC低吸収性嗅上皮における顕著なγδ T細胞浸潤が確認された（図S1）。これらの観察は、PASC嗅上皮がインターフェロン-γを発現するγδT細胞のユニークな集団を保有し、サステイン細胞および嗅覚ニューロンの両方が、これらの（および他の）炎症関連リガンドに応答するための関連する同族受容体を発現することを実証している。
PASC低血糖症サンプル（n=13人；表S2）と対照サンプル（n=7人）の別のコホートにおいて、嗅覚粘液をアッセイしてサイトカインとケモカインを測定した（fig. S4）。重度の細胞障害性炎症がないことと一致して、インターロイキン-1β（IL-1β）または腫瘍壊死因子-α（TNF-α）には顕著な上昇した変化が見られなかった。興味深いことに、炎症性サイトカインであるインターフェロン-λ1（IFN-λ1）は、PASC低浸透圧粘液で発現が増加した（P < 0.05, Welchの補正による不対t検定）。また、抗ウイルス免疫に関与するI型インターフェロンであるIFN-α2は、PASC低血糖のサンプルで発現が増加する傾向にあった（P = 0.0506, Welchの補正を加えた対応のないt検定）。IFN-γによって直接刺激され、嗅覚性SARS-CoV-2感染ハムスターモデル（21）において感染後31日目に発現が上昇することが観察されたIP-10（CXCL10）もこれらのサンプルで発現が上昇した（P < 0.05, Welchの補正による対応のないt 検定）。
PASC低浸透圧嗅上皮におけるT細胞の変化に伴う骨髄系細胞集団のシフト
PASC嗅上皮におけるγδT細胞の濃縮を考慮し、我々は、リンパ球集団の変化を調整することができる骨髄系にさらに注目した。抗CD68染色により、コントロールとPASCの両方の嗅上皮に骨髄系細胞が存在することが示された（図1A）。scRNA-seqによる骨髄系クラスターの解析では、マクロファージ、単球、および抗原提示樹状細胞（DC）の異なる亜型に対応する複数の亜集団が同定された（図3、A～C）。DCはCD207（LANGERIN）の発現に基づいて分離することができ、CD207+集団はCCR6とToll様受容体10（TLR10）の濃縮発現を示した（図3、AおよびC）。定量化により、PASC低吸収嗅上皮ではCD207+ DCへのシフトが見られ、それに伴いCD207-集団が減少していた（図3D）。免疫染色により、PASC低浸透圧嗅覚生検におけるCD207+ DCの存在が確認された（Fig.3E）。CD207は皮膚ランゲルハンス細胞内での機能的役割でよく知られているが、CD207+ DCは広く分布し、組織を調査し、T細胞の活性化を含む免疫応答を調整していると考えられている（26, 27）。CD207+DCに濃縮されたタンパク質であるTLR10は、骨髄系細胞がインフルエンザウイルスを検出し、その後の免疫応答を組織化する役割を担っている(28)。したがって、CD207+ DC細胞の濃縮は、PASC低浸透圧嗅上皮試料に見られる免疫浸潤の編成に役立つと考えられる。

図3. PASC低浸透圧嗅上皮生検は、DCサブセットの濃縮とM2マクロファージの減少を伴う骨髄系細胞のシフトを示す。
(A）選択した骨髄系細胞クラスタに関する嗅覚生検scRNA-seqデータのUMAP可視化、PASC低血糖と正常血糖コントロールデータセット（9、19）の比較。DC、樹状細胞；pDC、形質細胞様DC（CLEC4C+）；cDC1、従来のDCタイプ1細胞（CLEC9A+）；cDC2、従来のDCタイプ2細胞（CLEC10A+）。(B) (A)のUMAPプロット、サンプル寄与度で色分け。(C) 選択遺伝子発現プロットは、CD207+ DCクラスター（CCR6とTLR10）およびcDC2クラスター（IL1R2）の遺伝子発現差解析によって得られたCD207+ DCと追加マーカー遺伝子のクラスターアノテーションを確認するもの。(D) CD207+DCは正常血糖コントロール生検（赤）と比較してPASC低血糖生検（青）で濃縮されている（両側t検定、P = 0.0016; CD207-DCは減少、P = 0.0236). (E) 抗CD207抗体染色により、PASC低血糖鼻腔生検でCD207+樹状細胞を確認（白矢印）；白破線は基底膜を示す。スケールバー、50μm。(F) 遺伝子発現プロットは、M2マクロファージ（CD163、MAF、およびIGF1）および全マクロファージ（CD9）クラスターのマーカー遺伝子を示す。(G) PASC低血糖生検では、すべての常在骨髄系細胞に比してM2マクロファージの枯渇が認められた（両側t検定、P = 0.0175）。
マクロファージクラスターの解析により、CD163で示される抗炎症性M2マクロファージの明確な集団が明らかになった（図3、AおよびF）。CD163-マクロファージの相対数には差がなかったが、PASC低浸透圧嗅覚上皮ではM2マクロファージが有意に少ないことが観察された（図3G；P = 0.0175, 両側t検定）。M2マクロファージの減少は、この集団がいくつかのメカニズムで組織の修復を促進することができるため、興味深い。特に、今回観察されたM2マクロファージ集団が、嗅覚ニューロンの成長因子として知られるインスリン様成長因子1（IGF1）を産生することを考えると（29、30）、このような減少が見られる。PASC低浸透圧嗅覚上皮におけるこのM2マクロファージの相対的減少は、進行中の炎症性シグナルの存在を示す読み出しとして機能し、マクロファージをM2アイデンティティから遠ざけるかもしれない。
PASC低浸透圧嗅覚サンプルでは、胸腺細胞は免疫応答表現型を示す。
胸腺細胞はコロナウイルス侵入遺伝子を発現しており、SARS-CoV-2は急性COVID-19の際にこの細胞集団に感染することが分かっている(12-14)。サステイン細胞は、嗅覚上皮を覆う頂膜バリア細胞として、生体内変換酵素の強固な発現による有害化学物質の解毒、嗅覚ニューロンの繊毛が埋め込まれた粘液層のイオン量の調節、嗅覚上皮神経幹細胞のフィードバック制御など、複数の機能を有しています（31, 32）。ERMN (9)、CYP2A13、GPX6などの標準的なサスタキュラーマーカーの発現に基づいて、PASC低血糖またはコントロール試料から779個の高品質サスタキュラー細胞を同定した（Fig. 4A）。UGT2A1は、COVID-19における嗅覚消失のリスク上昇を示唆するゲノムワイド関連遺伝子であることが、sustentacular細胞で強く発現していた（15）。

図4. PASC低浸透圧嗅上皮において持続するサステンタキュラー細胞遺伝子発現変化。
(A）PASC低血糖サンプル（青）と正常対照サンプル（赤）の嗅覚生検scRNA-seqデータセットにおけるサステンタキュラー細胞サブセットのUMAP可視化（n = 9鼻生検：6 PASC低血糖、3 正常血糖）。遺伝子発現プロットは、選択された標準的なサステイン細胞マーカー（ERMN、GPX6、およびCYP2A13）の発現と、呼吸マーカーSERPINB3の最小限の発現を示す。(B）PASC低血糖および正常血糖対照嗅上皮生検のサステイン細胞における遺伝子発現の差を示すVolcanoプロット；赤または青は0.6 log2倍以上の変化の有意性を示す、P < 0.05。(C) PASC低血糖および正常血糖対照サンプルのサステイン細胞における、選択した抗原提示遺伝子および活性ウイルス感染への応答に通常関与する遺伝子の発現の視覚化（抗原提示遺伝子はPASC低血糖サンプルにおいて有意に発現が増加し、ウィルコクソン順位和検定により*P < 0.05に調整された）。(D）（C）のPASC低血糖持続性（sus）細胞で発現が上昇した転写物の遺伝子セット濃縮解析では、抗原提示およびIFN-γシグナル伝達を含む様々な生物学的プロセスが同定された。ボックスはプロセス用語ごとの変化した遺伝子の数を示し、-log10（ボンフェローニ補正P値）に基づき有意なプロセスのみが含まれている。(E）SARS-CoV-2感染31日後のハムスター、または非感染動物において、以前にサステイン細胞で同定された病原体応答遺伝子の発現の違い（21）。BST2、抗ウイルスおよび炎症シグナル伝達活性を有する膜貫通タンパク質をコードするインターフェロン誘導宿主遺伝子、調整後P < 0.05; STAT1、炎症シグナルの下流の転写因子、調整後P < 0.1, Wilcoxon rank sum; 図S5も参照のこと。S5; *P < 0.05。(F) PASC低血糖および正常血糖コントロール生検における、サステイン細胞マーカーERMN（緑）および神経細胞マーカーTUJ1（マゼンタ）の免疫組織化学染色の代表画像。核はDAPI（青）で染色した。スケールバー、50μm。
遺伝子発現の差次分析により、PASC低血糖と対照のサステイン細胞間の顕著な転写の変化が確認された（図4Bおよび図S5）。PASC低吸収サンプルに由来する胸腺細胞では、抗原提示遺伝子が濃縮されており、CXCL10、PTX3、またはCD46のような活性ウイルス感染の典型的マーカーにはほとんど変化が見られなかった（図4C、図S5、BからD）。急性ウイルス反応の不在と一致して、ウイルス参照ゲノムに整列したPASC低血糖患者からのscRNA-seq生検サンプルにはSARS-CoV-2の転写物が検出されなかった。PASC低血糖症サンプルで有意に発現が増加した転写産物の遺伝子セット濃縮解析（log2 fold change > 0.6, P < 0.05）では、インターフェロンシグナル伝達や抗原提示などいくつかの生物学的プロセスが確認された（図4D）。これらの知見を合わせると、サステイン細胞はPASCの間SARS-CoV-2に感染したままではなく、むしろその微小環境における局所炎症性サイトカインに反応しているようであることが示唆される。
SARS-CoV-2感染後のハムスター嗅上皮の以前のバルクRNA-seq解析では、サステイン細胞および他の細胞型の感染1カ月後にアップまたはダウンレギュレートされた一連の病原体応答遺伝子を同定した（図4E）(21)。そこで、初感染から4ヶ月以上経過したヒトPASC嗅上皮試料において、これらの同じ遺伝子が変化しているかどうかを検討した。ハムスターで同定された病原性応答遺伝子のうち、BST2だけが有意に濃縮されていた（調整P値<0.05、Wilcoxon順位和検定）。BST2（Tetherinとしても知られている）は、抗ウイルスおよび炎症性シグナル伝達活性を有する膜貫通タンパク質をコードするインターフェロン誘導型宿主遺伝子である（33, 34）。他のすべての嗅上皮細胞集団について同一の解析を行ったところ、水平基底細胞においてのみBST2の発現が特異的に有意に変化した（図S6；P < 0.05, Wilcoxon rank sum test）。COVID-19低血糖後の嗅上皮サンプルにウイルスRNAが存在しないことと一致して、その発現がサブゲノム核カプシドSARS-CoV-2 RNAの存在と相関するISG15のどの嗅上皮細胞集団にも有意な増加は観察されなかった（21）。
我々は、非COVID-19正常血、COVID-19正常血後、およびPASC低血糖の生検の免疫組織化学染色によってこれらの所見を検証した（図4F）。呼吸器上皮細胞ではなく、サステイン細胞の頂膜領域を選択的に標識する抗ERMNは、対照生検の両セットとPASC低血糖生検で強い均一なシグナルを示した（Fig. 4F）。一方、未熟な嗅覚ニューロンの体節と神経突起を染色するTUJ1抗体は、コントロールのサンプルでは豊富な標識を示したが、PASC低血糖のサンプルではあまり均一な標識を示さなかった（図4Fおよび図S7）。
嗅覚ニューロンの集団はPASC低血糖サンプルで減少している。
PASC低血糖サンプルではリンパ球の浸潤が見られるものの、擬似時間解析により、成体の神経原性ニッチである嗅上皮内で期待される嗅上皮系統関係とマーカー遺伝子の発現が確認された（図5、AおよびB）。さらに神経系サブセットの解析により、球状基底細胞／神経前駆体、未熟嗅覚神経細胞、成熟嗅覚神経細胞が同定され、PASC低血糖サンプルでは嗅上皮神経新生能力が枯渇していないことが示唆された（図5、C、D）。しかしながら、SARS-CoV-2受容体ACE2を発現できるPASC低浸透圧水平基底細胞の分析では、局所的炎症暴露のマウスモデルで観察された水平基底細胞の変化と同様に、上皮再生に関わる転写物のサブセットのダウンレギュレーションが見られた（図S8）。嗅覚ニューロン特異的遺伝子の解析では、PASC低血糖サンプルにおいて緩やかな変化が示唆された。例えば、その嗅覚受容体の下流のシグナル伝達因子の発現は、PASC低血糖群と対照群の間でほぼ同様であった（図5E；調整P値は有意ではない、ウィルコクソン順位和検定）。scRNA-seqデータに基づいて嗅覚ニューロンの数を定量化するために、嗅覚ニューロン数をサステイン細胞数で正規化した（図5F；n＝5 PASC低血糖、n＝5コントロール；P＝0.034、両側t検定）。嗅上皮生検は変動しやすく、また生検ではしばしば呼吸器様形質転換のパッチが存在するため、この方法を用いた。この方法で正規化すると、PASC低血糖サンプルでは、対照サンプルと比較して、嗅覚感覚ニューロンの数がsustentacular細胞に対して減少していることがわかった。しかし、嗅覚神経細胞数の減少にもかかわらず、嗅覚受容体を発現する細胞の頻度、嗅覚受容体遺伝子のmRNA発現、嗅覚神経細胞全体に発現する嗅覚受容体の分布には差が見られなかった（図S9）。致死的急性COVID-19後のヒト剖検サンプルで報告された広範で顕著な嗅覚ニューロンの遺伝子発現変化（12）とは対照的に、ここで同定されたPASC低血糖嗅覚ニューロンの変化は限られていた（図5Eおよび図S9）。

図5. PASC低浸透圧鼻腔生検における嗅覚神経細胞の解析。
(A）正常対照生検（n = 3）と比較したPASC低血糖生検（n = 4）の嗅覚上皮における細胞の軌跡系統分析。細胞には、水平基底細胞、球状基底細胞、嗅覚神経細胞、sustentacular細胞、およびmicrovillar細胞が含まれる。(B）（A）のUMAP関係に基づいてラベルされた嗅覚上皮細胞系統の擬似時間経過を示すヒートマップ。各細胞分化状態の代表的な転写産物マーカーをY軸に示している。(C) 図1Dの嗅覚神経細胞群内のアノテーションを示すUMAP可視化図。「すべてのニューロン軌道細胞」は、5つのPASC低血糖生検と3つの正常血糖対照生検におけるニューロン系譜細胞を含む。(D）遺伝子発現プロットは、嗅覚神経細胞分化経路の確立されたマーカーを示す。(E）正常対照生検と比較したPASC低血糖生検の嗅覚神経細胞（成熟および未熟）における選択的遺伝子発現。(F)正常対照生検と比較したPASC低浸透圧生検（n = 5）の嗅覚神経細胞（成熟および未熟）とサステイン細胞の比率。エラーバーはSEMを示す；両側t検定、P = 0.034。(GおよびH）PASC低血糖生検では、抗OMP抗体で標識された成熟嗅覚ニューロンの減少が免疫組織化学的に確認された。サスタキュラー細胞は抗SOX2抗体で標識し、核はDAPI（青）で染色した。P < 0.01、一元配置分散分析、Tukey検定およびBonferroni補正。
scRNA-seqによって同定された嗅覚ニューロン数の減少をさらに検証するために、非COVID-19正常血漿（n = 3）、COVID-19後正常血漿（n = 2）、PASC低血漿（n = 3）の生検を含む追加サンプルで免疫組織化学染色を実施した。我々は、抗嗅覚マーカータンパク質（OMP）抗体で成熟嗅覚神経細胞を可視化し（36-38）、頂膜抗SOX2抗体でサスタキュラー細胞を可視化した（図5Gおよび図S7）（9, 38）。非COVID-19およびCOVID-19後の正常血行群では、顕著なOMP+ニューロンとよく組織化されたSOX2+頂膜サステイン細胞核が確認された。一方、PASC低浸透圧生検では、OMP+ニューロンがまばらに存在し、サステイン細胞に対する成熟嗅覚ニューロンの比率が著しく減少した［図5、GおよびH；P < 0.01, Tukeyテストおよびボンフェローニ補正付き一元配置分散分析（ANOVA）］。COVID-19正常血漿サンプルとCOVID-19正常血漿後のサンプルでは、OMP+ニューロン集団に差はなかった。我々は、呼吸器上皮ではなく嗅覚上皮を含む領域で解析が行われたことを、咽頭上皮特異的マーカーERMNと未熟神経細胞マーカーTUJ1に陽性の細胞の存在に基づいて検証した（図S7）。これらの知見は、幹細胞およびサステンタキュラー細胞の機能変化とともに、免疫浸潤が成熟嗅覚ニューロンの数を変化させ、持続的な嗅覚消失を引き起こすというモデルを示唆している。
考察
SARS-CoV-2感染は、多くの生理学的システムにわたって持続的な機能障害を引き起こすが、PASCとより急性の病態生理学とを区別するメカニズムはまだ解明されていない（39, 40）。ヒト嗅上皮内のCOVID-19損傷に関する現在の証拠は、主に重度の急性COVID-19で死亡した患者を含む剖検研究から得られている。これらの研究では、匂いの客観的測定が欠けており、サンプルは大きな医療介入後に得られた（12、16）。ここでは、PASC低嗅症のCOVID-19患者からの嗅覚組織生検の分析を提供し、各患者は客観的検査によって記録されたCOVID-19後の嗅覚機能不全を示した。PASC低嗅症患者と対照正常者の内視鏡ガイド下嗅上皮生検のscRNA-seqデータを比較した結果、免疫細胞と嗅上皮の相互作用の変化が、サステイン細胞および嗅覚ニューロンの機能変化を促進するというモデルが示唆されました。
我々の発見は、緩やかな局所的な免疫細胞応答が、サステイン細胞および嗅覚ニューロンの表現型変化を引き起こすということと一致している。特に成熟したOMP+ニューロンの細胞数の相対的減少を含む嗅覚ニューロンの変化は、低嗅症や副嗅症を含む感覚機能障害を説明することができる。PASCに関連する低嗅症の文脈で観察された顕著な嗅覚ニューロンのトランスクリプトーム変化がないことは、急性COVID-19症例の剖検標本における所見とのいくつかの相違を示唆している（12）。急性期には、局所的な非自律的シグナルが神経細胞の遺伝子発現変化を促進すると考えられている。PASC低浸透圧嗅上皮では、重度の炎症がないように見えるが、その代わりに、PASC低浸透圧嗅上皮サンプルに特有のIFN-γおよびγδT細胞マーカーを発現する局所リンパ球集団の存在とともに、持続細胞におけるインターフェロン応答シグネチャーを同定している。
PASCに関連した嗅覚減退のヒトで観察された表現型と、以前にSARS-CoV-2に急性感染したハムスターで観察された表現型とを比較することは興味深い(12, 14)。ハムスターモデルでは、感染後数日間はマクロファージ、好中球、単球を含む広範な免疫細胞が上皮に浸潤し、2週間以内にほぼ完全に消失する。SARS-CoV-2感染から数ヵ月後にヒト嗅上皮にT細胞が持続的に浸潤するという我々の観察は、PASC低浸透圧症候群のCOVID-19患者が、急性に生じる免疫反応とは異なる過去の感染に対する選択的免疫反応を有する可能性を示唆するものである。
我々のデータは、免疫細胞、水平基底細胞、サステイン細胞、嗅覚ニューロンの間の調節異常軸がPASC低嗅症の嗅上皮で生じ、その結果、感覚機能障害を引き起こすという暫定的なモデルと一致する。このようなことが患者のサブセットでどのように、そしてなぜ起こるのかはまだ解明されていないが、COVID-19患者のマクロファージの解析から、SARS-CoV-2急性感染が他の免疫細胞の機能における長期的変化を誘発すると考えられる炎症性リプログラミングを引き起こすことが示されている(41)。さらに、マウスモデル（35）や老齢化したヒト（19）において、水平基底細胞は、追加の免疫細胞を勧誘するシグナル伝達相互作用を含む、免疫応答性の表現型を示している。さらに、SARS-CoV-2感染後の回復期に特定のCD8+T細胞クロノタイプの活性化を含む未解決の免疫応答が報告されている(42)。これらまたは類似のプロセスが、我々のPASC低血糖サンプルで同定された局所嗅上皮免疫細胞の変化を開始する可能性があると推測することは魅力的である。
ここに示したデータは、SARS-CoV-2感染がどのように長期的な嗅覚消失を引き起こすかについてのいくつかの別のメカニズム仮説にも関連している。動物モデルの研究から示唆される1つの可能性は、初期の深刻な広範囲の細胞損傷が、嗅覚上皮を再構築する基底幹細胞の能力を圧倒することであるが、我々のサンプルは、ヒト嗅覚裂の多くの領域に、嗅覚ニューロン、支持細胞、基底細胞からなる無傷の嗅覚上皮を保持していることを示唆している(14)。持続的なウイルス感染もまた、進行中の損傷を引き起こす可能性があるが（43）、我々のサンプルには活発なSARS-CoV-2感染の証拠は見いだせなかった。もう一つの可能性は、アノスミア／パロスミアが重度の継続的粘膜炎症の結果であるということであるが、我々の患者は局所浮腫、ポリープ形成、感染などの臨床炎症所見を示さず、嗅上皮で確認された分子署名は広い炎症反応に一致しなかった。注目すべきは、中枢性のメカニズムがPASCに関連した嗅覚障害に寄与している可能性があり、さらなる研究が必要なことである。しかしながら、ヒトの神経細胞へのSARS-CoV-2感染の証拠はほとんどなく（16）、嗅球または皮質で観察された画像変化の少なくとも一部は、嗅上皮の損傷（ウイルス感染の明確な部位）または篩骨板を越えた炎症中間体の拡散による末梢入力の減少を反映している可能性がある（44）。
我々の研究にはいくつかの限界がある。パンデミックに関連する課題を考えると、多数のCOVID-19患者からサンプルを得ることは困難である。したがって、我々の結論は、限られた患者サンプルセットで共通して観察された所見によって左右される。さらに、本研究では、外科的切除とブラシバイオプシーという2つの異なる方法で得られた患者試料を統合した（図S10）。生検の技術に関連したバッチ効果や遺伝子発現の変化は確認できなかった（図S11）。最後に、嗅覚溝領域内から生検を得るように注意したが、各嗅上皮生検の特定の内容におけるサンプル間のばらつきの可能性は避けられない。
今回のパンデミックは、嗅覚障害に対する新しい効果的な治療法のアンメットニーズを浮き彫りにした。今回得られたメカニズムの解明は、新たな治療戦略の可能性を示唆している。例えば、局所的な炎症性免疫細胞を選択的にブロックしたり、特定のシグナル伝達ノードを直接阻害することで、嗅覚上皮の恒常性や修復を乱すループに干渉する可能性がある。鼻の嗅覚溝を覆っている嗅上皮の位置は、局所的な局所ドラッグデリバリーに適しており、新しい治療薬の全身的あるいは標的外効果を回避する手段を提供することができるかもしれない。今後、動物モデルやヒトで治療薬を試し、PASCの嗅覚障害患者を長期にわたって追跡調査することにより、嗅覚障害の病因と管理について継続的な知見が得られると思われる。
材料と方法
研究デザイン
我々は、COVID-19後の低嗅覚症／無嗅覚症の患者9名から得られた嗅上皮生検組織の前向き解析を行った。嗅覚機能は、嗅覚識別試験（Sensonics Inc.）を使用して測定された。生検サンプルは、組織学またはscRNA-seq解析のために採取された。低嗅症／無嗅症の期間およびCOVID-19急性感染からの期間を含む患者の人口統計学的情報を収集した（表S1）。対照試料には、COVID-19の既往のない正常血液の人（3人）およびCOVID-19と診断されたことのある正常血液の人（2人）から得た嗅覚組織生検が含まれていた。すべてのヒトの研究は、Duke UniversityおよびUniversity of California San DiegoのInstitutional Review Boardによって承認されたプロトコルの下で行われた。
生検の収集と処理
ここで報告されるすべての生検サンプルは、Duke University School of Medicine Institutional Review Boardのプロトコル00088414および00105837に基づき採取された。患者は、嗅覚機能を評価するために、組織採取前に嗅覚識別テストを受けた。外科的生検については、良性下垂体腫瘍の切除のための経蝶形骨手術を受けている患者の手術室または診療所のいずれかで嗅粘膜が採取された。簡単に言えば、内視鏡による可視化を用いて、嗅覚溝粘膜を鋭く切開し、その下の骨から隆起させ、次に貫通切断鉗子で摘出した。鼻腔細胞診ブラシ生検では、内視鏡観察下で細胞診ブラシ（カタログ番号4290、Hobbs Medical Inc.、コネチカット州Stafford Springs）を嗅覚溝内に静かに配置し、診療所で組織を採取した（図S10）。ブラシを短時間回転させ、表面粘膜細胞を収集した。いずれの場合も、試料は氷上で採取液［ハンクス平衡塩溶液（HBSS）または10％牛胎児血清（FBS）入りHibernate-E培地；いずれもThermo Fisher Scientific, Waltham, MAから］に入れ、直ちに分析のために処理した。
外科的生検組織は、鋭く小片に分割した。すべての生検を、ディパーゼ／コラゲナーゼA／EDTAミックス、パパイン（2mg／ml）、およびデオキシリボヌクレアーゼI（すべてSTEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada）からなる酵素カクテルで37℃において15分間、頻繁に穏やかにトリチュレーションしながら消化された。15分後、Accutase (STEMCELL Technologies) を加え、サンプルを37℃でさらに5分間インキュベートした。5分後、FBSを添加した。サンプルがまだ大きな組織片を含んでいる場合、250μmのフィルターで濾過した。その後、すべてのサンプルを70μmのフィルターで濾過し、400gで5分間遠心分離を行った。ペレットに豊富な赤血球が観察された場合、組織をACK Lysing Buffer (Thermo Fisher Scientific)に再懸濁し、穏やかに揺すりながら室温で3〜5分間インキュベートした。サンプルを洗浄し、回転させ、非アセチル化ウシ血清アルブミン（1 mg/ml; Thermo Fisher Scientific）、抗凝集試薬（0.5 μl/ml; Gibco）、およびN-アセチルシステイン（5 μg/ml; Sigma-Aldrich, St. ブラシバイオプシーも同様に処理したが、解離酵素に要する時間は若干短く、赤血球溶解ステップは必要なかった。
シングルセルシークエンス
サンプルは、以前に記載されたように、単一細胞分析のために処理された(19)。簡単に言うと、細胞を自動カウンター（Cellaca MX、Nexcelom）上の生存率染色で定量化し、製造者の指示による3′ v3.1遺伝子発現プロトコルに従って、1万個の細胞を標的とする細胞捕捉およびバーコーディングのためにChromiumコントローラー（10X Genomics、Pleasanton、CA）にロードした。逆転写、増幅、ライブラリー調製、および配列決定（NovaSeq、Illumina）は、プロトコルにしたがって行った。
シングルセルRNA-seq解析
イルミナのベースコールファイルをFASTQファイルに変換し、CellRanger Counts 6.1.2（10X Genomics）で処理し、ヒト参照ゲノム（GRCh38）またはヒトとSARS-CoV-2ゲノムを含む複合参照ゲノム（45）のいずれかにアライメントを行った。生細胞×遺伝子数マトリックスから出発して、データ統合と前処理は、Scanpy (v1.8.2) と scvi-tools (v0.15.2) を用いて行われました。正確な細胞タイプの同定のために、本研究で作成されたデータは、私たちが公開しているヒト嗅覚のデータセット（GSE139522、GSE184117）（9、19）と統合されました。高変動遺伝子（HVG）は scvi-tools の "poisson_gene_selection" 関数（バッチキーとして患者 ID を使用）を使用して同定し、これらの遺伝子サブセットの生カウントを variational autoencoder (scVI) モデルの入力として使用した。scVIモデル（上位3000のHVGを使用）は、デフォルトのパラメータ（10潜在次元と隠れ層あたり128ノード）で、デフォルトの学習率（ELBO検証メトリックが少なくとも20エポックの間改善しなかったときに早期停止）で500教師なしエポックについて訓練された。負の二項観測モデル（gene_likelihood = "nb"）、連続共変量としてのミトコンドリア遺伝子の割合、および患者条件と患者IDのカテゴリ変数（これにより、細胞タイプ識別の目的のためにデータセット統合とバッチ補正を行う）に対するカテゴリ共変量キーが設定された。得られた10次元の潜在埋め込みデータからk-最近傍グラフを構築した（k=15近傍を使用）。このグラフは、Leidenアルゴリズム（resolution = 1.2）による細胞タイプのクラスタリング、およびUMAPアルゴリズム（min_dist = 0.5）の入力として用いられ、可視化された。ミトコンドリア遺伝子の割合が高く、総数が少ない死にかけ細胞のクラスター、および細胞ダブレットのクラスターを除去し、HVG同定から始まる上記の手順を繰り返した（ただしLeidenクラスタリング分解能=1.6で）。得られた細胞型クラスターを統合し、既知の細胞型マーカーに基づいて手動で注釈を付けた。
大まかなクラスタの同定と注釈付けを行った後、同じ scVI 埋め込みアプローチを用いて、各サブセットの HVG の再同定から始め、さらに反復的に関心のある細胞型のサブカルチャーを行った。嗅覚上皮の細胞型（嗅覚水平基底細胞、サステンタキュラー細胞、ボーマン腺細胞、微絨毛細胞、嗅覚神経細胞を含む）のみを用いて scVI モデルの学習を行った後、嗅覚神経細胞とサステンタキュラー細胞のダブルツのクラスタをさらに特定・除去しました。次に、嗅覚神経細胞と微絨毛細胞に対してscVIモデルを学習させ（ただし、scVIモデルでは2000個のHVGと100個の隠れノードを使用）、このモデルから得られるクラスタから嗅覚神経細胞系列の細胞タイプを同定した。最終的なscVIモデル（2000個のHVGと100個の隠れノードを使用）を使用して、これらの細胞を埋め込み、クラスター化し、球状基底細胞（TOP2AとASCL1）、即時ニューロン前駆体（NEUROD1とSOX11）、未熟嗅覚ニューロン（GAP43、DCX、GNG8）、成熟嗅覚ニューロン（GNG13とSTOML3）の既知のマーカーを用いて嗅覚ニューロン系列の細胞の型を手動で注釈を付けました。また、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞を含む広いリンパ球クラスターを、これらの細胞からの上位2000個のHVGからさらにサブクラスタリングし、得られたscVI包埋をクラスタリング（分解能＝1.1）してリンパ球サブタイプを特定したのも同じ手法であった。
これらの細胞で学習させたscVIモデルの2回目の反復で同定した嗅覚神経細胞系列の細胞種を用いて、軌跡解析と擬似時間解析を実施した。ボーマン腺細胞は解析から除外した。新しい近傍グラフは、n_neighbors = 100とn_pcs = 20を用いて計算され、細胞はデフォルトのLeidenアルゴリズムを用いて解像度 = 1.5で再クラスタ化された。クラスタ結合度は、デフォルト設定のパーティションベースのグラフ抽象化（PAGA）を用いて計算された。PAGAプロットは、threshold = 0.2を使用して構築された。疑似時間ヒートマップをプロットするために、Leiden クラスタは PAGA の接続性予測に基づいて並べられた。
トランスクリプトーム距離は、嗅覚ニューロン系統の細胞について、10次元scVI潜在空間包埋のペアワイズ相関距離行列から計算された。トランスクリプトーム距離は、各ペアの細胞間のペアワイズトランスクリプトーム距離の中央値を取ることによって、各嗅覚神経細胞群条件（コントロール対PASC低酸素）ペアについて要約された。
差分発現解析などの追加プロットについては、フィルタリングした出力をR (v4.1.1) でSeurat toolkit (v4.1.0) を用いて解析した (46)。Scanpyから処理されたanndataオブジェクトは、SeuratDiskのLoadH5Seurat関数を使用して、すべてのメタデータ（scVIクラスタを含む）を保存したRオブジェクトに変換された。データは、差分発現解析の前に、相対数正規化により正規化した。差分発現遺伝子は、FindMarkers関数を用いてデフォルト設定で検出し（Wilcoxon rank sum）、ggplot2を用いてプロットした（>log2 fold change, adjusted P < 0.05 で有意な差分発現遺伝子を同定する）。リンパ球サブセットのクラスターマーカーは、デフォルト設定でFindAllMarkersを使用して同定した。DotPlotは相対正規化カウントを使用して作成した。
NicheNet解析は、デフォルトのリガンド-ターゲット前モデル、リガンド受容体ネットワーク、および重量統合ネットワーク（47）を使用して、nichenetrパッケージ（v.1.1.0）を使用してRで実施した。具体的には、正規化された遺伝子発現を持つ関心のある細胞集団（すなわち、リンパ球クラスタ、嗅覚ニューロン、およびサステイン細胞）を、処理したRオブジェクト（anndataから）からサブセットアウトし、適切な受信者および送信者集団の入力として使用した。CircosプロットはCirclize (v.0.4.14)を用いて作成した。個々の比較のために、外科手術のみまたはブラシ生検のみのサンプルからのデータセットを分析し（図S11）、正規化された嗅上皮細胞集団の遺伝子発現プロファイルに有意な変化がないことを確認した。
免疫組織化学
組織学用のサンプルは、HBSS（Gibco）＋10％FBSで収集した。組織は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich、セントルイス）で、室温で4時間固定した。サンプルはPBSで洗浄した後、30％スクロース、250mM EDTA、およびPBS中、4℃で5〜7日間ロッカー上でインキュベートした。次に、試料を Optimal Cutting Temperature compound (VWR, Radnor, PA) で瞬間凍結し、クリオスタット (CryoStar NX50, Thermo Fisher Scientific) で 10 μm で切り出し、 Superfrost plus slides (Thermo Fisher Scientific) に採取した。
組織切片をPBSで再水和し、0.1% Triton X-100入りPBS中の5%正常ヤギ血清でブロッキングした。クエン酸ベースの抗原アンマスキング溶液（Vector Laboratories, Newark, CA）中で45分間組織を蒸すことにより、OMPについて染色する切片に抗原回収を行った。抗チューブリンβ3（BioLegend、クローンTUJ1、カタログ番号801201、AB_2313773；1：500）、抗CD45（BioLegend、クローンHI30、カタログ番号304001、AB_314389；1：50）、抗CD3（BioLegend、クローンHIT3a、カタログ番号. 300301、AB_314037；1：50）、抗CD68（BioLegend、クローンBL13756、カタログ番号375602、AB_2876705；1：50）、抗CD207（Langerin）（BioLegend、クローン4C7、カタログ番号144201、AB_2562087；1：50）、抗TCR γ／δ（BioLegend, clone B1, catalog number. 331202、AB_1089222；1：50）、抗ERMN（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号PA5-58327、AB_264 1113；1：100）、抗SARS-CoV-2ヌクレオカプシド（Novus、NB100-56576、AB_838838；1：250）、抗SOX2（Invitrogen eBioscience、カタログ番号. 14-9811-82, AB_11219471; 1:50), または抗OMP (Santa Cruz Biotechnology, catalog no. sc-365818, AB_10842164; 1:500) 一次抗体をブロッキングバッファで希釈し、室温で1時間または4℃で一晩組織片をインキュベートした。PBS洗浄後、組織を蛍光標識二次抗体と45分間インキュベートした（Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA）。カバースリップの前に、4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）（Vector Laboratories，Burlingame， CA）を含むベクタシールドを各セクションに塗布した。すべての画像は、Leica DMi8顕微鏡システム（Leica Microsystems）上で取得された。画像はImageJソフトウェア（v.2.3.0）を用いて解析し、スケールバーはLeicaのオリジナル取得ソフトウェアファイルのメタデータを使用して適用された。
免疫組織化学的標識の定量化のために、画像は40倍の対物レンズで取得し、ImageJで開いた。TUJ1/ERMNによる隣接切片の染色で、呼吸器上皮ではなく嗅覚上皮の存在を確認した。カウントは、嗅上皮の最低500μmの長さにわたって行った（患者ごとにカウントした平均長さ＝931μm）。嗅覚ニューロンは、OMP+細胞ソーマと樹状突起、および関連するDAPI+核の存在に基づいてカウントされた。耳介細胞はSOX2+核の有無でカウントした。SOX2+核は頂端のSOX2+核のみとし、SOX2+水平基底細胞（基底膜に対して明確に位置し、小さな平坦な形態を持つ）は除外した。各患者について、全SOX2+頂端細胞に対するOMP+細胞の総比率を算出した。隣接する切片は、アバクロンビー補正の必要性を避けるために、ある細胞タイプに特異的なマーカーのカウントに含まれなかった。
嗅覚性粘液アッセイ
UC San DiegoのIRB承認プロトコル（#210078）に従い、内視鏡ガイド下で吸水性フィルターペーパーを用いて嗅覚溝から粘液を採取した。コホートには、嗅覚識別テストを用いた心理物理テストに基づくPASC低吸収症患者（n = 13人）または対照正常吸収症患者（n = 7人）が含まれた。蛍光ビーズを用いたマルチプレックスアッセイ（LegendPlex、BioLegend）を用いて、フローサイトメトリーにより13種類のサイトカイン/ケモカインの定量を行った。
統計情報
すべてのシーケンスデータセットの解析は、上記のツールキットとパッケージを使用して、PythonまたはRで行った。プロットはScanpy、Matplotlib、ggplot2 in associated R toolkits (48) 、またはGraphPad Prism 9を用いて作成した。PASC低血糖サンプルとコントロールサンプルの細胞表現型の比較は、対応のない両側t検定で行い、有意性はP < 0.05と定義した。すべてのパラメトリック検定では、Shapiro-Wilk検定を使用して正規分布を評価し、適切な有意性検定（t検定またはMann-Whitney検定のいずれか）を使用した。差次的発現遺伝子はWilcoxon rank sum testで解析した。エラーバーはSEMを表す。差次的発現遺伝子セットは、ToppGene Suite (49)を用いて遺伝子オントロジー、細胞経路、または組織出力用語について解析された。免疫組織化学の定量は、Tukey検定、Bonferroni補正を用いた一元配置分散分析を用いて比較した。
謝辞
本研究のために生検標本を提供することに快く同意していただいた患者さんに感謝する。Duke Molecular Genomics Coreの専門的技術支援とV. Jainによるバイオインフォマティクスの支援に感謝する。また、臨床研究コーディネーターのA. WalkerとV. Eifertの専門的な支援に感謝する。グラフィカルな図式はBiorender.comで作成した。
資金提供本研究は、NIH助成金DC018371, DC016859 (B.J.G.), AG074324 (E.A.M.), and DC019956 (C.H.Y.) とDuke Department of Head and Neck Surgery & Communication Sciencesからの助成金によって実施された。
著者の貢献 B.J.G.が研究の企画とデータの解釈を行った。D.W.J.、R.A.-H.、B.J.G.は生検試料を入手した。J.B.F.、A.D.O.、T.K.、B.J.G.は scRNA-seq 実験を行った。C.H.Y.は粘液のアッセイと解析を行った。B.J.G., J.B.F., S.R.D., D.H.B., T.T. は scRNA-seq データの解析を行った。S.A.W.、H.M.、E.A.M.はリソースを提供し、実験デザインと解釈をアシストした。R.G.とJ.B.F.は、免疫染色と解析を行った。J.B.F., B.J.G., D.H.B., T.T., S.R.D. は、全著者の意見を取り入れながら原稿を執筆した。
競合する利益 B.J.G.はFrequency Therapeutics社からコンサルタント料を受け取っており、Rhino Therapeutics社への無報酬コンサルティングを開示しています。D.W.J.は、MedtronicおよびAssociation for Migraine Disordersから研究支援を受けています。H.M.はChemcomからロイヤリティ、Givaudanから研究助成金、花王からコンサルタント料を受領しています。
データおよび資料の入手：scRNA-seqデータセットはGEOにアクセッション番号GSE201620で寄託されています。コードの公開。解析に関わるスクリプトはZenodo (DOI 10.5281/zenodo.7102415) で公開されています（https://zenodo.org/record/7102415#.YyuFTiHMLao）。この作品はクリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際 (CC BY 4.0) ライセンスの下に提供されており、原著を適切に引用することを条件に、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、複製を許可しています。このライセンスのコピーは、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。このライセンスは、論文に含まれる図/写真/芸術作品またはその他のコンテンツで第三者にクレジットされているものには適用されません。この素材を使用する前に、権利者の承認を得てください。
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参考文献と注釈
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A. Carfi, R. Bernabei, F. Landi; Gemelli Against COVID-19 Post-Acute Care Study Group, Persistent symptoms in patients after acute COVID-19. JAMA 324, 603-605 (2020).
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2
S. E. Schambeck, C. S. Crowell, K. I. Wagner, E. D'Ippolito, T. Burrell, H. Mijočević, U. Protzer, D. H. Busch, M. Gerhard, H. Poppert, H. Beyer, Phantosmia, parosmia and dysgeusia are prolonged and late-onset symptoms of COVID-19. J. Clin. Med. 10, 5266 (2021).
CROSSREF
PUBMED
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3
K. K. Karamali、M. Elliott、C. Hopkins、COVID-19に関連する嗅覚機能障害。Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 30, 19-25 (2022).
CROSSREF
PUBMED
ISI
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4
P. ボスコロ・リッツォ、T・フンメル、C・ホプキンス、M・ディバッティスタ、A・メニーニ、G・スピナート、C・ファブリス、E・エマヌエリ、A・ダレッサンドロ、R・マルゾリーノ、E・ザネッリ、E・カンチェリエリ、K・カルグネルッティ、S. ファッダ、D・ボルセット、L・A・ヴァイラ、N・ガーダル、J・ポレセル、G・ティレール包括的な心理物理学的評価を用いた1年間のフォローアップによるマッチドケースコントロール研究。Rhinology 59, 517-527 (2021).
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