レトロウイルスの感染成功は常在微生物叢に依存する

哉百名


レトロウイルスの感染成功は常在微生物叢に依存する

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3519937/

メリッサ・ケイン、ロール・K・ケース、タチアナ・V・ゴロフキナ

論文情報

関連データ
補足資料
要旨
慢性的な感染を確立するために、ウイルスは宿主の免疫反応を回避する戦略を開発しなければならない。マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）を含む多くのレトロウイルスは、微生物相が豊富な粘膜表面を通じて最も効率的に感染する。我々は、MMTVを新生マウスに摂取させると、ウイルス抗原に対する無反応状態が引き起こされることを発見した。抗生物質で処理したマウスや無菌マウスは、感染性ウイルスを子孫に感染させないことから、この過程には腸内細菌叢が必要であることがわかった。MMTVと結合した細菌のリポポリサッカライドはToll様受容体4を誘導し、それに続いてインターロイキン-6（IL-6）依存的に抑制性サイトカインIL-10を誘導することが確認された。このように、MMTVは微生物叢との相互作用に依存して、免疫回避経路を誘導するように進化してきたのである。これらの知見は、ウイルス感染における常在細菌叢の基本的な重要性を明らかにするものである。

病原体の成功は、免疫系に対抗する手段、あるいは確立された免疫機構を自らの利益のために利用する手段を開発してきた。マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）を含むレトロウイルスは、少なくとも1つのToll様受容体（TLR7）によって検出され、検出はほとんどのTLRの下流でシグナルを発するアダプター分子（骨髄分化一次反応遺伝子88（MyD88）により発現）に依存しています（1-3）。しかし、レトロウイルスは様々な免疫回避のメカニズムを用いており（4、5）、免疫系を破壊したり（例えば、様々な種の免疫不全ウイルス）、感染を成功させるためにそれを攪乱したり（5、6）することが可能である。感染動物において、ウイルスタンパク質に対する免疫学的寛容の状態が確立されることも、ウイルスの拡散をサポートするはずである。経口感染したMMTVに感染した動物がMMTV抗原に対して耐性を持っているかどうかを調べるために、アジュバントと混合したビリオンタンパク質を動物に免疫してみた。新生児期にMMTVを含むミルクを摂取した成体動物は、ウイルスタンパク質に対する抗体（Abs）を産生できないが（図1A）、コントロール抗原に対する反応はそのままであった（図1B）。一方、非経口感染した新生児は、ウイルス特異的な抗体を産生した（Fig. 1A）。MMTV の持続性には TLR4 依存性の免疫調節サイトカインであるインターロイキン-10 (IL-10) の産生が必要であり、TLR4 の欠損は最終的に元のウイルスを消失させる (6) 。ウイルスを排除した MMTV 感染 TLR4 欠損 C57B10/ScNJ (B10.TLRLps-del) マウスは、免疫後 MMTV タンパク質に反応した (図 1A)．このように、MMTVに対する免疫寛容の誘導には、経口感染経路とTLR4の充足度の両方が必要であることがわかった。

Fig.
Fig.
MMTVに対する不応性は、経口感染経路と微生物叢に依存する。(AおよびB) MMTVに感染していないマウス、またはMMTVに感染した授乳期のMMTV(LA)雌を育成することによって感染したマウス、あるいは...の腹腔内感染によって感染したマウスを、表示した系統のマウスとした。
TLR4 は、細菌のリポポリサッカライド（LPS）に主たる特異性を持つパターン認識受容体（7）である（8）。しかし、この受容体を活性化するリガンドは他にも提案されており(9)、その中にはMMTVのタンパク質も含まれています(10)。したがって、MMTVは、自身のタンパク質または宿主の腸内細菌叢の産物のいずれかを使用してTLR4をトリガーすることができます。これらの可能性を区別するために、我々は2つの相補的なアプローチを用いました。まず、自然感染した妊娠中のC57BL/6J（B6）マウスを広域スペクトルの抗生物質の複合体で処理した（図S1A）。最初の妊娠の子孫を成体として免疫したところ、抗生物質を投与していない同腹仔とは異なり、MMTV抗原に反応した（図1C）。さらに、これらのマウスはMMTVフリーであった。脾臓に統合プロウイルスは見られず、MMTV感染（11、12）の敏感な指標であるウイルスのスーパー抗原（SAg）に反応するT細胞の欠失も見られなかった（図1D）。このように、抗生物質による常在細菌叢の枯渇は、MMTVの複製に大きな影響を与える。

次に、無菌（GF）C3H/HeN（野生型）マウス、およびTLR4（C3H/HeN.TLR4Lps-del）、MyD88（C3H/HeN.Myd88KO）、またはTLR4とMyd88（C3H/HeN.TLR4Lps-del MyD88）の両方を欠損したGF C3H/HeN マウスを作出した。4系統すべてのGF雌および対照の従来の特定病原体非含有（SPF）マウスに、感染したSPF野生型マウスの乳から分離したフィルター滅菌MMTVウイルスを注射し（0世代、G0）、繁殖させて子孫を作らせた（G1）。予想通り、ウイルスを注射したG0雌はすべて感染し、乳汁中に同量のウイルスを産生した（図2Aおよび図S2A）。注射したSPFマウスはすべて子孫に感染性ウイルスを伝播したが、野生型GFマウスの大部分（試験した7家族中5家族）は子孫にウイルスを伝播できなかった（図2、B、C、および図S2B）。注目すべきは、独立した8つのC3H/HeN.TLR4Lps-del GFファミリーのいずれも、感染性MMTVをその子に感染させなかったことである（図2、BおよびC）。これらの結果は、MMTV感染における微生物相の重要性を支持するとともに、このプロセスにおけるキープレイヤーとしてTLR4リガンドであるLPSが関与していることを示唆している。

図2
図2
異なる遺伝子型のGFおよびSPFマウスにおけるMMTVの持続性の違い。(A）MMTV（C3H）を非経口的に感染させたGF C3H/HeNマウスの乳汁中のMMTVビリオンRNAを逆転写PCRで検出した。NC、ネガティブコントロール。の乳汁から得たRNA。
従って、GF野生型グループにおける表現型の不完全な浸透（MMTV感染消失）は、オートクレーブ処理された動物飼料中のLPSの存在に起因している可能性がある。LPSのlimulus amebocyte lysate（LAL）試験により、GFマウスは1日当たり最大500ngのLPSを消費する可能性があることが確認された（図S2C）。この消費量は一様ではないと思われ、これが異なる家族間のMMTV消失のばらつきを説明する。実際、MMTVに感染したGF雌の5人に1人の授乳中の乳汁のウイルス画分にLPSが検出された（図S2D）。

感染したGF C3H/HeN.MyD88KOおよびC3H/HeN.MyD88KOTLR4Lps-delマウスは、SPF MyD88KOマウスと同様に（図2、CおよびD、図S3A）、多世代にわたって例外なくMMTVを伝播させた（図S3B）。この観察は、2つの重要なポイントを示している。まず、GFマウスでMMTVが感染しないのは、腸管関連リンパ組織が未発達であるためではないか（13）、あるいはMMTV感染に不可欠なM細胞が少ないためではないかという懸念が緩和される（14）。第二に、GF MyD88KOマウスによるMMTV感染は、GF野生型およびTLR4LPS欠損動物におけるウイルスクリアランスがMyD88に依存していることを示唆している。

TLR4は、MyD88またはTIRドメイン含有インターフェロン-β（TRIF）誘導アダプターのいずれかを介してシグナルを送る。TRIFはウイルス誘発性IL-10産生に必要であるが、MyD88は必要ないことがわかった（図S3C）。このように、MyD88は、TLR4とTLR7を介したウイルスに対する反応の両方に必要であることがわかった。

この結果は、腸内細菌叢が経口経路でのウイルスの通過を成功させるために重要であることを示唆している。さらに、GF野生型マウスに定義された細菌群［改変シェードラー細菌叢、ASF（15）］を再構成すると、ウイルス感染能力が回復した（図2E）。ASFのランダムな（ウイルスの観点から見た）構成は、免疫破壊が特定の種類の細菌に依存するのではなく、細菌由来のリガンド（おそらくLPS）を必要とすることを示唆している。

LPSはMMTVに直接結合するか、あるいはウイルス感染とは無関係に抑制的なサイトカインの環境を刺激する可能性がある。脾臓細胞への MMTV ビリオン添加が TLR4 依存的に IL-10 の産生を誘導する in vitro システムが使用された(6)。LPS に結合して中和するポリミキシン B（PMB）は、野生型脾臓細胞による MMTV の IL-10 分泌誘導能を緩和した（Fig. 3A）。また、PMBの存在下で過剰なLPSを添加するとIL-10分泌が回復することから、PMBは反応する細胞に対して直接毒性を示すものではなかった（Fig. 3B）。これらのデータから、MMTVはLPSと結合し、それによって環境からLPSを抽出・濃縮する因子として作用する可能性が示唆された。実際、授乳中の雌の乳腺から分離したMMTVはLPSを含まなかったが、ミルクを摂取した仔の胃の中のMMTVはLPSを多く含んでいた（図S4A）。MMTV-SPF単離株の勾配遠心分離により、ウイルス調製物中のすべてのLPS（およびそのIL-10惹起活性）はMMTVに結合していることが示された（図3Cおよび図S4B）。さらに、勾配遠心分離中に25μgのLPS（40μg/ml）を加えた場合（ウイルス単離株で見られるLPSの1000倍の用量）でも、ウイルス非存在下ではLPSはペレット化しなかった（Fig. 3C）。

図3
図3
MMTV結合LPSはIL-10の産生を誘導する。(A）野生型C3H/HeN（wt）またはC3H/HeN TLR4Lps-del（Lps-del） マウスからの脾臓細胞を、0.1μg/ml PMBの存在または不在下でMMTV-SPF分離株と共にインキュベートした。IL-10は組織培養の...
MyD88KOTLR4Lps-delマウス（ウイルス複製を制限できない）の大部分（図2D）が産生したMMTV-GFは検出可能なLPSを欠き、野生型C3H/HeN脾臓細胞からIL-10分泌を誘発しなかった（図3Cおよび図S4C）。MMTV-GF単離株は、対照のMMTV-SPF単離株と比較して、等量またはそれ以上の量のウイルスを含んでいた（図S4、BおよびC）。さらに、MMTV-GFは、勾配遠心分離中にLPSをペレット化し、次いでin vitro脾臓細胞培養におけるIL-10産生を刺激することが可能であった（図3C）。さらに、MMTVによるLPSの結合は、結合していないLPSと比較して、IL-10産生を誘導する能力を強く高める（図3、BおよびD）。このことは、MMTV、LPS、TLR4の間に特殊な相互作用があるか、あるいはPMBに対して非常に感受性の高いタイプのLPSが関与していることを示唆している（図3B）。このことは、一部のGFマウスにおけるMMTVの増殖（図2C）は、実際に混入したLPSによって助けられたという結論と、MMTVによるLPSの効率的な結合は進化的適応であるという議論を支持するものであった。また、2週齢のSPFマウスとGFマウスの小腸におけるバックグラウンドのIL-10レベルは同程度で、TLR4やMMTV感染とは無関係であることがわかった（図S5）ことから、哺乳類マウスのIL-10のバックグラウンドレベルは微生物とは無関係であることが示唆された。したがって，MMTVによるLPSの結合と濃縮は，腸内のIL-10のグローバルレベルに影響を与えることなく，おそらくコンパートメント化された形で起こるのだろう．しかし、LPSはIL-10産生を刺激するだけでなく、ウイルスの主要な標的の増殖を誘導し、ウイルス全体の力価を上昇させて、免疫反応に対してウイルスを優位に立たせる可能性がある。

IL-10は、MMTVに対する耐性の誘導に関与している可能性が高いサイトカインである。B細胞によるIL-10産生にはTLR4欠損の骨髄系細胞が必要であるが（6）、骨髄系細胞が産生するIL-10誘導シグナルの性質は不明であった。このシグナルを同定するために、サイトカイン欠損マウスの脾臓細胞（図4A）と腸管関連二次リンパ系器官の細胞（図S6）について、in vitroでウイルスに曝露した際のIL-10分泌能について試験してみた。IL-4、IL-12、およびIL-1はIL-10の誘導に必要なかったが、IL-6が重要であることがわかった（図4A）。IL-6 の分泌は TLR4 に依存するが、IL-10 には依存しないことから、TLR4 は IL-6 の上流に位置し、IL-6 は IL-10 の上流に位置すると考えられる。B6.CD14KO脾臓細胞もまた、MMTVに暴露されるとIL-10を産生できない（図4A）。このことは、CD14（LPSのTLR4結合の共受容体）もMMTVによるLPSとTLR4との相互作用に関与していることを示唆するものであった。

図4
図4
MMTV-LPSによるTLR4のトリガーによって誘導される免疫破壊経路の遺伝子レベルでの解明。(A) B6またはB10野生型マウス（互換的に使用）、あるいは指定のノックアウトまたは変異マウスの脾臓細胞を、MMTV-SPF単離株とインキュベートし、その後、...。
提案された一連のイベント（MMTV+LPS → TLR4 → IL-6 → IL-10）がin vivoでのMMTV転化経路に関与していることを遺伝子的アプローチで確認するために、B6.IL-6KO、B6.IL-10KO、B6.CD14KO、B10.LPS-delを利用した。TLR4Lps-del, B6.TLR2KOマウスを利用した。MMTVの運命は、感染マウス血統で多世代にわたって追跡された。IL-6およびIL-10欠損動物の両方が、B10.TLR4Lps-delおよびCD14KOマウスと同様に、連続する世代でMMTVを排除したが、TLR2KOは排除しなかった（図4Bおよび表S1）。したがって、我々の結果は、LPS誘発シグナル伝達がIL-10産生を介してウイルスの「転覆」経路を駆動し、それが連続する世代へのウイルス感染を促進するというモデル（図S7）を支持している。

感染したIL-10KOおよびIL-6KOマウスの後続世代における実際のウイルス量を詳細に解析したところ、ウイルスは徐々に減少し、ウイルスを完全に排除するには、様々な家系で異なる継代数を要した（表S1および図S8）。このように、初期の世代では、高いウイルス量がTLR4依存性転化経路の喪失を補い、適応免疫応答を圧倒することができるようである。しかし、感染した各マウス血統では、その後の継代ごとにウイルス量が減少するため、最終的にはウイルスが消失する（図S8）。

腸管粘膜やその他のバリアー組織の多くの恒常性維持機能には、定常的な微生物相が必要である。微生物叢は、組織修復（16）、自己に対する耐性［自分自身に対する耐性（17）および宿主の自己抗原に対する耐性（18）を含む］の誘導、および摂取した抗原に対する成人の経口耐性（19、20）を制御している。現在のところ、新生児の口腔内耐性が微生物叢に依存するのか、あるいはMMTVがレトロウイルスに特有のメカニズムで新生児の自己に対する口腔内耐性を誘導しているのかは不明である。常在菌は様々な病原体と相互作用し、病原性および日和見菌（21）、原虫（22）、真菌（23）の感染から宿主を保護したり、蠕虫（ぜんちゅう）の感染を促進する（24）。しかし、ウイルスの感染や病原体形成における常在菌の役割については、まだ解明され始めたばかりである。細菌微生物相は、ウイルスとの相互作用において、保護的役割（25）と教唆的役割（本報告）の両方を果たすことができる可能性が高い。この分野の知見が不足しているため、このような調査を他の系に拡大することが重要である。他のウイルスが、LPSのような細菌の産物を利用して感染を成功させるかどうかは、まだ明らかでない。粘膜表面を通じて感染するレトロウイルスもまた、同様の戦略を用いる可能性がある。ヒトの場合、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感染リスクは、受精肛門性交を行う人の間で最も高く（26）、HIVに感染した母親から授乳された乳児のリスクも高い（27、28）とされている。本研究は、これまで知られていなかったレトロウイルス発症における常在細菌の役割に光を当て、粘膜感染予防、ウイルス特異的ワクチン接種、治療への新しいアプローチを提案するものである。

補足資料
21998394
こちらをご覧ください(5.4M, pdf)
謝辞
B. TheriaultとA. Vestの協力により、gnotobiotic動物のモニタリングが実現したことに感謝する。この研究は、T32GM007183によるM.K., K.K., C.M.への支援を受けている。とC.M.、L.C.へのT32 AI065382-01、Juvenile Diabetes Research Foundation助成金2005-204と2007-353、National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) NIH AI082418とNational Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, NIHの消化器疾患研究コアセンター助成金DK42086によりA.V.Cに提供されたものである。 V.C.; National Cancer Institute, NIH, grant CA100383 and NIAID grant AI090084 to T.V.G.; and a grant (P30 CA014599) to The University of Chicagoによって行われた。SPFおよびGF C3H系変異株マウスの使用には、物質移転契約が必要である。本論文で報告されたデータは、本論文および補助オンライン資料に集計されている。

脚注
補助オンライン資料

www.sciencemag.org/cgi/content/full/334/6053/245/DC1

材料と方法

図 S1～S8

表S1

参考文献 (29-48)

論文情報
サイエンス 著者原稿; 2012年12月11日PMCにて公開。
最終編集版として掲載されました。
Science. 2011 Oct 14; 334(6053): 245-249.
doi: 10.1126/science.1210718
pmcid: pmc3519937
NIHMSID: NIHMS425334
PMID: 21998394
Melissa Kane,1 Laure K. Case,1,* Karyl Kopaskie,1 Alena Kozlova,1 Cameron MacDearmid,1 Alexander V. Chervonsky,2,* and Tatyana V. Golovkina1,‡†.
1シカゴ大学微生物学部，シカゴ，IL 60637，USA
2Department of Pathology, The University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA（病理学教室、シカゴ大学、シカゴ、IL 60637、USA
‡連絡先：ude.ogacihcu.dsb@ikvologt
†これらの著者はこの仕事に等しく貢献した。
*現住所 The University of Vermont, Given C249, 89 Beaumont Avenue, Burlington, VT 05405, USA（バーモント大学、ジブンC249、ボーモント通り89番地、バーリントン、バージニア州、米国）。
著作権表示
この論文の出版社による最終編集版は、Scienceに掲載されています。
参考文献と注釈

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