プレボテラ・コプリと微生物叢メンバーが栄養不良の治療食の有益な効果を媒介する

2024年3月20日 09:26

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掲載：2024年3月19日
プレボテラ・コプリと微生物叢メンバーが栄養不良の治療食の有益な効果を媒介する

https://www.nature.com/articles/s41564-024-01628-7

Hao-Wei Chang, Evan M. Lee, ...Jeffrey I. Gordon 著者一覧を見る
Nature Microbiology (2024)この記事を引用する

指標詳細

概要
微生物指向性補完食品（Microbiota-directed Complementary Food：MDCF）製剤は、栄養不良児の腸内コミュニティを修復するように設計されている。ランダム化比較試験により、栄養不良のバングラデシュの子どもにおいて、MDCF-2製剤が、よりカロリーの高い標準的な栄養介入と比較して体重増加を改善したことが示された。研究参加者のメタゲノム解析から、Prevotella copri株によるポンデリングの成長とMDCF-2糖鎖利用経路の発現との間に相関関係があることが明らかになった。この相関関係を検証するために、我々は、年齢および小腹の成長に関連する腸内細菌株の定義されたコンソーシアムでコロニー形成され、メタゲノムでアセンブルされたゲノムと密接に一致するP. copri株を含む、または含まない、gnotobioticマウスを使用する。腸内メタゲノミクスおよびメタトランスクリプトミクスと、宿主の単核RNA配列決定および腸内メタボローム解析を組み合わせることで、MDCF-2糖鎖の代謝におけるP. copriの重要な役割を同定し、Bifidobacterium infantisを含む他の微生物との相互作用を明らかにした。P.コプリを含むコンソーシアムは、体重増加を媒介し、腸管上皮細胞内のエネルギー代謝を調節した。この結果は、MDCF-2と栄養失調児の腸内細菌叢メンバーとの間の構造-機能相関を明らかにし、将来の治療法への潜在的な示唆を与えるものである。

主な内容
乳児の腸内細菌コロニー形成は、分娩様式、様々な感染源（膣、皮膚、糞便、母乳）からの母親の微生物への曝露、環境微生物、最初の食物1,2によって影響を受ける過程で、出生時に始まる。出生後3年目までに、微生物群集の形成過程（「成熟」）はほぼ完了し、この時期の健康な子どもの群集は、同じ家族の成人と同様の構成を示す2,3,4。対照的に、栄養不良の子どもは微生物叢の発達が遅れている。このような「未熟な」群集を無菌マウスに移植すると、レシピエント動物の成長と代謝に障害が生じる5,6。前臨床モデルでは、小腸内細菌叢の異常とタンパク質欠乏食の両方が、腸管/全身の炎症と栄養吸収障害を特徴とする栄養不良の小児が罹患する慢性疾患である環境性腸管機能障害の組織学的・病理学的特徴を共有する腸管障害を引き起こすことが示されている7,8,9。これらの知見を総合すると、腸内細菌叢とその遺伝子の集合体（マイクロバイオーム）が、出生後の健全な成長を促進する上で果たす役割が浮き彫りになった。

われわれは以前、ランダム化比較臨床試験に登録された中等度急性栄養失調のバングラデシュの生後12～18ヵ月の小児から連続的に採取した糞便サンプルのゲノム分解メタゲノム解析を行った。この試験では、微生物主導型補完食プロトタイプ（MDCF-2）の投与と、すぐに使える補完食（RUSF）の投与が、宿主の生理機能、子どものマイクロバイオームの組成と発現機能に及ぼす影響が比較された10,11。3ヵ月の介入期間中、MDCF-2はカロリー密度が15％低いにもかかわらず、小腸の成長（体長（身長）に対する体重の変化率で定義され、WLZスコアで表される）が有意に大きくなった。MDCF-2はまた、筋骨格系や中枢神経系の発達のバイオマーカーやメディエーターを含む、WLZと正の関連を持つ血漿タンパク質のレベルの有意な増加を促進した10。また、WLZスコアと関連するメタゲノム集合ゲノム（MAG）も同定した。セルロース、ガラクタン、アラビナン、キシラン、マンナンは、MDCF-2における主要な非デンプン多糖である（文献11）。WLZと正の相関を示した75のMAGの中で、2つのPrevotella copri MAGがMDCF-2の多糖を標的とする糖質利用経路の発現を支配していた。これらの経路の発現および糖鎖代謝産物の糞便中濃度は、小児のWLZ11の改善の程度と有意な正の相関を示した。2つのWLZ関連P. copri MAG（Bg0018とBg0019）は、機能的に保存された10個の多糖利用遺伝子座（PUL）を共有しており、そのうちの7個は完全に保存されていた。研究参加者において同定された11のP. copri MAGsにおけるこれら7つのPULの発現の程度は、それぞれのMAGのWLZとの関連性の強さを予測するものであった。

ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（以下、B. infantisと略す）は、乳児の腸の初期コロニー形成者であり、ヒトミルクオリゴ糖の主要な消費者である12。健康なバングラデシュの小児と栄養不良のバングラデシュの小児を比較した研究では、B. infantisは重度の急性栄養不良（SAM）の乳幼児／小児の微生物叢において枯渇しているか、あるいは欠落していることが示された。ランダム化比較臨床試験では、SAMの乳児に市販のB. infantis株を投与したところ、小腹の成長が改善し、腸内炎症のバイオマーカーのレベルが低下したことが示された13。前臨床試験の追跡調査から、バングラデシュのB. infantis株（Bg2D9）と米国のドナーから入手した市販のB. infantis株を、臨床試験に参加したバングラデシュの乳児の前処理として未培養の糞便微生物叢をコロニー形成させたgnotobioticマウスに導入すると、体重増加が促進されることが明らかになった13。

この論文では、MDCF-2代謝におけるP. copriとB. infantisを含む他の群集メンバーの役割、および宿主の生理学、特に体重増加と腸機能に対するMDCF-2の影響を調べるために、gnotobioticマウスを使用する。バングラデシュの子供たちから培養した、ゲノム配列の決定された細菌株のコレクションを、gnotobioticの雌マウス（ダム）に順次導入し、その後、哺乳期と離乳期にこれらの菌株を仔マウスに感染させた。これらの菌株は、バングラデシュの健常児の出生後の腸内微生物群集形成のさまざまな段階で顕著性が変化する微生物（「年齢識別性」分類群）4,5,6,14を代表している。また、MDCF-2臨床研究10,11で同定されたMAGと共通の特徴に基づいて選択されたWLZ関連細菌株も含まれた。仔ウシは、排他的ミルク給餌（母犬から）の後、MDCF-2添加飼料に離乳させるという同じ食餌順序に従った。MDCF-2に反応した微生物群集の組成と機能の変化を特徴付けると同時に、宿主の生理学的側面も調べた。大量の腸上皮細胞の正常な日常的入れ替わり15を支えるためには、かなりの代謝投資が必要であり、また、それらが分化・分化した状態で通常発現する機能も必要である。そこで我々は、上皮細胞の遺伝子発現と代謝が、P. copri MAG発現株の有無にかかわらず、定義されたコンソーシアムに関連する機能的差異の感度の高い報告者となるという仮説を検証した。我々は、MDCF-2に存在する糖鎖の代謝において、WLZ関連MAGに酷似したP. copri株が中心的な役割を果たし、さらにB. longum subsp. infantisやMDCF-2などの他の微生物叢メンバーとの関連において、体重増加を促進し、腸管細胞における代謝機能の発現に影響を及ぼす能力を有することを報告した。

研究結果
加齢およびWLZ関連細菌の仔ウシへの伝播
我々はまず、臨床試験に登録された小児の発育中の腸内細菌叢を反映した、ヒト腸内微生物群集を定義した11。そのうち16株は、以前に報告されたランダム化比較MDCF-2臨床試験が行われた都市スラム、ミルプールに住む生後6～24ヵ月のバングラデシュ人小児の糞便微生物叢から培養したものである（補足表1a）。これらの菌株は、16SリボソームRNA遺伝子の配列が、(1)健康なバングラデシュの小児の腸内細菌叢の発達を反映する分類群4,14、および(2)その存在量が体重増加率（β-WLZ）6,10と統計的に有意な関連（正または負）を示す分類群に近接していることから、最初に同定された。これらの菌株と、臨床研究11の全参加者から得られた糞便サンプルから組み立てられた1,000のMAGとの関連性は、平均塩基配列同一性（ANI）スコア、アラインメントカバレッジパラメーター16,17、およびコード化された代謝経路によって決定された（補足表1b-d）。MAGおよび培養株における炭水化物利用、アミノ酸およびビタミン／補酵素の生合成、発酵のコード化された代謝経路は、インシリコ再構築によって定義された。結果は、経路の有無を示す「バイナリー表現型」スコアの形で記述されている11。

2つのWLZ関連MAGであるBg0018とBg0019に類似した菌株をP. copriにコロニー形成させることで、微生物群集組成や発現機能、食餌性糖鎖分解、宿主代謝にどのような影響があるかを調べるため、バングラデシュ産のP. copri株PS131.S11（略称：P. copri Bg131）を選択した。この株が選ばれた理由は、Bg0018およびBg0019と系統学的に類似していること（Extended Data Fig.1a）、代謝経路の表現がこれらのMAGと一致していること（補足表1c,d）、そしてBg0018とBg0019に共通する10個の機能保存PULのうち5個を表現していることである。これら5つのPULは、デンプン、β-グルカン、ペクチン、ペクチン性ガラクタン、キシランの分解に関与すると予測されている（補足表1e,f）。さらにアラビノガラクタンを標的とするPULが、MAGs Bg0018とBg0019の対応するPULと保存性の基準を満たさないものの、保存されたデンプンを標的とするPULに隣接して見つかった（補足表1f）。

P.copriのMDCF-2に対する応答の特異性を評価するために、別のPrevotella属、Prevotella stercoreaからの分離株も加えた。臨床試験では、P. stercoreaのMAGはWLZと関連しておらず、この培養分離株は、MAG Bg0018とBg0019、またはP. copri Bg131に存在するPULを共有していなかった。その代わりに、P. stercorea分離株のPULは、主に動物由来の糖鎖を標的とするグリコシド加水分解酵素を含んでいた（補足表1g）。従って、この分離株はMDCF-2植物糖鎖ベースの餌でより低い適性を示すだろうと我々は仮定した。

P. copriをマウスに単コロニー化する最初の試みは、単体ではコロニー形成が不十分であることを明らかにした（Extended Data Fig.1b,c）。P.コプリのような後発のコロニー形成者が定着できるように、B.インファンティスが定義された群集の形成の初期段階で十分に代表されるようにするため、培養分離株のコレクションには、バングラデシュの子どもから回収したB.インファンティスBg463株とB.インファンティスBg2D9株の2株が含まれていた。Bg463株は、MDCF-26,14の開発につながったわれわれの以前の前臨床研究で使用されていた。B. infantis Bg2D9株は、Mirpurに住む生後6ヵ月の小児が摂取する代表的な食餌を摂取した離乳したての無菌マウスに投与したところ、Bg463株よりも高い適性（絶対量）を示した13。この優れた適性は、この株が持つ炭水化物利用経路の追加によるものと考えられた13。

我々はこの20菌株のコレクションを用いて、4つの異なる細菌コンソーシアムによる母親のコロニー形成を「連続的」に行う3群固定食試験を実施した（図1a-c）。例えば、コンソーシアム1と2は、生後1年目の健康な乳幼児／子供に顕著にコロニー形成される株（B. infantis分離株を含む）で構成され、コンソーシアム3の株は生後2年目の離乳期に顕著にコロニー形成される4,5,6,14。このダムから仔へのコロニー形成戦略は、細菌コンソーシアムを経口投与で新生仔に確実に送達するという技術的課題の克服にも役立った。

図1：他の培養年齢識別性細菌株およびWLZ関連細菌株の存在下で、人工授精した仔ウシと仔ウシの2頭1組にP. copriをコロニー形成させる効率に影響する因子の特定と、コロニー形成が仔ウシの体重増加に及ぼす影響。
図1
a,「MDCF-2添加離乳食」の各モジュールからのエネルギー寄与率 b,c,試験デザイン（群1,2,3について、それぞれダム2頭、仔ウシ8頭、5頭、7頭） b,ダムへの細菌コロニー形成と食餌切り替えのタイミング c,各治療群のメンバーに投与したガベージ。e, 仔ウシから採取した糞便サンプル中のB. infantis Bg2D9（群1）およびB. infantis Bg463（群2）の絶対量。 f, 生後指示された時点で指示された処理群の仔ウシから採取した糞便サンプル中のP. copriの絶対量。挿入図：P21で仔ウシから採取した糞便サンプル中のP. copriの絶対量。 g, P21およびP53で仔ウシから採取した糞便サンプル中の他の群集メンバーの絶対量の主成分分析。平均値±s.d.をd-f.に示す。d-fの各ドットは個々の動物を表す。P値は線形混合効果モデル（d, Methods）、両側Mann-Whitney U検定（f, inset）またはPERMANOVA（g）を用いて計算した。セントロイドは色のついた'X'で示す。網掛け楕円は標本分布の95%信頼区間を表す。各ドットは個々の動物を表す。d-gに示した解析では、すべての子孫から得られたデータを用いた。

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二重飼育された無菌ダムは、コロニー形成が始まる2日前の分娩後2日目に、標準的なブリーダー・チャウからMDCF-2を添加した「離乳食」に切り替えた。この離乳食は、臨床試験でMDCF-2投与中に小児が摂取した食事に似せて調製した（方法；図1aおよび補足表2）。3つの群すべてにおいて、仔マウスは、排他的ミルク給与（哺育している牝羊から）から始まり、その後、MDCF-2を添加した離乳期用飼料を摂取する離乳期へと続く一連の食事に供された。子犬は生後24日目（P24）に離乳させ、その後P53で安楽死させるまでMDCF-2のみを自由摂取させた。

安定したP. copriのコロニー形成を促進する因子を同定するために、2つの異なるB. infantis株、Bg2D9およびBg463がP. copriおよび年齢およびWLZ関連MAGを代表する他の培養株に及ぼす影響を比較した。B. infantis Bg2D9を3群実験の第1群のコンソーシアム1に、B. infantis Bg463を第2群のコンソーシアム1に組み入れた（図1b,c）。このコンソーシアムは5種類の「初期」乳児腸内コミュニティコロナイザーで構成され、分娩後4日目にダムに投与された。(1)分娩後7日目にP. copriとP. stercoreaを、(2)分娩後10日目に年齢識別可能なWLZ関連分類群を、(3)分娩後21日目にP. copri、P. stercorea、Faecalibacterium prausnitziiの3株を投与した（図1b）。この最後の時点で、3株を経口経口投与することで、ダムとその子のコロニー形成を促進させた。P. copriのコロニー形成の影響を調べるため、arm 2の複製であるが、arm 2とarm 4にプレボテラを含まないarm 3を加えた。最初の3回の給餌のタイミングの根拠は、食餌順序に基づくものであった（マウスが母親の母乳のみを摂取していた時期（P4）に初期コロニー形成菌を第1回目の給餌、仔マウスがヒトの離乳食（補完食）を摂取し始めた頃に第2回目の給餌、「補完食」の期間中に第3回目の給餌、そして離乳終了時（およびその後離乳後まで）にP. copriのコロニー形成レベルを一定にするために第4回目の給餌）。

B. infantisが宿主の体重および微生物叢に及ぼす影響
B. infantis Bg2D9をコロニー形成させたグノトビオティックマウスは、他の2つの実験群のマウスと比較して、P23（最初の測定時点、最終経口投与から2日後）とP53の間で有意に体重増加が大きかった（図1dおよび補足表3）。対照的に、2群と3群では、プレボテラ属を含むB. infantis Bg463をコロニー形成した動物と含まない動物の間で、体重増加に有意差はなかった。

これらの体重増加の差が微生物群集組成の差と関連しているかどうかを調べるため、群集DNAのショットガンシーケンスを用いて、分娩後21日目、24日目、35日目にダムから採取した糞便サンプル、P21日目、P24日目、P35日目、P53日目に子から採取した糞便サンプル、P53日目に子から採取した糞便および回腸内容物における全投与株の相対量および絶対量を定量化した（各群につきn = 2ダムおよび5-8仔を分析；補足表4a）。各コンソーシアムメンバーのコロニー形成は、各処置群の全動物間で非常に一貫していた（補足表4b-d）。B. infantis Bg2D9は1群ではP21で仔マウスにコロニー形成した。対照的に、B. infantis Bg463は2群および3群で5-8桁低い絶対量レベルでコロニー形成した（補足表4c）。これらの群間差はP53まで持続した。B. infantisが離乳前の早い時期にコロニー形成に関与していることと一致し、両菌株ともP21からP53にかけてコロニー数が減少した（図1e）。アーム1でB. infantis Bg2D9に曝露すると、離乳前（P21）のP. copriコロニー形成レベルは、B. infantis Bg463に曝露したアーム2のマウスよりも3桁大きかった（図1fおよび補足表4c）。P21に4回目の経口摂取を行ったところ、群2の糞便中のP. copriの絶対量は群1と同程度まで上昇し、このレベルは離乳後（P24からP53）ずっと維持された（図1fおよび補足表4c）。この4回目の経口摂取の効果は、安楽死時の回腸および大腸の微生物叢でも明らかであった（補足表4d）。

これらの結果に基づき、P. copriのB. infantisに対するコロニー形成依存性を、Extended Data Fig. 両飼育の無菌ダムを、産後2日目に標準的なブリーダー・チャウからMDCF-2を添加したバングラデシュ産離乳食に切り替えた。分娩後4日目に、一方の群にはB. infantis Bg2D9を接種し、もう一方の群には偽食させた。分娩後7日目と10日目に、両群のノトビオティックマウスに5つのP. copri株を含むコンソーシアムを経口投与した。これらの5つのP. copri株（Bg131、1A8、2C6、2D7およびG8）はすべて、バングラデシュの子どもから得た糞便サンプルから分離した（補足表5）。仔マウスは離乳完了時にダムから引き離され、P42に安楽死させるまで飼料をMDCF-2に切り替えた（各処理群n = 9マウス；2つの独立した対照実験）。この時点で、B. infantis Bg2D9を投与されたマウスから採取された糞便中のP. copriの絶対量は、B. infantisに曝露されなかった動物よりも3桁多かった（Extended Data Fig.） P23からP42までの体重増加には、単コロニー化群と両コロニー化群の間で統計学的に有意な差は見られなかったが、この所見の解釈は、P. copriを単コロニー化した動物で観察された、糞便のサイズと水分含量の増加によって、少なくとも部分的に混乱している。

P. copriに対するB. infantisの効果はP. stercoreaには一般化しなかった。P. copriとは異なり、P21およびP24に採取した糞便中のP. stercoreaの絶対量は、arm1および2に属するマウスで有意差はなかった（補足表4c）。離乳前のP24では、P. stercoreaの絶対量はP. copriのそれより5桁少なかった。離乳後の期間を通じて、P. stercoreaの絶対存在量は両処理群とも同程度であったが、P. copriより2桁低かった。

実験期間中、B. infantis Bg2D9のコロニー形成は、Prevotellaのコロニー形成にかかわらず、B. infantis Bg463でコロニー形成された動物とは異なる糞便群集組成をもたらした（図1g）。プレボテラと2つのB. infantis株のいずれかをコロニー形成した動物（arm1対arm2）では、このような違いはP21の時点で観察され、実験終了のP53までに顕著になった（図1g）。プレボテラ（Prevotella）を含む群集を保有する動物では、B. infantis Bg2D9のコロニー形成はBg463のコロニー形成と比較して、P53の糞便群集における3つの生物（B. luti、D. longicatena、M. multacida）と5つの生物の体力を有意に増加させた。multacida）およびP53糞便群集の5つの生物（B. breve、B. catenulatum、B. obeum、D. longicatena、M. multacida）を有意に増加させたが、他の群集メンバーの絶対量は有意な影響を受けなかった（Extended Data Fig.）

B. infantis Bg463でコロニー形成された動物では、プレボテラを群集に添加しても、P21とP53のいずれにおいても群集組成に有意差は認められず、1つの生物（Streptococcus gallolyticus；図1gとExtended Data図2a）のフィットネスが有意に増加しただけであった。しかし、群1と群3を比較すると、B. infantis Bg2D9とPrevotellaのコロニー形成の組み合わせは、P53の糞便群集と糞便群集において、それぞれ7種類と6種類の生物の体力を増加させた（B. catenulatum、Blautia obeum、Mitsuokella multacida-アラビノースを利用できると予測される4種類の生物のうち3種類を含む）（Extended Data Fig. これらの結果から、この前臨床モデルにおいては、（1）B. infantis Bg2D9のコロニー形成が、P. copriの適合性を含む微生物群集構造の重要な決定因子であった；（2）B. infantis Bg2D9を含む群集は、P. copriの適合性を含む微生物群集構造の重要な決定因子であった。infantis Bg2D9を含む群集は、体重増加の増大と関連していたこと、および（3）B. infantis Bg2D9が含まれる場合に生じる群集メンバーの体力の時間的プロフィールは、MDCF-2治療が開始された離乳期に、すべての小児がかなりのレベルのP. copri11を有していた臨床研究の小児のそれと、より密接に類似していた。

MDCF-2糖鎖の微生物代謝
微生物群集構造にこのような違いが観察されたことから、超高性能液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析計（UHPLC-QqQ-MS）を用いた糖鎖の単糖および結合含量の測定により、治療群間のMDCF-2の代謝を分析した。我々が盲腸を採取したのは、微生物発酵に特化した大きな腸内生息域で、微生物の遺伝子発現と多糖分解能力を比較したかったからである18。

B. infantis Bg2D9のコロニー形成は微生物群集構造の重要な決定因子であったが、Prevotellaのコロニー形成はB. infantisのコロニー形成に関係なく、MDCF-2糖鎖の分解を促進した（Extended Data Fig.3）。プレボテラのコロニー形成は、糞便中の糖鎖中のアラビノースレベル（Extended Data Fig. これらの違いは、P. copri Bg131がP. stercoreaとは異なり、アラビノースを含むMDCF-2糖鎖の処理に関与するPULを含むという事実によって支持される：すなわち、PUL27bはアラビノガラクタン消化が知られているか予測されている糖質活性酵素（CAZymes）を特定し、PUL2はアラビノガラクタンIIに見られる末端残基を標的としうるフコシダーゼを持つ（補足表1f）。対照的に、B. infantis Bg2D9でコロニー形成された動物とB. infantis Bg463でコロニー形成された動物との間には、測定された単糖あるいは結合のいずれについても、arm1およびarm2において有意な差は認められなかった（補足表7）。これらの結果を総合すると、プレボテラを含む群集は、分岐アラビナンのより完全な分解と、MDCF-2糖鎖からのアラビノースの遊離の程度がより大きいことを示している。

糖鎖利用におけるこれらの変化が、群集メンバーの発現代謝機能とどのように関連しているかを調べるために、我々は糞便内容物について微生物RNA配列決定（RNA-seq）を行った（補足表8）。まず、P. copriとP. stercoreaによるPULの発現レベルを解析した。プレボテラを含む両群（arm 1とarm 2）において、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）（Methods）（Extended Data Fig.

P. copriとは対照的に、α-マンナンおよびN-結合型糖鎖を標的とすると予測されるP. stercoreaの2つのPUL（それぞれPUL 5と7）のみが、高発現で有意に濃縮された（Extended Data Fig.）これら2つのPULは、P. copri PULよりも発現レベルが低かった。さらに、P. stercorea PULが標的とする糖鎖の主成分であるマンノース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミンについては、P. stercorea PULを含むコンソーシアムでコロニー化したマウスから採取した糞便内容物のアラビノース含量の低下が観察されたのとは異なり、有意差は認められなかった（Extended Data Fig.）これらの結果は、P. stercoreaではなくP. copriがMDCF-2からのアラビナンの遊離を増加させ、MDCF-2に代表される多糖の分解に寄与していることを示している。

次に、糖鎖代謝におけるこれらの変化が他の生物の代謝反応に影響を及ぼすかどうかを調べるために、他の生物群に注目した。B. infantis Bg2D9のトランスクリプトームはB. infantis Bg463とは異なっていた（Extended Data Fig.） UHPLC-QqQ-MSに基づく糞便糖鎖の解析と一致して、アラビノース利用はB. catenulatum、M. multacida、B. obeum-アラビノースを利用できると予測される4つの生物のうち3つ-で最もアップレギュレートされた経路の一つであった（Extended Data 図3dおよび補足表8c,d）。これら3つの生物はまた、B. infantis Bg2D9のコロニー形成で有意に多くなった（Extended Data Fig.2b）。B. catenulatumはP. copriのコロニー形成に反応してアラビノース利用遺伝子を直接発現上昇させた（arm2対arm3；Extended Data Fig.）対照的に、M. multacidaとB. obeumはB. infantis Bg2D9のコロニー形成に反応してアラビノース利用遺伝子のアップレギュレーションを示した（arm 1 vs arm 2; Extended Data Fig. 3d）。またM. multacidaとB. obeumは、B. infantis Bg2D9のコロニー形成に伴って、グルタミン酸とグルタミン酸だけでなく、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与するほぼすべての遺伝子の有意な発現上昇を示した（Extended Data Fig.）これらの結果から、B. infantis Bg2D9のコロニー形成はこれらの生物の群集中の存在量に影響を与えるが、P. copriのコロニー形成に伴うグリコシド活性（例えば、アラビナン分解）が、これらの生物の代謝反応の主要な決定要因であることが示唆される。

B. infantis Bg2D9、P. copriおよび腸内遺伝子発現
次に、B. infantis Bg2D9およびP. copriが微生物群集構造および発現代謝機能に及ぼす影響が、小腸の栄養吸収に特化した部分の上皮細胞における代謝変化と関連しているかどうかを検証した。この解析では、1群および3群の小腸サンプルをさらなる解析に使用した。これは、(1)B.infantis Bg2D9とP.copriを併用することで、どちらか一方の生物単独よりも大きな効果が得られたこと、(2)arm 1では、P21の離乳移行期までB.infantisとP.copriの両方でコロニー形成に成功したことで、臨床試験に参加した小児の微生物群集をよりよく反映することができたからである11。使用したB. infantis株が異なること、およびP. stercoreaではなくP. copriがより高いフィットネスとMDCF-2糖鎖を標的とするPULのより高い発現を示したことから、これらの生物の組み合わせの効果を比較するために、arm 1を「B. infantis Bg2D9とP. copriあり」、arm 3を「B. infantis Bg463とP. copriなし」と呼ぶ。

B. infantis Bg2D9とP. copriを併用した」マウスと「B. infantis Bg463とP. copriを併用しなかった」マウスでは、空腸絨毛の高さと陰窩の深さに有意差はなかった（それぞれn＝8および7匹；補足表9）。単核RNA配列決定（snRNA-seq）を用いて、P53動物から採取した空腸組織において、これら2つのコロニー形成状態が発現機能に違いをもたらすかどうかを調べた（各処置群につきn＝4、図2a-c、拡張データ図5、補足表10）。細胞クラスターは、4つの主要な腸管上皮細胞系譜（腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、パネス細胞）、および血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、平滑筋細胞、腸管ニューロンに割り当てられた（Extended Data Fig.）マーカー遺伝子解析によって、腸細胞系譜をさらに「絨毛基底部」、「絨毛中間部」、「絨毛先端部」の3つのクラスターに細分化することができた。統計的に有意な差次発現遺伝子の大部分（5,765個中3,651個；63.3％）は、これら3つの腸細胞クラスターに割り当てられた（Extended Data Fig.）

図2：P. copriおよびB. infantisの2つの異なる株を含む、または含まない細菌群集を含むマウスから採取した腸組織および血漿のsnRNA-seq解析および標的質量分析。
図2
図1aに記載した実験（P53）の終了時にアーム1（P. copriとB. infantis Bg2D9を含む）とアーム3（P. copriを含まず、B. infantis Bg463を含む）から採取した肘腸組織サンプルを解析した（a-dとfについてはn = 4サンプル/処置アーム）。a, アーム1とアーム3のマウスの間で、その予測フラックスに統計的に有意な差があるRecon2反応の数。TA, transit amplifying. b, 各Recon2サブシステムにおいて、2つの治療群間で活性に統計的に有意な差があると予測されるRecon2反応の数。c,snRNA-seqによって同定された細胞クラスターの比率表示。アスタリスクはscCODAによって定義された「統計的に信頼できる差」を示す（補足表10cおよび方法）。平均値±s.d.を示す。d, 尿素サイクルとグルタミン代謝に関与する絨毛に沿って分布する腸細胞クラスターにおける選択されたRecon2反応。e, 腸の長さに沿ったシトルリンレベルと血漿中のシトルリンレベルの標的質量分析定量。平均値±s.d.および両側Mann-Whitney U検定によるP値を示す。f,単糖、アミノ酸およびジペプチドの細胞外トランスポーターに対するP.コプリを含むまたは含まない細菌コンソーシアムでのコロニー形成の効果。Ala、アラニン；Arg、アルギニン；Asp、アスパラギン酸；Cys、システイン；Gal、ガラクトース；Glc、グルコース；Gln、グルタミン；Glu、グルタミン酸；Gly、グリシン；His、ヒスチジン；Ile、イソロイシン；Leu、ロイシン； Lys、リジン；Met、メチオニン；Orn、オルニチン；Phe、フェニルアラニン；Pro、プロリン；Sar、サルコシン；Ser、セリン；Thr、スレオニン；Trp、トリプトファン；Tyr、チロシン；Val、バリン。これらのトランスポーターが選択され、絨毛の長さに沿った発現領域の空間情報が、公表されている実験的証拠に基づいて割り当てられた29。dとfの矢印は、各Recon2反応の「前方」方向を示す。ウィルコクソン順位和検定は、2つの治療群間の正味反応スコア（a、b、d、e）の統計的有意性を評価するために用いた。P値はWilcoxon順位和検定から計算し、多重比較のために調整した（Benjamini-Hochberg法）；q < 0.05を統計的有意性のカットオフとして用いた。

フルサイズ画像
NicheNet19を用いて、snRNA-seqデータセットから受信細胞と送信細胞間の潜在的なリガンド-受容体相互作用を同定した。上皮細胞クラスターのうち6つ（陰窩幹細胞、増殖通過増幅/幹細胞、絨毛基底細胞、絨毛中間細胞、絨毛先端腸細胞、杯細胞）を「受信細胞」とし、それ以外のクラスター（上皮細胞と間葉細胞の両方）を「送信細胞」とした。Extended Data Fig. 6は、各受信細胞クラスターについて、2つのコロニー形成条件間で変化する「善意のリガンド-受容体相互作用」19を示している。同定されたリガンドには、細胞増殖（igf-1）、細胞接着（cadm1、cadm3、cdh3、lama2、npnt）、絨毛の長さに沿った上皮細胞機能／分化のゾーン化（bmp4、bmp5）、免疫応答（cadm1、il15、tgfb1、tnc）に影響することが知られているものが含まれる（Extended Data Fig.）すべての受容体細胞クラスターの中で、陰窩幹細胞は最も多くの善意のリガンド-受容体相互作用の変化を示した。例えば、igf-1は腸上皮の再生を促進することが知られている20。私たちは、P. copriを含むコンソーシアムによるコロニー形成が、陰窩幹細胞受容体にシグナルを送る杯細胞やリンパ管内皮細胞におけるigf-1の著しい発現上昇と関連していることを発見した。

続いて、Compass21と代謝反応のRecon222データベースを用いて、様々な細胞クラスター（(1)リーベルキュンの陰窩に位置する幹細胞および増殖通過増幅細胞クラスター、(2)3つの絨毛関連腸細胞クラスター、(3)杯細胞クラスター）における代謝フラックスのインシリコ予測を行った。図2は、絨毛の長さに沿って分布する腸細胞および杯細胞における、予測された代謝フラックスの違いを示している（Methods）。腸細胞系に属するクラスターでは、統計的に有意な差の数は絨毛底部の腸細胞で最も多く、絨毛先端に向かって減少している（図2a）。アーム3のマウスと比較すると、アーム1のマウスは、絨毛基底部および絨毛中間部の腸細胞において、エネルギー代謝、炭水化物、アミノ酸、脂肪酸の代謝、および各種トランスポーターに関連するサブシステムの活性の予測増加が大きかった（図2bおよび拡張データ図7）。

腸細胞はグルタミンを主要なエネルギー源としているが、脂肪酸やグルコースも利用できる。アーム1のマウスの絨毛状腸細胞で起こる脂肪酸酸化に関連する反応は、アーム3のマウスの絨毛状腸細胞に比べ、リーベルキュン陰窩まで拡大した細胞で増加することが観察された（図2b）。脂肪酸酸化は腸管幹細胞の維持・再生に関係している23。P. copriおよびB. infantis Bg2D9をコロニー形成したマウスでは、陰窩幹細胞および増殖性通過増幅／幹細胞の割合が増加したが、絨毛関連腸細胞クラスターでは増加しなかった（図2cおよび補足表10c）。B. infantis Bg463でコロニー形成され、P. copriを欠くマウスと比較して、B. infantis Bg2D9とP. copriでコロニー形成されたマウスは、グルタミン酸代謝、尿素サイクル、脂肪酸酸化および解糖に関与するサブシステムの活性から判断して、杯細胞におけるエネルギー代謝の増加が予測された（図2b）。

シトルリンは一般に、ヒトの食事にはあまり含まれていない。小腸腸管細胞でグルタミン代謝を介して主に合成され、循環系24に輸送され、代謝活性の高い腸管細胞量の定量的バイオマーカーとして機能する。血漿中濃度は小腸の吸収能力を示す。栄養不良の小児では低く、バングラデシュの中等度急性栄養失調の小児ではMDCF-225,26,27の投与後に上昇した。B.インファンティスBg2D9およびP.コプリを保有するマウスは、絨毛底および絨毛中部の腸細胞クラスターにおいて、シトルリン合成に関与する反応が統計学的に有意に増加することがCompassにより予測された（q < 0.05（調整P値）；ウィルコクソン順位和検定；図2d）。質量分析による追跡調査では、シトルリンが空腸、回腸、大腸の組織セグメントおよび血漿中で、3群に比べ1群で有意に増加していることが確認された（図2eおよび補足表10d）。

また、P. copriとB. infantis Bg2D9の存在は、絨毛底および絨毛中期の腸細胞における9種類のアミノ酸（必須アミノ酸であるロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンを含む）、ジペプチド、単糖類（グルコースとガラクトース）の輸送において、有意に高い予測活性と関連していた（図2f）。これらの予測は、絨毛の基部と中間部で空腸内に輸送されることが知られているこれらの重要な成長促進栄養素の吸収能力が高いことを示唆している24。

宿主の代謝と体重増加に対するP.コプリの影響
我々はより多くの動物（4匹の無菌ダムを二重に収容し、1腕あたり18～19匹の生存可能な仔ダムを得た）を用いて上述の実験を繰り返した。上記の実験で観察された体重増加の表現型と代謝の変化が、微生物群集におけるP. copriの存在または不在に起因するかどうかを調べるために、この繰り返し実験の両群でB. infantis Bg2D9を投与した。この変更以外は、同じ培養株、同じ導入順序、同じ飼料切り替え順序を適用した（Extended Data Fig.）安楽死（P53；補足表11）時に採取した糞便サンプル中のコンソーシアムメンバーの絶対量を定量化することで、各群内でのコンソーシアムメンバーのコロニー形成が再現可能であることを確認した。前回の実験と同様に、P. copriを含む群では、P. copriを含まない群に比べ、P23からP53の間で有意に体重増加が大きかった（Extended Data Fig.8bおよび補足表12）。

標的質量分析を用いて、2群のマウスの空腸、結腸、腓腹筋、大腿四頭筋、心筋、肝臓における20種類のアミノ酸、19種類の生体アミン、66種類のアシルカルニチンのレベルを定量した。さらに、血漿中の66種類のアシルカルニチンを定量した。結果は補足表13とExtended Data Fig. 前回の実験と同様、代謝活性の高い腸細胞バイオマスのバイオマーカーであるシトルリンは、P.コプリを添加した群のマウスの空腸で有意に上昇した（Extended Data Fig.）パルミチン酸（C16:0）、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）およびリノレン酸（C18:3）に由来するアシルカルニチンの有意な増加が、P. copri定着マウスの空腸で観察された（Extended Data Fig. これらのアシルカルニチン鎖長は、空腸サンプル中の他のすべての中鎖または長鎖アシルカルニチン種よりも高濃度で検出され、食餌の主要な脂質エネルギー源としての役割を示している（補足表13b）。これらの種の増加は、P. copriにコロニー形成された動物の空腸において、長鎖食餌脂質の輸送とβ酸化が増加したことを示唆している。

大腸組織の分析から、P. copri-colonized動物ではC16:0、C18:1およびC18:2アシルカルニチンの有意な上昇が認められ、脂質の吸収に直接関与していない組織コンパートメントでもβ酸化が上昇していることが示唆された（P < 0.01；Mann-WhitneyのU検定）（Extended Data Fig.）この所見は、P. copriコロニー形成動物における非エステル化脂肪酸の血漿レベルの有意な上昇と一致しており、末梢組織における脂肪酸β酸化を支持していると考えられる（拡張データ図8fおよび補足表13c）。さらに、分岐鎖アミノ酸の異化に由来することが知られているC3およびC4アシルカルニチンの大腸（および空腸）レベルは、P. copriコロニー形成動物で有意に上昇した（Extended Data Fig.）

P. copriのコロニー形成と別の食餌による体重増加
次に、P. copriのコロニー形成の影響を、Mirpurに住むバングラデシュの生後18ヶ月の子供が通常摂取する「対照」食（「Mirpur-18食」）4との関連で調べた。(2)P24に、異なる産仔の仔を混合し、MDCF-2とMirpur-18の2つの食餌処理群に無作為に割り付けた（1群あたりn = 2のダムと12の仔）。P53の安楽死時に採取した糞便内容物から、群集メンバーの絶対量を定量した。P. copri Bg131の絶対量には2つの食餌群間で有意差はなかったが、19種の群集メンバーのうち11種の存在量には統計的に有意な差があった（Extended Data Fig.9）。それにもかかわらず、我々はP. copriが群集に存在することに関連する体重増加の表現型が、Mirpur-18食餌の状況でも明らかであるかどうかの検証を進めた。そのために、すべての動物をMirpur-18飼料で離乳させたが、一方のグループにはP. copri Bg131を投与し（n = 8匹）、もう一方には投与しなかった（n = 9匹）。すべての動物はP53で安楽死させた。P. copriはマウスにうまくコロニー形成され、実験期間中、以前の実験と同程度のレベルに維持された（P53で、糞便内容物1グラム当たり10.4±0.1log10ゲノム当量）。重要なことは、2群間で体重増加に統計的に有意な差がなかったことである（P = 0.297；線形混合効果モデル（Methods））。これらの所見は、この前臨床モデルにおける体重増加に対するP. copriの効果が食餌依存性であることを示す証拠となる。

MAGsのBg0018およびBg0019に類似したP. copri分離株の試験
我々は以前、Mirpurに住むバングラデシュの子どもたちから培養した5つの糞便中P. copri株の特徴を明らかにした11。これらの株のうち2株（BgD5_2株とBgF_2株）は、P. copri Bg131株を含む他の分離株よりも、MAGs Bg0018株とBg0019株とのゲノム類似性が高く、系統学的距離、PUL含量、代謝経路の表現によって定量化された（図3aおよび補足表14a）。例えば、Bg0018/Bg0019で機能的に保存されている10個のPULのうち9個が、P. copri BgD5_2およびBgF5_2に存在し、55個の糖質利用経路のうち53個がP. copri BgD5_2およびBgF5_2に存在した（図3aおよび補足表14a-d）。さらに、MDCF-2に代表される様々な糖鎖を添加した培地で行ったin vitro増殖アッセイの結果、BgF5_2株はBg131株よりも、MDCF-2に豊富に含まれる糖鎖および／またはMDCF-2特有の糖鎖を、すぐに使える補助食品（すなわち、アラビナン、アラビノキシラン、ガラクタンおよびガラクトマンナン）と比較して強く好むことが明らかになった11。

図3：MAGs Bg0018およびBg0019に近縁な2つのP. copri株による離乳前のコロニー形成が、宿主の体重増加およびMDCF-2糖鎖分解に及ぼす影響の試験。
図3
a, 2つのP. copri MAGsに高度に保存されているPULと3つの培養P. copri株におけるそれらの発現の比較. b, 試験デザイン（各処理群につきn = 2のダムと13の子孫）. c, 実験終了時（P53）に採取した糞便内容物におけるP. copri株の絶対量と総細菌量. BgD5_2株とBgF5_2株および総細菌量の比較の厳密なP値は、それぞれ2×10-5および2×10-5である。群間差のP値はP = 4 × 10-5（線形混合効果モデル（Methods））。 e, P. copri BgD5_2とBgF5_2に共通するPULの動物の糞便内容物における発現のGSEA。Benjamini-Hochbergで調整したP値は、P. copriがコロニー形成したサンプル全体の平均log2 TPMによって遺伝子をランク付けするGSEAを用いて計算した。バイオリンプロットは、各サンプルの各分離株（n = 201遺伝子）において、22の予測PULのいずれかに割り当てられた全遺伝子のlog2 TPMを示し、コンセンサスPUL 17（アラビナン、デンプン；n = 22遺伝子）、PUL 4（ペクチン；n = 13遺伝子）、PUL 16（ペクチン性ガラクタン；n = 15遺伝子）のホモログを灰色で、残りの全PUL遺伝子と比較して色分けしている。内部ボックスプロットは、PULに割り当てられた全遺伝子の中央値（円）と四分位値（ボックス境界）を示す。f, P53で採取した糞便内容物に存在する糖鎖中の総アラビノースとガラクトースのUHPLC-QqQ-MS分析。アラビノースとガラクトースのP値はともに2×10-5である。g,h, UHPLC-QqQ-MSによる糞便内容物中のアラビノース（g）とガラクトース（h）を含むグリコシド結合の分析。t-Araf、2-Araf、2,3-Araf、3,4-Xylp/3,5-Arafおよび5-Araf (g)の正確なP値は、それぞれ2×10-5、8×10-5、2×10-5、2×10-5および2×10-5である。2,4,6-ガラクトース、3,4,6-ガラクトース、4-ガラクトースの正確なP値は、それぞれ3×10-5、2×10-5、2×10-5である。平均値±s.d.を示す。P値は両側Mann-Whitney U検定を用いて計算した（c,f-h）。b-hの各点は個々の動物を表す。

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MAGsのBg0018およびBg0019に似たP. copri株を離乳前にコロニー形成させることが、成長を促進し、上記の代謝効果をもたらすのに十分であるかどうかを直接決定するために、我々は、そのデザイン（図3b）が我々の以前の実験（図1bおよび拡張データ図8a）と類似しているが、いくつかの変更を加えた実験を行った。第一に、WLZ関連MAGs Bg0018とBg0019とのゲノム類似性が高いため、P. copri Bg131の代わりにP. copri BgD5_2とBgF5_2を用いた。第二に、最初の実験（図1）で使用したB. infantis株の違いをコントロールするため、この「第三の」実験では両群ともB. infantis Bg2D9を投与した（Extended Data図8に記載した第二の実験の場合と同様）。第三に、P. stercoreaはP. copriよりも低い頻度でコロニー形成しており、MDCF-2糖鎖に関連するCAZymesを発現していなかったため、2回目の経口投与混合物には含めず、P. copriのみを含むようにした。第四に、最初の実験でB. infantis Bg2D9がP. copriの離乳前のコロニー形成を促進したことから、離乳期の終わりに投与していたP. copriとP. stercoreaを含む第四回目の経口投与を省略した。前回と同様、P. copriを投与しなかった動物を対照群とした（各処理群につきn = 2ダムおよび13仔）。

安楽死時（P53）に採取した糞便内容物から単離したDNAのショットガンシーケンシングにより、実験群の動物がP. copriの両単離株だけでなく、定義したコンソーシアムの他の全メンバーにコロニー形成されていたことが確認された（補足表15）。BgD5_2株はBgF5_2株よりはるかに生育不良であったにもかかわらず11、両方の分離株でコロニー形成された動物では、BgD5_2株はBgF5_2株より絶対量が多かった（Fig. 3c）（Fig. 1bおよびExtended Data Fig. 8aに記載された実験では、P. copri Bg131ではそれぞれ31 ± 6.6%、24 ± 8.0%であったのに対し、相対存在量はそれぞれ37.8 ± 4.4%、15.5 ± 1.0%であった）。2つのグループを比較すると、BgD5_2およびBgF5_2によるコロニー形成は、他のバクテリアを置き換えることなく、群集バイオマスを増大させた（図3cおよび補足表15b）。

P. copri BgD5_2およびBgF5_2をコロニー形成したマウスでは、P. copriをコロニー形成していないマウスと比較して、P23とP53の間で体重の有意な増加が観察された（図3dおよび補足表16）。実験群と対照群間の離乳後体重の平均増加率の差（24％）は、図1bおよびExtended Data Fig. これらの以前の実験と同様、体重の差は糞便サイズの差に起因するものではなかった。

質量分析により、P. copriの離乳前コロニー化が腸の脂質代謝に影響を与え、MDCF-2糖鎖分解の主要な決定因子であることが確認された。回腸および結腸組織のターゲットLC-MSにより、大豆油脂質に対応する長鎖アシルカルニチンの有意な増加が明らかになった（Extended Data Fig. 糞便内容物の微生物RNA-seqから、全PUL遺伝子の中で、アラビナン／デンプン、ペクチン、ペクチン性ガラクタンが基質と予測される3つの保存PULに存在する遺伝子が、有意に高い発現レベルで濃縮されていることが明らかになった（方法；図3eおよび補足表18）。糞便内容物中に存在する糖鎖中の単糖をUHPLC-QqQ-MSで測定した結果、P. copri BgD5_2とBgF5_2が存在すると、P. copri Bg131を用いた以前の観察結果と一致するように、アラビノースのレベルが有意に低くなり、ガラクトースも有意に低くなった（この実験特有の知見）（図3fおよび補足表19）。P. copri BgD5_2およびBgF5_2によるコロニー形成はまた、測定されたすべてのアラビノース含有グリコシド結合と3つのガラクトース含有結合のレベルを有意に低下させた（図3g,hおよび補足表19）。これらのデータを総合すると、P. copri Bg131を含む微生物群集と比較して、これら2つの分離株のPUL含量はMDCF-2糖鎖の分解の増強と関連していることが示された。全20種類のアミノ酸と7種類のビタミンB群のUPHLC-QqQ-MSによる測定から、対照群と比較して、P. copri BgD5_2とBgF5_2のコロニー形成は、2種類の必須アミノ酸（トリプトファン、リジン）、7種類の非必須アミノ酸（グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、プロリン、グリシン）、およびパントテン酸（ビタミンB5）の糞便中濃度が有意に高いことと関連していることも明らかになった（補足表20）。

これらの実験から、（1）離乳前にP. copriをコロニー形成させると、MDCF-2食餌の条件下で体重増加が促進される、（2）この種の特定の菌株の存在がMDCF-2糖鎖分解の主要な決定因子／作用因子である、（3）これらの菌株を腸内コミュニティに組み込むと、腸の細胞代謝が変化する、との結論に達した。

考察
マイクロバイオームを標的とした栄養学的介入が、微生物叢とヒトの生理学に分子・細胞・システムレベルで影響を与えるメカニズムを明らかにしようとする場合、ヒトの腸内および腸外のさまざまな部位から組織にアクセスすることが大きな課題となる。本研究では、この課題に対処するために使用できる「逆翻訳」戦略を説明する。栄養失調の有病率が高いバングラデシュのコミュニティで生活する子どもたちから採取した糞便サンプルから培養した、年齢およびWLZに関連する細菌株の定義されたコンソーシアムで、グノトビオティックマウスをコロニー形成させた。P. copriは、炭水化物の利用に関与するPULや代謝経路を含むゲノム上の特徴が、臨床試験における体重増加の改善に関連するMAGと非常に類似している培養分離株によって代表された。これらのコミュニティは、MDCF-2の臨床試験に登録された小児が摂取した食事を再現した一連の食事の中で、ダムから仔への伝播が起こった。微生物RNA-seqと腸内容物に存在するグリコシド結合の標的質量分析から、P. copriがMDCF-2に含まれる多糖類の代謝に重要な役割を果たしている証拠が得られた。これと一致して、前臨床モデルにおけるP. copriに関連した体重増加はMDCF-2の摂取に依存していた。この表現型は、バングラデシュの子供たちが一般的に摂取する食事を投与した場合には観察されなかったが、2つの食事環境におけるP. copriのコロニー形成レベルは同程度であった。腸内のsnRNA-seqと標的質量分析から、B. infantis Bg2D9とP. copriの組み合わせを含むコンソーシアムでコロニー形成すると、脂質（MDCF-2の主要脂質成分である大豆油に最も多く含まれる脂肪酸を含む）の取り込みと代謝が増加することが示された。アミノ酸（必須アミノ酸を含む）および単糖類の取り込みと代謝に対するさらなる影響も予測され、一部のケースでは質量分析アッセイによって検証された。snRNA-seqによって、絨毛の基部、中間部、先端部に位置する腸細胞の集団が、多くの代謝機能の異なる発現パターンを示すという、これらの効果の空間的特徴が明らかになった。

臨床試験の結果にヒントを得て、我々の「逆翻訳」実験の目的は、生後の腸内微生物群集の形成とMDCF-2への曝露をエミュレートしたモデルにおいて、P.コプリの有無が及ぼす影響を確認することであった。今回の研究は、メカニズム的にも治療的にも意味のあるいくつかの問題を提起している。バングラデシュで培養したP. copri株をマウスに単コロニー化することはできなかった。したがって、他の微生物との相互作用の可能性がない限り、これらの菌株がMDCF-2の糖鎖代謝、体重増加、および／または腸上皮生物学に及ぼす影響をin vivoで直接調べることはできなかった。さらに、本研究で得られた知見と臨床試験参加者の糞便中マイクロバイオームを直接解析して得られた知見11から、MDCF-2糖鎖の分解が体重増加の促進に必要であることが示された。P.コプリが（1）腸管上皮の遺伝子発現、宿主の代謝、体重増加に直接的な影響を及ぼすのか、（2）P.コプリの存在または不在に依存する他の群集メンバーの影響を及ぼすのかを確認するためには、ダムに導入された（その後、その子孫に伝達される）細菌群集の組成を系統的に操作する追加研究が必要である。もしP. copriが宿主に直接的な影響を及ぼすのであれば、これらの影響のメディエーターがMDCF-2糖鎖代謝の直接的な産物なのか、あるいはこれらの糖鎖の生体内変換によって活性が制御されるP. copriの他の代謝経路の産物なのか、あるいは他のMDCF-2構成成分なのかはまだ明らかにされていない。P.コプリが腸上皮の糖質、脂質、アミノ酸代謝に及ぼす影響が、どの程度体重増加に寄与しているかを明らかにするためにも、今後の研究が必要である。snRNA-seqによって記録された代謝経路発現の空間的特徴をさらに明らかにする必要がある。例えば、（1）クリプト-絨毛軸に沿ったP. copriおよびその他の群集メンバーの分布を記録すること、（2）空間トランスクリプトミクス29,30の方法を進歩させ、上皮細胞系と微生物群集メンバーの両方に（同時に）適用できるようにすること、（3）in situ質量分析を用いて、個別の腸細胞集団の代謝プロファイルを直接特徴付けること、などが必要となる。

B. infantis Bg2D9による顕著な初期コロニー形成と、その後のP. copriのコロニー形成能力との関係についても、さらなる調査が必要である。B. infantis Bg2D9には、他のほとんどの培養B. infantis株には見られないゲノム遺伝子座がいくつかあり、様々な食餌性炭水化物を利用する能力を高めている可能性がある13。原理的には、これらの遺伝子座は、母乳の消費量が少ない栄養不良の子どもにおいて、B. infantis Bg2D9の体力を向上させる可能性がある。バングラデシュのSAMの乳児や幼児は、健康な子どもに比べてB. infantisのレベルが著しく低いか、あるいは完全に欠落している13。この前臨床研究で証明されたB. infantisとP. copriの相互作用は、まずSAMの患者にB. infantis Bg2D9を投与し、その後MDCF-2を投与して年齢に応じたマイクロバイオーム構成を回復させ、健康な成長を促進する効果を試験する根拠となる。

要約すると、本研究と我々の付随研究11は、食事成分の主要代謝因子として、また宿主の生物学的応答の主要なエフェクターとして機能する腸内微生物群集のメンバーを同定するための1つのアプローチを示している。この結果は、MDCFによる治療の候補者である栄養不良の小児集団を層別化し、適応的臨床試験デザインを含め、治療反応をモニタリングするためのマイクロバイオームベースの診断法を開発するための出発点となり得る。このアプローチに対するもう一つの潜在的な投資効果は、(1)（すでに同定されている）生理活性糖鎖から構成される「次世代」MDCFを、地理的に異なる地域に住む集団にとってより入手しやすく、手頃な価格で、文化的に受け入れられうる代替食品源から作り出すために必要な知識ベースである； (2) 発達段階（年齢）と疾患の重症度の関数として、栄養不良の子どもへのMDCFの投与について、より多くの情報に基づいた決定を行うこと、および(3) 食品成分が子どものマイクロバイオームの成長を促進する要素のフィットネスと発現する有益な機能にどのような影響を与えるかについての洞察に基づいて、補完栄養実践に関する方針を発展させること。

方法
倫理声明
報告された研究は、適用されるすべての倫理規定を遵守している。細菌株は、International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh（icddr,b）の倫理審査委員会（Ethical Review Committee）によって承認されたプロトコールのもと、インフォームド・コンセントを得て採取した糞便サンプルから培養した。icddr,bとWashington University in St. Gnotobioticマウス実験は、Institutional Animal Care and Use CommitteeおよびInstitutional Biological and Chemical Safety Committeeのプロトコルに従い、Washington University Animal Studies and Environmental Health and Safety Committeeの承認を得て実施された。

細菌ゲノムの配列決定とアノテーション
各単離株の単培養を、嫌気条件下（雰囲気；75％N2、20％CO2、5％H2）、コイチャンバー内のWilkins-Chalgren Anaerobe Broth（Oxoid、カタログ番号CM0643）中、37℃で一晩、振盪せずに培養した。細胞は遠心分離（5,000×g、10分間、4℃）により回収した。高分子ゲノムDNAを製造元のプロトコールに従って精製し（MagAttract HMW DNA kit, Qiagen）、その量を定量した（Qubit fluorometer）。サンプルを29ゲージの針に6-8回通して上下させ、断片サイズ分布を測定した（～30 kbp; TapeStation, Agilent）。

断片化したゲノムDNA（400-1,000 ng）を、SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0（Pacific Biosciences社製）を用いて、ディープ96ウェルプレート（Fisher Scientific社製）フォーマットでロングリードシーケンス用に調製した。DNAのハンドリングおよびトランスファーのステップはすべて、ワイドボアのゲノムDNAピペットチップ（ART社製）を用いて行った。バーコード化したアダプターをA-tailフラグメントにライゲーションし（20℃で一晩インキュベーション）、その後、損傷または部分的なSMRTbellテンプレートを除去した（SMRTbell Enzyme Cleanup Kit）。高分子量のテンプレートを精製した（AMPureビーズの原液添加量＝DNA溶液量の0.45倍）。異なる株から調製したライブラリーをプールした（1プールあたり3～6ライブラリー）。AMPureビーズをSMRTbell溶出バッファーで最終濃度40%(v/v)に希釈し、プールしたライブラリーの2.2倍量の混合液を加えた。12μlのSMRTbell溶出バッファーでAMPureビーズからDNAを溶出した。プールしたライブラリーを定量し（Qubit）、サイズ分布を評価し（TapeStation）、塩基配列を決定した（Sequel System、Sequel Binding Kit 3.0およびSequencing Primer v4（Pacific Biosystems））。得られたリードをデマルチプレックスし、Q20サーキュラーコンセンサスシーケンスリードを作成した（SMRT Linkソフトウェアで設定したCromwellワークフロー）。HiFi-errorを0.003、min-overlapを2,000、その他のオプションをデフォルトに設定し、Flye31（v2.8.1）を用いてゲノムをアセンブルした。ゲノムの品質はCheckM32（v1.1.3）を用いて評価した（補足表1a、5、14a）。

Prokka33 (v1.14)を用いて、アセンブルされたゲノム中のオープンリーディングフレーム(ORF)を同定した。SEEDゲノムアノテーションプラットフォーム34を応用した「サブシステム」アプローチを用いて、これらのORFの機能アノテーションを行った。ヒト腸内細菌ゲノム2,856個35,36,37にアノテーションされた、4つの主要カテゴリー（アミノ酸、ビタミン、炭水化物、発酵産物）に分類される98種類の栄養素／代謝産物の中核代謝を捉えたmcSEED代謝サブシステムのコレクションを用いて、20の分離ゲノムの9,820個のORFに機能を割り当てた。選択されたmcSEED代謝経路のインシリコ再構築は、機能的遺伝子アノテーションと、相同性ベースの手法およびゲノムコンテキスト解析を用いた予測に基づいて行われた。再構成はバイナリー表現型マトリックス(BPM)として表現され、アミノ酸とビタミンB群の'1'の割り当ては予測されたプロトトロフィーを示し、'0'はオーソトロフィーを示す。炭水化物については、「1」と「0」はそれぞれ、示された単糖、二糖またはオリゴ糖を利用する菌株の予測された能力または能力を示し、発酵最終産物については、「1」と「0」はそれぞれ、示された化合物を生産する菌株の予測された能力または能力を示す（補足表1cと14d）。

5つのP. copri単離株とMAG Bg0018およびBg0019の系統関係を計算するために、まずCheckM32（v1.1.3）を用いて、各単離株または2つのMAGのそれぞれに含まれる43のシングルコピー・マーカー遺伝子のアミノ酸配列と、Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482の単離株ゲノム配列（PATRICアクセッション番号226186.12）を抽出し、アラインメントした。連結されたマーカー遺伝子配列はfasttree38（v2.1.10）を用いて解析され、Jones-Taylor-ThorntonモデルとCAT進化率近似を用いて系統樹が構築され、その後Gamma20最適化を用いて樹の再スケーリングが行われた。その後、ape39(v5.6-2)を用いて、B. thetaiotaomicronゲノムをルートとし、ゲノム間の系統距離を抽出し、ggtree40(v3.2.1)を用いてツリーをプロットした。

これらの菌株とMAGのゲノム間の類似性は、pyani41 (ANIm (ANI calculated with the MUMmer algorithm) implementation of ANI, v0.2.10)を用いてANIスコアを計算することにより定量化した。まず、MAGと培養細菌株のゲノムとの間の可能性のある全ての組み合わせについてANImスコアを計算し、その後、アライメントカバレッジが10%未満のMAGと菌株ゲノムの組み合わせを取り除いた17。残りのMAGについて、培養細菌株のコレクションにおける「高度に類似した」ゲノムは、94%以上のANImスコアを有すると定義した（補足表1b）。次に、培養細菌株コレクション中の各ゲノムとその「高度に類似した」MAGとの間の二値表現型の一致の程度を決定した。バイナリー表現型の一致スコアは、培養菌株のゲノムとMAGの間で共有されるバイナリー表現型11の数を、菌株とMAGでアノテーションされたバイナリー表現型の総数で割ることによって計算した。各ゲノムの「代表的なMAG」は、バイナリー表現型の一致スコアが90％以上であると定義した（補足表1c）。

PULはref. 42に記載された方法に基づいて予測され、PULDB（Polysaccharide Utilization Lociation Database）インターフェース43を用いて表示された。PULは3つのカテゴリーに分類された： (1)「機能的に保存されている」（それぞれのゲノムの同じ組織に、同じCAZymesとSusC/SusDタンパク質をコードする共有のORFを含み、タンパク質間のアミノ酸の同一性が90％以上のPUL）； (2)「構造的に異なる」（それぞれのゲノムに存在するが、1つ以上のCAZymesまたは1つ以上のSusC/SusDタンパク質が欠損しているか、機能に影響を与えそうな形で断片化されている、または余分なPULエレメントが存在するPUL）、(3)「保存されていない」（それぞれのゲノムに存在するが、機能を完全に損なうと思われる変異がある、またはPULが同定されていないPUL）。

コロニー形成と飼育
無菌C57BL/6Jマウスは、プラスチック製フレキシブルフィルム製アイソレーター（Class Biologically Clean社製）で、23℃、12時間の厳密な光サイクル（点灯は0600時）で飼育した。各ケージにはオートクレーブ滅菌した紙製の「羊飼い小屋」を置き、自然な営巣行動を促し、環境を豊かにした。

MDCF-2を含む離乳用飼料は本文にあるように調製した。異なる飼料モジュールに含まれる成分を組み合わせ、混合物を乾燥、ペレット化し、ガンマ線照射（30～50kGy）により滅菌した。無菌性は、0.5％の酵母エキスを添加した脳心筋注入培地（LYBHI培地44）およびWilkins-Chalgren Anaerobae Broth中で、好気性および嫌気性条件下、37℃で7日間培養した後、LYBHIプレートおよび血液寒天プレートにプレーティングすることで確認した。各照射飼料の栄養分析はネスレピュリナ分析研究所で行った（補足表2c）。

トリオ交配に由来する妊娠C57BL/6Jマウスには、妊娠中および分娩後2日目までオートクレーブ処理したブリーダーチャウ（Purina Mills; Lab Diet 5021）を自由摂取させた。図1bおよび3b、ならびにExtended Data Figs 8aおよび9aに記載したgnotobioticマウス実験の実験デザインに関する要点は以下の通りである： (1) すべての細菌株はWilkins-Chalgren Anaerobe Brothで培養し（LYBHI培地で培養したF. prausnitziiを除く）、37℃で一晩増殖させた後に回収した（補足表1a）。prausnitziiを除き、すべてのギャベージ混合物には同量の（OD600で）構成細菌株が含まれていた。（3）各細菌コンソーシアムは、経口ギャベージ針（Cadence Science；カタログ番号7901）を用いて200μlの容量で産後のダムに投与された。1b; Extended Data Fig.8aに概略を示した実験では、処理群当たり4匹のダムと18～19匹の仔ウシ；Fig.3bに示した実験では、処理群当たり2匹のダムと13匹の仔ウシ；Extended Data Fig.9aに示した実験では、処理群当たり2匹のダムと12匹の仔ウシ）、（5. 9a）、（5）分娩後1日目から14日目まで毎日、各ケージで敷料の半分を新しい敷料に交換し、その後は7日ごとに敷料を交換した、（6）母親だけでなく、離乳期および離乳後の仔マウスにも自由摂取で飼料を与えた、（7）安楽死させたマウスから採取した生体試料は（絶食させずに）液体窒素でスナップ凍結し、使用前に-80℃で保存した。

仔マウスの体重はP23、P35、P53で測定し、P23の体重で正規化した。線形混合効果モデルを用いて、正規化マウスの体重増加に対する異なる微生物群集の影響を評価した：

$${\rm{Normalized}}; {\rm{weight}} \sim {\beta }{1}\left({\rm{arm}}\right)+{\beta }{2}\left({\rm{postnatal}}; {\rm{day}}\right)+\left(1|{\rm{mouse}}\right)$$
回腸、糞便および糞便群集における細菌株の絶対量の定義
細菌株の絶対量は、以前に記載された方法に若干の修正を加えて測定した45,46。簡単に説明すると、Alicyclobacillus acidiphilus DSM 14558の3.3×106細胞とAgrobacterium radiobacter DSM 30147の1.49×107細胞（文献45）を、DNA単離とショットガンシーケンス用のバーコード付きライブラリーの調製の前に、秤量した各凍結サンプルに添加した。シーケンシングはIllumina NextSeq装置を用いて行った。細菌の存在量は、各細菌ゲノムにリードを割り当てた後、特定のコミュニティ46のコンテキストにおけるゲノムの一意性のために正規化することによって決定した。得られたカウント表をR47（v4.0.4）にインポートした。スパイクインA. acidiphilus (Aa)とA. radiobacter (Ar)ゲノムを基準として、サンプルj中のある株iの絶対量を以下の式で計算した：

$$\begin{array}{l}{\rm{strain}}{i,,j}=\left(\frac{{\rm{counts}}{i,,j}\times {{Aa}}; {\rm{cells}}; {\rm{added}}{j}}{{{Aa}}; {\rm{counts}}{j}\times {\rm{sample}}; end{array}$$
回腸、大腸および糞便サンプルにおける実験グループ間の所与の菌株の存在量における観察された差の統計的有意性は、図1に記載された実験における3つのアーム間の各一対比較について、Kruskall-Wallis検定に続くDunnの検定、または図3および拡張データ図1bおよび9に記載された実験における2つのアーム間のMann-Whitney U検定を用いて決定した。B.infantisまたはPrevotella属以外の16種の生物のlog10絶対存在量プロファイルから計算した主成分へのサンプルの投影について、並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）48を用いて、図1gに記述した3つの群における群集組成の違いの統計的有意性を決定した。Rパッケージlme449（v1.1-27）およびlmerTest50（v3.1-3）内の線形混合効果モデルを用いて、異なる処理群および時間にわたって観察された特定の菌株の存在量の差の統計的有意性を検定した。実験期間中の糞便サンプル中のP.copri絶対量の変化を線形混合効果モデルで求めた：

P.コプリの絶対量の変化は線形混合効果モデルで求めた。\sim {\beta }{1}\left({\rm{arm}}\right)+{\beta }{2}\left(\rm{postnatal}; \rm{day}\right)+\left(1|{\rm{mouse}}\right)$$
図1の実験では、96個の糞便サンプル（2.2×106±1.2×105個の一方向75ntリード/サンプル（平均±s.d.））と、20個の大腸サンプル（1.5×106±4.2×105個の一方向75ntリード/サンプル）、20個の回腸サンプル（1.5×106±9.1×104個の一方向75ntリード/サンプル）をシーケンスした（補足表4a）。Extended Data Fig.1bに記載した実験では、糞便37サンプル（サンプルあたり5.8×106 ± 1.6 × 106一方向性75 ntリード）（補足表6a））、Extended Data Fig.8aに記載した実験では、糞便37サンプル（サンプルあたり1.3×106 ± 1.3 × 105一方向性75 ntリード）（補足表11a））の塩基配列を決定した。図3bの実験では、26個の糞便サンプルをシーケンスした（サンプルあたり2.9 × 106 ± 5.6 × 106 150 ntペアエンドリード（補足表15a））。

微生物RNA-seq
実験終了時に採取した糞便内容物からRNAを単離した6。相補的DNAライブラリーは、「Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus」キット（イルミナ社）を用いて単離したRNAサンプルから作成した。バーコード化されたライブラリーをシーケンスした（Illumina NovaSeq instrument）。図1bに示す実験では、20種類の糞便内容物サンプルから回収したcDNAを、それぞれ7.8×107±9.6×106の双方向150ntリード（平均±s.d.）の深さで配列決定した（補足表8a）。図3bの実験では、26種類の異なる糞便内容物サンプルからのDNAを、それぞれ6.5×107±2.1×107双方向150 ntリードの深さまで配列決定した（補足表18a）。生リードはTrimGalore51（v0.6.4）を用いてトリミングした。100bp以上のトリミングリードはkallisto52 (v0.43.0)を用いて参照ゲノムにマッピングした。

図3eおよび拡張データ図4a,bに記載したP. copriおよびP. stercorea PULの遺伝子の発現を解析するために、kallistoを用いてリードをゲノムにマッピングし、TPM（transcripts per million）値を得た（図1bおよび図3b）。TPM正規化発現は、ライブラリーの深さと遺伝子の長さの違いをコントロールするために用いた。図3eと拡張データ図4a,bでは、seaborn53 (v0.12.1)Pythonパッケージを用いて、予測されたすべてのPUL遺伝子について、偽カウントを1としたlog2 TPMを可視化し、各バイオリンプロットの左側にグレーで示したPUL遺伝子の残りに対して、各バイオリンプロットの右側に個々のPULを色分けして示した。Benjamini-Hochberg調整GSEA P値はfgsea54 (v1.20.0)を用いて計算され、与えられたarmのPrevotella-colonizedサンプル全体の平均log2 TPMによって遺伝子をランク付けした。各PULは、与えられた分離株からのすべてのPUL遺伝子を背景に遺伝子セットを構成し、最小および最大遺伝子セットサイズはそれぞれ5および50遺伝子であった（補足表8bおよび補足表18b）。

図3eに記載した解析では、P. copri BgD5_2とBgF5_2の間で100%ヌクレオチド同一性を持つ遺伝子の割合が高いことを考慮し、修正を加えた。P.コプリBgF5_2遺伝子セット全体と、P.コプリBgF5_2で同一配列を共有しないP.コプリBgD5_2遺伝子のサブセット（3,066遺伝子中61遺伝子）のみを含むことにより、2つの分離株間のユニークな遺伝子セットを表すkallistoインデックスを作成した。TPMは、P. copri BgD5_2およびBgF5_2 PULのユニークな遺伝子セット（n = 201のユニークな遺伝子、2つの分離株間で同一の塩基配列を持つ195の遺伝子と各分離株からの3つのユニークな遺伝子からなる（補足表14c））にフィルターダウンされた。

Extended Data Fig.3dに記載した微生物転写産物の存在量正規化差分発現解析のために、上記の糞便DNAおよびcDNAライブラリーからのリードを、そのサンプルが由来するアームで投与された細菌の特定のセットにマッピングすることにより、一対のメタゲノムおよびメタトランスクリプトカリスト擬似カウントを作成した。ライブラリーサイズの正規化による歪みを防ぐため、得られたカウントマトリックスは、Prokka33によって予測されたrRNA遺伝子座のカウントのフィルタリングを受けた。MTXmodel55は、微生物群集における遺伝子の差次的発現を検定するための一般化線形モデルベースのアプローチで、基礎となるメタゲノム存在量の違いによる偽陽性をコントロールする。MTXmodelは、「within-taxon-sum-scaling」56 を達成するために、各生物について対になったメタゲノムおよびメタトランスクリプトームカウント表を用いて実行された。armの各対比較は、一般化線形モデルデザインにおいて「arm」を単一固定効果として、それぞれのサンプルセットを用いて実行した。絶対存在量について正規化した後、発現に統計的に有意な差がある転写産物（すなわち、0から有意に異なる「arm」係数）は、与えられた生物からの転写産物セット全体に多重仮説補正を適用した後、同定した（q値（Benjamini-Hochberg調整P値）＜0.1）。GSEAはfgsea54を用いて各生物について行われ、MTXmodelの差次的発現検定からゼロフィルタリングを免れた全遺伝子を推定log2倍差でランク付けした。各生物における各mcSEED代謝経路は、差次的発現についてテストされたすべての遺伝子のバックグラウンドに対する遺伝子セットとして使用され、最小および最大遺伝子セットサイズはそれぞれ5および50遺伝子であった。

絨毛の高さと陰窩の深さの組織形態学的解析
空腸と回腸のセグメントをホルマリンで固定し、パラフィンに垂直に包埋した。5 μm厚の切片を作製し、ヘマトキシリンとエオジンで染色した。スライドをスキャンした（NanoZoomer装置、浜松）。QuPath57（v0.3.2）を用いて絨毛の高さと陰窩の深さを測定するために、各腸管セグメントから10個の陰窩-絨毛ユニットを選択した。測定は、研究者がコロニー形成群に関して盲検化した状態で行った。得られたデータセットには両側Mann-Whitney U検定を適用した。

snRNA-seq法
マウスから腸管切片（長さ1.5cm）を採取し、液体窒素中でスナップ凍結した（n = 4匹/処置群（雄マウス2匹、雌マウス2匹）、合計2処置群）。核を抽出する方法は、以前に膵臓について記述されたプロトコール58を参考にした。簡単に言えば、組織を解凍し、溶解バッファー（25mMクエン酸、0.25Mスクロース、0.1%NP-40、1×プロテアーゼ阻害剤（Roche））中でミンチにした。ペストルダウンサー（Wheaton）を用いて細胞から核を放出させ、バッファー（25mMクエン酸、0. 25Mスクロース、1×プロテアーゼ阻害剤）で3回洗浄し、100μm、70μm、40μm、20μm、最後に直径5μmのストレーナー（pluriSelect）で順次濾過して、再懸濁バッファー（25mM KCl、3mM MgCl2、50mM Tris、1mM DTT、0.4U μl-1 rNase阻害剤（Sigma）、0.4U μl-1 Superase阻害剤（ThermoFisher））中の単一核を得た。サンプルあたり約10,000個の核を、3′遺伝子発現v3.1キットマニュアル（10×Genomics）に記載されているプロトコールに従って、ゲルビーズインエマルジョン生成、逆転写、シーケンス用ライブラリーの構築に供した。ライブラリーはバランスされ、プールされ、配列決定された（Illumina NovaSeq S4; 3.23 × 108 ± 1.39 × 107 paired-end 150 nt reads per nucleus (mean ± s.d.) from jejunal samples）。リードがマウス参照ゲノム（GRCm38/mm10）のイントロン領域にマップされるように、フラグ'-include-introns'を付けた10× Genomics CellRanger59 5.0パイプラインを用いて、リードアライメント、フィーチャーバーコードマトリックス、品質管理を行った。ミトコンドリアコード遺伝子またはリボソームタンパク質遺伝子からのリードが2.5%を超える核はフィルターで除外した。

snRNA-seqデータセットの解析
サンプルの統合、カウントの正規化、細胞のクラスタリング、マーカー遺伝子の同定はSeurat 4.060を用いて行った。簡単に説明すると、CellRangerから出力されたフィルターされたフィーチャーバーコード行列をCreateSeuratObject（min.cells = 5, min.features = 200）を用いてSeuratオブジェクトとしてインポートした。各サンプルはSCTransform61,62を用いて正規化し、SeuratソフトウェアパッケージのSelectIntegrationFeatures、PrepSCTIntegration、FindIntegrationAnchors、IntegrateDataを用いて統合した。全サンプルの核を含む統合データセットは、SeuratパッケージのFindNeighbors（次元=1:30）およびFindClusters（分解能=1）を用いて教師なしクラスタリングを行った。細胞タイプの割り当ては、報告されているマーカー29,63,64の発現に基づき、手作業で行った。

各細胞クラスターについて、遺伝子カウントを集計してサンプルレベルのカウントを得、擬似バルク化された各サンプルがedgeRベースの遺伝子発現差分解析の入力となった65,66。

NicheNetベースの解析19（v1.1.0）では、snRNA-seqデータセット内のすべてのクラスターを、陰窩幹細胞、増殖経口増幅/幹細胞、絨毛底腸細胞、絨毛中間腸細胞、絨毛先端腸細胞、および杯細胞のセンダーとして使用した。Nichenet_seuratobj_aggregate (assay_oi = 'RNA')関数をデフォルト設定で使用し、Seuratからの遺伝子発現差情報をNicheNet解析に組み込み、善意のリガンド-受容体相互作用を選択した。

Compassベースのin silico代謝フラックス解析21 (v0.9.10.2)は、6つの上皮細胞クラスター（陰窩幹細胞、増殖通過増幅細胞、絨毛基底細胞、絨毛中間細胞および絨毛先端腸細胞、杯細胞）のそれぞれから得られた転写産物を用いて実施した。Compass が算出した反応スコアは、(1) Recon2 反応の信頼度、(2) Recon2 反応アノテーションの情報の完全性に基づいてフィルタリングされた。生化学的証拠（Recon2では信頼度4と定義; 参考文献22）によりサポートされ、反応に関する酵素情報が完全なRecon2反応のみがフォローオン解析に進められた（収量：83のRecon2サブシステムで2,075のパスフィルター反応）。

続いて、P. copri の有無が、Compass に基づく 6 つの細胞クラスターの Recon2 反応レベルでの代謝活性予測に影響するかどうかを判断するため、「代謝フラックス差」を計算した。正味反応スコア」は以下のように計算した：

$$c={c}{\rm{f}}-{c}{\rm{r}}$$

ウィルコクソン順位和検定を用いて、2つの処理群間の正味反応スコアの有意性を検定した。Wilcoxon rank-sum検定からのP値はBenjamini-Hochberg法で多重比較のために調整した。

Cohen's (d})は、2群間21（我々の場合、P. copriを含むマウスと含まないマウス）の各反応の効果量を示すのに使用できる。ここで、n、s、aはオブザベーションの数、分散、平均（我々の場合、正味の反応スコア）を表す。

$${s}{\rm{pool}}=\sqrt{\frac{\left({n}{j}-1\right){s}{j}^{2}-({n}{k}-1){s}{k}^{2}}{{n}{j}+{n}{k}-2}}$$
$$d=\frac{{a}{j}-{a}{k}}{{s}{{{\mathrm{pool}}}}}$$
({a}{j}因子)と({a}{k}因子)が共に非負の数である場合、コーエンの(d)が正であれば、群(j)の平均が群(k)の平均より大きいことを示し、コーエンの(d)が負であれば、その比較において群(j)の平均が小さいことを示す。Cohen's(d)の大きさは効果量を表し、2群の平均値の差と相関する。正味反応得点だけでなく、正味サブシステム得点の平均も負になる可能性があるため、符号の一致と群平均の順序を維持するために、Cohenのdを以下のように調整した。調整後のCohenのdは代謝フラックス差(m)を表し、以下のように定義される：

$$\left{\begin{array}{c}{a}{j} > 0{rm{;}} {a}{k} < 0{rm{;}}left|{a}{j}right| < \left|{a}{k}right|:m=-d < 0{rm{;}};{a}{k｝ > 0{rm{;}}left|{a}{j}right|> \left|{a}{k}right|：m=-d < 0{rm{;}} };{a}{k} < 0:m=\frac{{\rm{|}}{a}{j}{\rm{|}}-{\rm{|}}{a}{k}{\rm{|}}}{{s}_{\rm{pool}}}\ {\rm{other}}:m=d\end{array}\right.$$
scCODA68(v0.1.8)は、snRNA-seqデータセットから同定された細胞クラスターの比例表現における、異なる治療条件間の「統計的に信頼できる差異」を検出するためのベイズ確率モデルです。この方法は、snRNA-seqデータを解析する際の2つの主な課題、(1)サンプル数の少なさ、(2)データセットの構成性（特定の細胞クラスターの比例代表の増加は、必然的に他の全ての細胞クラスターの比例代表の減少につながる）を考慮している。従って、この固有の負の相関バイアスを考慮せずに t検定などの単変量統計検定を適用すると、偽陽性が報告されることになる。

scCODAは、ベイズ一般化線形多変量回帰モデルを用いて、各細胞クラスターの比例代表に対する治療群の「効果」を記述する。ハミルトニアンモンテカルロサンプリングは、モデルに治療の効果を含める事後包含確率を計算するために用いられる。タイプIエラー（偽発見）は、各効果の事後包含確率から導かれる。統計的に信頼できる効果」の集合は、ユーザー定義の偽発見閾値α（デフォルトではα = 0.05）を超えることなく選択できる最大の効果の集合である。ベイズモデルにおける事前確率の選択、ハミルトニアンモンテカルロサンプリングの設定など、デフォルトのパラメータを用いてscCODAを適用した。腸内分泌細胞クラスターを参照クラスターとして使用したのは、scCODAの作成者の推奨に従い、サンプル間で一貫した比例的表現を持つ細胞クラスターを選択するためである。

質量分析
糞便グリコシド結合のUHPLC-QqQ-MSおよび短鎖脂肪酸のGC-MS
UHPLC-QqQ-MSによる糞便糖鎖中のグリコシド結合および単糖の定量は、添付の研究11に記載されている方法で行った。糞便内容物中の短鎖脂肪酸レベルは、ref. 6.

宿主組織中のアシルカルニチン、アミノ酸および生体アミンのLC-MS測定
アシルカルニチンは、空腸、結腸、肝臓、腓腹筋、大腿四頭筋、心筋、および血漿で、文献69に従って測定した。69。一方、20種類のアミノ酸と19種類の生体アミンを、空腸、肝臓、筋肉において、文献70に詳述されている方法に従って定量した。70. 非エステル化脂肪酸の血漿レベルは、UniCel DxC600 clinical analyser（Beckman Coulter）を用いて測定した。

糞便中のアミノ酸およびビタミンB群の標的質量分析
アミノ酸およびビタミンB群のターゲットLC-QqQ-MSの方法は、以前の論文71を参考にした。糞便サンプルを氷冷メタノールで抽出し、200μlのアリコートを乾燥させ（真空遠心分離；LabConco CentriVap）、水に80％メタノールを含む溶液200μlで再構成した。抽出した代謝物の 2 μl アリコートを、Agilent 1290 Infinity II UHPLC システムと、ポジティブイオンダイナミック多重反応モニターモードで動作する Agilent 6470 QqQ-MS に注入しました。ネイティブ代謝物は、HILIC カラム (ACQUITY BEH Amide、2.1 × 150 mm、粒子径 1.7 μm、Waters) で、0.4 ml min-1 の一定流速で 20 分間のバイナリーグラジエントを用いて分離しました。移動相は、0.125%ギ酸を含む水中の10 mMギ酸アンモニウム緩衝液（A相）と、0.125%ギ酸を含む95%アセトニトリル/H2O (v/v)中の10 mMギ酸アンモニウム（B相）から構成された。バイナリー勾配は以下の通り： 0-8分、91-90%B; 8-14分、90-70%B; 15-15.1分、70-91%B; 15.1-20分、91%B。濃度既知の20種類のアミノ酸と7種類のビタミンB群の標準品プール（アミノ酸プール： 0.1 ng ml-1～100 μg ml-1；ビタミンBプール： 0.01 ng ml-1～10 μg ml-1）を、絶対定量用の外部検量線としてサンプルとともに注入した。

統計と再現性
すべての実験において、ダムは無作為に異なる処理群に割り付けられた。すべての実験における処理群のサンプルサイズは、リターのサイズによって決定された。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、我々のサンプルサイズは過去の論文で報告されたものと同様である6,13。子供の雌雄両方を使用した。実験から得られたデータは除外しなかった。本研究で用いた統計検定は、データが正規分布していることを必要とせず、分散が等しいことも仮定していない。データ収集と解析は実験グループに対して盲検化されていないが、最初の実験と検証実験は我々のチームの異なるメンバーによって独立して行われた。また、snRNA-seq解析とその後の標的メタボロミクス定量も異なる科学者が実施した。

生物学的材料
バングラデシュの小児から採取した糞便サンプルから培養したヒト検体および細菌株はicddr,bの所有物である。icddr,bとワシントン大学の間には、これらのサンプルを使用するための材料譲渡契約が存在する。資料の請求はJ.I.G.まで。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
微生物群集およびロングリード細菌株ゲノムシーケンスデータセット、細菌ゲノムアセンブリ、微生物RNA-seqおよびsnRNA-seqデータセットは、研究アクセッション番号PRJNA1067830でNational Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive (SRA)に寄託されている。UHPLC-QqQ-MSデータセットは、Glycopostの研究アクセッション番号GPST000392で利用可能です。

コードの利用可能性
使用したソフトウェアはすべて一般に公開されているものである。

参考文献
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参考文献のダウンロード

謝辞
D.O'DonnellとM.Karlssonにはマウスの飼育で貴重な助力を、M.Meierにはショットガンシーケンスと微生物RNA-seqデータセットの作成で重要な役割を、J.Gurugeには細菌株の培養と維持の助力を、S.DengとJ.Serugoには生物試料アーカイブの監督を感謝する。また、Digestive Disease Research Core Center (NIDDK P30 DK052574)のWashington University Advanced Imaging and Tissue Analysis Coreの組織スライド作成支援にも感謝する。本研究は、米国国立衛生研究所（NIH）（DK30292）、Washington University Personalized Medicine Initiative、Bill & Melinda Gates Foundation（INV-016367）からの助成金により行われた。E.M.L.はNIHトレーニンググラント（T32 HG000045）の支援を受けている。Y.W.はNIHのキャリア開発賞（K01 DK134840）を受けている。C.Z.は、NIH F30プレドクトラルMD/PhDフェローシップ（DK131866）の受給者である。K.M.P.はHelen Hay Whitney財団から博士研究員として研究助成を受けている。C.K.は、NIH F30博士研究員特別研究員（DK123838）である。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Hao-Wei Chang、Evan M. Lee、Yi Wang。

著者および所属
ワシントン大学医学部ゲノム科学・システム生物学エジソンファミリーセンター（米国ミズーリ州セントルイス

Hao-Wei Chang、Evan M. Lee、Yi Wang、Cyrus Zhou、Kali M. Pruss、Suzanne Henrissat、Robert Y. Chen、Clara Kao、Matthew C. Hibberd、Hannah M. Lynn、Daniel M. Webber、Marie Crane、Jiye Cheng、Ye Chen、Michael J. Barratt、Jeffrey I. Gordon。

米国ミズーリ州セントルイス、ワシントン大学医学部、腸内マイクロバイオーム・栄養研究センター

米国ミズーリ州セントルイス、ワシントン大学医学部病理学・免疫学教室

Hao-Wei Chang、Yi Wang、Kali M. Pruss、Matthew C. Hibberd、Daniel M. Webber、Michael J. Barratt、Jeffrey I. Gordon

フランス、マルセイユ、エクス・マルセイユ大学、CNRS、マクロモレキュール生物学構築・機能研究部門

スザンヌ・アンリサット & ニコラ・テラポン

感染症・炎症性疾患センター、サンフォード・バーナム・プレビス・メディカル・ディスカバリー・インスティチュート、ラホヤ、カリフォルニア州、米国

ドミトリーA.ロディオノフ、アレクサンドルA.アルザマソフ、アンドレイL. オスターマン

米国カリフォルニア大学デービス校化学部

ホアン・J・カスティーヨ、ギャレット・クチュール、イェー・チェン、ニキータ・P・バルカゾ・ジュニア、カーリート・B・レブリラ

デンマーク、リングビー、デンマーク工科大学バイオテクノロジー・バイオメディシン学科（DTUバイオエンジニアリング

ベルナール・ヘンリサット

サウジアラビア、ジッダ、キング・アブドゥルアジーズ大学、生物科学部

バーナード・ヘンリサット

サラ・W・ステッドマン栄養・代謝センター、デューク大学メディカルセンター、ダラム、ノースカロライナ州、USA

オルガ・イルカエワ、マイケル・J・ミュールバウアー、クリストファー・B・ニューガード

米国ノースカロライナ州ダーラム、デューク大学メディカルセンター、デューク分子生理学研究所

オルガ・イルカエワ、マイケル・J・ミュールバウアー、クリストファー・B・ニューガード

米国ノースカロライナ州ダーラム、デューク大学メディカルセンター医学部

オルガ・イルカエワ＆クリストファー・B・ニューガード

米国ノースカロライナ州ダーラム、デューク大学メディカルセンター薬理学・癌生物学教室

クリストファー・B・ニューガード

バングラデシュ国際下痢症研究センター（icddr,b）、バングラデシュ、ダッカ

イシタ・モスタファ、スバシシュ・ダス、ムスタファ・マフフズ、タフミード・アーメド

貢献
マウス実験はH.-W.C.、E.M.L.、Y.W.、C.Z.およびJ.I.G.がデザインし、H.-W.C.、E.M.L.およびC.Z.が実施した。マウス飼料はH.-W.C.がM.J.B.の協力を得て調製し、I.M.、S.D.から提供されたヒトの食事調査結果に基づいている、細菌ゲノムは、D.M.W.、H.-W.C.、M.C.が配列決定とアセンブルを行い、S.H.、D.A.R.、A.A.A.、N.T.、B.H.、A.L.O.がゲノムアノテーションに貢献した。ショットガンシーケンスと微生物RNA-seqデータセットは、H.-W.C.とE.M.L.が作成し、M.C.H.、H.M.L.、D.M.W.とともに解析した。質量分析ベースのメタボローム研究は、J.C.、O.I.、M.J.M.、C.B.N.が実施した、 snRNA-seqデータセットの作成と解析は、H.-W.C.、Y.W.、K.M.P.、R.Y.C.、C.K.、M.C.が担当した。H.-W.C.、E.M.L.、Y.W.、J.I.G.は、共著者の貴重な協力を得て本原稿を執筆した。

共著者
ジェフリー・I・ゴードン宛。

倫理申告
競合利益
A.L.O.とD.A.R.は、微生物群集の予測的表現型プロファイリングのための計算ツールの開発を追求する会社Phenobiomeの共同設立者である。C.B.L.はInfinant Health社、interVenn Bio社、one.bio社の共同設立者であり、糖鎖の特性解析とヒトの健康に役立つ糖鎖アプリケーションの開発に携わっている。本論文の残りの著者は、競合する利害関係はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、本論文の査読に貢献した匿名の査読者に感謝する。

その他の情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

拡張データ
Extended Data 図1 P. copriのコロニー形成効率とB. longum subsp. infantisによる前コロニー形成との関係を明らかにする。
(a)マウス研究で使用した培養P. copri分離株の系統樹と、ヒトでのランダム化比較研究でWLZと正の相関を示した2つのMAGの系統樹。各対間の系統学的距離をマトリックスで示す。(b）実験計画（実験1では1群あたりn＝9匹、実験2では1群あたりn＝10匹）。マウスは実験1ではP28、実験2ではP25で離乳させた。(c) P42でマウスから採取した糞便サンプル中のP. copri株の総絶対存在量。平均値±SDを示す。各ドットは別々の動物を表す。P値は両側Mann-Whitney U検定を用いて計算し、実験1では4x10-4、実験2では3x10-4であった。

Extended Data 図2 異なる時点と場所における、定義されたコミュニティ内の他の細菌種の絶対量。
(a)P53で採取した糞便サンプルにおいて、B. infantis Bg2D9（群1対群2）、またはB. infantis Bg2D9とPrevotellaの組み合わせ（群1対群3）で有意に高かった生物の絶対量（群1、群2、群3についてそれぞれn=8、5、7）。B. obeum（群1対群3）およびD. longicatena（群1対群2）の調整後P値はそれぞれ2x10-4および7x10-4である。(b, c)P53で採取した糞便内容物（パネルb）およびP21で離乳前に採取した糞便サンプル（パネルc）における同じ生物の絶対量。平均値±SDを示す。各点は個々の動物を表す。P値はKruskal-Wallis検定にBonferroni補正を加えたPost-hoc Dunn検定で算出した。N.S.は有意ではない（P > 0.05）。

Extended Data Fig. 3 gnotobioticマウスにコロニー形成した培養年齢識別性細菌株およびWLZ関連細菌株のコンソーシアムの標的質量分析および微生物RNA-Seq解析。
図1aの実験終了時に採取した膀胱内容物を分析した。(a,b)UHPLC-QqQ-MSを用いた、P53で採取した糞便糖鎖中の総アラビノース（パネルa）およびアラビノースを含むグリコシド結合（パネルb）の定量。略号 Arafはアラビノフラノース、Arapはアラビノピラノース、Xylpはキシロピラノース。各ドットは個々の動物を表す（1、2、3群ではそれぞれn=8、5、7）。平均値±s.d.を示す。(c)正規化メタトランスクリプトームカウントのプロファイルのPCA（Methods参照）。各グループのセントロイドは色付きの「X」で示されている。P値はPERMANOVAで計算した。(d) 4つのアラビノース資化性細菌における特定の炭水化物利用およびアミノ酸生合成経路に関与する遺伝子のMTXmodel存在量正規化差分発現解析。Violinプロットは、示された生物における代謝パスウェイのアノテーションを持つすべての発現遺伝子のlog2倍差の分布を示す。パネルdのドットは、対応するパスウェイに関与する個々の遺伝子についての差次的発現検定結果を表し、Benjamini-Hochberg調整P値が0.1未満である場合に着色されている（Methods参照）。略号 BCAAは分岐鎖アミノ酸、Gluはグルタミン酸、Glnはグルタミン。

Extended Data Fig. 4 P. copriおよびP. stercorea PULの発現と、予測される標的の標的質量分析。
(a,b)図1に記載した実験の2つのプレボテラを含む群（群1と群2はそれぞれn = 8と5子孫）におけるP. copri Bg131（パネルa）とP. stercorea（パネルb）が共有するPULの発現のGSEA。Benjamini-Hochberg調整P値は、GSEAを用いて、アーム1および2のプレボテラ属にコロニー形成されたサンプル全体にわたって、遺伝子を平均log2 TPMでランク付けし、予測されたすべてのPUL遺伝子を背景に各PULが遺伝子セットを構成するように計算した。Violinプロットは、各単離株のPULのいずれかに割り当てられた全遺伝子のlog2 TPMを示し、プロットは示されたPULを示すように分割されている。アーム2（パネルa）のPUL27aの正確な調整P値は3x10-4である。(c)UHPLC-QqQ-MSを用いた、P53で採取したセカル糖鎖中の総マンノース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミンレベルの定量（アーム1、2、3についてそれぞれn = 8、5、7子孫）。平均値±SDを示す。各ドットは個々の動物を表す。P値は、Kruskal-Wallis検定にBonferroni補正を加えたPost-hoc Dunn検定で計算した。

Extended Data 図5 P. copriを含む、または含まない細菌コンソーシアムでコロニー形成したマウスにおける腸内遺伝子発現の差のsnRNA-Seq解析。
図1に記述した実験終了時に「P. copriを含む＆B. infantis Bg2D9を含む」群と「P. copriを含まない＆B. infantis Bg463を含む」群から採取した腸管組織サンプルを解析した。(a)上皮細胞タイプ間のマーカー遺伝子発現のドットプロット。細胞タイプ内のある遺伝子を発現する核の平均発現レベルとパーセンテージを、それぞれドットの色と大きさで示す。(b) 両群の動物から単離したすべての空腸核の統合UMAPプロット（n = 4マウス/群）。(c) 各細胞クラスターにおける統計的に有意な差次的発現遺伝子の数と方向性。

Extended Data Fig. 6 NicheNetに基づくP. copriのコロニー形成が細胞間シグナル伝達に及ぼす影響の解析。
各行は異なる送り手細胞クラスターを表す。各列はこれらの送り手細胞によって発現されるリガンドを表す。細胞は、図1に記述した実験から、「P. copriとB. infantis Bg2D9を併用」群と「P. copriとB. infantis Bg463を併用」群のマウス間の、送り手細胞クラスターにおけるリガンド発現のlog2倍差に基づいて色分けされている。リガンド（列）は、レシーバー細胞クラスターと、これらのレシーバー細胞における下流シグナル伝達経路の示された機能に基づいてグループ化されている。

Extended Data Fig. 7 「w/P. copri & w/ B. infantis Bg2D9」群と「w/o P. copri & w/ B. infantis Bg463」群のマウス間で、その活性に統計的に有意な差があると予測されるRecon2サブシステムにおけるRecon2反応の正規化数。
詳細については、影響を受けた他のサブシステムを示した図2bの凡例を参照のこと。

Extended Data Fig. 8 P. copriのコロニー形成が生後の体重増加および宿主の代謝に及ぼす影響の検証。
(a)研究デザイン（群1および群2はそれぞれ、n = 4のダムと18および19の子ども）。(b)出生後23日目で正規化したダムの子孫の体重［線形混合効果モデル（Methods参照）］。(c-e）空腸シトルリンレベル（パネルc）とアシルカルニチンレベル（パネルd）、および大腸アシルカルニチンレベル（パネルe）の標的質量分析。空腸C3と空腸C18:1（パネルd）の正確なP値は、それぞれ1x10-5と7x10-4である。大腸C4/Ci4、C5、C16、C18:1（パネルe）の厳密なP値はそれぞれ3x10-6、2x10-6、3x10-4、7x10-4。(f）非エステル化脂肪酸の血漿レベル。各ドットは1匹の動物を表す。パネルb-fの平均値±SDを示す。P値は線形混合効果モデル（パネルb）または両側Mann-Whitney U検定（パネルc-f）から算出した。N.S.、P値＞0.05。

Extended Data 図9 雌雄同腹の牡牝2頭における定義された群集に対する食餌の影響の評価。
(a)実験デザイン（n = 2 ダム、12 子/食餌処理）。(b) P53で安楽死させたマウスの糞便中の群集構造の有意差を示す主成分分析（P = 1x10-5; PERMANOVA）。楕円は95％信頼区間を表す。(c)P53における糞便内容物中の定義された群集メンバーの絶対量。B. breve、B. catenulatum、B. infantis Bg2D9、D. formicigenerans、E. coli、F. prausnitzii、L. garavieae、L. ruminis、およびM. multacidaの正確なP値は、それぞれ4×10-5、4×10-5、4×10-5、6×10-4、4×10-5、2×10-4、4×10-5、1×10-4、および4×10-5である。P値はPERMANOVA（パネルb）および両側Mann-Whitney U検定（パネルc）によって算出した。N.S.、P値＞0.05。平均値±SDを示す。各ドットは個々の動物を表す。

Extended Data Fig. 10 P. copri BgD5_2およびBgF5_2でコロニー形成したgnotobioticマウスにおける回腸および大腸アシルカルニチンのLC-MS。
(a) 大豆油脂質に対応する回腸アシルカルニチンのLC-MS。(b）大豆油脂質に対応する大腸アシルカルニチンのLC-MS。各ドットは個々の動物を表す（各群n = 13匹）。平均値±SDを示す。P値はパネルaおよびbについて両側Mann-Whitney U検定を用いて計算した。

補足情報
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補足表
補足表1-20。

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Chang, HW., Lee, E.M., Wang, Y. et al. プレボテラ・コプリおよび微生物叢メンバーが栄養不良の治療食品の有益な効果を媒介する。Nat Microbiol (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-024-01628-7

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受領
2023年11月20日

受理
2024年1月31日

出版
2024年3月19日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-024-01628-7

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テーマ
微生物群集
マイクロバイオーム
Nature Microbiology (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276 (オンライン)

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