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枯草菌と乳酸菌の細胞間における非共役プラスミド転移
オープンアクセス
枯草菌と乳酸菌の細胞間における非共役プラスミド転移
ルイザ・P・モラフスカ、オスカー・P・カイパース
初出:2022年12月22日
https://doi.org/10.1111/1751-7915.14195
について
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概要
枯草菌は土壌に生息する細菌であり、その自然環境において他の多くの微生物と相互作用することができる。我々は、枯草菌から工業的に有用な乳酸菌への種間遺伝子の導入の可能性を検討した。種間 HGT の可能性を探るため、共培養プロトコルを開発し、高コピー非共役プラスミドが枯草菌から乳酸菌に移行することを証明した。興味深いことに、このプラスミドの導入には、枯草菌のコンジュゲーションやコンピテントステートの活性化を伴わない。さらに、本研究では、コンピテントではない Lactococcus lactis sp. cremoris 株に対して、細胞間プラスミドの非共役的な種内移 植を初めて示した。本研究は、細胞間形質転換がユビキタスな HGT の一形態であり、自然(非遺伝子組み換え)株改良の代替ツール として利用できる可能性があることを示している。
はじめに
遺伝子の水平伝播(HGT)は、細菌の進化や生態系において重要な役割を担っている。環境の変化に適応するため、細菌は様々な淘汰圧のもとで有益な性質を持つ外来DNAを獲得する(Cohan & Koeppel, 2008; Wiedenbeck & Cohan, 2011)。HGTの生態学的重要性の有力な証拠は、近縁種における抗生物質耐性および病原性決定因子の獲得と拡散であり、これは抗生物質耐性病原体の出現に重大な結果をもたらし得る(Dengら、2019;Schmidt & Hensel、2004;Siddaramappaら、2011)。
一般的に認識され、よく知られている細菌のHGTのメカニズムは、コンジュゲーション、トランスダクション、および自然形質転換である。形質転換プロセスでは、細菌は一時的なコンピテンス状態に入り、DNA取り込み装置の組み立てを活性化して、裸のDNAを環境から直接獲得する (Chen et al., 2005; Chen & Dubnau, 2004; Lorenz & Wackernagel, 1994)。このプロセスは、レシピエントの細胞に遺伝的にコード化されており、成長段階、栄養利用可能性、飢餓、細胞密度、さらには抗生物質ストレスなどの多くの生理的および環境的要因によって制御される(Claverysら、2006; Dubnau, 1991a; Hamoenら、 2003; Håvarsteinら、 1996; Slagerら、 2014)。DNA取り込み機構は一般に種を超えて保存されているが、誘導条件や誘導剤の種類は種によって異なる。例えば、枯草菌では、定常期の開始時や高い細胞密度に反応してコンピテンスを誘導する(Anagnostopoulos & Spizizen, 1961; Dubnau, 1991b)。一方、Streptococcus pneumoniaeでは、コンピテンスの活性化は指数関数期の特定の時期に観察され、定常期には抑制された (Håvarstein et al., 1995)。注目すべきは、多くの細菌がコンピテンス誘導遺伝子の完全なセットを示すことである。しかし、形質転換促進条件はまだ必ずしも解明されていない(David et al., 2017; Mulder et al., 2017; Wydau et al., 2006)。
自然形質転換とは異なり、コンジュゲーションとトランスダクションは、それぞれドナー細胞、またはドナーファージの存在を必要とし、DNA交換のための特定の導管に関与する。コンジュゲーションの場合、適合するドナーとレシピエントの間で交配ペアが形成された後、遺伝物質が交配チャンネルまたはコンジュゲーションピルスを通じて伝達され、通常コンジュゲーションエレメントにコードされている(Auchtungら、2016; Cabezónら、2015)。トランスダクションの間、遺伝情報は、キャプシドの組み立て中に宿主のDNAのランダムな断片を獲得し、ドナーとレシピエントの両方に感染することができたファージビリオンを介して運ばれる(Chiangら、2019; Clokieら、2011; Marcelliら、2020)。抱合と伝達は確かに細菌のHGTに寄与しているが、その伝達能力は、表面排除、遺伝物質の種類とサイズ、宿主域特異性、レシピエントに存在する制限修飾系、性的隔離など多くの要因によって制限されている(Dahmane et al., 2017; Mahony et al., 2017; Majewski, 2001; Thomas & Nielsen, 2005)。
これらの古典的なHGTメカニズムに加えて、最近の証拠は、膜小胞(Domingues & Nielsen, 2017)、細胞間自然形質転換(Blesa et al, 2015; Etchuuya et al, 2011; Matsumoto et al, 2016; Zhang et al, 2018)、ナノチューブ(Dubey & Ben-Yehuda, 2011)などのバクテリアのDNA移転の代替手段という考えを支持している。興味深いことに、枯草菌は、コンジュゲーション(Grohmann, 2010a, 2010b; Lee et al., 2012; Rösch et al., 2014; Singh et al., 2013)やファージ導入だけでなく、遺伝物質を伝達することが示されている(Deichelbohrer et al, 1985; Tzipilevich et al., 2017; Yasbin & Young, 1974)に加え、細胞間の非共役プラスミド転移(Dubey & Ben-Yehuda, 2011; Zhang et al., 2018)により、種内および種間HGT事象を研究する優れた候補となる。枯草菌と乳酸菌(LAB)の仲間は、食品や飼料生産、プロバイオティクス市場において非常に重要な存在である。しかし、新しいスターター培養物を生産するための現在の菌株改良法は、国民の抵抗や遺伝子組み換え生物の使用に関する欧州連合指令によって強化されているため、制限されています。そこで近年、遺伝形質の動員を目的とした自然発生的なHGTプロセスへの関心が改めて高まっている(Bron et al., 2019; Kuipers, 2015; Marcelli et al.) ここでは、枯草菌とラクトコッカス・ラクティスやストレプトコッカス・サーモフィラスなどの工業的に関連するLABの共培養におけるHGTの可能性を探る。今回初めて、高コピーかつ非結合性プラスミドを、非結合性かつ結合陰性である枯草菌とL. lactis株において、共培養技術により種間および種内移行させることを実証している。
実験手順
菌株および増殖条件
B. subtilis株はLysogeny Broth (LB) を用い、220 rpmで振盪して通気するか、1.5% (w/v) 寒天で固めたLB上で37℃で培養した。L. lactis株はグルコースを最終濃度 0.5% (w/v) で添加したDifco M17 (GM17) を用いて30℃で、常温培養か1.5% (w/v) 寒天で固めた GM17上で、培養した。S. thermophilus株は、グルコース(0.5%w/v)およびラクトース(1%w/v)添加Difco M17培地(GLM17)または1.5%(w/v)寒天培地で37℃にて嫌気的に静置培養を行なった。必要に応じて,増殖培地に以下の最終濃度の抗生物質を添加した:クロラムフェニコール(cm)5μg/ml,テトラサイクリン(tet)5μg/ml,スペクチノマイシン(spec)100μg/ml,およびエリスロマイシン(ery)5μg/ml。
本研究で使用した全ての菌株を表1に示す。使用したすべてのプラスミドとオリゴヌクレオチドをそれぞれ表2および3に示す。
表1. 本研究で使用した菌株
菌株名 種 類 遺伝子型 Abr Reference
PY79 B. subtilis Prototroph SPβ, ICEBs1- - BGSC
PY79 ΔcomK B. subtilis PY79; comK::spec spec 本研究の成果
PY79 pNZ8048 B. subtilis PY79; pNZ8048 cm この研究室では、PY79とpNZ8048を組み合わせて使用する。
168 B. subtilis trpC2 - BGSC
168 pNZ8048 B. subtilis 168 trpC2, pNZ8048 - BGSC
168 ΔcomK B. subtilis 168 trpC2, comK::spec ラボストック
168 ΔamyE B. subtilis 168 trpC2, amyE::tet tet ラボストック
MG1363 L. lactis NCDO712のプラスミドフリー誘導体 (Prt-, Lac-) - Gasson (1983)
MG1363 GFP+ L. lactis MG1363; pseudo10::Pusp45-sfGFP(Bs) ery Overkamp et al.
MG1363 ΔcluA L. lactis MG1363; ΔcluA - この仕事
MG1363 GFP+ ΔcluA L. lactis MG1363_sfgfp(Bs); ΔcluA ery この仕事
MG1363 pNZ8048 L. lactis MG1363; pNZ8048 cm 本作
MG1363 ΔcluA pNZ8048 L. lactis MG1363; ΔcluA, pNZ8048 cm 本業
MG1363 pNZ521 L. lactis MG1363; pNZ521 cm この仕事
MG1363 ΔcluA pNZ521 L. lactis MG1363; ΔcluA, pNZ521 cm この研究室では、L. lactis の遺伝子発現を調べるために、以下の実験を行った。
CNRZ302 pNZ8048 S.thermophilus pNZ8048 cm 本 当
ST11 pNZ8048 S.thermophilus pNZ8048 cm この著作物
表2. 本研究で使用したプラスミド
プラスミド 遺伝子型 Abr Reference
pNZ8048 NICE 誘導性ベクター cm de Ruyterら(1996)
pseudo10::Pusp45-sfGFP(Bs) Pusp45-sfGFP(Bs) 配列を持つ統合ベクター pSEUDO10 ery Overkampら(2013)
pGh9::cluA pGh9感温性プラスミド(pWV01の複製感温性誘導体;Ottoら、1982)欠失用L. lactis cluA構築物をSmaIを介してpGh9にギブスンアセンブリによりクローニング、未発表ery Kulakauskas博士の株コレクション(未発表)ery
pNZ521 10.7 kb pSK111 cmの完全なprtPおよびprtM遺伝子を有するpNZ122誘導体 Maruggら(1995年)
表3.本研究で使用したプライマーの一覧。
名称 配列 5′ → 3′ 増幅断片 産物サイズ (bp)
cmR_FW GCAGACAAGTAAGCCTCCTA 1 767
cmR_RV GGGCAGGTTAGTGACATTAGA 1
repA_FW TGCGGCGTTAGCTATAGAAG 2 1225
repA_RV CTGCTTTCTTCATTAGAATCAATC 2
Pnis_FW CCAAGATCTAGTCTTATAACTATAC 3 803
Pnis_RV CGGCTTTCATAATCTAACAGAC 3
repC_FW TATGAAAGCCGATGACTGAATG 4 539
repC_RV AACCGCAGATTTTGAAAAAC 4
性因子を欠く Lactococcus lactis 株の構築
L. lactis MG1363 における cluA のノックアウトには、Saulius Kulakauskas 博士から贈られた pGh9 thermosensitive plasmid system を使用した。cluA配列を含むpGh9プラスミドによるエレクトロコンピテントL. lactis MG1363の形質転換は、以前に記載したように行った(Maguinら、1996)。L. lactisでは、pGh9は28℃で複製されるが、細胞が37℃以上の温度で培養されると失われる。pGh9-cluAプラスミド誘導体を使用して、28℃の許容温度でネイティブなcluA遺伝子座にプラスミドを統合した。さらに37℃でプラスミドを切除した結果、L. lactis MG1363 ΔcluA株が得られた。
交配手順-細胞間プラスミド導入
ドナーおよびレシピエントのモノカルチャーを一晩培養したものを接種し、最終OD600が0.05になるように希釈し、適切な抗生物質を補充し、最適温度で別々にインキュベートした。L. lactisは30℃、B. subtilisは37℃で培養した。その後、対数増殖期中期(OD600〜0.5)に達するまで培養した。培養期間後、細胞を採取し、1XSMM(Harwood & Cutting, 1990)培地で洗浄して、1μlの培養物当たり107個の最終密度にした。ドナー細胞とレシピエント細胞を細胞比1:1(ドナー:レシピエント)で混合し、混合培養物5μlを非選択性GM17培地にスポットし、風乾し、最適温度でO/N培養した。B. subtilisは37℃,L. lactisは30℃の温度で培養した。S. thermophilusについては、1%ラクトース添加GM17培地(GLM17)で交配を行い、37℃で共培養を行った。O/N交配プレートからの細胞は1mlの1XSMM培地を用いて収穫し、適切な抗生物質を含む選択的リッチ培地プレートにプレーティングし、その後、O/Nのために示された温度でインキュベートした。形質転換体を有するプレートを、クロラムフェニコール耐性の場合にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの非ヘテロ性転移を除くために、適切な抗生物質を用いて、B. subtilisとL. lactisはGM17、S. thermophilusはGLM17というリッチ選択性培地に再現させた。一晩培養後、形質転換体を選択的液体培地で増殖させ、プラスミドを単離した(NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA, Macherey-Nagel, GmbH & Co. KG, Germany)を用いてゲル電気泳動を行った(Bio-Rad Laboratories, Inc.の水平ゲル電気泳動システム、オランダ)。さらに、L. lactis形質転換体におけるpNZ8048の存在を確認するために、pNZ8048アニーリングプライマー(表3)を用いたPCR反応(T100 Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Inc, The Netherlands)を実施した。
DnaseI処理
DnaseI 処理は、ナノチューブに関する既報の研究(Dubey & Ben-Yehuda, 2011)と同様 に実施した。ドナー株とレシピエント株を別々に指数関数的な中間期まで成長させ、その後ペレット化し、DNaseI バッファー(50 mM Tris, pH 7.2, 10 mM MgCl2, 5 mM CaCl2)で洗浄し、100 μg/mlのDNaseI存在下で37℃、15分間別々にインキュベーションを行った。ドナーとレシピエントを1:1の割合で混合し、その混合物にDNaseI(100μg/ml)を添加し、LB寒天培地上にスポットした。コントロールとしてDNaseIバッファー(DNaseIなし)を添加した。混合共培養を30℃または37℃で18時間培養し、レプリカをそれぞれの抗生物質プレートにプレーティングした。
顕微鏡観察技術
TIRF顕微鏡-FM5-95による膜の可視化
培養物を上記のように調製し、最終濃度1μg/mlのFM5-95膜色素を添加したGM17中の1% (w/v) アガロース上にスポットし、実験の前に37℃で1時間インキュベートした。ナノチューブを高解像度で可視化するために、TIRF 60× 対物レンズを使用した(Olympus 60X/1.49, APON 60XOTIRF, UIS2, 1-U2B720)。FM5-95色素を用いた膜構造の観察には、Quad-mCherryフィルターセットを用いた:レーザーによる励起は568 nm、発光は594 nm。
SEM
混合培養では、B. subtilisとL. lactisを別々にリッチ培地で指数関数的成長期半ばまで培養し、1:1の割合で混合してナノチューブを可視化させた。この混合物をGM17寒天培地にスポットし、その上にEM銅グリッドを置き、37℃で6時間インキュベートした。インキュベーション期間終了後、細胞をグルタルアルデヒド(2%)で4℃、一晩固定した。翌日、細胞を0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、1%四酸化オスミウム(0.1 M カコジル酸ナトリウムで調製)と共に室温で1時間インキュベートした。固定後の試料を水で3回洗浄し、その後30%、50%、70%のエタノールで15分間脱水し、最後に100%のエタノールで30分間脱水した。最後に、100%エタノール:テトラメチルシラン(TMS)(1:1)中でインキュベートした。10分後、サンプルは純粋なTMSで15分間処理され、その後、画像化の前に風乾された。
結果
B. subtilis、L. lactis、S. thermophilus は、バクテリアナノチューブに類似した膜状構造体を形成することができる。
混合培養におけるHGTを促進する膜状構造の可視化
最近の10年間で、隣接する細菌細胞を橋渡しする膜状構造の存在が広く研究された(Bhattacharya et al., 2019; Dubey et al., 2016; Dubey & Ben-Yehuda, 2011; Pal et al., 2019; Pande et al., 2015; Stempler et al.) 顕微鏡技術を用いることで、グラム陽性菌(枯草菌、黄色ブドウ球菌)およびグラム陰性菌(大腸菌)において、これらの膜接続が同定され、特徴づけられてきた。ナノチューブのような構造体が、種内・種間における遺伝子組換え現象を導くことができると提唱されている(Dubey & Ben-Yehuda, 2011)。そこで、我々は、L. lactis、S. thermophilus にこのような膜結合が存在するかどうかを調べ、さらに、ナノチューブ生産者として知られる B. subtilis とこれらの微生物の混合培養による種間相互作用について検討した。
そこで、選択した微生物の共培養条件を最適化し、試験環境下で顕微鏡による解析を行った。その結果、B. subtilis と L. lactis は、リッチ培地 GM17 にスポットし、37℃で共 同培養することで共存できることが確認された。B. subtilisとS. thermophilusについては、GM17に1%の乳糖を添加し、37℃で培養することが最適条件であった。このような環境を踏まえ、6時間培養後の共培養体を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察し、全反射蛍光顕微鏡(TIRF)で種間および種内の膜接続、分子移動現象を促進することが知られているナノチューブを可視化した(図1および補足資料)。
詳細は画像に続くキャプションに記載
図1
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パワーポイント
キャプション
枯草菌とLAB菌の間で非共役プラスミドが移行する可能性
各微生物の単培養および共培養を顕微鏡で解析した結果、固形培地で培養した細胞は、バクテリアナノチューブに類似した膜状構造体を形成していることがわかった(図1)。この膜状構造体の形成は、HGTやいわゆる細胞間形質転換を促進する可能性があるため、枯草菌とLAB菌の種間プラスミド転移を検討し、高コピー、非共役シャトルベクターpNZ8048 (3.4 kb, cmR) を保有するドナー株のコレクションを設計し、ドナーおよびレシピエントの細胞で複製した (de Ruyter et al., 1996)。レシピエント株は、新たに操作された株の選択を容易にするために、染色体上に組み込まれた抗生物質カセットを含んでいた(実験手順;表1)。
枯草菌株間でのプラスミド導入
まず、2つの枯草菌の細胞間形質転換を検討した。枯草菌の交配には、まず、よく特性化された枯草菌168実験室株を用いた。枯草菌はコンピテンス状態の誘導に伴い、環境から遊離したDNAを取り込むことができるため、交配手順の間に、転移したプラスミドが隣接する溶解した供与細胞から受容細胞に取り込まれないようにするために、コンピテンスマスターレギュレーターComK(Hahnら、1996;van Sinderenら、1994)をコードするcomK遺伝子をノックアウトした受容菌株を用いることに決定した。さらに、comK-株は、後にLB寒天培地プレート上で選択するために、spectinomycin抗生物質カセットを有していた。ドナー株には、pNZ8048 (cmR) 非共役シャトルプラスミドを保有するB. subtilis 168を使用した。プラスミド移行を調べるために、リッチ非選択性寒天培地プレートにドナー細胞とレシピエント細胞の混合物をスポットし、抗生物質選択圧なしで一晩インキュベートした。コントロールとして、ドナー細胞とレシピエント細胞を別々に同じ種類の非選択性寒天培地プレートにスポットした。さらに、天然コンピテンスの活性化によるDNAの取り込みを除外し、細胞間DNA転移を確認するために、レシピエント細胞を別々に交配プレートにスポットし、1μgの外来性pNZ8048 DNAを添加した。培養時間後、形成された混合マクロコロニーを回収し、レシピエント株の抗生物質耐性を試験した。選択板の解析から、specRとcmRの両方の抗生物質に耐性を持つコロニーはすべて、ドナーとレシピエントの混合集団にのみ由来することがわかった(図2A)。ドナーまたはレシピエントの単培養株の耐性コロニーは選択培地上では観察されず、レシピエント細胞がスペクチノマイシンおよびクロラムフェニコール寒天培地上にコロニーを形成するためにはドナー細胞と同じ環境にあることが必要であることが示された。さらに、レシピエント株は外部から与えられたプラスミドDNAを培地から取り込むことができず、自然なプラスミド形質転換の可能性は排除された。レプリカプレーティングの後、得られたコロニーをプラスミドの存在について追加で調べた(図2B)。導入効率は、ドナー細胞から遺伝物質を受け取ったレシピエントの割合として推定し、CFUレシピエントあたり10-2個の形質転換体で見積もった(図2C)。
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図2
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パワーポイント
キャプション
細胞間形質転換における機能的な天然コンピテンスの関連性をさらに検討するために、168 ∆comK (specR) 株 168 ∆amyE (tetR) 株 comK+ 株をレシピエント株として用いた場合のプラスミド導入効率を比較検討した。なお、枯草菌がデンプンを分解するために用いるα-アミラーゼをコードする機能的なamyE遺伝子の欠如は、導入効率に影響せず、固体培地上での自然形質転換の効率も低下させないはずである。交配手順の後、同じドナー株の枯草菌168 pNZ8048を固体培地上で168 ΔcomK (specR) または168 ΔamyE (tetR) と共培養し、プラスミド転移を適宜検討した(図2A)。平均して、168 ΔamyE(tetR)へのプラスミド導入効率は、168 ΔcomK (cmR)と比べて有意な差はなかった(図2C)。このことは、交配条件下では、枯草菌細胞における推定上の天然コンピテンスの活性化がプラスミド獲得を促進しないことを示している。
枯草菌168株のゲノム解析により、温帯性ファージSPß (Warner et al., 1977) と統合・共役要素ICEBs1 (Auchtung et al., 2005, 2007) が存在することが判明している。そこで、プラスミド導入が細胞間接触依存的であり、コンジュゲーション現象や誘導されたプロファージ導入の結果ではないことを確認するために、ICEBs1とSPβを硬化させた枯草菌PY79株を用いた試験を行った。その後、comK遺伝子にspectinomycin抗生物質カセットを挿入したコンピテンス陰性株を設計し、B. subtilis PY79 ΔcomK (specR) recipient strainを得た。ドナー株には、B. subtilis PY79 pNZ8048 (cmR) 株を使用した。推定された導入効率から、PY79は168株と同様の性能を示し、pNZ8048が非共役的に導入され、ファージ導入を伴わないことがわかった(図2C)。さらに、プラスミドの導入はDNaseIに対して耐性があり、pNZ8048は環境から直接取り込まれたのではなく、保護導管を介して導入された可能性が高いことが分かった。B. subtilisとの交配による導入効率は、CFU受信者あたり10-2個の形質転換体が得られると見積もられた(図2C)。
枯草菌とL. lactis間の種間プラスミド転移
L. lactisは、乳発酵のスターター培養、異種タンパク質生産の宿主、治療薬の送達プラットフォームとして広く用いられているグラム陽性細菌である。そのため、遺伝子操作のステップを省略して新たな遺伝形質を獲得することができれば、工業的に有用な特徴を持つ新規株の設計・生産に大きく貢献することが期待されます。コンピテンス関連遺伝子にいくつかの変異があるため、L. lactis MG1363はコンピテンス状態に入ることができない(Mulder et al., 2017)。そのため、環境からのDNA取り込みを除いた細胞間形質転換を研究することが可能であった。
B. subtilisからL. lactisへのプラスミド導入
枯草菌が非共役プラスミドを効率的に近傍に導入できることを踏まえ、枯草菌とL. lactis間の種間プラスミド転移を利用した最初の交配実験を計画した。ドナー株として、B. subtilis 168 pNZ8048 (cmR) および PY79 pNZ8048 (cmR) を、レシピエント株として pSEUDO10_sfgfp(Bs) (eryR) (MG1363 GFP+)を導入した L. lactis MG1363 を使用し、ドナー株とレシピエント株の間でプラスミドを導入した。そこで、ドナー株とレシピエント株を両株の生育を支持する固形リッチ培地(GM17)上で37℃にて共培養し、交配後のレシピエント株の抗生物質耐性を分析した。レシピエント株はゲノムにエリスロマイシンカセットが組み込まれているため、L. lactis形質転換体の選択はエリスロマイシン(5μg/ml)およびクロラムフェニコール(5μg/ml)GM17プレートで行った。細胞間プラスミド導入により、最初の選択ラウンドの後、5μg/mlのエリスロマイシンおよび5μg/mlのクロラムフェニコールに耐性のL. lactis MG1363コロニーが多数得られ(図3A)、プラスミド導入効率は、CFUレシーバーあたり10-4〜10-5と見積もられた。しかし、液体培地や固体選択性リッチ培地(GM17、エリスロマイシン5μg/ml、クロラムフェニコール5μg/ml)で得られた形質転換体は増殖させることができなかった。興味深いことに、クロラムフェニコール濃度を1μg/mlおよび2.5μg/mlに減らしたリッチ培地上での形質転換体のレプリカプレーティングでは、L. lactisシングルコロニー、およびB. subtilis形態を有するいくつかのコロニーが得られた(図3B)。さらに、得られたL. lactis形質転換体と分類されたコロニーの同一性を確認するために、顕微鏡による解析を行い、これらのコロニーがMG1363 GFP+細胞であることを確認した(図3C)。
詳細は、画像に続くキャプションに記載
図3
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パワーポイント
キャプション
次に、MG1363 GFP+ pNZ8048 のシングルコロニーを選択し、GM17 にエリスロマイシン 5 μg/ml とクロラムフェニコール 2.5 μg/ml を接種し、プラスミド抽出と直接コロニー PCR により L. ラクティス培養での pNZ8048 の存在を確認した。形質転換細胞から単離したpNZ8048のゲル電気泳動では、pNZ8048特有のバンドは見られなかった(図3D)。逆に、MG1363 GFP+ pNZ8048コロニーと同じコロニーから単離したゲノムDNAのPCR分析では、クロラムフェニコールカセットを含むpNZ8048断片の存在が明らかになった(図3E)。このことは、レプリカプレーティングからのコロニーが、量は減少しているがpNZ8048のコピーを持っていると思われることを示唆している。
L. lactis から B. subtilis へのプラスミド導入
L. lactis から枯草菌へのプラスミド導入の可能性を検討するために、L. lactis から枯草菌へのプラスミド導入の可能性を検討した。今回、ドナー株として、pNZ8048 (cmR) で形質転換した L. lactis MG1363 を用い、レシピエントとして B. subtilis 168 ΔcomK (specR) を使用した。B. subtilis と L. lactis のマッティングの場合と同じ共培養条件を適用し、プラスミド移 植効率を推定した(図 4A)。得られた枯草菌コロニーを、適切な抗生物質(スペクチノマイシン100μg/mlおよびクロラムフェニコール5μg/ml)を含む選択培地に複製し、プラスミドの存在を検査した(図4B、C)。さらに、ドナーおよびレシピエント株におけるpNZ8048の完全性を、SalIおよびBglII制限酵素を用いた制限分析によって確認した図4D。レシピエント細胞からドナー細胞への移植に際して生じたと思われるプラスミドサイズの変化は観察されなかった。この結果から、コンピテンス陰性枯草菌は隣接するL. lactis MG1363細胞からプラスミドDNAを獲得できることが示され、細胞間プラスミド形質転換効率は、CFUレシピエントあたり10-6形質転換体と見積もられた。
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図4
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パワーポイント
キャプション
乳酸球菌性因子の存在は、L. lactis細胞間のプラスミド交換を促進しない
これまでのデータから、L. lactisは細胞間交換によりプラスミドDNAを枯草菌に導入できることが示唆された。次に、L. lactis の細胞間形質転換について検討を進めた。
L. lactis MG1363は、染色体上に、DNAの共役移動に関与する性因子凝集タンパク質、CluAをコードするcluA遺伝子を持つ(Godonら、1994)。性因子の動員によるプラスミド転移の可能性を排除するため、L. lactis MG1363をpGH9-cluA感温性プラスミドで形質転換し、cluAをマーカーレスでノックアウトし、L. lactis MG1363 ΔcluAを得た。さらに CluA 変異株を pseudo10::Pusp45-sfGFP(Bs) プラスミドで形質転換し、L. lactis MG1363 GFP+ ΔcluA (eryR)レシピエントストレインを得た。非共役プラスミド転移における性因子の役割を調べるため、野生型と cluA 変異体を別々に pNZ8048 の供与体および受容体として使用し、転移効率を比較した。さらに、工業的に望ましいfeature-PrtPプロテアーゼ(Gasson, 1983)をコードするpNZ521プラスミドを導入し、その存在をカゼイン寒天平板で試験した。
30℃のGM17寒天培地上での交配手順、および5μg/mlエリスロマイシンおよび5μg/mlクロラムフェニコールによるさらなる抗生物質選択の後、L. lactisが両方の高コピープラスミド、pNZ8048およびpNZ521をそれぞれ、CFUレシーバー当たり10-3〜10-4の変換体で転移できることを観察した(図5A,B)。推定された導入効率の解析から、MG1363株における性因子の存在は、研究された交配条件下、豊富な成長促進培地上ではプラスミド導入を促進しないことも判明した(図5A,B)。
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図5
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さらに、枯草菌PY79株からL. lactis MG1363の野生型とcluA変異株へのプラスミド導入効率を比較し、検討した条件下では細胞間プラスミド導入に機能するcluAが必要でないことを確認した(図5D)。
S. thermophilusからB. subtilisへの細胞間プラスミド導入
牛乳発酵に使用されるもう一つの工業的関連性のある細菌は、S. thermophilusである。このグラム陽性菌は、天然のコンピテンスを誘導することができると報告されている。コンピテンスの活性化とコンピテンス・マシーナリーの組み立ては、環境中のComXフェロモンの存在量によって決定され、その生産と分泌は通常、特定の環境要因に応答して開始される(Fontaine et al, 2013; Haustenne et al, 2015)。先に、枯草菌とS. thermophilusが乳糖を添加したGM17上で共培養され、膜状の接続を形成することを確認したため、S. thermophilusが細胞間接触様式で枯草菌にプラスミドDNAを送達できるかどうか疑問に思った。そこで、弊社株コレクションから入手可能な S. thermophilus ST-11 株および CNRZ302 株の pNZ8048 プラスミドを枯草菌 168 ΔcomK (specR) に細胞間輸送する試験を実施した。ST11株およびCNRZ302株は電撃授精によりpNZ8048プラスミドを導入し、ドナー株として使用した。さらに、レシピエント株としてB. subtilis 168 ΔamyE(tetR)を試験した。交配は1%ラクトース添加GM17培地を用い、37℃、ドナー/レシピエント細胞比1:1で実施した。
プラスミド導入効率を解析した結果、枯草菌は L. lactis と枯草菌の交配と同様に S. thermophilus 株から効率的にプラスミド DNA を取得できることがわかった。ST-11株の形質転換効率は10-6個/CFUであったが、CNRZ302株では10-5個/CFUであった(図6)。(図6)。
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図6
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考察
本研究では、グラム陽性菌のいくつかの菌種において、細胞間相互作用を介した種内および種間プラスミド転移の可能性を検討した。まず、これまで枯草菌の混合株(Dubey & Ben-Yehuda, 2011; Zhang et al., 2018)、大腸菌(Maeda et al., 2006; Matsumoto et al., 2016)において報告されていた細胞間仲介によるHGTの現象を枯草菌で確認しました。次に、枯草菌とL. Lactis、または枯草菌とS. thermophilusの混合共培養において、高コピーかつ非共役のプラスミドが転移することを初めて示し、細胞間DNA転移がユビキタスなHGTの形態であることが示された。
B. subtilisは乳製品の腐敗を引き起こすことが知られているため(Arakawa et al., 2008; Faille et al., 2014; Moschonas et al., 2021)、グルコースまたはラクトースを添加したM17培地でLABと共存していると予想された。異種間のHGTを研究するために、ドナー株とレシピエント株の両方の生育を支持する共培養条件をテストした。B. subtilis、L. lactis、S. thermophilus の共培養に最適な条件を特定し、様々な顕微鏡技術で単細胞の相互作用を可視化した(図1)。蛍光色素FM5-95による膜染色により、これらのグラム陽性菌が膜状構造を形成していることが明らかになり、これまでバクテリアナノチューブとして同定されている(Dubey et al.2016; Dubey & Ben-Yehuda, 2011)。注目すべきは、ナノチューブが、固体培地上の枯草菌の非結合性プラスミドのHGTに寄与していることが最近示唆されたことである(Dubey & Ben-Yehuda, 2011)。このため、我々は種内交配を行うことにより、非共役型細胞間プラスミド転移についてさらに詳しく調べ、その境界を探ることにした。
その結果、枯草菌は隣接する枯草菌にプラスミドDNAを効率的に送り込むことがわかった。また、細胞溶解や増殖中の細胞からの自発的なDNA分泌により、遺伝物質が環境中に放出されることがあるため(Nielsen et al. コンピテンスマスターレギュレーターComKをコードする遺伝子をノックアウトすることにより (Hahn et al., 1996; van Sinderen et al., 1994) 、形質転換に対する自然コンピテンスの誘導によるドナー非依存のDNA取り込みの可能性を除外した(図2C)。さらに、プラスミド導入がDNase処理に鈍感であることを示し、細胞間遺伝子導入に関する先行研究の結果を支持した(Dubey & Ben-Yehuda, 2011; Zhang et al.、2018)。DNase処理に対する耐性は、ピリを介したコンジュゲーションによるDNA移動と同様に、プラスミドDNAが保護導管に封入されていることを示す。しかし、ここでは、統合的かつ共役的な要素であるICEBs1を保有するB. subtilis 168株と共役陰性B. subtilis PY79の移動効率の違いによって、細胞間プラスミド移動は共役から区別することができた(図2C)。注目すべきは、枯草菌の細胞間における非共役プラスミド転移は、形質転換によるDNAの取り込みよりも効率的であったことである(図S1A,B)。最後に、共培養における生存可能なドナー細胞は、交配に不可欠である。comK遺伝子が機能している場合と機能していない場合のレシピエント細胞を直接プレートに加えてもプラスミドを取り込むことができないことを示し、ドナー細胞とレシピエント細胞が近接して増殖することが必要であることを確認した(図2C)。さらに、ドナー株を意図的に熱処理で死滅させると、交配は不成功に終わった(データ示さず)。
本研究は、LABにおけるHGTのメカニズムに新たな知見を与えるものである。我々は、プラスミドDNAが枯草菌とL. lactisの混合コロニーから(図3および4)、L. lactis株間で(図5)、そして最終的に枯草菌とS. thermophilusの間で(図6)、移動できることを証明した。コンピテント関連遺伝子にいくつかの変異があるため、L. lactis MG1363はコンピテント状態になることができない(Mulder et al.、2017)。そのため、L. lactis のマッティングについては、プラスミド導入は自然形質転換を伴わない。まず、枯草菌からL. lactisへのpNZ8048(cmR)の導入について検討し、L. lactisが選択培地への1回目のプレーティング後にクロラムフェニコールに対する耐性を示すことを示した(図3B)。しかし、得られた形質転換体は、同じクロラムフェニコール濃度の液体培地では生育できず、複製後の固体選択培地では生育不良であった。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼはクロラムフェニコールに対する耐性を付与するが、ナノチューブを介して細菌間で移行することが分かっており、後天的にクロラムフェニコール耐性が非遺伝的に獲得できることが示されている(Dubey & Ben-Yehuda, 2011)。このことは、L. lactis形質転換体が、殺傷濃度のクロラムフェニコールを含む液体培地で複製または培養した後に増殖が困難になったことを説明すると思われる(図3B、図S2)。
しかしながら、L.ラクティスのコロニーおよび低濃度のクロラムフェニコールで培養した形質転換体の液体培養物から単離したゲノムDNAのPCR分析により、pNZ8048アンプリコンが認められた(図3E)ことから、枯草菌由来のpNZ8048が、恐らくコピー数を減少させてL.ラクティス形質転換体に存在することが示唆された。pNZ8048プラスミドのコピー数の減少は、B. subtilisとL. lactisで活性な制限修飾(R/M)システムの違いに起因している可能性がある。B. subtilisは、5′CTCGAG 3′配列を認識し、BsuM R/Mシステムでメチル化できる。このシステムは、2つのシトシンDNAメチル化酵素のBsuMMオペロン(ydiO-ydiP)と、制限核酸分解酵素と機能未知の関連タンパク質2つのBsuMRオペロン(ydiR-ydiS-ydjA)からなる (Guha, 1988; Maehara et al., 2011;松岡ら, 2011; Matsuoka et al., 2005)。特に、pNZ8048プラスミドはBsuM R/Mシステムの認識配列を含んでおり、枯草菌の宿主で改変されている可能性が高い。我々は、枯草菌からL. lactisへの細胞間プラスミド移行時に、移行したpNZ8048コピーのほとんどがメチル化され、その後L. lactis R/Mにより外来DNAとして認識される可能性が示唆された (O'sullivan et al., 2000; Schouler et al., 1998)。さらに、自然形質転換で入ってくるDNAと宿主のDNAのメチル化パターンの違いは、形質転換効率に大きく影響する(Beauchamp et al.、2017)。我々の予備実験では、枯草菌から分離したpNZ8048は、BsuMの異性体であるXhoIでの消化に鈍感であることが判明した(図S3)。これは、B. subtilisにおいてpNZ8048が5′CTCGAG 3′配列をメチル化し、XhoI活性からプラスミドDNAを保護していることを示唆している。逆に、L. lactis宿主から単離したpNZ8048はXhoIで切断することが可能であった。さらに、異なる宿主から分離した pNZ8048 を L. lactis MG1363 に形質転換したところ、B. subtilis 宿主から分離した pNZ8048 と比較して 10 倍の形質転換効率の低下が見られた。しかし、この現象を完全に理解するためには、今後の研究が必要である。L. lactis形質転換体におけるpNZ8048のコピー数を計数することにより、B. subtilisドナー株のメチル化がDNAの種間移動に与える影響をより明らかにできると考えられる。
次に、枯草菌が隣接する枯草菌細胞にプラスミドを転移させるだけでなく、L. lactis株間でも種内細胞間プラスミド転移が起こることを実証した。さらに、L. lactis MG1363のcluA変異体を用いて、コンジュゲーションに依存しない転移を示し、工業的に重要なプラスミドpNZ521の送達に応用できることを明らかにした(図5)。
研究対象菌の平均形質転換効率の違いから、枯草菌と枯草菌、L. lactisとL. lactisの種内交配では、細胞間を介したプラスミド導入が最も成功した(図S1B)。しかし、枯草菌をドナー株またはレシピエント株とする種内交配では、効率が平均で1000倍も低下した。同じ非共役プラスミドを種内および種間で導入する場合の違いは、枯草菌、L. Lactis、S. thermophilusの細胞表面やコロニー形成の特性が異なるため、結果として安定な細胞間結合の形成に影響を与えるのではないかと推測される(Figure S1C)。特に、最も効率的な移動は、強力なバイオフィルム生産能力で知られる枯草菌で観察された(Arnaouteliら、2021)。L. lactisもバイオフィルムを形成することができるが (Habimana et al., 2009; Oxaran et al., 2012) 、B. subtilisで見られるものよりも量が少なく、これはマクロコロニーの形態に反映されている (Figure S1C) 。バイオフィルムは細菌の HGT に大きく寄与することから (Maeda et al., 2006; Molin & Tolker-Nielsen, 2003)、枯草菌が豊富なバイオフィルムを形成する能力は、細胞間移動を促進する重要な機能であることが示唆される。興味深いことに、枯草菌のナノチューブを介した細胞間接続の形成と分子間移動には、フラジェリンの発現とバイオフィルムの形成に影響を与えるホスホジエステラーゼであるYmdB(Dubeyら、2016;Stemplerら、2017)の活性が必要です(Diethmaierら、2014, 2011)。
また、S. thermophilusとの混合培養の中で、枯草菌は自然の能力を用いずにプラスミドDNAを獲得できることを示した。これらの有望な結果は、B. subtilisとL. lactisドナー株からS. thermophilusへのDNA導入に焦点を当てて、さらに検討する予定である。
結論として、我々は、同居細菌が実験室内で古典的な共役機構とは異なる物理的接触を確立し、自然形質転換を伴わずにHGTを行うことを示した。このように、LABの非共役プラスミド転移は、自然界における菌株改良のための有望なプラットフォームであり、他の産業関連細菌においても探索されるべきものである。
著者
Luiza P. Morawska: 概念化(同)、データキュレーション(同)、形式分析(同)、調査(同)、方法論(同)、可視化(同)、執筆-原案(同)、執筆-レビューおよび編集(同)。Oscar P. Kuipers: 概念化(同等)、資金獲得(リード)、調査(サポート)、方法論(サポート)、リソース(リード)、監督(リード)、検証(リード)、執筆 - 原案(サポート)、執筆 - 査読および編集(サポート)。
謝辞
L. lactis cluAを欠損させたpGh9感温性Ery100-rプラスミドを持つ大腸菌TG1 repA VES6759株を提供していただいたSaulius Kulakauskas博士(INRA)、プロテアーゼアッセイを手伝っていただいたJelmer Coenradij(RUG)にも謝意を表したい。
資金情報
著者らはBE-Basic Foundationからの資金提供に謝意を表する。TKIBE01001に感謝する。
利益相反
すべての著者は利益相反がないことを宣言している。
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