微生物と宿主の形質に関する遺伝子マッピングから、マウス腸管におけるAkkermansia muciniphilaによる免疫調節脂質の産生を明らかにした

2023年2月13日 10:35

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公開日：2023年2月9日
微生物と宿主の形質に関する遺伝子マッピングから、マウス腸管におけるAkkermansia muciniphilaによる免疫調節脂質の産生を明らかにした

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01326-w

Q. Zhang, V. Linke, ...F. E. Rey 著者を表示
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指標詳細

概要
宿主の遺伝的変異が腸内細菌叢にどのような影響を与えるのか、その分子基盤はまだほとんど分かっていない。本研究では、遺伝学的に多様なマウス集団を用い、システム遺伝学的手法により、微生物-宿主の動態に影響を及ぼす糞便メタゲノム、小腸転写物、糞便脂質を用いて、微生物機能を含む宿主と微生物の表現型間の相互作用を明らかにした。定量的形質座位（QTL）マッピングにより、細菌分類、運動性、胞子形成、リポ多糖産生などの細菌機能、細菌および宿主由来脂質のレベルの変動に関連するマウスゲノム領域を同定した。その結果、Akkermansia muciniphilaの存在量とオルニチン脂質の大腸レベルについて重複するQTLを見出した。さらに、in vitroおよびin vivoの研究により、Akkermansia muciniphilaが腸内でこれらの脂質の主要な供給源であることを明らかにし、オルニチン脂質が免疫調節効果を持つことを示す証拠を得るとともに、代謝および免疫の調節に重要な役割を果たす転写因子をコードするAtf3などのこれらの形質と共調節する腸の転写物を特定することができた。これらの結果は、オルニチン脂質がA. muciniphilaと宿主の相互作用に重要である可能性を示唆しており、腸内細菌に対する応答の決定要因として宿主の遺伝学的な役割を支持するものである。

主な内容
腸内細菌は、哺乳類の生理学およびヒトの健康において基本的な役割を担っている1,2,3。環境曝露と宿主の遺伝的変動は腸内細菌叢の構成を調節し4,5,6、ヒトの腸内細菌群に見られる大きな対人変動に寄与している。近年のシーケンサー技術や解析パイプラインの進歩により、宿主遺伝学や腸内細菌叢が健康に及ぼす影響についての理解が進んでいます。集団研究により、ヒト7,8,9,10,11およびマウスコホートにおける宿主遺伝と腸内細菌形質の関連性が明らかにされています12,13。さらに、宿主遺伝情報とメンデルランダム化を活用した研究により、腸内細菌と、ヒトの短鎖脂肪酸の糞便レベル14、血漿タンパク質15、ABO組織血液型16などの他の分子複合形質との関連性が浮き彫りになっています。しかし、これらの研究のほとんどは、微生物の器官構成に焦点を当てており、宿主の遺伝的変異が腸内細菌叢の機能的能力に与える影響についての理解には、現在大きな隔たりがあります。

微生物代謝産物は、微生物と宿主の間のコミュニケーションの重要なノードである。代謝産物には、食事成分由来の小分子（例えば、トリメチルアミンN-オキシド）17や、ビタミン18や脂質19など微生物がデノボ合成するものがあります。エイコサノイド、リン脂質、スフィンゴ脂質、脂肪酸などの脂質は、多くの細胞プロセスを制御するシグナル伝達分子として作用する20,21,22。腸内細菌は、胆汁酸の産生および代謝の調節を介して食物脂質の吸収を調節するだけでなく、脂質および宿主が産生する脂質の前駆代謝物の主要な供給源でもある23,24。細菌細胞膜関連脂質は、微生物-宿主間の相互作用にも重要である19,25が、これらの動態におけるその役割についての理解は、腸内細菌についてようやく進み始めたところである。

腸内生態系における微生物-宿主間相互作用を支配する一般原理を定義することは、困難な課題である。システム遺伝学的研究は、前例のないプロセスや分子を呼び起こす仮説を生み出し、これらの相互作用の基盤となる遺伝子、パスウェイ、ネットワークの同定に利用することが可能である。腸内細菌、腸内脂質、宿主の遺伝的変異の間の関連を調べるために、我々は8つの創始株から派生した遺伝的に多様な集団であるDiversity Outbred (DO) mouse cohortを活用した。C57BL/6J (B6), A/J (A/J), 129S1/SvImJ (129), NOD/ShiLtJ (NOD), NZO/HLtJ (NZO), CAST/EiJ (CAST), PWK/PhJ (PWK) and WSB/EiJ (WSB)26,27 の8つの創始株から派生した遺伝学的多様性を持つ集団である。これら8つの株は、異なる腸内細菌群集を保有し、食事誘発性代謝疾患に対する不均衡な代謝応答を示す28。DOの集団は、遺伝子マッピングの能力と解像度を最大化することを目的とした交配戦略によって維持されています。我々は、DOマウスの糞便メタゲノム、腸内トランスクリプトーム、糞便リピドームを解析し、これらの形質と関連する宿主遺伝子を同定するために定量的形質座（QTL）解析を行った。微生物と脂質の関連を明らかにするためにマイクロバイオームQTL（mbQTL）と糞便リピドームQTL（clQTL）を統合し、これらのコ・マッピング形質と関連する遠位小腸で発現する候補遺伝子を同定した。これらのデータセットは、宿主と腸内細菌との相互作用を支える分子メカニズムを解明するための貴重なリソースとなる。

研究成果
腸内細菌の特徴は宿主の遺伝学と関連している
高脂肪・高ショ糖食（HF/HS）を約22週間与えた264匹のDOマウスの糞便微生物相を解析した（Extended Data Fig.）私たちは以前、この餌が8つの創始者株においてマイクロバイオームの変化と関連する幅広い代謝反応を引き起こすことを示し、腸内細菌分類群の存在量の変動と関連する遺伝子座を同定しました28,29。ここでは、腸内細菌の機能に焦点を当て、腸内細菌形質に影響を与える宿主遺伝学の役割を検証します。メタゲノム解析の結果、全マウスにおいて、約190万個の予測される微生物オープンリーディングフレーム（すなわちメタジェン）、2803個の細菌機能（KEGGオーソログ、KOs）、187種の細菌分類が明らかになった。また、メタゲノムビニングを行い、種レベルの細菌ゲノムに相当するメタゲノム集合ゲノム（MAG）を得た（拡張データ図2、補足表1〜4、補足注1）。

次に、QTL解析により、これらの形質の存在量に関連するマウスゲノムの領域を同定した。その結果、KOについては760の関連性が検出され（オッズの対数（LOD）> 6.87, Pgenome-wide-adj < 0.2）、そのうち200はゲノム全体で有意（LOD > 7.72, Pgenome-wide-adj < 0.05）であった。 05）、細菌分類群については45の関連（LOD > 6.87, Pgenome-wide-adj < 0.2）、そのうち15はゲノムワイドで有意だった（図1a、補足表5および6）。15番染色体上の63-64 MbpにQTLホットスポットを同定した。このゲノム領域はLODスコア> 6の154の微生物形質と関連していた（補足表7）。この遺伝子座にマッピングされた形質について、最良の線形不偏予測因子としてDO創始者対立遺伝子効果を推定した。その結果、129対立遺伝子と正の相関を示すKOと分類群、および129対立遺伝子と負の相関を示すKOと分類群の2つの明確な対立遺伝子効果が検出された（Extended Data Fig.3）．以下に詳述するように、腸内細菌で最も多い2つの系統、ファーミキューテスとバクテロイデテスはこの遺伝子座にマッピングされ、対立遺伝子の影響は正反対であった。

図1: DOマウスコホートにおける微生物形質に対するQTLの遺伝的構造。
図1
a, 性、食餌日数、コホートを共変量として用いた2,803の腸内細菌KO機能形質（上段）および187の細菌分類形質（下段）に対するQTLマッピング結果。各ドットはマウスゲノム上のある形質に対するQTLを表している。破線は並べ替え検定で決定したQTLの有意閾値を表す（LOD > 9.19, Pstudy-wide-adj < 0.05; LOD > 7.72, Pgenome-wide-adj < 0.05; LOD > 6.87, Pgenome-wide-adj < 0.2). b, Chr15上の腸内細菌QTLホットスポットは、複数の細菌の胞子形成および運動機能がマッピングされている。c, Chr15上のホットスポットにマッピングされた機能に関する濃縮解析（フィッシャーの正確検定）。 d, Chr15ホットスポットにマッピングされた微生物機能に関するQTLは、129S1/SvImJ対立遺伝子効果が負であった。e, 染色体15ホットスポットにマッピングされたFirmicutesのQTLは負の129S1/SvImJアレル効果を有し、一方、この遺伝子座にマッピングされたBacteroidetesのQTLは正の129S1/SvImJアレル効果を有していた。

ソースデータ

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パスウェイ濃縮解析の結果、129対立遺伝子と最も強く関連するKO群において、細菌の「運動性タンパク質」と「細胞増殖」機能カテゴリーが有意に濃縮されていた（図1b,c）。より具体的には、14の胞子形成機能の存在量は、129対立遺伝子と負の相関があった（図1d）。さらに、すべてのMAGにおけるKOの分布を調べたところ、すべての細菌の胞子形成KOはFirmicutesに属するMAGにのみ存在し、一方、正の129対立遺伝子効果を示したKOのほとんどはBacteroidetesに属するMAGに存在していた（拡張データ図4a）。QTLマッピングから観察された対立遺伝子効果がDO創始系統の形質パターンと対応しているかどうかを評価するために、8つの創始系統の年齢をマッチさせ、同じくHF/HS食を与えたマウスの16SリボソームRNA遺伝子データを既報のとおり調査した13。これらの知見と一致するように、129系統のマウスでは、バクテロイデーテスのレベルが高く、バクテロイデーテスとファーミキューテスの比率が最も高いことがわかった（Extended Data Fig.4b）。興味深いことに、この遺伝子座にマッピングされたFirmicutes MAGの胞子形成KOの数とこれらのMAGのLODスコアの間に有意な正の相関が検出された（図1e）。重要なことは、我々のデータセットでよく検出される胞子形成KOを含まないFirmicutes MAG（例えば、Lactobacillus、Lactococcus）は、このQTLに有意な関連を示さなかったことである。これらの結果は、宿主の遺伝的変異が、胞子形成菌の存在量を調節することによって部分的に腸内コミュニティ構造に影響を与えるという考え方を支持するものである。

Chr15 QTLホットスポット内の一塩基多型（SNP）関連解析では、6つの有意なSNPが同定された：2つのイントロン変異、Gsdmc遺伝子のSNP rs582880514とGsdmc2遺伝子のSNP rs31810445、どちらもLODスコアは8.0；4つのSNPは遺伝子間変異（拡張データ図4c）であった。ガスデルミン（Gsdm）は、膜透過とパイロプトーシス30（細胞内外の病原体によって引き起こされるプログラムされた細胞死の炎症型）を引き起こす孔形成タンパク質のファミリーである31。これらの結果は、Gsdmc/Gsdmc2の宿主遺伝子の変異が腸内細菌の機能量と関連していることを示しており、これらの宿主タンパク質が運動機能や胞子形成機能を持つ細菌群の存在量を調節している可能性があるとの仮説を提示している。

糞便脂質は腸内細菌および宿主遺伝学と関連している
我々は、腸内細菌-宿主相互作用に関連する可能性のある脂質アクターをアクノスティカルに検出するために、幅広い発見戦略を採用した。液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析計（LC-MS/MS）を用いて、メタゲノム解析に用いた全マウスを含む381匹のDOマウスの糞便リピドームの特性を明らかにした。その結果、35の脂質クラス (Fig. 2a,b) と4つの主要な脂質カテゴリー (1) 脂肪酸、 (2) リン脂質、 (3) スフィンゴ脂質、 (4) グリセロ脂質からなる1,048種の脂質が同定された。最も多くの脂質が記録されたのは、哺乳類の宿主に多く存在することが知られているトリグリセリド（TG）とホスファチジルコリン（PC）のクラスであった32。DO盲腸で検出された3,384種の脂質のうち、547種（16.2%）が無菌マウスの盲腸と比較して高いレベルで検出された（倍率>10倍、調整後P < 0.05）。例えば、ホスファチジルグリセロール（PG）は、我々のデータでは2番目に大きなリン脂質クラスであり、細菌のリピドームの主要な構成要素であることが知られている33。一方、哺乳類では、PGはごくわずかな成分である。同様に、グリセロ脂質では、モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）がこのクラスで2番目に多く検出された脂質を占めている。これらの脂質は、細菌や植物には多く含まれるものの、動物組織では微量な成分に過ぎない34。これらの知見は、私たちが行った糞便リピドームの解析が、宿主および腸内細菌群の構成要素を捉えていることを示唆しています。また、MAGsと糞便脂質量の相関解析、および通常飼育マウスと無菌マウスの糞便リピドームの比較により、腸内の脂質量を調節する可能性のある分類群を同定した（拡張データ図5a、b、補足表8-10、補足注2）。さらに、QTLマッピングにより、糞便脂質の特徴に関する399の有意なQTLが同定された（LOD > 7.60, Pgenome-wide-adj < 0.05） (Fig. 2c, Supplementary Table 11 and Supplementary Note 3)。これらの関連は、マイクロバイオームの遺伝的制御の分子的な説明の可能性を示す豊富な情報を提供するものである。

図2: DOマウスにおける糞便リピドームの遺伝的構造。
図2
a, 381匹のDOマウスで合計3,384個の糞便脂質が定量され、そのうち1,048個が4つの主要なクラスからなる脂質であることが確認された。各点は糞便脂質の特徴を表す。b, 同定された脂質は35の脂質サブクラスに属し、バクテリア関連PGとMGDGが共通のサブクラスであった。 c, 3,964の糞便脂質QTL (LOD > 6, Pgenome-wide-adj < 0.2) と12のQTLホットスポットが特定された。ホットスポットは矢印で示され、対応するゲノム遺伝子座が示されている。破線は並べ替え検定で決定されたQTLの有意閾値を示す（LOD > 7.60, Pgenome-wide-adj < 0.05）。同定された脂質のうち、68.2%が合計1,162のQTLを示し（上図）、未同定の特徴の70.1%の同様の部分が2,802のQTLに寄与した（下図）。RT, リテンションタイム。脂質クラスの略称は、補足表16を参照。

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媒介解析により細菌と糞便脂質の関連を明らかにする
腸内細菌形質と糞便脂質形質の間の因果関係を明らかにするために、個々の腸内細菌メタジェンとコ・マップする脂質形質の間で調停分析を行った（Methods）。媒介解析は、QTLが2つの形質に対して別々の効果を持つのか、それとも別の形質への効果を通じて1つの形質に影響を与えるのかを判断しようとするもので、この場合、中間形質は媒介因子と呼ばれる。図3aは、糞便脂質形質に対するQTL効果を媒介する腸内細菌メタゲンを示しています。ある微生物形質が糞便脂質に影響を与える場合、そのQTLとは独立した形質であれば、共変量として含めても糞便脂質のQTLシグナルに大きな影響を与える可能性は低いだろうと考えた。しかし、糞便脂質のQTL効果を媒介する微生物形質については、元の糞便脂質QTLのLODスコアが大きく低下することが予想される。興味深いことに、我々は、微生物のメタゲノムが媒介するQTLを持つ3つの糞便脂質特徴を見出した。これらの媒介微生物形質の多くは、Akkermansia muciniphilaという細菌に属する遺伝子であった。なお、微生物形質と糞便脂質の間の因果関係の方向性は、データから直接推論することはできない。これらの結果は、A. muciniphilaレベルと腸内のこれらの脂質種の存在量は同じ遺伝子座によって調節されており、2つの形質が潜在的につながっていることを示唆している（図3b,c）。

図3: 仲介分析により、A. muciniphilaとOLの間に潜在的な因果関係があることがわかった。
図3
a, 媒介効果モデルおよびNullモデルの説明図。散布図中の各ドットは、腸内細菌メタジェン-糞便脂質フィーチャーのペアに対する媒介テストの結果を表す。x軸は、糞便脂質QTLモデルに共変量として腸内細菌メタジェンを追加したときの糞便脂質フィーチャーのQTL LODスコア低下を示し、y軸は各糞便脂質の元のQTL LODスコアである。同じy軸の値を持つドットは、個々のメタゲノムと1つの糞便脂質の特徴との媒介テストを表す。QTL LODスコアの低下が大きいものは、腸内細菌の特徴から糞便脂質の特徴への有意な媒介効果を表している。3つの未知の糞便脂質特徴と宿主ゲノムとの関連は、A. muciniphila遺伝子によって影響を受けていた。b, A. muciniphila遺伝子によって媒介された3つの脂質特徴がオルニチン脂質と同定された。a と b を結ぶ破線は、m/z 値で示される同定されたオルニチン脂質のフラグメンテーションパターンを指し、主要なフラグメントはそれぞれの化学構造とともに赤色で示されている。 c, 同定された 3 つのオルニチン脂質について、共変数として個々の A. muciniphila 遺伝子を加えた場合（仲介モデル）または共変数に A. muciniphila 以外の遺伝子を加えた場合（Nullモデル）の LOD スコア低下の分布図。d, A. muciniphila MAGs QTLと5つの遺伝子座（第1染色体、第2染色体、第7染色体、第12染色体、第15染色体）でコ・マップされた3種のオルニチン脂質QTL。LOD > 5.5 のQTLは赤でハイライトされている。

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さらに、これらの糞便脂質とA. muciniphilaが同じ遺伝子座にマッピングされているかどうかを検証した。A. muciniphilaのMAG46個を宿主ゲノムにマッピングしたところ、Chr1: 92.9 Mbp, Chr2: 79.4 Mbp, Chr7: 129.8 Mbp, Chr12: 59.4 Mbp, Chr15: 75.9 Mbpなどの複数のQTLが見つかった（図3d）。興味深いことに、3つの糞便脂質も同じ遺伝子座にQTLを示し、同様の創始者対立遺伝子効果パターンを示した(Fig. 3e)。これらのA. muciniphilaの存在量に対する創始者対立遺伝子効果は、DO創始者株における腸内細菌量に関する以前の研究13と一致するものであった。これらの脂質の特徴は、当初、我々のリピドミクス解析パイプラインでは同定されなかったが、互いに密接に関連していると思われた。さらに、フラグメンテーションスペクトルを解析した結果、これらの未同定の特徴はオルニチン脂質（OL）であることが示唆された（図3bおよび補足説明4）。このことは、合成OLを用いて確認された（下記参照）。この3つの特徴は、OL 30:0, OL 31:0, OL 32:0 の合計組成を持ち、[M+H]+イオンとして検出される。OLでは、3-ヒドロキシ脂肪酸が、ヘッドグループとして機能するオルニチンアミノ酸にアミド結合を介して接続されている。その後、第二の脂肪酸がエステル結合で第一の脂肪酸に連結される35。OLは、特定のグラム陰性菌の外膜に存在する細菌特異的な非リン型糖脂質である36,37。

A. muciniphilaは、マウスやヒトの腸内でOLを産生する。
A. muciniphilaは、宿主の代謝的健康に多くの有益な効果をもたらすとされるグラム陰性菌である38,39。これまでの研究で、OLは微生物と宿主の相互作用に重要であることが示唆されているが25,40、腸内細菌におけるこれらの脂質の出現は知られていなかった。A. muciniphila が OL を産生するかどうかを調べるため、まず A. muciniphila と他の 2 種類のグラム陰性菌 Bacteroides thetaiotaomicron および Escherichia coli を嫌気的条件下で培養して脂質をプロファイリングしました。その結果、A. muciniphilaの抽出物には、対象となる3種のOLがすべて同様に高レベルで含まれていたが、他の種では溶媒ブランクと区別がつかなかった（Fig.4a）。リン酸塩の制限は、いくつかの細菌種で OL の生産を誘発するため25 、追跡実験では、リン酸塩レベルが試験管内で増殖した A. muciniphila の OL 量を調節しているかどうかを調べた。0.02 mM（成長限界）、0.2 mM（適切）、2 mM（過剰）の 3 種類のリン酸濃度を検討した結果、0.02 mM のリン酸濃度が OL の生成に影響を与えることがわかった。LC-MS/MS 分析により、A. muciniphila 細胞抽出物には、培地に含まれるリン酸レベルに関係なく、OL が主要な脂質種として検出された（Extended Data Fig.6a, b）。さらに、試験管内で生育した A. muciniphila から分離した細胞外小胞にも OL が検出された (Extended Data Fig. 6c and Supplementary Note 6)。これらの結果は、OL が A. muciniphila の外膜に局在している可能性を示唆し、これらの脂質が宿主とどのように相互作用するのかについての洞察を与えてくれるものである。

図4：A. muciniphilaは、マウスとヒトの腸内でOLを産生する。
図4
a, A. muciniphila (A. m), B. thetalotamicron (B. t) および E. coli (E. c) を試験管内で培養して採取した細胞ペレットからマウスで検出した主要3種のOL量 (n = 3 生物学的独立サンプル/生物) b, Gnotobiotic マウスに A. muciniphila, B. thetalotamicron, E. coliを定着させ糞便内容物で検出した OL 量。c, ヒトの糞便サンプルにおける顕著なOL種の検出は、A. muciniphilaの存在量と両側スピアマン相関により有意な相関がある（n = 16人の独立した糞便サンプル）。箱ひげ図は、四分位範囲、中央値、四分位範囲の1.5倍以内の点の広がりを示し、ひげ図の端を超えたデータは個別にプロットされている。治療群間の統計的差は、対応のない両側Welchのt-検定で検定した。

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さらに、無菌マウスの腸内にコロニー形成したA. muciniphilaが産生する脂質のプロファイリングを行った。成体無菌B6マウスを5群に分け、上記の各菌種を単独で、大腸菌とA. muciniphilaの2種でコロニー形成させ、または無菌状態にした（各群n = 3-5）。マウスは接種後2週間、DO試験で用いたのと同じHF/HS飼料で維持した。これらのマウスの糞便をLC-MS/MSで分析したところ、A. muciniphilaが定着したマウスだけが、盲腸内に検出可能なレベルのOLを有していた（Fig.4b）。これらの結果から、A. muciniphilaの腸内コロニー形成とOL濃度の高さに因果関係があることが確認された。

我々は、A. muciniphila のコロニー形成が、ヒトの腸内における OL の存在と関連しているかどうかを検討した。我々は、A. muciniphilaの相対的な存在量が幅広い範囲（検出不能〜39.8%）に及ぶ、以前に特徴付けられた高齢者のコホート41の糞便サンプルのサブセットの脂質含有量を分析した。これらのヒトの糞便サンプルのLC-MS/MS分析では、A. muciniphilaでコロニー形成した軸索培養やマウスよりも広範囲のOL種が検出されたが、以前に特定された3つのOL 15:0_15:0, OL 16:0_15:0, OL 17:0_15:0 のレベルはすべてA. muciniphilaレベルと著しく相関した（図4c）。これらの結果は、A. muciniphila がマウスおよびヒトの腸管における OL の主要な産生者であることを示唆している。

OL はリポポリサッカライド（LPS）誘発のサイトカイン応答を調節する
A. muciniphila 由来の OL が宿主に免疫応答を引き起こすかどうかを調べるために、まず DO マウス腸内で最も多く検出される OL、すなわち OL_15:0_15:0 を化学的に合成した。A. muciniphilaの宿主に対する有益な作用は、ヒトとマウスの両方の研究で既に報告されており、OLとLPS由来のリピドAの構造が似ていることから、OLはリピドAのアンタゴニストとして機能すると推測された。LPSで処理すると、B6および129マウスから得たBMDMによるTNF-αおよびIL-6の産生が有意に増加した（Extended Data Fig.7a）。一方、OL調製物を処理しても、500 ng ml-1および1,000 ng ml-1でわずかに増加した以外は、これらの細胞によるTNF-αおよびIL-6の有意な産生を刺激しなかった（Extended Data Fig.7b）。しかし、OLでマクロファージを前処理すると、B6および129マウスの両方で、細胞生存率に大きな変化をもたらすことなく、LPS誘発TNF-αおよびIL-6の抑制効果があることが観察された（Extended Data Fig.7c，d）。これらの結果は、A. muciniphila 由来の OL が LPS 誘発炎症反応を予防できることを示唆している。さらに、LPS処理したBMDMから分泌される他のサイトカインを測定したところ、BMDMの遺伝子背景の機能として、LPSとOLに対する応答に違いはあるものの、OL製剤はIL-1β、MCP-1、MIP-1α、GM-CSF、IL-12およびRANTESの生成を抑制した（Fig. 5）。さらに、OLはこれらの細胞で抗炎症サイトカインIL-10のレベルを増加させた（図5）。これは、OLが炎症性サイトカインと抗炎症サイトカインの両方のレベルを変化させることによって炎症を調節している可能性があることを示唆している。興味深いことに、LPS存在下でのIL-12の産生は、129マウスではB6マウスの10倍以上であり、OLはこれらのマウスでより大きな抑制効果を示した（Fig.5）。これらの結果は、A. muciniphila 由来の OL が宿主の自然免疫反応に影響を与え、その効果は宿主の遺伝子の機能として変化する可能性があることを示している。

図5：OLはLPSによるBMDMからのサイトカイン産生を調節する。
図5
LPS（10 ng ml-1）と異なる濃度のOLで刺激したB6および129マウスBMDMからの上清中に検出されたIL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、MCP-1、MIP-1α、GM-CSFおよびRANTESのレベル。箱ひげ図は、四分位範囲、中央値、四分位範囲の1.5倍以内の点の広がりを示し、ひげ図の端を超えたデータは個別にプロットしている。

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腸内遺伝子はA. muciniphilaとOL QTLとコ・マップしている
小腸の遺伝子発現制御マップを作成し、腸内細菌叢と関連する重複SNPを同定することを目指した。細菌分類群／遺伝子／脂質と発現が共通する遺伝子を同定することは、各遺伝子座における候補遺伝子を絞り込むだけでなく、微生物-宿主相互作用の根底にある生物学への貴重な洞察をもたらすと推論される。さらに、発現QTL（eQTL）マッピングが遺伝的多型と複雑な形質を結びつける力を持つことは、他の研究者によっても十分に立証されている42,43。我々は、RNA-seqを用いて234匹のDOマウスの遠位小腸における転写産物レベルをプロファイリングした。その結果、DOマウスの少なくとも10％において、10カウント/ミリオン（CPM）以上の転写産物が8,137件検出されました。平均LODスコアが21.2の4,462の局所eQTLと平均LODスコアが7.1の10,894の遠位eQTLを同定した（Supplement Table 12）。eQTLのアレル効果をco-mappingしたmbQTLとclQTLのアレル効果と比較することで、腸内転写産物と共制御される可能性のある腸内微生物の特徴や糞便脂質を同定した（拡張データ図8および補足注7）。

A. muciniphilaとOLの5つのco-mapping QTL領域（Chr1, Chr2, Chr7, Chr12, Chr15）について、eQTLデータを用いて、注目する宿主候補遺伝子の支持区間を検索した。co-mappingしたeQTLとA. muciniphila/OL QTLの対立遺伝子効果を比較することにより、eQTLの対立遺伝子効果がA. muciniphila/OL と相関している宿主候補遺伝子をいくつか見出した（図6、拡張データ図9、補足表13）。(1) 遺伝子活性化転写因子3（ATF3）はChr1: 92.96 Mbpに遠位eQTLを有し、QTL LODスコアは6.55であった。ATF3は、toll-like receptor 444の活性化によって誘導される炎症性サイトカインの転写を負に制御することによって、宿主免疫応答事象において重要な役割を果たす。(2) TRAF-interacting protein with a forkhead-associated domain (Tifa) という遺伝子は、Chr1: 90.95 Mbp に LOD スコア 6.19 の遠位 eQTL を有していた。TIFAは、LPS合成の中間体である細菌由来のヘプトース-1,7-ビスホスフェートを細胞質監視経路で感知し、NF-kB応答を引き起こすことが報告されている45,46。さらに、TIFAはTRAF6と相互作用し、宿主の自然免疫応答を媒介する。(Jumonji domain-containing protein 8 (Jmjd8) という遺伝子は、Chr1: 92.14 Mbp に遠距離 eQTL を持ち、LOD スコアは 6.72 であった。JMJD8 は TNF 誘導 NF-kB シグナルのポジティブレギュレーターとして機能する47。最近の研究では、JMJD8はLPSを介した炎症と脂肪細胞におけるインスリン抵抗性に必要であることが示されている48。(4) 遺伝子 Gcg は Chr1: 92.36 Mbp に遠位 eQTL を有し、LOD スコアは 7.11 であった。Gcg はグルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）を含む複数のペプチドをコードしている。GLP-1レベルはエンドトキシン、IL-1β、IL-649など様々な炎症性刺激によって誘導される。A. muciniphilaとChr1上のOL QTLと共マップする遠位eQTLを持つこれらの遺伝子は、LPSなどの微生物関連分子パターン（MAMPs）に対する宿主免疫応答に関与しているということは、これらの遺伝子発現がOLに対する宿主応答の制御に寄与している、あるいはA. muciniphilaの生息量を調節している可能性を示唆している。

図6：1番染色体に存在するA. muciniphilaと大腸OLと共マップする遠位小腸（回腸）遺伝子のeQTL。
図6
a, A. muciniphila, caecal OLのQTLとTifa, Atf3, Jmjd8, GcgのeQTLがChr1: 90-95 Mbpにco-mapされている。b, Tifa, Atf3, Jmjd8, Gcg遺伝子のeQTLとA. muciniphila/OL QTLの間の対立遺伝子効果のスピアマン相関.

出典データ

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A. muciniphilaとAtf3の関連性の解明
A. muciniphila/OL QTLとAtf3遺伝子eQTLのco-mappingは、ATF3がこれらの形質の存在量に影響を与えることで説明できるかどうかを調べた。そこで、野生型（WT）マウスとAtf3遺伝子欠損マウスにHF/HS食を4週間摂取させ、この分類群の存在量を測定した。その結果、Atf3-/-マウスとWTマウスの糞便中のA. muciniphilaは同程度の量であった。Atf3-/-マウスの糞便中のA. muciniphilaの量は野生型と比較して約15%少なかったが（各遺伝子型につきn = 7）、その差は有意ではなかった（Extended Data Fig.10a）。これらの結果から、Atf3はA. muciniphilaの体力に大きな役割を担っていないことが示唆された。また、Atf3は他の因子と複合的に作用している可能性があり、これは腸内細菌A. muciniphilaの豊度が多系統形質であるという観測と一致する。

また、A. muciniphilaとOLがAtf3の発現を調節している可能性も考えられる。この考えを検証するために、LPSまたはOL調製物とLPSの組み合わせで刺激したB6と129のBMDMの発現プロファイルを評価した。DESeq2解析により、OLで処理したB6マウス由来の細胞では、674個の遺伝子が差次的に発現していた（420個の遺伝子がアップレギュレート、254個の遺伝子がダウンレギュレート）のに対し、129マウス由来のBMDMでは384個の遺伝子がOLによって影響を受けた（304個の遺伝子がアップレート、80個の遺伝子がダウンレギュレート）ことが確認されました。上述したいくつかのサイトカインの遺伝子発現の違い（Extended Data Fig. 10b）は遺伝子型間で一致していたが、遺伝子型間で差次的に発現する遺伝子の全体の重複は比較的低く（Extended Data Fig. 10c）、OLに対する応答は遺伝子型によって大きく異なる（Extended Data Fig. 10e）ことが確認された。上述のように、ATF3はTLR4シグナルのネガティブレギュレーターである。我々は、B6および129のBMDMの両方について、OLがATF3の発現を上昇させることを観察した（Extended Data 図10d）。さらに、以前の研究50では、BMDM（B6バックグラウンド）においてATF3によってダウンレギュレートされる30個の遺伝子が同定された。この結果と一致するように、我々は、B6マウス由来のBMDMにおいて、OLがこれらの遺伝子の発現を低下させることを見出した。一方、129マウス由来のBMDMでは、これら30遺伝子のうち18遺伝子がOLによって発現が上昇することを見出した（Extended Data Fig.）これらの結果は、A. muciniphila/OL QTLとAtf3 eQTLのコ・マッピングは、OLがAtf3遺伝子発現に及ぼす影響によって説明できること、この遺伝子の発現増加は、宿主遺伝子型の機能として異なるプログラムを引き起こし、免疫と代謝反応に異なる影響を与える可能性があることを示している。

以上のことから、A. muciniphilaは遠腸において大腸菌の主要な生産者であり、A. muciniphilaが生産するOLはAtf3発現を上昇させることにより宿主のLPS誘発炎症を負に制御するという考え方が支持された。

考察
我々は、システム遺伝学的アプローチにより、腸内細菌、そのコード化された機能、糞便脂質および宿主の腸内遺伝子発現の関係を明らかにした。その結果、A. muciniphilaという細菌が免疫活性を持つOLを産生し、それがヒトやマウスにコロニー形成された糞便から検出されることを見出した。A. muciniphilaは、これまでにマウスとヒトの両方で、いくつかの遺伝子座における宿主の遺伝的変異と関連していた。しかし、マイクロバイオーム組成の主要な決定因子として知られている食事を含む環境条件は、これらの研究間で大きく異なっている。本研究で報告された関連性は、異なる食餌を用いた他のマウス研究でこれまでに報告された関連性とは異なるものである12,51。また、同じコホートのDOマウスについて、以前に発表された代謝形質に対して腸内マイクロバイオーム形質がメディエーターとして働くかどうかを調べた53。しかし、おそらく複雑な代謝形質に対する腸内マイクロバイオームの影響を推測するための本研究の統計的検出力が限られているため、有意なメディエーターは検出されなかった。

以前の研究では、一部のグラム陰性菌がリン酸塩制限条件下でOLを産生することが示唆されていた54,55,56。一方、我々は、OLレベルが100倍のリン酸レベルの範囲で一貫して高いことを確認し、リン酸がA. muciniphilaにおけるOL合成の主要なドライバーではないことを示唆した。注目すべきは、最近の研究で、細菌病原体Pseudomonas aeruginosaによるOL生産の増加は、その細胞表面をより疎水性にし、病原性の低下と抗菌剤および宿主免疫防御への高い耐性をもたらすことが示されたことである25。A. muciniphilaは、宿主上皮に近接した粘液層に存在する宿主の糖鎖を消費する。ムチンの糖鎖やアミノ酸はA. muciniphilaの基質となる一方で、この層には、下層の粘膜上皮細胞への微生物の侵入を防ぐための可溶性の宿主防御分子も封じ込められている。我々は、膜OLがA. muciniphilaの腸内環境との相互作用に影響を与え、そのニッチに重要な適応を示し、宿主との相互作用に重要である可能性を推測している。これらの仮説を検証するためには、A. muciniphilaを遺伝的に操作するツールの開発が必要である。

私たちや他の研究者が観察したLPS誘発サイトカインに対するOLの抑制効果57,58は、A. muciniphilaが宿主の生理機能に与える影響の重要な側面を表していると思われる。これまでの研究で、TLR4 を介した LPS シグナルを阻害する天然分子と合成分子が同定されており、これらは敗血症性ショックを予防し、生体内で抗炎症および抗神経痛活性を有する59。CD14を標的とするLPSアンタゴニスト分子の一群は、A. muciniphila OLと、2本の疎水性鎖に結合したグルコースユニットやC-660上の塩基性窒素などの構造的特徴を共有しており、OLが抗炎症作用を持つ可能性を裏付けている。OL が LPS シグナルを抑制する正確なメカニズムは不明であるが、我々の研究は A. muciniphila 由来の OL が炎症反応を調節する可能性を示唆するものであった。

また、A. muciniphila は、宿主の自然免疫系遺伝子である Atf3、Tifa、Jmjd8 を共同制御していることが明らかとなった。Tifaは、129株およびB6株における大腸炎感受性の重要な遺伝的決定因子である「サイトカイン依存性大腸炎感受性遺伝子座」（Cdcs1）領域に位置している61。TIFA は、TRAF タンパク質の制御を通じて自然免疫シグナルを調節し、NF-κB の活性化および炎症につながる重要な因子である。TIFA 依存的なグラム陰性菌に対する免疫の重要性45 と、129 株と B6 株の LPS 処理した BMDM に対する OL の効果の差を考慮すると、この遺伝子は A. muciniphila-OL- ホスト相互作用におけるキープレイヤーである可能性が示唆された。これまでの研究で、ATF3 はマクロファージにおける TLR4 や CCL4 の発現を抑制することで炎症反応を調節することが示唆されており44,62 、ATF3 を介した腸のホメオスタシスにおける微生物相の重要な役割が明らかにされている63。これらの研究は、ATF3がIl6とIl12の遺伝子発現レベルを負に制御していることを示した44。これと同様に、我々は、LPS処理したBMDMにおいてOLがこれらのサイトカインに負の影響を与え、その量はATF3発現に影響を与える同じ遺伝子座に関連していることを見出した。また、これまでの研究で、ATF3が宿主の抗菌ペプチド発現を正に制御することが示され64、OLの産生が緑膿菌を疎水化し、カチオン性抗菌ペプチドに対する抵抗性を高めることが示唆されている25。しかし、Atf3-/-マウスとWTマウスでは、A. muciniphilaと抗菌ペプチド発現のco-mappingや、A. muciniphilaのコロニー形成レベルの顕著な差は観察されていない。このことから、A. muciniphilaとAtf3は、（1）A. muciniphilaが腸内でOLを大量に生産していること、（2）OLがこの重要な制御因子の発現を上昇させることが示唆され、説明することができる。これらの分子メカニズムについてはさらなる研究が必要であるが、これらの結果は、A. muciniphilaとOLレベルが宿主の免疫防御システムの中心的な役割を担っていることを示唆しており、腸内細菌、特にA. muciniphilaに対する応答の決定要因として、宿主遺伝学が重要な役割を担っていることを支持するものである。

以上のように、本研究では、ヒトおよびマウスの腸内におけるOLとA. muciniphilaの存在を結びつけ、これらの脂質がA. muciniphilaと宿主の相互作用におけるキープレイヤーであることを示唆するものであった。本研究は、宿主の遺伝子が腸内細菌叢に及ぼす影響のメディエーターとして、細菌の機能と脂質の重要性を浮き彫りにするものである。

研究方法
動物実験
動物の飼育と研究プロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン校（UW-Madison）の農業生命科学部のAAALAC認定Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を受けた。マウスを用いたすべての実験は、UW-Madison Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコルに基づいて行われた（DOマウスのプロトコル番号A005821、gnotobioticおよびAtf3 KOマウスのプロトコル番号M00559）。

DOマウスモデル
DOマウスはJackson Laboratoryから4週齢で入手し、UW-MadisonのDepartment of Biochemistry vivariumで維持した。DOマウスは100匹ずつの波で、それぞれ同数の雄と雌が割り当てられた。すべてのマウスは、温度（22.2℃）と湿度（60%）を制御した環境下で、12時間の明暗サイクル（6時に点灯、18時に消灯）で維持された。すべてのマウスにHF/HS飼料（TD.08811、Envigo Teklad、脂肪44.6% kcal、炭水化物34%およびタンパク質17.3%）を与え、施設到着後は滅菌水をアドリビタブルで投与した。マウスは同じビバリウム室で飼育され、餌の摂取量を監視し、共食いによる交差接種を防ぐために個体別に収容された。DOマウスは22-25週齢で死亡させた。糞便サンプルは、4時間の絶食後、安楽死の直前に採取した。糞便およびその他の組織は、殺処分後速やかに採取し、すべての試料を直ちに液体窒素で瞬間凍結し、さらに処理するまでは-80℃で保存した。これらのマウスを用いた他の研究も発表されている13,53,65,66.

グノトビオティック研究
C57BL/6J無菌マウスは、UW-Madisonのgnotobiotic mouse facilityで繁殖・飼育した。オルニチン脂質の試験には雄マウスを使用した。すべてのマウスは、制御された環境（22.2℃、湿度60%）で、プラスチック製フレキシブルフィルムのgnotobioticアイソレーターにて、標準的なチャウ食（LabDiet 5021）で12時間の明暗サイクル（6時に点灯、18時に消灯）の厳密な下で維持された。8週齢で、マウスをEnvigo Teklad (TD.08811) の西洋式HF/HS食 (脂肪44.6%、炭水化物34%、タンパク質17.3%) に切り替え、200μlの細菌培養物を経口摂取させた。コロニー形成から2週間後にマウスを安楽死させ、糞便内容物を採取した。

DO創始者マウス
C57BL6J (B6) および 129S1/SvImJ (129) 雄マウス（5週齢）をジャクソン研究所から入手した。すべてのマウスは、厳密な12時間の明暗サイクル（6:00に点灯、18:00に消灯）下で制御された環境（22.2℃、60％の湿度）で維持された。すべてのマウスに標準的なチャウ食（LabDiet 5021）を与え、滅菌水を1週間アドリビタットで摂取させた。6週齢ですべてのマウスを安楽死させ、骨髄細胞を採取した。

Atf3マウスの研究
Atf3ヘテロ接合体マウス（B6.129X1-Atf3tm1Dron/HaiMmnc）は、ノースカロライナ大学のミュータントマウスリソースおよびリサーチセンターから入手した。Atf3欠損全身ノックアウトマウス（Atf3-/-）とWTマウスの年齢と性を一致させた同腹子を、Atf3ヘテロ接合体マウスの交配により作製した。マウスは12時間の明暗サイクル（6時点灯、18時消灯）、22.2℃、湿度60％の厳密な環境下で維持された。動物にはHF/HS飼料（TD.08811, Envigo Teklad, 44.6% kcal fat, 34% carbohydrate and 17.3% protein）を与え、離乳後は滅菌水を自由摂取させた。糞便サンプルは7週齢で採取した。

メタゲノムショットガンDNA配列決定
糞便DNAは、DOマウスから採取した個々のペレットから、以前に記載された方法28,67で抽出した。DNA抽出後、イルミナペアエンド（PE）ライブラリーを、既述のプロトコル68を用いて構築し、ゲルで長さ〜450 bpのDNA断片を選択するように変更した。PEリード（2×125）は、MiSeqおよびHiSeq 2500プラットフォームの組み合わせで作成しました。

メタゲノム解析リードの処理
Fastx Toolkit（v0.0.13）を用いて、以下のように前処理を行った。(1) 生サンプルのデマルチプレックスには、fastx_barcode_splitter. (2)1つのサンプルに対して複数の順方向および逆方向リードファイルが存在する場合（複数のレーン、複数のプラットフォーム、複数の時間で実行されたため）、リードファイルを1つの順方向および逆方向リードファイルに連結した (3) バーコードをトリミングしてリードを形成した (fastx_trimmer -f 9 -Q 33) (4) リードをトリミングして低質配列を除いた (fastq_quality_trimmer -t 20 -l 30 -Q33)。トリミング後、カスタムPythonスクリプトを用いて、対になっていないリードを解析から除外した。宿主配列を同定・除去するために、bowtie269 (v2.3.4) を用いてマウスゲノム (mm10/GRCm38) に対してリードをデフォルト設定でアライメントし、マウスゲノムとアライメントしなかった微生物DNAリードはsammools (v1.3) (samtools view -b -f 4 -f 8) を用いて同定した。

メタゲノムde novoアセンブリと遺伝子予測
低品質な配列や宿主の汚染DNA配列を除去した後、各メタゲノムサンプルは、metaSPAdes70 (v3.11.1) を用いて、複数のk-merサイズを持つ長いDNA断片（コンティグ）にde novoアセンブルした (metaspades.py -k 21、33、55、77)。500 bp未満のコンティグは処理から除外された。オープンリーディングフレーム（ORF）（すなわち、微生物遺伝子、メタジェンとも呼ばれる）は、Prodigal71（v2.6.3）により、デフォルトパラメータで隠れマルコフモデル（HMM）を用いて、アセンブルしたコンティグから予測されたもの。予測された遺伝子のうち、100bp未満のものは以降の処理から除外した。冗長な遺伝子を取り除くために、すべての予測されたORFは、CD-HIT72 (v4.6.8) を介して、短いORFの長さの90%以上のヌクレオチドレベルで95%の同一性の基準を使用して、ペアワイズで比較された。各CD-HITクラスタにおいて、最も長いORFが代表として選ばれた。この最終的な非冗長（NR）微生物遺伝子セットをDO腸内細菌叢NR遺伝子カタログと定義した。

メタゲノムアノテーション
遺伝子分類学的アノテーションは、DIAMOND73（v0.9.23）を用いて、デフォルトのカットオフ：E値＜1×10-3およびビットスコア＞50を用いてDO腸内細菌叢NR遺伝子カタログの遺伝子とNCBI NRデータベース（2018年12月21日ダウンロード）の位置合わせを行うことにより実施した。分類学上の割り当ては、DIAMONDコマンドの「-taxonmap prot.accession2taxid.gz-taxonnodes nodes.dmp」パラメータを使用し、複数のアラインメントがある場合は最低共通祖先（LCA）アルゴリズムで決定した。遺伝子機能アノテーションは、KEGGサーバー（https://www.kegg.jp/ghostkoala/）経由でKEGG orthology and links annotation（KOALA）法を用い、原核生物属パンゲノム2,698,820を参照として行った。K-number割り当てのためのビットスコアのカットオフは60であった。

マイクロバイオーム形質定量
Bowtie2 (v2.3.4) とデフォルトパラメータを用いて、各サンプルのクリーンPEリードとDO gut microbiome NR gene catalogueをアライメントすることにより、微生物遺伝子の定量を行った。RSEM74 (v1.3.1)を用いて、微生物遺伝子の存在量を推定した。微生物遺伝子CPMの相対的な存在量は、微生物遺伝子の期待数を遺伝子有効長で割った後、総和で正規化することで算出した。分類学的解析は、注釈付きメタゲンの大部分を占めるバクテリアに焦点を当てました。その結果、1,927,034個のメタゲノムが検出され、そのうち1,636,209個がバクテリア、195個が古細菌、17,372個が真核生物、946個がウイルスとして注釈されました。また、分類されていない遺伝子は272,312個ありました。微生物機能のアバンダンス情報を得るために、同じ KO アノテーションを持つ遺伝子の CPM を合算した。一つの遺伝子に複数の KO アノテーションがある場合は、すべての KO アノテーションを使用した。分類学的アバンダンスは、NCBI分類群アノテーションが同じ遺伝子のCPMを、門、目、クラス、科、属レベルで、1分類群あたり10遺伝子以上、合計した。

MAGsの再構築
細菌ゲノムを再構成するために、コンティグの5mer頻度とコンティグカバレッジの2つの縮小された次元の特徴を用いて、密度ベースアルゴリズムDBSCANでアセンブルコンティグをクラスタリングしました。このビニング処理は、パイプラインAutometa75 (docker image: ijmiller2/autometa:docker_patch) によって行われ、メタゲノム配列から分類学的に異なる微生物ゲノムのデコンボリューションを可能にしました。再構成されたメタゲノムの品質は CheckM76 (v1.1.3) を用いて評価した。高品質の MAG を割り当てるには、ゲノムの完全性が 90% 以上、ゲノムの汚染が 5% 未満であることが必要であった。MAGsの定量は、各サンプルのクリーンなPEリードをすべて同じサンプルのMAGsとアライメントすることにより行った。ゲノムカバレッジは、bedtools (v2.29.2) の 'genomecov' コマンドを使用して計算し、その後、すべてのサンプルでライブラリサイズによる正規化を行った。さらに冗長なMAGを取り除くため、Mashソフトウェア77（v2.2）を用いて、全ゲノム塩基類似度推定（ペアワイズ平均塩基同一性（ANI））に基づき、90％のANIで高品質MAGをクラスター化した。また、高品質のMAGから、各MAGから予測されるORFをKEGGデータベースに対してアノテーションし、異なる分類群間でコードされている機能ポテンシャルを比較した。A. muciniphilaのMAG IDは補足表14に含まれている。

糞便リピドミクス解析のためのサンプル調製
糞便内容物（30 ± 7.5 mg）と10 μl SPLASH Lipidomix内部標準混合物を金属ビーズ付きチューブに分注し、270 μlメタノール（MeOH）を加えてタンパク質を沈殿させた。コントロールサンプルは、各バッチで抽出したビーズビート結合DO創始者株盲腸（NZO、PWK、NOD、B6、129、AJ）30 ± 7.5 mgで構成された。各チューブに、抽出溶媒として900μlのメチルtert-ブチルエーテル（MTBE）および225μlの水を加えた。すべての工程を4℃の氷上で行った。混合物を25 Hzで8分間、ビーズビートによりホモジナイズした。最後に、混合物を4℃で11,000×gで8分間遠心分離し、その後、親油性上層240μlをガラスバイアルに移し、真空遠心分離器で60分間乾燥させた。

乾燥した親油性抽出物を、サンプル中の水分含量の変化を考慮して、10 mg 乾燥重量あたり 200 μl の MeOH:Tluene (9:1 v/v) に再懸濁した（最小値は 100 μl）。乾燥重量は、すべての固体部分を含む残りの混合物を乾燥させることによって決定された。

DOマウス糞便サンプルのLC-MS/MS分析
LC-MS/MSによるサンプル分析は、Ultimate 3000 RSLCバイナリポンプ（流速400μl min-1; Thermo Fisher）または検証実験用のVanquishバイナリポンプを用いて、50℃に保持したAcquity CSH C18 column（2.1 mm × 100 mm × 1.7 μm particle diameter; Waters）でランダムオーダーで実施した。移動相Aは、250 μl l-1酢酸を含むアセトニトリル/H2O (70:30 v/v)中の10 mM酢酸アンモニウムから構成されていました。移動相Bは、同じ添加物を含むイソプロパノール/アセトニトリル（90:10 v/v）中の10 mM酢酸アンモニウムから構成されていた。移動相Bは、最初2分間2%で保持し、3分間で30%に増加し、さらに1分間で50%、14分間で85%に増加し、1分間で95%に増加し、7分間保持した。次の注入の前に、カラムを2分間再平衡化した。

DO脂質抽出物（20μl）を、HESI II加熱エレクトロスプレーイオン化（ESI）源によってQ Exactive Focus質量分析計に結合したUltimate 3000 RSLCオートサンプラー（Thermo Fisher）により注入した。ソースとインレットキャピラリーは共に300 °Cに保たれました。シースガスは25ユニット、補助ガスは10ユニット、スプレー電圧はそれぞれ5,000 V (+) と4,000 V (-) に設定された。MSは極性切替モードで動作し、同一分離中にポジティブモードMS1とネガティブモードMS2のスペクトル(Top2)を取得した。MSの取得パラメータは、分解能17,500、MS1スキャンでは1×106、MS2スキャンでは1×105のAGCターゲット、MS1およびMS2のイオン蓄積時間100 ms、MS1のスキャン範囲は200〜1,600 Th、MS2のスキャン範囲は200〜2,000 Th、フラグメントの分離幅1 Th、ステップHCD衝突エネルギー（20、30、40ユニット）、アンダーフィル比率1.0%、ダイナミック排除10sとした。

QTLマッピング
遺伝的QTLマッピングは、R/qtl2 (v0.24) パッケージ78 を用いて行い、ランダム効果、すなわち血縁効果による全体的な遺伝的関係の考慮を含む線形混合効果モデルを当てはめた。QTLマッピング力を低下させることなく集団構造を考慮するLOCO（leave one chromosome out）法を使用した。各腸内細菌形質および糞便リピドーム形質について、性別、食餌日数およびマウスコホート（wave）を、前述13と同様に加法的共変量として使用した。腸内細菌形質および糞便リピドーム形質については、正規化した存在量／カバレッジを正規分位数に変換した。報告されたマッピング統計量は、log10尤度比（LODスコア）であった。QTL支持区間は95％ベイズ信頼区間を用いて定義した78。QTLの有意性閾値は並べ替え解析により決定した（n = 1,000）。我々は、2,803の腸内マイクロバイオーム機能形質、197の腸内マイクロバイオームタクソン形質、3,384の糞便脂質特徴形質をQTLマッピングに含めた。報告されたゲノムワイドP値は、初期解析でQTLを過度に宣言することを避けるため、複数の表現型について調整されていない。有意なQTLはゲノムワイドP < 0.05を用い、一致するQTLマッピングとホットスポットを見つけるためにゲノムワイドP < 0.2を使用した。

媒介解析
媒介解析は、以前に記述したように実施された79。媒介解析は、サンプルの20％において少なくとも10のCPMを有する136,200の同定されたメタゲンすべてを、3,963のすべての糞便脂質特徴に走査することにより、個々の腸内細菌メタゲンと脂質特徴を関連付けるために使用された。腸内メタゲノムと糞便脂質データの両方が利用可能な動物のサブセットを使用した（n = 221）。まず、示唆的QTLを持つ腸内細菌形質を結果変数として定義し、次に示唆的mbQTLマッピングモデルに加法的共変量として糞便脂質メディエーター候補を含め、QTL解析を再実行した。同じ解析を、糞便脂質の特徴をアウトカムとし、腸内微生物の特徴をメディエーター候補として行った。仲介的な役割は、元のアウトカムQTLからLODスコアが有意に減少することで支持された。腸内細菌のメタ遺伝子メディエーター候補のLODスコア低下の有意性は、LODスコア低下でスケーリングしたzスコアで推定し、保守的なzスコア≦-6を原因メディエーター候補として記録した。ある腸内細菌分類群、例えばA. muciniphila腸内の全メタジェンについてフィットした分布の平均を対応するz-スコアにスケーリングし、この腸内細菌分類群についての媒介意義が評価された。

細菌培養と細菌細胞外小胞の単離
A. muciniphilaは、定義された培地で嫌気的に増殖させた（補足表15）。リン酸塩条件の影響を調べるため、培地中のリン酸塩濃度を0.02、0.2、2mMに調整した。大腸菌MS200-1株は、LC培地（10 g l-1 バクトトリプトン、5 g l-1 バクトイーストエキス、5 g l-1 NaCl）中で増殖させた。B. thetaiotaomicron株VPI-5482はCMM培地で培養した。すべての細菌株は37℃で培養した。3菌株の脂質分析用細胞は、遠心分離により得た。A. muciniphilaの細胞外小胞の単離は、既報の方法を用いた80。

ヒト糞便サンプル
便サンプルは、以前の研究41から入手した。サンプルは、Wisconsin Longitudinal Studyの参加者から収集された。簡単に言えば、参加者は便サンプルを無菌容器に直接採取し、その後、サンプルは処理研究所に到着するまで（48時間以内）〜4℃で保管された。到着後、滅菌ストローに糞便を充填し、既報の通り-80℃で保存した41。これらのサンプルの16S rRNA遺伝子配列決定データは、以前に発表されている。Wisconsin Longitudinal Studyの糞便サンプルの使用は、UW-MadisonのInstitutional Review Boardによって承認された。参加者の同意は、訓練を受けたインタビュアーによる口頭と書面の両方を含むプロセスによって得られ、記録は UW-Madison でデジタルおよび物理的に保存された。この取り組みには、脆弱な人々や未成年者からのサンプル収集は含まれていない。

OL 検証実験のためのサンプル調製
糞便内容物は、30 ± 6 mg を金属ビーズ付きチューブに分注し、280 μl の MeOH を加えてタンパク質を沈殿させた。各チューブに、抽出溶媒として900μlのMTBEと225μlの水を加えた。すべてのステップは、4 ℃の氷上で行った。混合物を25Hzで8分間ビーズビートしてホモジナイズした。細菌培養の場合、〜75μlの細菌培養物をチューブに分注し、タンパク質沈殿のために280μlのMeOHを添加した。10秒間ボルテックスした後、抽出溶媒として900μlのMTBEを加え、10秒間ボルテックスし、6分間オービタルシェーカーで攪拌した。相分離は、225μlの水を加え、その後20秒間のボルテックスで誘導した。すべてのステップを4℃の氷上で行った。最後に、各混合物を4℃で11,000×gで8分間遠心分離し、その後、240μlの親油性上層をガラスバイアルに移し、真空遠心機で60分間乾燥させた。乾燥した親油性抽出物を200 μl MeOH:toluene (9:1 v/v)に再懸濁した。

OLバリデーション実験のLC-MS/MS分析
LC-MS/MSによるサンプル分析は、Ultimate 3000 RSLCバイナリポンプ（流速400μl min-1; Thermo Fisher）またはVanquishバイナリポンプを用いて、50℃に保持したAcquity CSH C18 column（2.1 mm × 100 mm × 1.7 μm particle diameter; Waters）でランダムな順序で実施された。移動相およびグラジエントは、DOサンプルと同じものを使用しました。

検証実験では、Vanquish Split Sampler HTオートサンプラー（Thermo Fisher）とQ Exactive HF質量分析計をHESI II加熱ESIソースで接続し、糞便または培養エキス10 μlを注入した。ソースとインレットキャピラリーは共に350 ℃に保たれた（Thermo Fisher）。シースガスは25ユニット、補助ガスは15ユニット、スペアガスは5ユニットに設定し、スプレー電圧は3500V、SレンズRFレベルは90に設定した。MSは極性切替dd-MS2モード（Top2）で動作し、同一分離中にポジティブモードとネガティブモードのMS1とMS2スペクトルを取得した。MSの取得パラメータは、分解能30,000、MS1スキャンは1×106 AGCターゲット、MS2スキャンは5×105 AGCターゲット、MS1およびMS2イオン蓄積時間100 ms、MS1スキャンレンジ200～2,000 Th、フラグメント用分離幅1.0 Th、ステップHCDコリジョンエネルギー(20、30、40ユニット)としました。

リピドミクス解析
得られたすべてのLC-MSリピドミクス生ファイルは、MSConvertGUI (ProteoWizard, Dr Parag Mallick, Stanford University) を介してmgfファイルに変換され、LipiDex81およびCompound Discoverer 2.0 or 2.1.0.398 (Thermo Fisher) を用いて、それぞれDOおよび検証実験用に処理された。すべての生ファイルは、ブランクをマークしてCompound Discovererに読み込まれ、以下のワークフロー処理ノードを使用して2つの結果ファイルが生成されました。Input Files, Select Spectra, Align Retention Times, Detect Unknown Compounds, Group Unknown Compounds, Fill Gaps and Mark Background Compoundsで「Aligned」結果、Input Files, Select Spectra and Detect Unknown Compoundsで「Unaligned」結果を得ました。Select Spectraでは、リテンションタイムのリミットを0.4～21分に設定し、MSオーダーと未認識MSオーダーの置換をMS1に設定した。さらに、FTMS Mass AnalyzerとHCD Activation Typeに置換を設定した。Align Retention Timesでは、質量公差を10ppmに設定し、データセットに応じた最大シフト量をDOでは0.6分、検証実験では0.5分に設定しました。未知化合物の検出では，質量公差を10ppm，S/N閾値を5（DO）または3（検証），最小ピーク強度を5×106（DO）または1×105（検証）に設定しました。

DO試料では、イオンとして[M+H]+1および[M-H]-1を選択し、最大ピーク幅0.75分、ピークあたりの最小スキャン数7を設定した。検証試料では、[M+H]+1および[M-H+TFA]-1を選択し、最大ピーク幅0.75分、ピークあたりの最小スキャン数5とした。最後に、Fill Gapsと同様にGroup Unknown Compoundsについては、質量公差を10ppm、保持時間公差を0.2minに設定しました。最適な化合物を選択するために、ルール#1と#2をunspecifiedに設定し、優先MSオーダーはMS1、優先イオンは[M+H]+1を選択しました。それ以外は、デフォルトの設定を使用しました。得られたピーク表は、Compounds、Compound per File、Feature（「Unaligned」はFeatureのみ）の3階層でExcelファイルにエクスポートし、後にcsvとして保存した。LipiDexのSpectrum Searcherで、DO用のライブラリとして、'LipiDex_HCD_Acetate', 'LipiDex_HCD_Plants', 'LipiDex_Splash_ISTD_Acetate', LipiDex_HCD_ULCFA' と 'Ganglioside_20171205' が選択されました。を、検証実験用に「Coon_Lab_HCD_Acetate_20171229」「Ganglioside_20171205」「Ornithine-Lipids_20180404」を選択しました。すべての検索において、MS1およびMS2の検索公差は0.01 Th、返される検索結果は最大1件、MS2の低質量カットオフは61 Thというデフォルトが維持されています。Peak Finderタブでは、Compound Discovererをピークテーブルタイプとして選択し、その「Aligned」「Unaligned」結果、およびSpectrum ResearcherからのMS/MS結果をアップロードしました。脂質スペクトル純度75%以上、MS2検索ドットプロダクト500以上、リバースドットプロダクト700以上、さらにFWHMウィンドウの乗数2.0、質量差15ppm以下、アダクト/ダイマーおよびインソースフラグメント（およびアダクトとダイマー）フィルタリング、 RT M.A.D Factor 3.5 以上というデフォルトを維持しながら、最低1ファイルでのフィーチャー同定が必要とされました。DOの後処理として、1つのファイルにしか存在せず、IDを持たないフィーチャーはすべて削除し、重複も削除した。対象となる3種のオルニチン脂質のピーク面積は、TraceFinder v3.3.350.0 (Thermo Fisher) を介して取得しました。これらのデータベースで検索した脂質クラスとそれぞれの付加体の詳細を補足表15に示す。脂質IDの照合は、ラン間で<±5 ppmで行った。

OL の合成
化学物質と方法
すべての化学物質は、Chem-Impex、Sigma-Aldrich、Agros Organics、またはTCI Americaから入手した。すべての試薬と溶媒は、使用前に蒸留したヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタンを除き、さらに精製することなく使用した。分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）は，Silicycle社のF-254蛍光指示薬を用いて，250 µmのガラス裏打ちシリカプレートで行った。可視化はUVライトとヨウ素を使用して行った。

一般的な装置情報
核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、重水素化溶媒中で、BFOプローブを備えたブルカー-アバンス分光計で400MHzで、およびDCHクライオプローブを備えたブルカー-アバンス分光計で500MHzで記録された。化学シフトは、残留溶媒ピークまたはテトラメチルシラン（TMS）を基準として、parts per millionで報告されています。カップリングはヘルツ（Hz）単位で報告されています。ESI-exact質量測定（ESI-EMM）質量分析データは、Waters LCT装置で収集されました。

OL合成
トリデカン酸（化合物1、3.2 g、15 mmol）を、スターバーを備えた丸底フラスコ中のジクロロメタン（150 ml、0.1 M）に溶解させた。1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC-HCl) (4.3 g, 22.5 mmol), 4-dimethylaminopyridine (DMAP) (273 mg, 2.25 mmol) およびMeldrums acid (3.2 g, 22.5 mmol) をフラスコに加え、室温で一晩攪拌した。翌日、反応混合物を1 M HCl (3 × 75 ml)、飽和NaHCO3 (3 × 75 ml) およびブライン (3 × 75 ml) で洗浄した。その後、混合物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。次に、得られたオイルを、スターバーを備えた丸底フラスコ中のベンゼン（19 ml）に溶解し、ベンジルアルコール（45 mmol, 4.7 ml）を添加した。反応物を95℃に3時間加熱した後、減圧下で濃縮した。粗反応混合物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液としてヘキサン中5-10％酢酸エチル）で精製し、化合物2 3.6 gを油として得た（2工程で収率69％）。

スターバーを備えた丸底フラスコに化合物 2 (3.6 g, 10.4 mmol) を加え、テトラヒドロフラン (16 ml) およびエタノール (8 ml) の 2:1 混合溶媒に溶解させた。丸底フラスコを氷浴で冷却し、シアノボロハイドライドナトリウム (1.6 g, 26 mmol) を加えた。1 M 塩酸水溶液 (26 ml, 26 mmol) を添加漏斗を介して添加し、反応を室温まで撹拌し、TLC でモニターした。出発物質の消費に伴い、反応物の水性部分をジクロロメタン（3×20ml）で抽出し、有機部分と合わせた。合わせた有機部分をブライン (3 × 20 ml) で洗浄し、MgSO4上で乾燥し、減圧下で濃縮して、3.26 gの化合物3 (93% 粗)を得た。この材料はさらに精製することなく使用した。

ペンタデカン酸 (1.93 g, 9 mmol) をスターバーを備えた丸底フラスコに加え、ジクロロメタン (80 ml) に溶解させた。そのフラスコにEDC-HCl (2.68 g, 14 mmol), DMAP (974 mg, 8 mmol) および化合物3 (2.78 g, 8 mmol)を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌させた。翌日、混合物を1 M HCl (3 × 50 ml)、飽和NaHCO3 (3 × 50 ml) および飽和食塩水 (3 × 50 ml) で洗浄した。次に、混合物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗物質をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液としてヘキサン中5-10％酢酸エチル）により精製し、化合物4.3 gを得た（単離収率94％）。

スターバーを備えた火炎乾燥丸底フラスコに、Pd/C (798 mg, 0.75 mmol Pd) を添加した。フラスコに乾燥ジクロロメタンを加えてスラリー化し、雰囲気を窒素に交換した。化合物4 (4.3 g, 7.5 mmol)を無水メタノールに溶解し、反応容器に加えた。その後、雰囲気を水素に交換し（バルーン圧）、一晩反応させた。翌日、反応物を酢酸エチルで希釈し、セライト上で濾過した。混合物を減圧下で濃縮し、化合物5を白色固体として得た (3.5 g, 97% 粗収率)。この材料はさらに精製することなく使用した。

スターバーを備えた丸底フラスコに化合物5 (256 mg 0.5 mmol) を加え、ジメチルホルムアミド (DMF) (5 ml) に溶解させた。このフラスコにN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（277μl, 1.6 mmol）およびヘキサフルオロリン酸アザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（HATU）（216 mg, 5.5 mmol）を加え、15分間攪拌した。保護されたオルニチン (250 mg, 0.6 mmol) を添加し、室温で撹拌し、TLCでモニターした。出発物質がTLCでもはや観察されないとき、混合物をジエチルエーテル(20 ml)で希釈し、1 M HCl (3 × 20 ml)、飽和NaHCO3 (3 × 20 ml) およびブライン (3 × 20 ml)で洗浄した。混合物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、白色固体 (376 mg 粗)を得た。この試料を、1H NMR分析で同一と思われる同一粗物質の追加試料と合わせ、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（溶離液としてヘキサン中25％酢酸エチル）で精製して、131mgの化合物6を得た。

スターバーを備えた火炎乾燥丸底フラスコに、Pd/Cn (17.0 mg, 0.16 mmol Pd)を加えた。フラスコに乾燥ジクロロメタンを加えてスラリー化した後、雰囲気を窒素に交換した。保護されたオルニチン脂質 (化合物 6, 131 mg, 0.160 mmol) を 4 ml 無水メタノール/ジクロロメタン (DCM) (1:1) の混合液に溶解し、反応容器に加えた。その後、雰囲気を水素に交換し（バルーン圧）、一晩反応させた。翌日、反応物をセライト上で濾過した。混合物を減圧下で濃縮し、OLをオフホワイトの固体として得た（82.2 mg、粗収率86％）。脱保護されたOLは、得られた混合物中のLCおよびESI-EMM（[M]+計算597.5207、測定597.5188、0.002 ppm）を用いて同定し、この物質は、ここに記載の実験においてさらに精製することなく使用された。

RNA-seqおよびeQTL解析
DOマウスからの瞬間凍結回腸遠位部のサンプルを、Qiagen Tissuelyser（25Hzで2ステップ2分、5分間の氷インキュベーションを伴うフリッププレートによるホモジナイズ）を用いてホモジナイズした。Qiagen 96 universal kit (Qiagen)を用いてホモジナイズしたサンプルからトータルRNAを抽出した。RNAのクリーンアップは、Qiagen RNeasy mini kit (Qiagen)を用いて行った。DNA はオンカラム DNase 消化で除去した（Qiagen）。精製 RNA は Nanodrop 2000 spectrophotometer と RNA fragment analyzer (Agilent) を用いて定量した。ライブラリー調製は、TruSeq Stranded mRNA sample preparation guide (Illumina) を用いて実施した。IDT unique dual index (UDI)、Illumina UDIまたはNEXTflex UDIを各ライブラリーサンプルのバーコードとして使用した。RNA配列決定は、Illumina NovaSeq 6000プラットフォームで行った。Raw RNA-seqリードの品質管理は、Trimmomatic82（v0.39）を用いてデフォルトパラメータで実施した。遺伝子型によらないゲノム再構成と対立遺伝子特異的発現定量は、GBRSツール（http://churchill-lab.github.io/gbrs/）を用いて実施した。DOマウスの10％以上で100万分の10以上の転写産物を持つ遺伝子を下流解析に使用した。eQTLマッピングでは、性別、RNA-seq指数、RNA-seq波、マウスコホート（波）を加法共変量として用いた。eQTL解析は、それ以外は以前に記載したものと同じである53。

BMDMアッセイおよび細胞生存率測定
6週齢のB6および129マウスから大腿骨および脛骨を採取し、骨髄を分離した。骨髄細胞を単細胞懸濁液に再懸濁し、分化を目的として、10％子牛胎児血清（FCS）、2mM l-グルタミン、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、20 ng ml-1 マウスマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）（バイオレジェンド）添加の完全DMEM培地で培養を行った。BMDM細胞は、処理群にランダムに割り付けられた。7日目にBMDMを回収し、1％牛胎児血清（FBS）添加培地中でLPS、OLまたはLPS＋OLで6時間処理した後、サイトカイン測定のために上清を回収した。最適化のため、LPS-またはOL処理BMDMからのサイトカイン（TNF-αおよびIL-6）産生は、それぞれマウスTNF-α ELISA MAX DeluxeキットおよびマウスIL-6 ELISA MAX Deluxeキット（BioLegend）を用いて実施した。LPS＋OL共培養BMDMに対するサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、MCP-1、TNF-α、MIP-1α、GM-CSF、RANTES）産生のフォローアップアッセイはQ-Plex Mouse Cytokine Screen 16-Plex(Quansys) を用いて実施した。細胞生存率は、7-アミノアクチノマイシンD（eBioscience）で染色後、フローサイトメトリー（Thermo Fisher Attune NxT）により決定した。

BMDMのRNA-seq
凍結したBMDMをQiagen Tissuelyserでホモジナイズし（20 Hzで2分間）、Qiagen 96 universal kit（Qiagen）を用いてトータルRNAを抽出した。RNAのクリーンアップはQiagen RNeasy mini kit (Qiagen)を用いて行った。DNAはオンカラムDNase消化（Qiagen）により除去した。TruSeq Stranded mRNA sample preparation guide (Illumina)を用いてライブラリー調製を行った。RNA配列決定は、Illumina NovaSeq 6000プラットフォームで実施した。Raw RNA-seqリードの品質管理は、Trimmomatic82（v0.39）を用いてデフォルトパラメータで実施した。遺伝子定量はRSEM74 (v1.3.1)を用いて実施した。DESeq283 (v1.26.0) を用いてグループ間の差次的発現遺伝子を同定した。

マウスの糞便サンプルに対するAkkermansia特異的qPCR
マウスの糞便サンプル中のAkkermansia存在量を定量するために、A. muciniphilaに特異的なプライマー（フォワードCAGCACGTGAAGGTGGGACおよびリバースCTTGCGTTGCTTCAGAT）84を使用し、以前に検証された。純粋培養から単離した A. muciniphila ゲノム DNA を用いて、7点からなる標準曲線を作成した（範囲：1 ng μl-1-0.015625 ng μl-1）。PCR反応にはSsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)を用いた。糞便中のA. muciniphilaの量は、糞便重量で正規化した。

データ解析および統計解析
すべてのデータ統合と統計解析はR (v3.6.3) で行った。データ収集と解析は、実験条件に対してブラインドで行わなかった。解析から除外されたデータはない。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、我々のサンプルサイズは過去の論文で報告されたものと同様である13。グループ間の差は、対応のない両側Welchのt-testを用いて評価した。エンリッチメント解析は、カスタムR関数を用いたフィッシャーの正確検定で行った。相関分析は、R 関数 'cor.test()' を用いた両側 Spearman の相関で実施した。多重検定では、Benjamini-Hochberg 誤発見率 (FDR) 手法を用いて P 値を調整した。データ統合は、Rパッケージのdplyr (v1.0.6), tidyr (v1.1.3), reshape2 (v1.4.4) および data.table (v1.14.0) を用いて行った。ヒートマップはRパッケージのpheatmap (v1.0.12)を用いてプロットした。その他のプロットは、Rパッケージ ggplot2 (v3.3.3), gridExtra (v2.3), RcolorBrewer (v1.1-2) および ggsci (v2.9) を用いて作成しました。

報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryをご参照ください。

データの入手方法
DOメタゲノムWGSデータは、Sequence Read Archive (SRA)のアクセッションPRJNA744213で入手可能です。RNA-seq データは Sequence Read Archive (SRA) の Accession number PRJNA772743 および PRJNA896574 から入手可能。質量分析データファイルは、Chorus (chorusproject.org) にてプロジェクト ID 1681 で公開されている（DO caecum lipidomics: https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/10cb106716da44cd924a3c73ac30083d およびfounder strains caecum lipidomics: https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/ad7566e8f45942d2ba0f579857629b55 への直接リンク）。DOマウスに関連する遺伝子型データおよび追加的な表現型データは、Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.pj105)で公開されている。SNP associated data cc_variants.sqlite は https://ndownloader.figshare.com/files/18533342 で、QTLマッピングに使用したマウス遺伝子データ mouse_genes_mgi.sqlite は https://ndownloader.figshare.com/files/17609252 で入手可能である。ソースデータは本論文に添付しています。

コードの利用可能性
本研究で使用したすべてのコードは、GitHub (https://github.com/qijunz/Zhang_DO_paper) または対応するソフトウェアパッケージのウェブサイトから入手可能です。

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論文

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謝辞
ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター DNA Sequencing Facilityによるシーケンシングとサポートサービス、ウィスコンシン大学コンピューターサイエンス学部 Center for High Throughput Computing (CHTC) による計算資源とサポート、ウィスコンシン大学マディソン校 K. Anantharamanによる計算資源とサポート、ウィスコンシン大学カーボーンがんセンター Flow Labによるサポートサービスに感謝します。この研究は、National Institutes of Health (NIH) grants DK108259 (F.E.R.), HL144651 (F.E.R. and A.J.L.), HL148577 (F.E.R. and A.J.L.) によって支援されている。 ), DK101573 (A.D.A.), GM131817 (H.E.B.), GM070683 (K.W.B. and G.A.C.); NIH National Center for Quantitative Biology of Complex Systems grant P41108538 (J. J.C.). J.C.）、NIH 国立アレルギー感染症研究所助成金 T32AI55397（J.H.K.）；NLM Computation and Informatics in Biology and Medicine Postdoctoral Fellowship 5T15LM007359 (L.L.T.) and T32DK007665 (L.L.T.) and NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant T32 GM008505 (T.J.P.)．この研究は、Fondation Leducq 17CVD01 (F.E.R.) の支援も受けた。V.L.はポーランド科学財団（MAB/2017/2、START 064.2022）、欧州分子生物学機構EMBO（博士研究員ALTF 474-2021）、ポーランド国立科学センター（SONATINA 5 2021/40/C/NZ3/00283）から支援を受けている。健康のための再生メカニズム-ReMedy」プロジェクト（MAB/2017/2）は、欧州地域開発基金の下で欧州連合が共同出資するポーランド科学財団の国際研究アジェンダプログラム内で実施されている。

著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Q. Zhang, V. Linke.

著者と所属
米国ウィスコンシン大学マディソン校細菌学教室

Q. Zhang, L. L. Traeger, K. Kasahara, R. L. Kerby, J. H. Kemis, E. I. Vivas & F. E. Rey

米国ウィスコンシン大学マディソン校化学部

V. リンケ、D. E. マンソン、T. J. ポラスケ、E. A. トルヒーヨ、T. R. レディ、J. D. ラッセル、H. E. ブラックウェル & J. J.クーン

IMol ポーランド科学アカデミー, ワルシャワ, ポーランド

V. リンケ

ポーランド、ワルシャワ、IMolポーランド科学アカデミー、ReMedy国際研究アジェンダユニット

V. リンケ

ウィスコンシン大学マディソン校バイオ分子化学部門、米国ウィスコンシン州マディソン市

K. A. Overmyer、I. J. Miller、J. J. Coon

モーグリッジ研究所、ウィスコンシン州マディソン、USA

K. A. Overmyer & J. J. Coon

ウィスコンシン大学マディソン校生化学教室（米国ウィスコンシン州マディソン

K. L. Schueler、D. S. Stapleton、M. E. Rabaglia、M. P. Keller、A. D. Attie

カリフォルニア大学ロサンゼルス校微生物学・免疫学・分子遺伝学・人類遺伝学部門、カリフォルニア州ロサンゼルス、米国

M. セルディン＆A.J.ルシス

カリフォルニア大学ロサンゼルス校（米国カリフォルニア州ロサンゼルス）医学部

M. セルディン＆A.J.ルシス

ジャクソン研究所、バーハーバー、ミシガン州、アメリカ

D. M. Gatti、G. R. Keele、D. T. Pham、G. A. Churchill

インディアナ大学化学部（米国インディアナ州ブルーミントン

J. P. Gerdt

米国ウィスコンシン大学マディソン校生物統計学・医療情報学教室

K. W. Broman

貢献度
F.E.R.、M.P.K.、A.D.A.は研究の構想を練った。Q.Z., V.L., L.L.T., A.D.A., J.J.C. and F.E.R. designed experiments. K.L.S.、D.S.S.、M.E.R.はマウスサンプル採取に協力した。L.L.T.とJ.H.K.は、DNA配列決定のためのサンプル処理に貢献した。Q.Z., L.L.T. and K.W.B. はメタゲノム解析とQTL解析を行った。V.L., K.A.O., E.A.T., T.R.R. および J.D.R. はリピドミクスデータを収集した。V.L.、I.J.M.、M.P.K.、D.M.G.、G.R.K.、D.T.P、G.A.CはリピドームとリピドームQTLデータを分析した。D.E.M., T.J.P., J.P.G. および H.E.B. は OL の合成を行った。R.L.K.は細菌培養実験を行った。Q.Z.とK.K.は細胞培養の研究を行った。E.I.V.はノトバイオティクスマウス実験に協力した。Q.Z.、M.S.、A.J.L.は腸内RNA-seqをサポートした。Q.Z.、V.L.、F.E.R.は原稿を執筆した。最終原稿は全著者が承認した。

共著者
F. E. Reyに連絡する。

倫理的宣言
競合する利益
J.J.C.はThermo Fisher Scientificのコンサルタントである。他の著者は競合する利害関係を宣言していない。

査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、Ran Blekhman氏と他の匿名査読者の査読に感謝します。

追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。

エクステンデッドデータ
Extended Data 図1 研究の概要。
Diversity Outbred マウスから糞便メタゲノム（n = 264匹）、糞便リピドーム（n = 381匹）および遠位小腸トランスクリプトーム（n = 234匹）を作成した。定量的形質座位（QTL）解析により、細菌分類群、細菌の機能、細菌および宿主由来脂質のレベル、小腸の転写レベルの変動に関連するゲノム領域が同定された。また、形質間の因果関係を同定するために、媒介解析とコ・マッピング比較を行いました。

Extended Data 図2 DOメタゲノム解析。
a, 全サンプルでアセンブルされたリードの平均割合 b, 我々が作成したアセンブリと公開データベース（n = 297匹）とのマッピングの割合の比較 c, 全メタゲノムでKEGGパスウェイに検出された微生物機能。d, DOマウス（n = 264匹）で検出された上位20の腸内細菌属。 e, メタゲノム解析されたゲノムの品質。 f, DOマウスで検出されたA. muciniphila MAGsの2つの変異体。箱ひげ図は、四分位範囲、中央値、四分位範囲の1.5倍以内の点の広がりを示し、ひげ図の端を超えたデータは個別にプロットしている。

ソースデータ

Extended Data 図3 Chr15:61-65MbpにあるDO腸内細菌叢QTLホットスポット。
Chr15ホットスポットにおけるKOおよび分類群形質QTLのファウンダーアレル効果（LOD > 6）。

出典データ

Extended Data 図4 DO腸内細菌叢QTLホットスポットとSNPの関連性。
a, 全MAGでChr15ホットスポットにマッピングされたKOの有無。b, BacteroidetesとFirmicutesの創始者アレル効果の推定とBacteroidetes/Firmicutes比（左パネル）。Kemisらによる創始者株におけるBacteroidetes Firmicutesの存在量とBacteroidetes/Firmicutes比の観察値（右図、n = 9-12匹/創始者株）。箱ひげ図は四分位範囲、中央値、四分位範囲の1.5倍以内の点の広がりを示し、ひげ図の端を超えたデータは個別にプロットしている。

ソースデータ

Extended Data 図5 腸内細菌MAGと糞便脂質の相関関係。
a、DOマウスにおけるMAGsの存在量と糞便脂質量との間の両側スピアマン相関係数を示すヒートマップ。細菌性MAGは5群に、糞便脂質は6群にクラスタリングされた。 b, 各糞便脂質クラスタの脂質クラスの濃縮度。フィッシャーの正確検定とBenjamini-Hochbergによる多重検定補正を使用した。

出典データ

Extended Data 図6 Akkermansia muciniphilaにおけるオルニチン脂質(OL)の検出。
a, リン酸濃度の異なる培地（20µM、200µM、2000µM）で試験管内培養したA. muciniphilaの細胞ペレットから検出されたすべてのOL種の相対量を示すヒートマップ。 b, リン酸濃度の異なる培地で培養したA. muciniphilaの細胞ペレットから検出した脂質成分の相対量。c, A. muciniphilaから精製した細胞外ベシクル（AmEVs）に検出されたOL成分の相対的存在量とA. muciniphila細胞との比較。

ソースデータ

Extended Data 図7 BMDMによるサイトカイン産生。
a,b, (a) TNF-α および (b) IL-6 レベルは、異なる濃度の LPS または OL で 6 時間処理した B6 および 129 マウスの BMDM 細胞の上清から検出した。 c, 10 ng/mL LPS および異なる濃度の OL で 6 時間処理した B6 および 129 マウスの BMDM 細胞の細胞生活率。N = 3生物学的複製/処理群。箱ひげ図は、四分位範囲、中央値、四分位範囲の1.5倍以内の点の広がりを示し、ひげ図の端を超えるデータは個別にプロットされる。

ソースデータ

Extended Data 図8 コ・マッピングQTLの例。
a, Chr8: 10.5-14.5 Mbpにおいて、腸内細菌リポ多糖コリンフォスフォトランスフェラーゼ機能とPglyrp1 eQTLのコ・マッピングが見られた。 b, Chr4: 50 Mbpにおいて、未同定の大腸機能とローカルなAcnat1 eQTLのコ・マッピングが見られた。 c, Acnat1がタウリンと脂肪酸を抱合することからN-アシルタウリンとして機能を特定した。e, Chr17:30-34Mbpでは、いくつかの未同定特徴がco-mappingされ、その後トコフェロールと同定され、最も重要な特徴のα-トコフェロールグルクロニドを例示している。

出典データ

Extended Data 図9 A. muciniphilaレベルと関連するコ・マッピング形質に対する創始者対立遺伝子効果。
A. muciniphila、糞便OL、eQTL遺伝子がChr1: 90-95 Mbp, Chr2: 77-81 Mbp, Chr7: 126-131 Mbp, Chr12: 55-63 Mbp and Chr15: 75-79 Mbpにco-mappingされた。

ソースデータ

Extended Data Fig. 10 OL/LPSで処理したBMDMにおける遺伝子の発現。
a, Atf3-/-マウスおよびWTマウスの糞便中のA. muciniphilaの存在量（n = 7マウス/遺伝子型；両遺伝子型とも雌4、雄3）。 b, LPS（10 ng/ml）またはLPS（10 ng/mL）とOL（1 μg/mL）で6時間処理したB6および129マウス由来BMDM細胞からのIL1b、IL6およびIL12aの遺伝子発現量。c、B6および129マウス由来のBMDMにおける差次的発現遺伝子の数。 d、LPS（10ng/mL）またはLPS（10ng/mL）およびOL（1μg/mL）で6時間処理したB6および129マウス由来のBMDMにおけるATF3の遺伝子発現レベル。e, B6および129マウスのBMDMにおける差次的発現遺伝子 f, BMDMにおいてATF3が制御する既報告遺伝子50。B6および129マウスにおけるOLがこれらの遺伝子に与える影響。箱ひげ図は、四分位範囲、中央値、四分位範囲の1.5倍以内の点の広がりを示し、ひげ図の端を超えたデータは個別にプロットしている。処理群間の統計的な差は、両側Welchのt-検定で検定した。

出典データ

補足情報
補足情報
補足説明1-7.

報告書の概要
補足表1-16.
ソースデータ
ソースデータ図1
統計的なソースデータ。

ソースデータ Fig.
統計的なソースデータ。

ソースデータ拡張データ Fig.
統計的なソースデータ。

出典データ拡張データ Fig.
統計的なソースデータ。

ソースデータ拡張データ Fig.
統計的なソースデータ。

出典データ拡張データ Fig.
統計元データ。

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この記事の引用
Zhang, Q., Linke, V., Overmyer, K.A. et al. Genetic mapping of microbial and host traits reveals of production of immunomodulatory lipids by Akkermansia muciniphila in the murine gut. Nat Microbiol (2023)。https://doi.org/10.1038/s41564-023-01326-w。

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受付終了
2021年12月10日

受理済
2023年1月10日

公開
2023年2月9日

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https://doi.org/10.1038/s41564-023-01326-w

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研究テーマ
遺伝的関連性研究
遺伝子連鎖研究
リピドミクス
脂質
メタゲノミクス
Nature Microbiology (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276（オンライン版）

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