感染性造血壊死ウイルスに感染したニジマス（Oncorhynchus mykiss）の培養水温の違いによる腸内内容物の変化に関するメタゲノムおよびメタボローム解析

2023年10月17日 10:46

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オリジナル研究論文
Front. 微生物学、2023年10月16日
第2章脊椎動物の消化器系における微生物
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1275649
感染性造血壊死ウイルスに感染したニジマス（Oncorhynchus mykiss）の培養水温の違いによる腸内内容物の変化に関するメタゲノムおよびメタボローム解析

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1275649/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit

Qiang Hai Jianfu Wang* Weiguo Kang Shuru Cheng Jie Li Nana Lyu Yajun Li Zhiyuan Luo Zhe Liu
甘粛農業大学畜産科学技術学院、蘭州、中国
伝染性造血壊死症（IHN）はニジマスの養殖を制限する主要な病気である。実用的な生産においては、養殖水の温度がその死亡率に影響を与える重要な要因であることが判明している。現在のところ、温度がIHNVに対するニジマスの腸内細菌叢と代謝産物の免疫応答にどのような影響を与えるかについてはほとんど知られていない。本研究では、12～13℃（C：生理食塩水を注射、A：IHNVを注射）および16～17℃（D：生理食塩水を注射、B：IHNVを注射）でIHNV（5×105 pfu/匹）に14日間感染させた後のニジマス（遺伝的背景が一致した幼魚）の腸内微生物の変化をメタゲノム解析およびメタボローム解析を用いて解析し、IHNVに有効なプロバイオティクスをスクリーニングすることを主な目的とした。その結果、12～13℃でIHNVに感染した場合、真核生物の損失が認められた。グループCと比較して、グループAではエルシニア科などの有害病原体が有意に増加し、4,087の腸内代謝物が有意に変化した。D群と比較すると、B群は連鎖球菌科とラクトコッカス・ラクティスの存在量が有意に増加し、4,259の腸内代謝物が有意に変化した。免疫関連代謝産物である1-オクタデカノイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンとL-グルタミン酸の濃度は、A群とB群で有意に上昇した。B群と比較して、A群ではアエロモナス、シュードモナス、エルシニア科などの病原性細菌が有意に増加し、B群では連鎖球菌科と乳酸球菌が有意に増加した。さらに、2つのグループ間で4,018個の代謝物が有意に異なっていた。興味深いことに、1-Octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineとL-GlutamateはB群よりもA群で有意に高かった。 C対Aで異なる代謝物のいくつかはFomitopsis pinicolaと相関し、D対BではLactococcus raffinolactisと、A対BではHypsizygus marmoreusと相関した。本研究は、ニジマスの腸内細菌叢と代謝産物が異なる温度でIHNVにどのように反応するかを明らかにし、IHNに対する潜在的な耐性を持つ有益な細菌をスクリーニングすることで、IHNの予防と治療に新たな知見と科学的根拠を提供するものである。

はじめに
ニジマス（Oncorhynchus mykiss）は経済的価値の高い冷水魚であり、世界中で広く養殖されている。しかし、伝染性造血壊死症（IHN）の大量発生によりニジマスが大量に死亡し、ニジマス養殖業の健全な発展が著しく阻害されている。伝染性造血壊死症ウイルス（IHNV）は、ラブドウイルス科ノビルハブドウイルス属に属し、長さ約150～190 nm、直径約65～75 nmの弾丸のような粒子からなり、約11 kbの結節のないネガティブセンス一本鎖RNAゲノムを包んでいる（Morzunovら、1995；Dixonら、2016）。IHNVは伝染性造血壊死症（IHN）の原因菌であり、サケ資源に著しい死亡率をもたらす可能性がある（Abbadi et al.）この病気は、世界動物保健機関（OIE）により届出可能動物疾病に分類され、中国の農業農村開発省によりΠ類動物疾病に分類されている（Anderson et al.） IHNが発生すると、罹患魚は腹部膨満、眼球突出、皮膚黒化などの表現型特徴を示すほか、主要な造血器官が広範囲に壊死する（Yong et al.） IHNVは腸内でも大量に複製し、ニジマスの腸壁細胞の壊死を引き起こす。主な特徴的な病変は腸内の黄色い粘液で、粘液状の管状の糞が肛門から垂れ下がる（Huang et al., 2022）。ニジマスの若魚では死亡率が最大80～100％に達することもある（Louboutin et al., 2021; Ren et al.）米国で最初に報告されて以来、この病気はカナダ、ヨーロッパ、日本、中国で広く蔓延し、養殖業に深刻な経済的損失をもたらしている（Kimら、2023）。現在、IHN の予防と制御は主にワクチンの開発に基づいている。しかし、現在に至るまで、有効なIHN防除対策は見つかっていない。生産においては、温度がIHNの発病に影響する重要な因子であることが判明しており、培養水温が3℃～15℃の場合、IHNは多数の死亡を引き起こし、培養水温が15℃を超えると発病が停止する（Dixonら、2016；Wargoら、2017）。

腸は体にとって外部環境と最も密接な接点であり、消化器官であるだけでなく、体内最大の免疫器官でもある（Jin et al.）腸内の微生物は宿主の健康に影響を及ぼし、健康な腸を維持し、病原体の侵入に抵抗する上で重要な役割を果たしている（Den Besten et al.）ウイルス病原体が宿主に侵入すると、その腸内微生物やその代謝産物および代謝産物誘導体に変化を引き起こす可能性がある（Dong et al., 2019; Wu et al., 2021）。IHNVに14日間感染したニジマスの腸内では、バチルス菌などのいくつかの有益な細菌の存在量が有意に高いことが判明した（Huang et al., 2022）。さらに、コイの腸内容物や生息環境から分離されたいくつかの細菌は、コイヘルペスウイルス（KHV）の発生を効果的に抑制することができた（吉田ら、2013）。バチルス属の栄養補給は、ティラピア湖ウイルス（TiLV）に感染したティラピア（Oreochromis mossambicus）の死亡率を低下させ、様々な免疫器官におけるTiLVのレベルを低下させる（Waiyamitraら、2020）。湖水からのクロモバクテリウム・アクアティカムの抽出物は、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）の免疫力を向上させるだけでなく、その代謝産物に幅広い殺菌効果がある（Yiら、2019）。オオクチバス（Micropterus salmoides）の腸から分離されたSerratia marcescens MS01は、Micropterus salmoides rhabdovirus（MSRV）の増殖を有意に抑制した（Songら、2023）。これらの報告は、腸内のプロバイオティクスとその代謝産物の一部が抗ウイルス作用を持つことを示している。しかし、IHNV感染後の腸内微生物とその代謝の変化については、培養温度の異なるニジマスでは報告されていない。

ハイスループットシーケンス技術の発展に伴い、マルチオミクスの複合解析戦略が広く用いられている。メタボロームには、一定期間継続する生命活動や、環境・生理・病理学的変化が生物に及ぼす影響が反映される（Liu et al.、2022）。したがって、代謝物レベルの変化を解析し、代謝物と病原体の侵入との関係を確立することは、疾患バイオマーカーの同定や疾患発症の解明に役立つ重要なことである（Olive and Sassetti, 2016）。メタゲノムでは、大規模な微生物群集の直接配列決定が可能であり、腸内微生物の遺伝子組成やその群集の機能が明らかになる（Jiang et al.）従来の微生物培養やその他の手法とは対照的に、メタゲノムには、より正確な種の分類、より高い感度、本来の種の割合の保存、検出できる種の範囲の広さ、培養不可能な微生物の回避といった利点がある（Shi et al.）ウイルスは腸内微生物のバランスを崩し、宿主の栄養素の吸収と代謝に影響を与える可能性がある。したがって、宿主と病原体の相互作用を理解することは、IHNの制御にとって重要である。

本研究では、メタゲノム解析とメタボローム解析を用いて、12～13℃と16～17℃の温度でIHNVに感染したニジマスの腸内微生物と代謝物の変化を解析した。様々な培養温度でIHNVに感染したニジマスの腸内微生物と代謝物の進化パターンを理解し、IHNの予防・治療効果を持つ可能性のある細菌叢を同定する。本研究の結果は、異なる培養温度におけるIHNVに対するニジマス腸内微生物と代謝産物の免疫応答メカニズムの解明、およびIHNに対する予防効果を有する可能性のあるニジマス腸内プロバイオティクスの探索に役立ち、IHNの予防と治療に対する理論的裏付けと新たな方法を提供することができる。

材料と方法
2.1. 倫理規定
ニジマスを用いた実験は、中国の実験動物の使用と飼育に関する法律に従って実施された。動物を用いたすべての実験手順は甘粛農業大学の動物飼育委員会の承認を得た。

2.2. 魚類と実験計画
我々は、中国甘粛省のニジマス養殖場から、傷害歴や感染歴のない平均体重238.34±20.38 gの健康なニジマス（遺伝的背景が一致している幼魚）40尾を入手した。これらのニジマスを無作為に4群（10尾/槽）に割り付けた。飼育は3000Lの水槽で行い、地下水を酸素添加し、紫外線殺菌した。水温は2群で12～13℃、他の2群で16～17℃であった。魚には市販のトラウト用飼料を体重の2％になるよう計算した給餌率で毎日与えた。残留飼料と糞は給餌の2時間後に清掃し、水換えは1日2回、毎回1/3の水を交換した。各群は設定温度に1週間馴化させた。

馴化期間終了後、対照群には500μLの生理食塩水を腹腔内に注射し、治療群には500μLのウイルス混合液（ウイルス含量： 5×105プラーク形成単位（pfu）/匹；感染性造血壊死症ウイルス（IHNV）株は、実験グループが罹病ニジマスから分離・保存したもの）。12-13℃および16-17℃の攻撃群をA群およびB群、12-13℃および16-17℃の対照群をC群およびD群として記録し、その後さらに14日間、馴化期間と同じ管理方法で飼育した。実験手順の概略を図1に示す。

図1
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図1. 一般的な作業の流れと本研究の概要。

給餌期間終了後、MS-222（Sigma Aldrich Co., St. 内容物を絞り出し、2mLの凍結乾燥チューブに入れ、チューブ内をPBSで洗浄し、洗浄液と腸内容物を十分に混合した。凍結したチューブは液体窒素で研究室に持ち帰り、-80℃の冷蔵庫に保存し、配列決定のためにドライアイスでBiomarker Technologies社に送った。

2.3. メタゲノム配列決定とバイオインフォマティクス解析
腸内容物から合計12サンプル（3サンプル/グループ）を選び、微生物DNAを抽出した。微生物DNAは、Bacterial DNA Extraction Kit（Omega, Shanghai, China）を用いて腸内から抽出した。DNA濃度はNanodrop 1000（Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, United States）を用いて測定し、DNAの完全性は1％アガロースゲルで評価した。微生物DNAライブラリーは、TruSeq DNAサンプル調製キット（Illumina, San Diego, CA, United States）を用いて構築し、Biomarker Technologies社（中国、北京）のIllumina Hiseq X Tenプラットフォーム（Illumina, San Diego, CA, United States）でペアエンドケミストリー（PE150）により配列決定した。シークエンシングから得られた未加工リードは、品質管理およびフィルタリングを行い、Bowtie2を用いてホストゲノムと比較し、ホストのコンタミネーションを除去してクリーンリードを得、マクロゲノムアセンブリのためにMEGAHITを用いてアセンブルし、QUASTを用いて評価した。遺伝子予測にはMetaGeneMark(Version3.26)を用いた。MMseqs2を用いて非冗長遺伝子セットを構築した。予測された配列をGenBankのNonredundant database (NR) とBLASTで比較し、E-value≤1e-5の配列を意味のある配列とみなし、種のアノテーション情報を得た。最後に、予測された遺伝子をGO, KEGG, eggNOG, Pfam, SwissProt, CAZy, VFDB, CYPEDなどのデータベースと比較し、遺伝子機能アノテーションを得た。

2.4. メタボローム解析とバイオインフォマティクス解析
メタボロームシークエンサーのために腸管内容物から合計 24 サンプル（6 サンプル/グループ、3 サンプルはメタゲノムシークエンサーのサンプルと同じ）を選択した。サンプル50 mgを秤量し、内部標準物質を含む抽出液1,000 μL（メタノール：アセトニトリル容量比＝1：1、内部標準物質濃度： 20mg/L）、スチールビーズを加え、45Hzで10分間粉砕し、10分間超音波処理（氷水浴）し、-20℃で1時間放置した後、4℃、12,000rpmで15分間遠心分離し、上清500μLをEPチューブで注意深く除去した；抽出液を真空濃縮機で乾燥させ、160μLの抽出液（アセトニトリルと水の容量比：乾燥した代謝物に160μLの抽出液（アセトニトリルと水の容量比：1：1）を加え、30秒間ボルテックスした後、氷水浴中で10分間超音波処理し、サンプルを4℃で15分間、12,000rpmで遠心分離した。上清[120μLを2mLインジェクションバイアルに注意深く入れ、各サンプル10μLを機械で試験するための品質管理（QC）サンプルに混合した]。LC-MS/MSは、UPLC HSS T3カラム（1.8μm、2.1×100mm、Waters）をWaters Xevo G2-XS QTofに結合したUHPLCシステム（Waters Acquity I-Class PLUS）を用いて行った。移動相は0.1％ギ酸水溶液（A）と0.1％ギ酸アセトニトリル（B）。注入量は1μL。一次および二次質量分析データは、取得ソフトウェア（MassLynx V4.2、Waters）のMSeモードを使用して、Waters Xevo G2-XS QTof高分解能質量分析計で取得した。収集された生データは、Progenesis QI ソフトウェアによってピーク抽出、ピークアライメント、およびその他のデータ処理操作が行われ、Progenesis QI ソフトウェアのオンライン METLIN データベースと BioMarker 独自のライブラリに基づいて同定された。親イオン質量数の偏差100ppm以内、フラグメントイオン質量数の偏差50ppm以内の理論フラグメントを同時に同定。主成分分析（PCA）、部分最小二乗判別分析（PLS-DA）、および直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を適用し、Rパッケージモデルを使用してグループ間の有意な代謝物を分析した。モデルの投影における変数重要度（VIP）値は、多重クロスバリデーションを用いて算出した。OPLS-DAモデルの差分倍数、p値、VIP値を組み合わせて、差分代謝物をスクリーニングした。スクリーニング基準は以下のとおりである： FC＞1、p値＜0.05、VIP＞1。さらに、Human Metabolome Database (HMDB)やKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)などのウェブベースのデータベースを用いて、差分代謝物および関連パスウェイを検証および解析した。

2.5. 統計解析
すべてのデータは平均値と標準偏差（平均値±SD）で示され、独立標本t検定を用いて解析された。p値＜0.05は統計的に有意とみなされた。統計解析はSPSS 24.0（IBM Corp, Armonk, NY, United States）を用いて行った。

結果
3.1. マクロゲノーム
3.1.1. マクロゲノムのシーケンス情報
12個のニジマス中腸内容物サンプルをイルミナHiseqシーケンスし、品質管理、宿主コンタミネーションの除去、データアセンブリを行った結果、合計2,307,835 Contigs、平均192,319.6/サンプルが得られた。N50は平均478。すべてのサンプルで希少化曲線が平坦化し、配列決定深度がこれらのコロニーサンプルに存在する多様な生物種と機能を捕捉するのに十分であったことを示している（補足図S1）。

3.1.2. 腸内微生物のグループ分けの違い
ACEとChao1は種の豊かさ指数であり、ShannonとSimpsonは種の豊かさと均等性指数である。本研究では、Chao1、ACE、Simpson、Shannonの各指数を用いて、異なる処理条件下における腸内微生物のα多様性を測定した。A群、B群、C群、D群間のChao1、ACE、Simpson、Shannonの差は有意ではなかった（p＞0.05）が、D群のChao1とACEはB群よりも高く、有意な傾向があった（0.05＜p＜0.1）（図2A～D）。Bray-Curtis距離を用いたPrincipal Coordinates Analysis（PCoA）により、微生物群集のβ多様性を算出し、可視化した。その結果、ニジマスの腸内微生物群集は処理群間で異なっていた（図3）。

図2
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図2. 各群における腸内微生物のα多様性。(A）Chao1指数。(B）ACE指数。(C）シンプソン指数。(D）シャノン指数。

図3
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図3. β多様性：Bray-Curtis距離に基づく細菌群集構造の主座標分析（PCoA）。

サンプル中に検出された未同定のものを除くと、ニジマスの腸内細菌叢は細菌、真菌、ウイルス、古細菌、後生動物、真核生物で構成されていたが、真核生物はA群には認められなかった（補足図S2）。門レベルでは、12サンプルで合計74門がアノテーションされ、Aグループで58門、Bグループで49門、Cグループで48門、Dグループで51門がアノテーションされた（補足図S3A）。合計51のコアフィラが4つのグループすべてに共通するものとして同定された（補足図S3A）。ニジマスの腸内細菌叢で優勢な門は、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、ファーミキューテス（Firmicutes）、粘菌門（Mucoromycota）、担子菌門（Basidiomycota）である（図4A）。C群とA群、C群とD群の間には、門レベルで有意な差は見られなかった（補足表S1、S4）。D群とB群の有意差は放線菌（D：0.083188％、B：0.065120％）であった（p＜0.05）（補足表S2）。A群とB群で有意差が認められたのは、Candidatus Parcubacteria（A: 0.000243%, B: 0.0%）、Firmicutes（A: 1.078702%, B: 3.371615%）、Fusobacteria（A: 0.000132%, B: 0.001808%）であった（補足表S4）。

図4
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図4 （A）門レベルの相対的存在量から見た腸内細菌叢トップ10。(B) 門レベルの相対的存在量における腸内細菌叢トップ10。

属レベルでは、A群752属、B群539属、C群561属、D群613属の合計1,005属が12検体でアノテーションされた（補足図S3B）。4つのグループに共通するコア属は343属であった（補足図S3B）。A群ではPseudomona属、Rhizophagus属、Acinetobacter属が優勢であった（図4B）。B群ではPseudomonas属、Lactococcus属、Acinetobacter属が優勢であった（図4B）。C群ではPseudomonas属、Acinetobacter属、Rhizophagus属が優勢であった（図4B）。D群ではHafnia属、Pseudomonas属、Acinetobacter属が優勢であった（図4B）。IHNVに感染するとニジマスの腸内細菌叢に変化が起こり、養殖温度の違いによってIHNVに感染する属に違いが見られる。C群とA群では23属に有意差があり、D群とB群では24属に有意差があり、A群とB群では29属に有意差があり、C群とD群では33属に有意差があった。

4群のニジマスの腸内内容物の微生物群集のさらなる違いを評価し、特定のバイオマーカーをスクリーニングするために、線形判別分析Effect Size（LEfSe）（LDA＞4）を用いた。その結果、C群とA群では優占微生物叢が異なることが示された。C群の優占菌叢はシュードモナデス属であったが、A群ではエルシニア科とエンテロバクター属であった（図5A）。D群に比べ、B群では乳酸桿菌、乳酸球菌、連鎖球菌、ファーミキューテス、乳酸球菌が優勢であった。一方、D群では、Hafniaceae、Hafnia、Enterobacterales、 Proteobacteria、Gammaproteobacteria、Hafnia alvei、Hafnia paralveiが優占した（図5B）。A群とB群では優占微生物群集が異なり、A群の優占群は腸内細菌科、アエロモナス・カベルニコラ、シュードモナス・スタッツェリ、アエロモナス、エルシニア科、シュードモナス、腸内細菌科であり、B群の優占群は乳酸球菌、乳酸球菌、連鎖球菌、乳酸桿菌、ファーミキューテス、真菌、モラクセラ科であった（図5C）。グループDと比較すると、グループCの優占菌叢は放線菌であり、グループDの優占菌叢はHafniaceae、Enterobacterales、Hafnia、Hafnia alvei、Hafnia paralveiであった（図5D）。

図5
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図5 （A）C群とA群を比較した線形弁別分析（LDA）の効果量（LEfSe）分析。(B）D群とB群を比較した線形弁別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析。(C）A群とB群を比較した線形弁別分析（LDA）の効果量（LEfSe）分析。(D）C群とD群を比較した線形弁別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析。

3.1.3. 腸内微生物の機能解析
遺伝子レベルでは、合計 58,827 個の非冗長遺伝子セットが検出され、5,943 個の KO にアノテーションされた。総長28,525,935 bp、平均長484.00 bp。最大長は13,434 bp、最小長は102 bpである（表1）。

表1
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表1. Non-redundant Genesetセットの結果統計。

腸内細菌叢の機能はKEGGマップによって決定された。KEGG解析では、合計22のパスウェイが第2レベルでアノテーションされた。注釈付けされた遺伝子数が最も濃縮された上位4パスウェイは、グループAではGlobal and overview maps, Carbohydrate metabolism, Energy metabolism and Amino acid metabolism、グループBとCではGlobal and overview maps, Carbohydrate metabolism, Amino acid metabolism and Translation、グループDではGlobal and overview maps, Carbohydrate metabolism, Amino acid metabolism and Membrane transportであった（図6）。第3レベルでは、157のパスウェイが観察された。グループ A と B で最もアノテーション遺伝子数が濃縮されたパスウェイのトップ 3 は、代謝パスウェイ、二次代謝産物の生合成、抗生物質の生合成、グループ C は代謝パスウェイ、二次代謝産物の生合成、酸化的リン酸化、グループ D は代謝パスウェイ、二次代謝産物の生合成、多様な環境における微生物代謝であった（図 7）。C群とA群の差分経路は、光合成生物における炭素固定（C: 0.009683%、A: 0.005666%）、脂肪酸伸長（C: 0.000886%、A: 0.000355%）、光合成（C: 0.012486%、A: 0.006821%）、スフィンゴ糖脂質生合成-ガングリオ系列（C: 0. D: 0.000277%, B: 0.000647%）、AとBのグループ間の異なる経路はユビキチンを介したタンパク質分解（A: 0.007503%, B: 0.005117%）、CとDのグループ間の異なる経路は光合成（C: 0.012486%, D: 0.007512%）であった。

図6
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図6. KEGGパスウェイレベル2における微生物の様々なグループに関する機能メモ。

図7
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図7. KEGGパスウェイレベル3における様々な微生物群の機能メモ。

3.2. 代謝
3.2.1. 異なる処理下における腸内容物の代謝物の違い
処理の違いによる代謝物の変化をより理解するため、LC-QTOFプラットフォームに基づき、24検体のメタボロームを定性・定量分析し、ポジティブモードとネガティブモードで合計5,847代謝物（ポジティブモード2,743代謝物、ネガティブモード3,104代謝物）を検出した。PCAによるクラスタリングの結果、グループ間で顕著な分離が見られ、異なる処理後にサンプル中の代謝物が大きく変化していることが示されました（図8）。

図 8
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図 8. 腸内代謝物の主座標分析（PCoA）。

VIP（VIP＞1）、t検定（p＜0.05）、FC（FC＞1または＜0.5）により腸内代謝物の相対濃度をスクリーニングした。 B群では4,259（発現上昇：2,174、発現低下：2,085）、A群では4,018（発現上昇：2,026、発現低下：1,992）、C群では4,290（発現上昇：2,251、発現低下：2,039）であった（図9D）。異なる培養温度でのIHNV感染後の生物免疫に関連する代謝物をさらに探索するため、免疫、細胞増殖、死などに関連する代謝物を選択し（表2）、宿主における重要な機能を探索した。

図9
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図9 (A) C対Aの差分代謝物ボルケーノプロット。(B) C 対 A 微分代謝物ボルケーノプロット。(C）C対A代謝物差分ボルケーノプロット。(D）C対A代謝物差分ボルケーノプロット。

表2
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表2. 異なる処理におけるニジマスの腸内容物の差分代謝物。

3.2.2. 異なる処理下におけるニジマスの主な活性化経路の差異
異なる養殖温度におけるIHNVによるニジマスの潜在的な代謝経路の活性化をさらに調べるため、KEGGマップを用いてこれらの重要な代謝物と代謝経路を関連付けた。C群とA群の差分代謝産物は、セロトニン作動性シナプス、アラキドン酸代謝、血小板活性化、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達、オキシトシンシグナル伝達経路、FcεRIシグナル伝達経路、喘息、フェロプトーシス、神経活性リガンド-受容体相互作用、胆汁分泌経路に濃縮された（図10A）。D対Bの差次代謝産物は、アポトーシス、ネクロプトーシス、血小板活性化、スフィンゴ脂質シグナル伝達経路、フェロプトーシス、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達、オキシトシンシグナル伝達経路、スフィンゴ脂質代謝、セロトニン作動性シナプス、アラキドン酸代謝において主に濃縮された（図10B）。A対Bの異なる代謝物は、FcεRIシグナル伝達経路、喘息、フェロプトーシス、神経活性リガンド-受容体相互作用、セロトニン作動性シナプス、アラキドン酸代謝および胆汁分泌に濃縮された（図10C）。CとDの主な代謝産物は、アポトーシス、ネクロプトーシス、血小板活性化、スフィンゴ脂質シグナル伝達経路、フェロプトーシス、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達、オキシトシンシグナル伝達経路、セロトニン作動性シナプスとアラキドン酸代謝、オキシトシンシグナル伝達経路、スフィンゴ脂質代謝、セロトニン作動性シナプスとアラキドン酸代謝に富んでいる（図10D）。

図10
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図10. (A)C対Aの差分代謝物の代謝経路濃縮分析。(B）DとBの差分代謝物の代謝経路濃縮解析。(C）A対Bの差分代謝物の代謝パスウェイ濃縮解析。(D)CとDの差分代謝物の代謝パスウェイ濃縮解析。

3.3. 微生物と代謝物の相関解析
重要な差分代謝物と微生物との関係を理解するために、ピアソン相関分析を行った。C群とA群では、懸念される代謝物が26の微生物と相関していることがわかりました（図11A）。黄色ブドウ球菌は、上昇代謝産物であるロイコトリエンC4およびグルタチオンと正の相関を示し、下降代謝産物である3′,5′-サイクリックAMPおよびアンジオテンシン(1-7)と有意な負の相関を示した。Vibrio vulnificusは、上昇代謝物1-Octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineと負の相関を示し、下降代謝物3′,5′-Cyclic AMPと正の相関を示した。Yersinia kristenseniiは、アップレギュレートされた代謝物1-Octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineと負の相関を示し、ダウンレギュレートされた代謝物3′,5′-Cyclic AMP、Fibrin、Angiotensin (1-7)と有意に正の相関を示した。Fomitopsis pinicolaは、代謝物であるグルタチオン、L-グルタミン酸、ロイコトリエンC4、ロイコトリエンD4のアップレギュレーション、および代謝物であるアンジオテンシン（1-7）、プロスタグランジンH2のダウンレギュレーションと負の相関を示した。D群対B群では、懸念される差次代謝物が24の微生物と関連していることが判明した（図11B）。Streptococcus parauberisは、代謝物スフィンゴシン1-リン酸、3′,5′-サイクリックAMP、cGMP、ロイコトリエンD4、ADPおよびグルタチオンのダウンレギュレーションと負の相関を示し、代謝物プロスタグランジンH2、フィブリンおよび1-オクタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンのアップレギュレーションと正の相関を示した。ラクトコッカス・ラフィノラクティスは、ロイコトリエンD4、ADPおよびグルタチオンの代謝低下と負の相関を示し、1-オクタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンおよびプロスタグランジンH2の代謝上昇と正の相関を示した。A群とB群では、注目される代謝物は25の微生物と相関していた（図11C）。Streptococcus parauberisは、ダウンレギュレートされた代謝物Leukotriene C4、Sphingosine 1-phosphate、Angiotensin II、L-GlutamateおよびGlutathioneと負の相関を示し、アップレギュレートされた代謝物γ-L-Glutamyl-L-cysteineおよびProstaglandin H2と正の相関を示した。Hypsizygus marmoreusは、代謝低下物質であるL-グルタミン酸および1-オクタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンと正の相関を示し、代謝上昇物質である3′,5′-サイクリックAMPおよびγ-L-グルタミル-L-システインと負の相関を示した。C対Dでは、懸念される代謝物が30種類の微生物と相関していた（図11D）。黄色ブドウ球菌は、アップレギュレートされた代謝物グルタチオンと負の相関があり、ダウンレギュレートされた代謝物スフィンゴシン1-リン酸、スフィンゴシンおよび1-オクタデカノイル-2-(15S-ヒドロキシ-5Z,8Z,11Z,13E-エイコサテトラエノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンレチノエートと正の相関がありました。

図11
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図11. (A)C対Aの差分代謝物の種存在量との相関分析。(B）D対Bの差分代謝物の種存在量との相関分析。(C）A対Bの差分代謝物と種の存在量との相関分析。(D）C対Dの差分代謝物と種の存在量との相関分析。

考察
宿主の「外臓器」として知られる腸内微生物は、栄養代謝および免疫調節において相互作用し、重要な役割を果たしている（O'Hara and Shanahan, 2006; Valdes et al.）腸内細菌叢は主に細菌、真菌、ウイルス、古細菌、後生動物、真核生物から構成されている。定常状態では、宿主と微生物は互いに影響し合い、相互依存的な共生の動的バランスを確立している。宿主の免疫系が腸内微生物を監視することで、腸内細菌叢の安定性が維持され、腸粘膜の健康が促進され、病原体に対する宿主の抵抗力が強化される（Iacob et al.）しかし、さまざまな要因（食物の変化、抗生物質の使用、病原性細菌の侵入など。 )は、細菌叢の構造を変化させ、細菌叢の組成バランスを崩し、細菌叢の代謝ネットワークを変化させ、生態学的不均衡を引き起こし、腸の炎症を抑制する免疫調節ネットワークに影響を与えるため、細菌叢の侵入を制限する宿主の能力が低下し、病原性細菌が組織に侵入して病気を引き起こし、最終的に炎症性腸疾患やその他の病気につながる可能性がある（Ding et al、 2017). 魚類は恒温動物であり、温度は魚類の腸内微生物群集に大きく影響する。ニジマスのIHNVに対する感受性は温度に大きく影響され、魚の耐性に大きな差が生じる。水温が15℃以下の春と秋はニジマスIHNのピークシーズンであるが、15℃を超えるとニジマスIHNの発生率は著しく低下する。以上の分析と知見から、我々はニジマスの腸内細菌叢の組成とその代謝産物、および高温条件下でのIHNに対する抵抗性の増大には関係があるのではないかと仮説を立てた。そこで、12～13℃および16～17℃で培養したIHNV感染ニジマスの腸内微生物の組成とその代謝物の違いをメタゲノム解析およびメタボローム解析を用いて解析した。また、IHNに対する防御効果や治療効果が期待される腸内微生物とその代謝物をスクリーニングした。本研究では、ニジマスの腸内微生物は主に細菌性であり、これは他の魚種の腸内組成と同様であった（Li et al.、2015）。しかし、培養温度12～13℃でIHNVに感染した後の腸内微生物叢には、真核微生物は見られなかった。真核生物は他の微生物に比べて環境への適応性が低いことが指摘されており（Massana and Logares, 2013）、一方で腸内真核生物の多様性は宿主の健康と正の相関があることが示されている（Lozupone et al.）ニジマスを低温養殖下でIHNVに感染させると、腸管内の真核生物が減少した。さらに、低温養殖条件下でIHNVに感染すると、ニジマス腸内微生物のディスバイオシスが起こり、宿主の自然免疫力が低下することが示された。門レベルでは、プロテオバクテリア（Proteobacteria）とファーミキューテス（Firmicutes）がすべての実験群で優勢であり、これは先行研究の結果（Huang et al. 主要細菌である放線菌は、抗菌・防蟻活性を有する代謝産物を産生する（Valliappan et al., 2014; Landwehr et al.）放線菌の存在量の有意な減少は、IHNV感染後4日目と14日目に検出された（Huangら、2022年）。このことはさらに、ニジマスのIHNV感染が放線菌に変化をもたらす可能性を示している。ファーミキューテス属は乳酸を産生することができ、これは腸疾患に対する調節機能を有する（Ganesan et al., 2018）。一方、フソバクテリア属は宿主の炎症反応を刺激し、特定の病原菌の増殖を抑制することができる（Kelly et al.）最近の研究で、アジア産シーバス（Lates calcarifer）の高い抗酸化能と抗炎症能は、ファーミキューテス菌とフソバクテリアの存在量の有意な増加と相関していることが明らかになった（Siddik et al.）本研究の結果、高温攻撃群では低温攻撃群に比べ、ファーミキューテス類とフソバクテリア類が有意に多いことが示された。このことはさらに、これら2つの門が宿主の健康と密接に関係していること、そして高温攻撃群の腸内細菌叢は低温攻撃群に比べて宿主の健康に有益であることを示唆している。培養温度の違いによってニジマスの腸内細菌叢のゲートレベルに有意差が生じることは一般的になく（Huyben et al.

処理間の腸内細菌叢の違いと宿主の健康への影響をさらに理解するために。LEfSE分析を用いて、群間で存在量が有意に異なる種を見つけ、その結果を考察した。エルシニア科の中のエルシニアは、ヒトや動物に敗血症を引き起こすことがある（Huang et al.、2023）。本研究の結果、12～13℃でIHNVに感染した後、Yersiniaceaeが有意に増加した。我々は、低温で培養したニジマスにIHNVを感染させると、条件付き病原性細菌が増加し、IHNの病態をさらに悪化させるという仮説を立てた。ラクトコッカス・ラクティスはプロバイオティクスとして、ニジマスの自然免疫系を強化し、宿主を病原体から保護する（Santibañez et al.、2021）。レンサ球菌科の病原性細菌の中には、宿主に様々な敗血症性疾患を引き起こすものがある（Neila-Ibáñezら、2023）。16～17℃でIHNVに感染すると、Lactococcus lactisとStreptococcaceaeが有意に増加した。このことは、16-17℃でのIHNV感染後の腸内病原性細菌の増加は、一部の有益な細菌の有意な増加を伴っており、IHNに対する抵抗性に寄与している可能性を示している。B群と比較すると、A群ではAeromonas cavernicola、Pseudomonas stutzeri、Aeromonas、Yersiniaceae、Pseudomonasなどの有害菌が優勢であった。一方、B群ではStreptococcaceae、Lactococcus lactisが有意に増加していた。このことから、IHNV感染によって腸内フローラ中の有害菌叢はいずれも増加するが、低温でIHNVに感染した有害菌叢の種類と存在量はより高温であることが示された。

微生物群集の機能解析を直接行えることは、メタゲノム技術の最も重要な応用のひとつである。微生物の光合成と炭素固定は、CO2とH2Oを利用して細胞形成のための有機物を合成し、同時にO2を放出するという点で、植物の光合成に似ている（Robert Tabita, 2004）。腸内の微生物の光合成は主に微細藻類と光合成細菌に由来し、微細藻類は宿主の免疫力を高めることができる（Cerezuela et al.）エビの飼料に光合成細菌を加えると、生存率が向上する（Saejungら、2021）。12～13℃でIHNVに感染したニジマスでは、光合成生物の炭素固定と腸内微生物の光合成機能が有意に低下した。我々は、IHNVの感染が腸内微細藻類や光合成細菌の存在量や機能に影響を及ぼし、ニジマス体内の酸素濃度を低下させるという仮説を立てた。また、ニジマスの発生は溶存酸素にも影響され、低温下でのニジマスのIHNV感染により腸内細菌の酸素放出能力が低下し、死亡率が上昇するという仮説を立てた。興味深いことに、低温養殖群では腸内微生物の光合成が高温養殖群よりも有意に高く、ニジマス養殖の至適温度では腸内微生物の光合成機能が低下していた。Symphysodon aequifasciatusのエネルギー代謝は低温ストレス下で増加し、生体内部環境の安定維持に利用されることが判明している（Wen et al., 2017）。我々は、ニジマスは低温培養下で宿主内部環境の安定性を維持するために、微生物の光合成によるエネルギー産生を増加させる必要があると仮説を立てた。一方、腸内微生物の脂肪酸伸長機能は、12～13℃でのIHNV感染後に有意に低下した。大腸炎を発症したマウスでは、脂肪酸伸長機能が有意に低下していることが判明した（Zhuら、2021）。このことは、低温培養中にIHNVに感染すると、ニジマスの腸内で炎症が起こる可能性を示唆している。O-グリカンは、宿主に対する有害細菌の影響を抑制することができる（Zhuら、2021；Takagiら、2022）。他のタイプのO-グリカン生合成の機能は、16-17℃でのIHNV感染後に有意に低下した。我々は、高温下でのIHNV感染後の腸内細菌叢の機能は、宿主の健康にとって好ましくない方向に向いていると仮定している。ユビキチンを介したタンパク質分解は、誤発現したタンパク質を分解することができる（Zhao et al.）低温でのIHNV感染はニジマスの正常な生物学的プロセスに大きな影響を与え、その結果、微生物のユビキチンを介したタンパク質分解の負担が増加するという仮説を立てた。異なるグループ間での微生物量と機能の違いは、IHNVへの感染がニジマスの腸内細菌叢のディスバイオシスにつながることを示唆している。全体として、IHNV感染後の腸内細菌叢には有害細菌が増加しており、これが宿主の健康にさらに影響を及ぼしている。低温で感染したIHNVの腸内有害細菌が高温より多いのは、高温の方が菌体が安定しており、IHNVが腸内や宿主のホメオスタシスに与える影響が少なく、宿主の免疫力が高いためと考えられる。したがって、腸内微生物のホメオスタシスを維持することは、IHNの予防や治療において非常に重要である。

腸内微生物の代謝産物は腸管上皮細胞を通じて体循環に入り、宿主の様々な臓器に影響を与えて病原体に反応し、宿主の免疫システムにおいて重要な役割を果たす（Alwin and Karst, 2021）。さまざまな治療法は、さまざまな腸内微生物に影響を与えるだけでなく、腸内の代謝産物や代謝経路も変化させる。例えば、セロトニン作動性シナプス経路の変化は、機能の脳に影響を与える（Xiao et al.）アラキドン酸の代謝は、魚類のストレス抵抗性や免疫などの機能と有意な相関がある（Xu et al.、2022）。セロトニン作動性シナプスとアラキドン酸代謝経路の両方が、体内の痛みの発生と密接に関連している（Hale and Lowry, 2011）。血小板の活性化は血栓症に関連するだけでなく、自然免疫や適応免疫、臓器障害にも影響し、活性化した血小板は可溶性因子を産生し、免疫細胞と直接相互作用して炎症表現型や自己免疫反応を促進する（Zhangら、2022；Scherlingerら、2023）。逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達は腸の機能を改善する（Zhangら、2020）。フェロプトーシスは、アミノ酸、脂質、糖の代謝だけでなく、炎症やがんなどの疾患の発症にも関連している（Sunら、2020；Jiangら、2021）。その結果、セロトニン作動性シナプス、アラキドン酸代謝、血小板活性化、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達、オキシトシンシグナル伝達経路、フェロプトーシス経路が低温および高温攻撃群で変化していた。我々は、IHNVが腸内微生物と身体の代謝を変化させ、ストレス、炎症、自己免疫、そして身体の神経系への潜在的な影響につながるという仮説を立てた。FcεRIシグナル伝達経路、神経活性リガンド-受容体相互作用、胆汁分泌は、C対Aでは変化したが、C対Dでは変化しなかった経路である。FcεRIシグナル伝達経路は、生体が病原性細菌に感染したときに重要な機能を果たす重要な免疫関連経路である（Chen et al.）神経活性リガンドと受容体の相互作用は、神経機能に直接関係している（Wei et al.）胆汁にはウイルスを中和し、ウイルス感染性を低下させる能力がある（Leeら、1975年）。C群とA群の比較では変化しなかったが、C群とD群の比較では変化した経路には、アポトーシスとスフィンゴ脂質シグナル伝達経路が含まれる。アポトーシスは自律的なプログラム細胞死メカニズムであり、細胞環境の安定性を維持するのに役立ち、老化細胞や壊死細胞を排除し、恒常性を維持することを可能にする。しかし、アポトーシス細胞数は、刺激によって誘発されたダメージに対して著しく増加する(Elmore, 2007)。炎症もまた、プログラムされた細胞壊死の引き金となりうる（Newton and Manning, 2016）。スフィンゴ脂質シグナル伝達経路は発癌と密接に関連している（Liら、2013）。スフィンゴ脂質は天然代謝産物の一種で、ヒトでも共生細菌でも合成することができ、スフィンゴ脂質様天然産物を通じて宿主の健康に影響を与えることができる（Hou et al.） A対Bの差次代謝産物は、免疫、抗ウイルス、その他の要因に関連する経路に富んでいる。C対Dの差次代謝産物は、主に生物の安定性と免疫に関連している。A群とB群はともにIHNVに感染し、宿主の自然免疫や宿主の恒常性に影響を与えただけでなく、腸管上皮細胞や腸内微生物はIHNVによるダメージに抵抗するために、いくつかの抗ウイルス産物を分泌した。しかし、これらの抗ウイルス産物の分泌量は培養温度の違いによって異なり、抗ウイルス活性に関連するこれらの代謝産物の違いは、温度の違いによるIHNVに感染したニジマスの死亡率の違いと密接に関連していると考えられた。C群とD群はIHNVに感染しておらず、温度の違いは主に宿主の自然免疫と恒常性に影響を与えた。我々の研究から、高温飼育と低温飼育では生体の安定性と免疫力が異なること、高温と低温でIHNVに感染すると腸内微生物の代謝が変化し、生体の代謝が変化することがわかったが、培養温度によって違いがあった。

腸管内の代謝産物の多くは微生物由来であり、宿主の健康維持に重要な役割を果たしている。CとA、DとB、AとB、およびCとDの比較では、さまざまな細菌に関連するいくつかの差次代謝産物が同定された。CとAの比較で選択された差次代謝産物に関連する有害な細菌には、黄色ブドウ球菌、ビブリオ・バルニフィカス、エルシニア・クリステンセニー、ストレプトコッカス・パラウベリスが含まれる。黄色ブドウ球菌は、炎症反応を引き起こし、宿主の正常な生理機能に影響を及ぼす危険性の高い病原体である（Knox et al.）ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）は広く分布する病原体群で、一次敗血症を引き起こす可能性がある（Lu et al. エルシニアは動物に分布し、マクロファージによる殺傷に抵抗する能力を持っているため、ヒトや動物において敗血症や限局性感染症を引き起こす可能性がある（Joutsen et al.） Streptococcus parauberisは広く分布しており、集団感染を引き起こす可能性がある（Kimら、2022年）。興味深いことに、C対Aの代謝物の一部は、抗腫瘍、抗酸化、免疫増強、抗炎症作用で知られるFomitopsis pinicolaとも相関している（Leeら、2008；Bishop、2020）。乳酸は宿主の免疫力を調節し、腸内のホメオスタシスを制御し、病原性細菌に対する抵抗性を制御する能力があることが研究で示されている（Hagi and Hoshino, 2009）。A対Bの代謝産物において、ヒフキサルノコシカケと相関が見られ、ヒフキサルノコシカケには抗酸化力があることが示された（Xu et al., 2020）。選択された重要な代謝産物はいくつかの有益な微生物と関連しており、これらの微生物とその代謝産物はIHNVに対する薬剤としての可能性がある。

結論
選択された重要な代謝産物は、いくつかの有益な微生物と関連しており、これらの微生物とその代謝産物は、IHNVに対する薬剤としての可能性がある。IHNは腸内微生物のディスバイオシスを引き起こし、いくつかの条件付き病原性細菌が有意に増加し、腸内微生物による光合成と炭素固定が有意に減少した。しかし、条件付き病原性細菌は、低温でのIHNV感染後に、高温でのIHNV感染後よりも増加した。さらに、腸内代謝産物もIHNV感染後に大きく変化し、いくつかの免疫関連代謝産物はIHNV感染温度によって異なっていた。最後に、IHNを予防・制御する可能性のあるプロバイオティクスFomitopsis pinicola、Lactococcus raffinolactis、Hypsizygus marmoreusをスクリーニングした。この結果は、異なる培養温度下におけるニジマス腸内微生物と代謝物のIHNVに対する免疫応答を明らかにし、IHNに対する潜在的な効果を持つ有益な細菌をスクリーニングしたものであり、IHNの予防と治療に対する新たなアイデアと科学的根拠を提供するものである。

データ利用声明
本研究で発表されたデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は論文/補足資料に記載されている。

倫理声明
動物実験は甘粛農業大学動物飼育委員会の承認を得た。本研究は、現地の法律および機関要件に従って実施された。

著者貢献
QHとJWが研究を計画し、最初の原稿を執筆した。QH、JW、WK、SC、JL、NL、YL、ZLu、ZLiがサンプルを準備し、バイオインフォマティクス解析を行った。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および／または発表のために金銭的支援を受けたことを表明する。本研究は、中国国家自然科学基金（助成番号32060257）および現代シルクロード寒冷乾燥農業科学技術支援プロジェクト（GSLK-2021-6およびGSLK-2022-11）の支援を受けた。

謝辞
本研究にご助言とご協力をいただいたすべての参加者に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1275649/full#supplementary-material。

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受理された： 10 August 2023; Accepted： 2023年10月02日；
発行：2023年10月16日

編集：ジョージ・グラント

ジョージ・グラント（アバディーン大学、英国
査読者

Yongyao Yu, 華中農業大学, 中国
Rossanna Rodriguez-Canul, メキシコ、メリダ研究センター
Copyright © 2023 Hai, Wang, Kang, Cheng, Li, Lyu, Li, Luo and Liu. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Jianfu Wang, wangjf@gsau.edu.cn

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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