ビタミンDはCOVID-19患者におけるI型IFNシグナル伝達を増強する
公開日：2022年10月22日
ビタミンDはCOVID-19患者におけるI型IFNシグナル伝達を増強する
Shirin Hafezi, Fatemeh Saheb Sharif-Askari, ...Rabih Halwani 著者を表示する。
Scientific Reports 12巻 記事番号: 17778 (2022) この記事を引用する
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指標詳細
概要
ビタミンD（VitD）が抗菌ペプチドを誘導することにより抗ウイルス応答を調節する能力はよく知られている。しかし、SARS-CoV-2に対するVitDの効果については十分に検討されていない。我々は，VitDが宿主のIFN-α/β（a/β）シグナルを増強する能力を，in vitroおよびVitDで治療した重症COVID-19患者の両方で報告した．集中治療室に入院中の重症COVID-19患者（43人），またはVitDを投与されなかった患者（37人）から血液と唾液の検体を採取した．患者は入院後29日まで追跡され、患者の生存成績が収集された。RIG-1/MDA-5およびJAK-STATシグナル伝達経路の活性レベルが高く、MX-1やISG-15などの抗ウイルス性インターフェロン刺激遺伝子（ISG）の遺伝子およびタンパク質レベルが有意に高いことが、in vitro、PBMCをvitDで処理した後、vitD処理患者の全血および唾液検体の両方で観察された。さらに、VitD治療患者は、未治療患者と比較して、29日目までに全死亡のリスクが低かった（調整ハザード比、0.37、95％信頼区間0.14-0.94、P = 0.038）。今回明らかになったIFNに対するVitDの調節的役割は、SARS-CoV-2感染の予防とおそらく治療のために、正常レベルのVitDを確保することの重要性を示唆するものである。しかし、特にCOVID-19感染におけるVitDの抗ウイルス効果を完全に解明するためには、さらなる機構的研究が必要である。
はじめに
自然免疫はSARS-CoV-2感染を制御するために重要であり、自然免疫の調節ができない患者は重症化しやすい1。I型インターフェロン（IFN-α、β）は、抗ウィルス自然免疫の重要な要素である。SARS-CoV-2感染の制御と解決には、IFN-α/βシグナルとその結果生じるインターフェロン刺激遺伝子（ISG）の効率的な誘導が不可欠であることが、いくつかの報告で示されている2.
SARS-CoV-2は、ヒト上皮細胞の細胞質において、一本鎖（ss）RNA細胞質感知タンパク質（RIG-1とMDA5）3,4によって認識されます。すると、下流のインターフェロン制御因子（IRF）3、あるいはIRF7が活性化され、重要な抗ウイルス活性を示すIFN α/βサイトカインが速やかに産生され、ウイルスの増殖や拡散が制限されることになるのです5。IFN α/βサイトカインは、IFNAR1およびIFNAR2サブユニットからなる二量体受容体に結合し、IFN-stimulated gene factor 3（ISGF3）という転写複合体を形成する。ISGF3は、リン酸化されたSignal Transducer and Activator of Transcription STAT(1), STAT2, IRF9からなり、核内に移行してインターフェロン刺激応答要素（ISRE）に結合し、抗ウイルス性ISGsの転写を活性化する6, 7, 8. このように、ウイルス感染細胞においてIFN-α/βシグナルとISGsが効率的に誘導されることは、宿主の抗ウイルス反応にとって基本的なことである。そのため、IFN-α/βサイトカインの産生に遺伝的な欠陥がある、あるいはこれらのサイトカインを中和する自己抗体を有するCOVID-19患者は、臨床転帰が悪化する可能性があると報告されています1,9,10。
現在までのところ、COVID-19疾患の管理用に承認された有効な抗ウイルス剤は知られていません。いくつかの報告では、入院中のCOVID-19患者の異なる環境におけるSARS-CoV-2感染に対して、インターフェロンベースの治療（IFNβ1aまたはIFNβ1b）の有効性が示されている11,12,13。さらに、インターフェロン療法は、コロナウイルス感染の非ヒト霊長類モデルにおいて、ウイルス量を減少させ、肺病理を改善することが示されている14。このように、IFNレベルを刺激し、SARS-CoV-2感染を予防できる治療戦略の探索は、より重要となってきています。
ビタミンD（VitD）は、骨格系に不可欠なビタミンとして長い間認識されてきた。さらに、ウイルス感染に対する免疫など、免疫系の調節にも大きな役割を担っていることが示唆されている15,16。疫学的研究により、VitDの欠乏はインフルエンザおよびCOVID-19の重症化リスクの増加をもたらす可能性があることが示され17、一方、補充はCOVID-19の進行または死亡を防ぐかもしれない18、19、20。in vitro研究でもVitDが直接抗ウイルス効果を持つという事実が支持されており、カテリサイジンLL-37およびヒトβディフェンシン215、21、22などの抗微生物ペプチドを発現するVitDの能力との関連が指摘されている。ここでは、in vitroおよびCOVID-19入院患者を対象に、VitDの抗ウイルス機構が、RIG-1/MDA-5シグナル、JAK-STAT経路の活性、およびその結果生じるIFN α/βシグナルとISGs産生の増加によって、宿主のタイプIFN免疫を増加する能力に関連している可能性を示しました。
研究方法
インシリコデータセット
National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus (NCBI GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) および European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, https://www.ebi.ac.uk) で公開されているトランスクリプトームデータセットを使用しました。含まれる研究（RNA-sequencing platform）は、気管支上皮細胞を培養し、calcitriol (GSE106885), poly I:C (GSE106885), IFNα (GSE148829), または SARS-CoV-2 (GSE147507) で処理または非処理をしたものである。Reactome interferon alpha/beta signal pathway (R-HSA-909733) と 524 遺伝子からなる Human ISG library23,24 を用いて、処理した気道上皮細胞における IFN/ISGs レベルのスクリーニングを行いました。使用したデータセットの詳細は、補足表S1に示した。
COVID-19患者コホート
2020年9月から2021年1月の間にドバイのRashid Hospitalの集中治療室に入院し、PCRでSARS-CoV-2感染が確認されたCOVID-19関連の重症肺炎患者80人から血液検体と唾液検体を入手しました。COVID-19の重症度ステータスは、高流量酸素療法または非侵襲的換気を必要とする肺炎と定義した25。試験時、これらの患者のうち43人は、VitD（コレカルシフェロール）を週1回50,000IUとして2～3週間投与されました。VitDへの患者の割り当ては、週1回50,000単位のVitDの追加を推奨する国の治療プロトコルに基づき、医師の判断に基づき行われた25。残りの患者（n = 37）にはVitDは投与されなかった。入院時の臨床検査データと臨床データを表1に示すが、血清25-ヒドロキシビタミンD［25（OH）D］値は、COVID-1925の国家臨床管理プロトコルではルーチンに要求されていなかったので、例外とした。選択された患者は、すべての人口統計学、合併症、およびCOVID-19重症度の一般的な実験室の炎症マーカー、およびIFNβ1aまたはIFNβ1bなどのあらゆる種類のインターフェロンベースの治療の使用について調整された（表1）。すべての検体は、患者の日常診療の一環として採取された。唾液は挿管された患者から吸引によって採取された。本研究は、Dubai Health AuthorityのDubai Scientific Research Ethics Committee（DSREC）からRashid Hospitalにおいて倫理的承認を得た（DSREC-12/2020_02）。また、研究参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。すべての方法は、関連するガイドライン（ヘルシンキ宣言とベルモントレポート）および規則（DSREC規則）に従って実施された。生物学的液体を安全に収集し、取り扱い、検査するためにCDCが推奨する予防措置がとられた26。
表1 研究対象者のベースライン臨床特性。
フルサイズの表
試験管内治療
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）は、3人の健康なコントロールの末梢血からFicoll-Paqueを用いて分離し、完全なRPMI-1640培地に再懸濁させた。さらに、この細胞を50 nM calcitriol (Sigma-Aldrich, USA) および/または1 μg/ml of IFNα (Myltenic Biotec, USA) で8時間処理し、RT-qPCRおよびウェスタンブロットを行うために、これらの細胞から総RNAおよびタンパク質をそれぞれ単離した。
ウェスタンブロットによるタンパク質の発現
全血および唾液サンプルを、14,000g、4℃で20分間遠心分離することによりペレット化した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ試薬キット（Thermo-Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit）を用いて測定した。細胞は、1×Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA) と1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich, USA) を添加した後、10×RIPA Buffer (Abcam) を用いて溶解した。15マイクログラムの総タンパク質を10%ゲルを用いて分離した。タンパク質をニトロセルロース膜（Bio-Rad）に移し、脱脂乳で室温で1時間ブロックし、VDR（cat#12,550）、p-STAT1（cat#9167）に特異的な抗体と4℃で一晩インキュベーションした。STAT1 (cat#14,994)、p-STAT2 (cat#88,410), STAT2 (cat#72,604), p-JAK1 (cat#74,129), JAK1 (cat#29,261), p-IRF3 (cat#29,047), IRF3 (cat#11,904), RIG-1 (cat#3743),MX-1 (cat#37,849) および ISG-15 (cat#2758) 特有の抗体と共に、4℃の温度で一晩培養する。ローディングコントロールとしてβ-Actin (cat#8457)を用いた。すべての抗体は、Cell Signaling Technology, USAから購入した。ブロットはChemiDoc Touch Gel Imaging System (Bio-Rad)でClarity Western ECL Substrate (Bio-Rad)を用いて現像した。Image Labソフトウェア（Bio-Rad）を用いて、タンパク質バンドの検出と定量を行った。
IFNα酵素結合免疫吸着アッセイ
市販のヒト用ELISAキット（Human Interferon alpha 1 ELISA Kit (ab213479), Abcam, USA）を用いて、全血試料中のIFNαサイトカイン濃度を測定した。アッセイは製造元の説明書に従って実施した。すべてのサンプルは二重測定した。
qRT-PCRを用いた遺伝子発現アッセイ
PBMC、全血、唾液サンプルからの Total RNA は、製造元の指示に従い Trizol 試薬を用いて単離した (Invitrogen, Carlsbad, CA)27. 高容量 cDNA 逆転写キット (Applied Biosystems) を用いて、1 μg の RNA から相補的 cDNA を製造者のプロトコールに従って合成した。cDNAの増幅には、5×Hot FirePol EvaGreen qRT-PCR SuperMix (Solis Biodyne, USA) を用い、qRT-PCRはQuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 28で実施した。qRT-PCR で使用した MDA-5 (IFIH1), RIG-1 (DDX58), IRF3, IRF9, MX-1, ISG-15, および 18s のプライマー配列は、補足表 S2 に寄託している。遺伝子発現は、参照遺伝子18s rRNA29に対して正規化した上で、Comparative Ct（ΔCt）法を用いて解析した。
解析手順
Affymetrix の生データを正規化し、対数変換した。マイクロアレイのデータ（CEL ファイル）は、R ソフトウェアで Robust Multi-Array Average (RMA) 法により前処理を行った30。発現量の IQR が最も大きいプローブセット ID を選択し、遺伝子を表現した。RNA-seq 研究では、Bioconductor パッケージの limma-voom31 を用いてデータを前処理した。差分発現遺伝子のfold changeは、Limma Bioconductor package32,33を使用して実施された。
さらに、患者の人口統計学的因子（年齢、性別、肥満度）、合併症（糖尿病）、COVID-19関連重症度血清マーカー（Dダイマー、CRP）を調整したCox比例ハザード回帰モデルを用いて、VitD補給と死亡率の関連を評価した。そして、29日間の累積生存率を示すためにKaplan-Meier生存曲線を構築した。統計解析はSPSS（バージョン26.0）、Rソフトウェア（バージョン3.6.1）、PRISM（バージョン8）を用いて実施した。すべての検定は両側で行い、P値0.05未満を統計的に有意とした。
結果
VitDはin vitroでIFN α/βシグナルを増強する
公開されているトランスクリプトームデータセットを用いて、ヒト気道上皮細胞（HAECs）をVitD（カルシトリオール）、ポリI：C（ウイルス感染の模倣）、IFNαで処理した後、さらにSARS-CoV-2感染後のreactome type I IFNシグナル伝達経路（R-HSA-909733）の活性を評価した。興味深いことに、IFNα/βシグナル伝達経路は、IFNαやポリI:C処理細胞、SARS-CoV-2感染細胞と同様に、VitD処理後にin vitroで濃縮または活性化されていることがわかった（図1A、正規化したIFNα/βシグナル伝達経路）。(図1A、IFN α/βシグナル伝達経路の正規化濃縮スコア（NES）は、VitDで1.005、IFNαで1.41、poly I:Cで1.00、SARS-CoV-2で1.40であった）。
図1
図1
VitD処理後のヒト気道上皮細胞およびPBMCにおけるIFNα/β経路シグナルの増加およびISGの高発現。(A）IFNα、poly I:C、SARS-CoV-2、VitD処理したヒト気道上皮細胞（HAEC）におけるIFNα/β経路のエンリッチメント。IFNα (1.41), poly I:C (1.00), SARS-CoV-2 (1.40), VitD (1.005) 処理したHAECの正規化濃縮スコア (NES) を示す。(B）IFNα, poly I:C, SARS-CoV-2, VitD処理HAECs処理細胞におけるRIG-1, MDA-5, IRF3, IRF9, MX-1, ISG-15の遺伝子発現レベル。(C) Reactome Interferon α/β シグナル経路 (R-HSA-909733) およびVitD標的遺伝子リスト中の遺伝子の重ね合わせ表示。IFNαについては、GEOを利用してIFNα処理したBEAS-2B細胞の3レプリケートからRNAseqデータを取得した。GSE148829 datasetを使用した。Poly I:CまたはVitDについては、GEOを使用して、Poly I:Cまたはカルシトリオール（VitD）処理HAECsの3レプリケートからRNAseqデータを取得した。GSE106885 dataset、SARS-CoV-2については、SARS-CoV-2感染HAECの3レプリケートからRNAseqデータを抽出し、GEO: GSE147507 datasetを用いた。GSE147507 datasetから抽出した。結果は、症例と対照の遺伝子発現のlog fold change±SEで示される。(D-F）VitD（50nMのカルシトリオール、8時間）処理PBMCにおけるVDRのmRNAおよびタンパク質レベル。 G-L）VitDおよび/またはIFNα（50nMのカルシトリオールおよび/または1μg/mlのIFNα、8時間）処理PBMCにおけるp-STAT1、p-STAT2およびp-JAK1タンパク質レベル。 M-O）VitDおよび/またはIFNα処理PBMCにおけるISG-15のmRNAおよびタンパク質レベル。PBMCsは、健康なドナーの末梢血から単離された（n = 3）。統計学的検定：比較は、データの歪度によって、対応のないt検定またはMann-Whitney U検定を用いて行った。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。
フルサイズ画像
これに伴い、RIG-1（DDX58）やMDA5（IFIH1）などのRNA細胞質感知タンパク質、IRF3やIRF9などのインターフェロン制御タンパク質、MX-1やISG-15などのインターフェロン刺激遺伝子の発現が、IFNαやポリI：C処理、およびSARS-CoV-2感染と同様にVitD処理後にHAECで上昇した（Fig. 1B）。これらの結果は、VitDIFNによる抗ウイルス反応は、RIG-1/MDA-5シグナル、JAK-STAT経路、および結果として生じるISGs産生の活性化を介している可能性があることを示唆している。
肺細胞におけるこれらの遺伝子に対するVitDの効果をさらに確認するために、VitDで処理した後の2つの細胞タイプ（PBMCまたは単球）から得られた、よく知られたVitD標的遺伝子の4種類のリストを、in vivoまたはin vitroのいずれかで使用しました34,35,36,37。1つはビタミンD3（2000μgまたは80,000IU）をボーラス投与した人のPBMCsのデータセット34、もう1つは健康な12人から分離したPBMCsを10nMの1，25（OH）2D3（カルシトリオール）35でインビトロ処理したデータセットであった。第3のデータセットは、85人のPBMCから分離し、100 nMのカルシトリオールでin vitro処理した初代単球36、第4のデータセットは、100 nMのカルシトリオールでin vitro処理したTHP-1細胞37であった。興味深いことに、肺細胞をVitDで処理した後に上昇したいくつかのリアクトームIFN α/βシグナル遺伝子（RIG-1、MDA5、STAT1、STAT2、IRF9、MX-1、ISG-15）は、PBMCや単球でVitDに反応することが既に知られている遺伝子と重複した（図1C；補表S3）。
さらに、健常者から分離したPBMCを50 nMのVitD（カルシトリオール）および／またはIFNαで処理し、VitDのタイプI IFNに対する調節効果を検討した。まず、ベースラインとVitD処理後の細胞におけるVitD受容体（VDR）の発現を調べた。注目すべきは、VitD処理後にVDRのmRNAおよびタンパク質の高い発現レベルが観察されたことである（Fig. 1D-F, 3 log FoldChange (FC) increase of VDR mRNA level; P = 0.002 ）。さらに、VitDおよび/またはIFNαで処理したPBMCでは、リン酸化（p）-STAT1、p-STAT2およびp-JAK1のレベルが上昇した（図1G-L、p < 0.0001; 付録図S1）。その結果、ISG-15などのISGの遺伝子およびタンパク質の発現量が増加した（図1M-O、ISG-15 mRNAレベルの2FC増加、P < 0.000; 付録図S1）。VitD処理後のJAK-STATシグナルとISG発現レベルのこの高い活性は、IFN α/βシグナルの増加を示すものである。
VitDを投与したCOVID-19患者の血中では、I型IFNシグナル伝達が亢進している。
Type I IFNの調節障害は、重症COVID-19疾患の発症に重要であると考えられています10。 そこで、重症COVID-19患者にVitDを投与することで、Type I IFNシグナルが増強されるかどうかを検討しました。この目的のために、入院中にVitD（50,000 IU cholecalciferol、週1回、2-3週間）を投与した、または投与しなかった重症COVID-19患者の全血中のRIG-1/MDA-5およびJAK-STATシグナル伝達経路の活性を測定している。ICUに入院中のCOVID-19患者80名を対象とした。このうち、43名の患者にVitDの投与が行われ、37名の患者にはVitDの投与が行われなかった。これらの2つのグループ間で、人口統計、合併症、およびCOVID-19の重症度マーカーにベースライン時の有意差はなかった（表1）。
我々はまず、これらの患者の血液中のVDRの発現量を測定した。VitDを投与されたCOVID-19患者の血液中では、投与されていない患者と比較して、VDRのmRNAおよびタンパク質レベルの上昇が観察された（図2A-C、VDR mRNAレベルの0.5 log FC増加、P < 0.0001）。興味深いことに、治療した患者の全血では、未治療の患者と比較して、RIG-1、MDA-5、p-IRF3のmRNAおよび/またはタンパク質レベルの上昇が観察された（図2D-J MDA-5 と RIG-1 mRNAレベルの2 log FC増加、P < 0.0001; および IRF3 mRNAの3.76 log FC増加、P = 0.03 ）。これらの事象は、IFN-α/βサイトカインの急速な産生につながる可能性があるため5、我々はさらに、これらの患者の血漿中のIFNαのレベルをELISAアッセイを用いて測定した。有意なレベルではないが、VitD後のIFNαの血漿レベルの増加が観察された（図2K、VitD治療対未治療患者の血漿中のIFNαレベルの平均9.4 ± 2.2 対 平均7.3 ± 5 pg/ml、P = 0.196）．
図2
図2
VitD治療を受けたCOVID-19患者の血中IFNα/βシグナルの増加。(A-C）VitD投与（コレカルシフェロールを毎週50,000 IU投与）および未投与のCOVID-19患者の全血中のVDRのmRNAおよびタンパク質のレベル。(D-J）VitD投与患者と未投与のCOVID-19患者の全血におけるRIG-1、MDA5、p-IRF3などのRNA細胞質感知蛋白のmRNAおよび／または蛋白質レベル。(K）VitD治療およびVitD未治療のCOVID-19患者の血漿中のIFNαのレベル。(L-Q）VitD治療及びVitD未治療のCOVID-19患者の血液中のp-STAT1、p-STAT2及びp-JAK1のタンパク質レベル。(R-X）VitD投与患者とVitD未投与のCOVID-19患者の血液中のIRF3、MX-1やISG-15などのISGのmRNAおよび／またはタンパク質レベル。VitD投与患者（n=9；男性6名、女性3名）および未投与COVID-19患者（n=9；男性6名、女性3名）の全血を、VitD投与（n=43；男性36名、女性7名）または未投与（n=37；男性27名、女性10名）のコホートからランダムに選択しました。統計学的検定：比較は、データの歪度によって、対応のないt検定またはMann-Whitney U検定を用いて行われた。*p < 0.05、**p < 0.01。
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さらに、IFN α/βシグナル伝達経路に対するVitDの調節効果を確認するために、私たちが募集した重症COVID-19患者の全血でJAK-STAT経路の活性を測定しました。興味深いことに、VitDを投与したCOVID-19患者の血液では、非投与の患者と比較して、リン酸化p-STAT1、p-STAT2、p-JAK1のレベルが上昇していた（図2L-Q、P < 0.0001; 付録図S2）。さらに、IRF9、MX-1、ISG-15などのISGのmRNAおよび/またはタンパク質レベルは、VitD治療後に上昇した（図2R-X、IRF9、MX-1、ISG-15のmRNAレベルの約2 log FC増加、P < 0.0001 ）。このことは、VitD投与がI型IFNシグナルの活性を高め、ウイルス感染症、特にSARS-CoV-2に対する免疫力を向上させることを示唆している。
COVID-19治療患者の唾液には、VitDによって刺激されたIFN α/βシグナル伝達が反映されています。
唾液はCOVID-19の診断と予後のための非侵襲的バイオマーカーの良い情報源であると信じられている38。そこで我々は、I型IFNに対するVitDの効果が唾液に反映されているかどうかを検証することにした。これは、それゆえ、薬物治療やビタミン補充後のI型IFN活性の測定に唾液を使用する可能性を示唆するものである。そのために、我々は、VitDで治療した、あるいはしていない重症COVID-19患者から得た唾液サンプルで、RIG-1/MDA-5およびJAK-STAT経路の活性を測定した。
これらの患者の全血で観察されたものと同様に、VitD治療後のCOVID-19患者の唾液サンプルでは、VDRのmRNAとタンパク質レベルが上昇した（Fig. 3A-C, 0.58 log FC 増加のVDR mRNA, P < 0.0001 ）。さらに、RIG-1、MDA-5、およびp-IRF3のmRNAおよび/またはタンパク質レベルで測定されるRIG-1/MDA-5シグナル伝達経路の増加（図3D-J、RIG-1、MDA-5、およびIRF3 mRNAレベルの約2FC増加、P < 0. 0001）、VitDを投与した患者の唾液では、未投与のCOVID-19患者と比較して、p-STAT1、p-STAT2、p-JAK1のレベルで測定したJAK-STAT経路の高い活性が認められた（図3K-P、P = 0.001; 付図S3）。JAK-STAT経路の活性化の結果として、MX-1やISG-15などのISGのmRNAおよびタンパク質レベルも、VitDを投与したCOVID-19患者の唾液では対照群と比較して上昇した（図3Q-V、MX-1のmRNAの1.40 log FC増加、P < 0.0001；ISG-15 mRNAの6.55 log FC増加、P < 0.0001 ）。
図3
図3
VitD治療を受けたCOVID-19患者の唾液におけるIFNα/βシグナルの増加。(A-C）VitD投与（コレカルシフェロールを毎週50,000 IU投与）および未投与のCOVID-19患者の唾液中のVDRのmRNAおよびタンパク質のレベル。(D-J）VitD投与患者と未投与のCOVID-19患者の唾液中のRIG-1、MDA5、p-IRF3などのRNA細胞質センシングタンパク質のmRNAのレベル。(K-P）VitD治療およびVitD未治療のCOVID-19患者の唾液中のp-STAT1、p-STAT2、およびp-JAK1のタンパク質レベル。(Q-V)VitD投与およびVitD未投与のCOVID-19患者の唾液中のMX-1およびISG-15などのISGのmRNAレベル。VitD投与患者（n=43；男性36名、女性7名）または未投与患者（n=37；男性27名、女性10名）のコホートからランダムに選んだVitD投与患者（n=5；男性3名、女性2名）および未投与COVID-19患者（n=4；男性2名、女性2名）の唾液を使用した。統計学的検定：比較は、データの歪度によって、対応のないt検定またはMann-Whitney U検定を用いて行われた。*p < 0.05、**p < 0.01。
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VitD治療を受けたCOVID-19患者は全死因院内死亡率が低かった
次に、COVID-19患者の全死亡率に対するVitD治療の効果が評価されました。29日目までに、VitD治療群では43人中8人（19%）が死亡したのに対し、未治療群では37人中12人（32%）が死亡しました（図4；調整ハザード比、0.37、95%信頼区間0.14-0.94；P = 0.038）。この結果は、VitD治療がタイプI IFNシグナルの増強を通じて、最も可能性の高い免疫反応の改善と全死亡率の低下に寄与していることを示唆している。
図4
図4
COVID-19でVitDを投与した患者の29日目の全死亡率の低下。VitDを投与した患者（n = 43、死亡イベント8件）と未投与のCOVID-19患者（n = 37、死亡イベント12件）のKaplan-Meier曲線です。Cox比例ハザード回帰モデルは，患者の人口統計学的因子（年齢，性別，肥満度），合併症（糖尿病），COVID-19関連重症度血清マーカー（Dダイマー，CRP）で調整されている．
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考察
本研究では、VitDの抗ウイルス機構が、RIG-1/MDA-5およびJAK-STAT経路のシグナル伝達を増強することによって、in vitroおよびCOVID-19入院患者の臨床環境の両方で、宿主IFN-α/βシグナルを増加させるその能力と関連付けられることを実証し、結果として抗ウイルスISGsのMX-1とISG-15が得られた (図5). このIFN α/βシグナルとISGの増加は、SARS-CoV-2ウイルス感染を除去するための自然免疫応答を強化する可能性がある。
図5
図5
研究結果の概略図。VitDは、RIG-1/MDA-5およびJAK-STAT経路のシグナル伝達を促進し、その結果、MX-1とISG-15抗ウイルスISGsの産生を促進する。
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感染後、いくつかのSARS-CoV-2タンパク質、N、NSP16は、RIG-1とMDA-5、およびIFN-α/βサイトカインの生成に必要な下流のインターフェロン制御因子（IRF3またはIRF7）の活性化を抑制する39。興味深いことに、我々は、in vitroでのVitD処理と、VitD処理したCOVID-19入院患者の全血および唾液において、RIG-1、MDA5およびIRF3のアップレギュレーションに注目した。これらの知見と同様に、Jadhavら40 は、VitD (Calcitriol; 1,25(OH)2D) 処理が、デングウイルス感染マクロファージにおいてin vitroでRIG-1の遺伝子発現レベルをアップレギュレートすることを示しています。SARS-CoV-2がIFN型免疫反応を調節し、宿主の自然免疫を操作することが示されていることから10、VitDのこのIFNシグナルを高める能力は、SARS-CoV-2感染に罹患する過程での基礎となり得るものであると考えられる。
SARS-CoV-2が介在するSTAT1の阻害と、それに続くSTAT3優位のシグナル伝達への移行は、入院中のCOVID-19患者に最もよく見られる炎症性状態を引き起こす可能性がある39. VitDの投与は、in vitroおよびCOVID-19入院患者の全血と唾液中のJAK-STAT経路の活性化を促進した。IFN-α/βによるJAK-STAT経路の活性化は、何百ものISGのアップレギュレーションを引き起こし、その多くは感染細胞内でウイルスに迅速に拮抗する能力を持っている。
さらに、JAK-STATシグナル経路に関与する重要な転写因子であるIRF9と、MX-1やISG-15などのISGがVitD処理により発現上昇した。IRF9の欠損は、いくつかのウイルス感染症に対する感受性を高め、MX-1およびISG-1541のレベルを低下させることが報告されています。MX-1は、IFN-α/βシグナルによって誘導される抗ウイルス応答の一部であるGTPaseである。ウイルスの転写と複製を阻害することにより、インフルエンザウイルス感染を抑制することが示されている42。ISG-15は、ウイルス感染に対する宿主応答のもう一つの重要な構成要素であり、ウイルスタンパク質と結合する、あるいは「ISGylation」することにより、ウイルスの局在、プロテアーゼ活性、宿主タンパク質との相互作用能力を阻害する43。同様に、デングウイルス感染マクロファージを 1,25(OH)2D40 で処理すると、ISG-15 の発現が増強された。
VitDの標的遺伝子の一つとして同定されたIRF5転写因子37は、最近、VitDによって制御される22の転写因子の一つであり、単球における他のVitD標的遺伝子の転写も制御することが示されている44。In vitroの実験では、VDRはVitDで処理した単球のIRF5の遺伝子座に結合していました44。TLR3の下流に位置し、I型シグナル伝達に不可欠なIRF5をVitDがアップレギュレートするという報告45は、TLR3/IFNシグナル伝達におけるVitDの関与の背後にさらなる根拠を与えているのかもしれません46。このVitDの効果については、さらなる調査が必要です。
IFN α/βシグナルの上昇とISGsのレベルは、VitDで治療したCOVID-19患者の血液と唾液の両方で明らかであったことは注目に値します。唾液腺を取り巻く豊富な血液循環は、血液中のタンパク質の唾液への交換を促進することが示されている47。このことは、唾液が治療後のI型IFNの血中濃度/活性をモニターするための信頼できる液体となり得ることを示しています。唾液は、様々な疾患における診断または予後のツールとして研究されており、血清や尿のような他の生体液の代替となることが期待されている38,48。したがって、唾液はCOVID-19の重症度や治療をモニターするための非侵襲的なバイオマーカーの供給源となり得る。
最後に、IFN α/βシグナルを上昇させるVitDの能力は、COVID-19の患者にとって有益である可能性がある。I型IFNおよびISGの血中濃度が上昇した無症状のCOVID-19患者は、疾患の進行が制限されていることが報告されている49。さらに、血中濃度が20 ng/mL（< 50 nmol/L）未満と定義されるVitD欠乏は、COVID-19の重症度と死亡率の重要な要因である可能性が高いです50。この点に関して、スペインで行われたCOVID-19で入院した76人の患者の無作為化臨床試験では、入院時に高用量VitD（カルシフェジオール0.532mg、21,000IUコレカルシフェロールの経口に等しい）を投与すると集中治療室入室のリスクが著しく低下することが明らかになった51。イタリアで行われたCOVID-19患者324人の観察研究では、VitD治療（50,000 IU cholecalciferol/月）がCOVIDによる院内死亡のリスクを低下させたと報告されています-1952。今回，より高用量のVitDを投与したところ（50,000 IU cholecalciferol per week, 2〜3週間），29日目までのCOVID-19関連死亡が有意に低下した．SARS-CoV-2に対するIFN反応とISGsの産生を増加させるVitDの能力に関する我々の発見は、VitDが免疫力を改善し、したがって重症COVID-19患者の生存を改善する可能なメカニズムの一つを強調するものであった。
長所と短所
本研究は、VitDがin vitroで、また治療により重症感染症に苦しむCOVID-19患者のIFNシグナル伝達経路の産生と活性を増強する能力を解明した最初のものである。SARS-CoV-2ウイルスは、IFN型免疫反応を調節することで自然免疫を操作するため、IFNシグナル伝達を改善するVitDのこの能力は、SARS-CoV-2ウイルス感染性にとって重要な意味を持つ可能性がある。本研究の長所にもかかわらず、認識されるべきいくつかの限界がある。第一に、すべての患者は入院後29日間のみフォローアップされており、この期間以降に発生した事象の報告は制限される可能性がある。第二に、ベースラインの血清25(OH)D濃度が患者から得られなかったことである。しかし、VitDを投与するかしないかの無作為化は、COVID-19治療に関する国のガイドラインに基づき、医師の判断に基づき行われた25。最後に、VitD代謝は遺伝的要因に影響されるかもしれないが、これは我々の研究の焦点ではない。
結論
結論として、我々のデータは、VitDがRIG-1/MDA-5およびIFN α/β経路のシグナル伝達とISGsの産生を増強する可能性があることを示した。このような知見は、VitDの補給が、患者の自然免疫を高めることによってCOVID-19疾患の重症度を軽減するのに役立ち、SARS-CoV-2感染の予防とおそらく治療のために十分なVitDを維持するための公衆衛生メッセージを支持するという重要な含意を示唆している。I型IFNに対するVitDの調節的役割を確認し、COVID-19感染症における治療薬としてのVitDの有効性とメカニズムを解読するために、さらなる研究とRCTが必要である。
データの利用可能性
本研究で使用したデータセットおよび解析したデータセットは、対応する著者から入手可能である。
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資金提供
サウジアラビア王国リヤド市のキングサウド大学科学研究部（Vice Deanship of Scientific Research Chairs; Research Chair of Prince Abdullah Ben Khalid Celiac Disease research chair）から資金提供を受けたことに感謝の意を表します。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Shirin HafeziとFatemeh Saheb Sharif-Askari。
著者と所属
シャルジャ大学医学・健康科学研究所、シャルジャ、アラブ首長国連邦
Shirin Hafezi、Fatemeh Saheb Sharif-Askari、Narjes Saheb Sharif-Askari、Qutayba Hamid、Rabih Halwani
アラブ首長国連邦ドバイ市ドバイ保健局薬学部
ハーラ・アリ・フセイン・アルサイード
アラブ首長国連邦、アブダビ、カリファ科学技術大学工学部、生物医学工学科
ハビバ・アルサファル
アラブ首長国連邦、アブダビ、カリファ科学技術大学、バイオテクノロジーセンター
ハビバ・アルサファル
アラブ首長国連邦、アブダビ、カリファ科学技術大学医学部遺伝学・分子生物学科
ハビバ・アルサファル
ザイード大学健康科学部（アラブ首長国連邦、アブダビ
ファトメ・アル・アヌーティ
シャルジャ大学医学部臨床科学科、シャルジャ、アラブ首長国連邦
Qutayba Hamid & Rabih Halwani
McGill大学ヘルスセンター研究所Meakins-Christie研究所（カナダ、QC州、モントリオール
Qutayba Hamid
サウジアラビア キングサウド大学医学部小児科 Abdullah Ben Khaled王子セリアック病講座
Rabih Halwani
貢献度
F.S.S.A., R.H., S.H., and N.S.S.A. conceived and design the experiments; S.H. and H.A.H.A. collected samples and/or perform experiments; F.S.S.A. analyzed the data. 原稿の執筆および修正には全著者が貢献した。
共著者
Rabih Halwaniにご連絡ください。
倫理的宣言
利益相反
著者は、競合する利益を宣言していない。
追加情報
出版社からのコメント
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この記事の引用
Hafezi, S., Saheb Sharif-Askari, F., Saheb Sharif-Askari, N. et al. Vitamin D enhances type I IFN signaling in COVID-19患者におけるビタミンD。Sci Rep 12, 17778 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41598-022-22307-9。
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受領日
2022年3月10日
受理済
2022年10月12日
公開日
2022年10月22日発行
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