マイクロバイオームが腸の概日リズムを安定化させる

哉百名



マイクロバイオームが腸の概日リズムを安定化させる
Yueliang Zhang, Yongjun Li, Annika F. Barber https://orcid.org/0000-0002-5058-939X, +6, and Amita Sehgal https://orcid.org/0000-0001-7354-9641 amita@pennmedicine.upenn.eduAuthors Info & Affiliations
Contributed by Amita Sehgal; received October 18, 2022; accepted December 22, 2022; reviewed by Joanna C. Chiu and Paul E. Hardin
2023年1月23日
120 (5) e2217532120
https://doi.org/10.1073/pnas.2217532120
第120巻｜第5号
意義
概要
結果
考察
材料と方法
データ、材料、ソフトウェアの入手方法
謝辞
サポート情報
参考文献
意義
我々は、マイクロバイオームと摂食のリズムが腸内の概日リズムにどのような影響を与えるかを明らかにした。ショウジョウバエのモデルを用いて、摂食を特定の時間帯に制限すると、遺伝子発現の概日リズムが強化されることを示した。しかし、自由摂食と比較して、時間制限摂食はストレス因子に対する感受性を高めることがわかった。このことは、これまで代謝的な利点と関連づけられてきた時間制限給餌が体力を促進するという考え方に疑問を投げかけるものである。マイクロバイオームは、逆に、腸内の概日リズムの強さを弱める。また、昼夜のサイクルの変化に対する腸内時計の反応を和らげ、腸内の概日リズムが脳内のリズムと同調した状態を維持できるようにする。この結果は、マイクロバイオームが動物の概日リズムの同調を促進することを示している。
要旨
腸内細菌は、宿主の生理機能や健康に影響を与えることがよく知られている。我々は、概日時計による生理機能の制御が広く行われていることを踏まえ、ショウジョウバエの腸内におけるマイクロバイオームが概日リズムとどのように相互作用しているのかを調べた。自由摂取のショウジョウバエではマイクロバイオームが周期的に変化せず、時計のないper01のショウジョウバエでのみ、時間差摂食が周期を制限した。しかし、時限給餌とマイクロバイオームの消失は、腸内サイクリングの転写産物の構成に独立に、また共に影響を及ぼした。さらに、両者ともリズミカルな遺伝子発現の振幅を増加させ、少なくとも部分的にヒストンアセチル化の変化によるTFの効果が見られた。予想に反して、時間差給餌は動物をストレスに対してより敏感にさせた。概日リズムにおけるマイクロバイオームの機能を解析した結果、無菌のハエは明暗サイクルのシフトに伴い、より迅速にリセットされることがわかった。我々は、環境条件の変化による急激な変動を防ぐために、マイクロバイオームが宿主の腸内のサイクルを安定化させていることを提案する。
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腸内細菌は、代謝や免疫から脳機能まで、多くの生理的プロセスに重要な役割を担っており、そのため健康や体力の重要な決定因子と考えられています（1-3）。マイクロバイオームは長期的には比較的安定していますが、特に食事に反応して短期的な変動が起こります（4-6）。また、哺乳類の腸内細菌は、その組成や腸内局在の点で、一昼夜にわたってリズミカルな変動を示します(7-10)。
マイクロバイオームの循環は宿主の概日時計に依存しており（8-10）、食物摂取の概日制御を介する可能性がある。実際、クロックミュータントマウスでは、摂食リズムを付与することで、マイクロバイオームのリズムを回復させることができる(8)。このような定時給餌（TF）パラダイムは概日リズムを強化し、通常の条件下や高脂肪食を与えたマウスで代謝の健康を改善することから、間欠的断食（IF）の人気のあるモードになっている（11-14）。興味深いことに、マイクロバイオームのリズムは高脂肪食によって損なわれるが、断食によって部分的に回復することができる（10）。このことから、マイクロバイオームの循環が断食の健康効果に寄与しているという興味深い可能性が出てきた。
マイクロバイオームがTFの有益な効果を仲介しているかどうかにかかわらず、マイクロバイオームはさまざまな組織における概日リズムに影響を与える（7、15-21）。この点に関して最もよく研究されている組織は肝臓であり、マイクロバイオームの消失によって概日リズムが変化することが示された（7, 17, 18）。異なる研究で確認された影響の性質は、リズム遺伝子発現の位相の変化から、サイクリングの抑制、無菌動物で異なる遺伝子がサイクリングするような概日転写産物の再プログラミングまで様々である。Wegerらは、マイクロバイオームの消失は複数の組織における時計遺伝子の発現にほとんど影響を及ぼさないが、リズム遺伝子の発現における性差を弱めることを見出した(20)。宿主の概日リズムのマイクロバイオーム制御との関連性は不明であるが、概日リズムの乱れがマイクロバイオームを通じて一部生理に影響を与えることから、重要であることは明らかである。特に、時差ぼけしたヒトのマイクロバイオームは、無菌マウスに時差ぼけを思わせる代謝障害を与える(8)。
ショウジョウバエにも腸内細菌叢があり、哺乳類のそれに比べてはるかに単純であるが、生理に大きな影響を与えることが知られている(22)。哺乳類のデータに基づいて、ハエのマイクロバイオームも循環すると予想され、マイクロバイオームの循環の生理的関連性を研究するための良いモデルになり得ると考えた。さらに、TFパラダイムが老化したショウジョウバエの心臓の健康を改善することから（13）、マイクロバイオームがTFの効果を媒介するかどうかを検討した。その結果、実験室飼育のショウジョウバエでは、TF条件下でもマイクロバイオームの循環がほとんど見られないことがわかった。また、意外なことに、TFはストレスに対するハエの応答を低下させた。しかし、マイクロバイオームは、時計遺伝子の循環を調節し、環境サイクルのシフトに対する反応を和らげるという重要な概日リズムの役割を担っている。我々は、微生物が宿主の腸に安定性を与え、腸のリズムを脳のリズムと同調させていることを提唱する。
研究成果
ショウジョウバエのマイクロバイオームは、ほとんど循環していない。
マイクロバイオームの概日制御について調べるため、私たちはまず、自由食のハエが時間帯によってマイクロバイオームに変化を示すかどうかを調べることから始めた。マイクロバイオームには周期性があり、その時計制御を解明することは重要であると考え、野生型（Iso31）と、主要な概日時計遺伝子であるperiod（per）を欠くハエを用いたアッセイを行った。Zeitgeber Times (ZT) 0, 4, 8, 12, 16, 20 (ZT0 = 点灯、ZT12 = 消灯) にオスとメスのハエから糞を採取し、これらを16S rRNAseqにかけてマイクロバイオームを解析した (SI Appendix, Fig. S1A および Dataset S1 A and B)。JTKサイクル解析を用いたところ、いずれの遺伝子型でも、自由摂取によるマイクロバイオームのα多様性の3つの別個の測定値（Faithの系統的多様性、シャノン多様性、豊かさ）においてサイクリングは検出されなかった。同様に、ハエのマイクロバイオームの大部分を構成する特定の種の相対的な存在量も、昼夜のサイクルの間に変化を示さなかった（Fig. 1 A-D, AF condition, これは自由摂取のマイクロバイオームを含むハエを反映したもの）。
図1.

ショウジョウバエの腸内マイクロバイオームは、1日のサイクルの中でほぼ安定している。(A and B) 野生型Iso31および時計変異体per01の腸内では、アドリブ（AF）およびTF条件下でマイクロバイオームの多様性に日周振動が見られない。リズムの評価にはJTK_cycleを使用した。(C, D) TF条件下での特定の細菌種の周期、ただしper01のみ。JTK_cycleの値を示す。
ハエは通常、摂食の概日リズムを示すが、これがマイクロバイオームのリズムを駆動するほど強固ではないのではないかと推測し、ZT0からZT10までしか餌が手に入らないようなリズミカルな摂食パラダイムを与えた（TF条件、すなわち図1においてTFを施したマイクロバイオームを持つハエ、である）。上記と同様の解析により、野生型ハエではα多様性や分類群存在量に概日変動は見られなかった（図1 A-C, TF condition）。一方、乳酸菌とグルコナセトバクターはともにTFを導入したper01ハエで周期性を示し、宿主時計がTFのマイクロバイオームへの影響を妨げていることが示唆された（Fig. 1D）。概日リズムとは別に、乳酸菌と酢酸菌の全体的な相対量は、摂食条件に関わらず、野生型と比較してper01ハエで低かった（SI Appendix、図S1B）。
マイクロバイオームとリズミカルな摂食は、独立に、そして一緒にサーカディアン転写産物を変化させる。
TFを用いてもハエでマイクロバイオームが循環することは見いだされなかったが、哺乳類での研究から、マイクロバイオームが宿主の循環に影響を与えると考える理由があった。TFの有無にかかわらず、マイクロバイオームがリズム遺伝子発現を制御しているかどうかを調べるため、材料が豊富なことから選んだ雌のハエから腸内マイクロバイオームを除去し（SI Appendix、図S2A）、RNAseqによって、これらの動物の腸内の概日リズム遺伝子発現とマイクロバイオームを含むコントロールのそれを比較した。各条件（無菌またはマイクロバイオーム含有）は、さらに、アドリブおよびTFの2つの異なる摂食パラダイムの下で試験し、4つのグループ-アドリブ無菌（AS）、TF無菌（TS）、アドリブマイクロバイオーム（AM）、TFマイクロバイオーム（TM）（図2A）とした（Dataset S1 C-F )。
図2.

無菌ハエの腸内では転写産物の循環が促進されている。(A) 無菌（sterile）（S）およびマイクロバイオームを含むハエ（M）をそれぞれad libおよびTF条件（ASおよびTS、AMおよびTM）でRNA-seq解析した実験プロトコルを示す模式図。各条件で3つの生物学的複製をアッセイした。(B) AM、TM、AS、TSのハエの腸について、12：12のLDサイクルにおける各タイムポイントでの転写産物量の主成分分析（PCA）。(C)AM、TM、AS、TSについて、重複して振動する転写産物の数を示すベン図。JTK_cycleのP < 0.01の値をサイクリングのカットオフ値として使用した。(D）AMとASの条件下で、P < 0.01のJTK_cycle値を用いて振動する転写物のピーク位相の極性ヒストグラムプロットである。(E）P<0.01のJTK_cycleカットオフを用いた、AMとASの間で重複する振動転写物の数を示すベン図。(F) AMとASで重複する周期的な転写産物の振幅の比較。データは平均値±SEM、***P < 0.0001はスチューデントのt検定で示した。(G) 振動が失われた転写物、共有された転写物、またはAMに比べASで増加した転写物を示す位相ソートされたヒートマップ。振動している転写産物のGO生物学的プロセス濃縮解析は下部に示す。
無菌（ASとTS）および微生物含有（AMとTM）ハエで発現する上位遺伝子の主成分分析（PCA）は、アッセイした4グループ間で明確に分離し、特にTFで維持したグループでは、時間帯の影響を示した（Fig. 2B）。このように、概日リズムの転写産物は、試験した条件ごとに異なっていた。これらの異なる発現遺伝子を比較すると、無菌状態のハエに濃縮された転写産物は、TFでリズミカルに発現する可能性が高いことも明らかになった（SI Appendix、図S2BのクラスタCおよびD）。それにもかかわらず、いくつかの遺伝子はマイクロバイオーム含有ハエにおいてユニークなサイクラーであった。サイクリングの統計的カットオフにかかわらず、4つのグループ間の重複のパターンは類似しており、1つのグループのみでサイクリックに発現する遺伝子と複数のグループで発現する遺伝子があった（図2CおよびSI Appendix, 図S2 CおよびD）。循環のカットオフをより緩やかにした結果は、SI Appendix, Fig.
マイクロバイオームの存在は、意外にも、腸内転写産物の概日サイクルを弱めたが、サイクリング転写産物の位相の全体的な分布は変わらなかった（Fig. 2D）。無菌状態のハエで増加したサイクリングは、リズミカルに発現する遺伝子数の増加とサイクリングの振幅の増加で構成されており（図2 EおよびF）、AM対ASおよびTM対TSの比較で明らかになった。無菌状態のハエで、アドリブ条件下でサイクリングを獲得した遺伝子は、代謝タンパク質、特にアミノ酸やペプチド代謝に関わるものをコードする傾向があった(Fig. 2G)。しかし、発生や分化に関わる遺伝子には、あまりサイクルが観察されなかった。エネルギー代謝に関わるタンパク質をコードする転写産物は、無菌および微生物を含むハエで循環していた（Fig. 2G）。同様の結果は、サイクリングのカットオフをより厳しくしても得られた（SI Appendix、Fig. S3A）。
TFは、サイクリング転写産物の数とサイクリングの全体的な振幅を増加させるだけでなく、リズミカルな転写産物の位相の分布に影響を与えた（図3 A-F）。これは、マイクロバイオームを持つハエ（図3 A-C）と無菌のハエ（図3 D-F）で顕著であった。プロトコルは内因性リズムに一致するように設計されているため、位相の変化は予想外であった(23)。摂食リズムは系統によって多少異なる可能性があることから (24, 25)、今回用いた iso31 ハエの摂食パターンをアッセイしてみた。その結果、午前中にピークが検出された。これは以前の報告（23, 26）と一致し、AFとTFの位相差は摂食の位相の変化によるものではないことを示唆する（SI Appendix, 図S4A）。また、無菌状態のハエとマイクロバイオームを持つハエの間には違いが見られなかったことから、これらの条件下でのトランスクリプトームの違いも摂食の変化によるものではないことが示された（SI Appendix, 図S4B）。
図3.

TFは、無菌およびマイクロバイオームを保有するハエにおいて、腸内転写産物の循環の位相と振幅を変化させる。(A) AMおよびTM条件下で振動する転写物のピーク位相のポーラーヒストグラムプロット。JTK_cycleによるP < 0.01をサイクリングのカットオフとして使用した。(B) AMとTMで周期が重なる転写産物についての振幅の比較。データは平均値±SEM、***P < 0.0001はスチューデントのt検定で示した。(C) AMとTMで振動が消失、共有、または増加した転写産物を示す位相ソートヒートマップ。振動する転写産物のGO生物学的プロセス濃縮解析を下部に示す。 (D) ASおよびTS条件で振動する転写産物のピーク位相のポーラーヒストグラムプロット。(E) ASとTSで周期が重なる転写産物の振幅の比較。データは平均値±SEM、****P < 0.0001はスチューデントのt検定で示した。(F) TSとASで振動が消失、共有、または増加した転写産物の位相ソートヒートマップ。振動している転写産物のGO生物学的プロセス濃縮解析は下部に示す。
TFで周期性を獲得した転写産物、またはアドリブとTFの両方の条件で周期性を獲得した転写産物は、代謝タンパク質をコードしていることがわかった。興味深いことに、ミトコンドリア／エネルギー代謝に関与する転写産物は、TF条件下で周期性を失う傾向があった（Fig.） より厳密でないサイクリングのカットオフを用いたヒートマップを（SI Appendix, 図S3 BおよびC）に示す。
位相の分布にマイクロバイオームが影響しないことと同様に、TF条件下で無菌のハエとマイクロバイオームを含むハエを比較したところ、無菌のハエではより多くの遺伝子が高い振幅で循環していたものの、位相に違いは見られなかった（SI Appendix, Fig.S5 A and B）。一般に、TFにより、無菌状態のハエは代謝遺伝子のサイクルを獲得し、翻訳や輸送に関わる転写物のサイクルを失った（SI Appendix, Figs.）
マイクロバイオームとTFの効果の重複を調べるため、AMに比べTMでサイクルが増加する遺伝子は、無菌状態でもサイクルが増加するかどうかを調べた。TMでサイクリングが促進される1,183遺伝子のうち、269遺伝子が無菌状態でもサイクリングが促進されたことから、完全な重複ではないものの、部分的な重複が示唆された（Dataset S1G）。TFパラダイムとマイクロバイオームの喪失による独立した効果を考えると、これら2つのレジメンを組み合わせた場合（TFで維持された無菌ハエ）、サイクリングが最大になることがわかった。これは、サイクリング遺伝子の数が非常に多く、また、すべての条件にわたってサイクリングする遺伝子の振幅が大きいことに反映されていた（SI Appendix、図S2I、S3E、およびS5 DとE）。これらの共通サイクリング転写産物で注目すべきは、小分子およびカルボン酸代謝のタンパク質をコードする転写産物であった。微生物群の損失やTFによってもたらされた循環の変化は、影響を受けた遺伝子の平均発現レベルの変化とは無関係であった（SI Appendix, Fig.S6 A-D）。
代謝系転写産物の循環は、TFとマイクロバイオームの欠如によって促進される。
微生物相の消失とTFはどちらも代謝系遺伝子に大きな影響を与えるため、AM、TM、AS、TS条件下での代謝系遺伝子の日々の発現を詳細に調べた（Dataset S1H）。TFやマイクロバイオームの消失によって振幅が大きくなったのは、ピークレベルが高くなったか、谷レベルが低くなったかのどちらかであった（SI Appendix, 図S7 A-P）。例えば、Prx2540-2は、無菌およびマイクロバイオームを含むハエ（TSおよびTM）の両方でTFにより高いピークレベルを示したが、Sodh1リズムの振幅の増加は、主に谷レベルの減少に起因した。一般に、マイクロバイオームを失うと全体のレベルが上昇する傾向があり、その結果、NinadやSodh1などの振幅が増加することがよくあった。
TFとマイクロバイオームが時計遺伝子や他の転写因子のサイクルに異なる影響を与える。
マイクロバイオームとTFは、時計制御遺伝子ほどではないが、時計遺伝子の周期も変化させた（SI Appendix, 図S8 A-F）。微生物群の喪失は、tim、pdp1、Clkのサイクリングの振幅を増加させたが、cycのサイクリングは増加しなかった（SI Appendix, Figure S8 B, C, E and F）。perの振幅の変化は、RNAseq実験でアッセイされた4つの時点では有意ではなかったが、6つの時点をアッセイしたqPCR実験では明らかであった（SI Appendix、図S9A）。TFは、無菌のハエではper、cry、cycのサイクリングの振幅を増加させたが、微生物含有ハエではcryのサイクリングのみを促進した（SI Appendix、図S8 A、D、E）。ClkとtimはTFの影響を示さず、興味深いことに、pdp1サイクリングは無菌ハエのTFによって振幅の減少を示した（SI Appendix, Fig. S8C）。
時計遺伝子の変化は様々で、トランスクリプトーム全体の変化と必ずしも並行していなかったため、マイクロバイオームおよび/またはTFによって誘発された循環遺伝子の変化が、他の転写因子の循環の変化によって媒介されているかどうかを検討した。多くの転写因子は、AM、TM、AS、TSのうち1つ以上の条件で循環し、他の転写産物の場合と同様に、循環は無菌のハエでより強固であり、TFでも同様だった（SI Appendix, 図S9 C-F および Dataset S1 I-L）。相の分布を調べたところ、マイクロバイオームは相の分布にほとんど影響を及ぼさなかったが、TFは無菌およびマイクロバイオームを含むハエにおいて転写因子サイクリングの相を変化させた（SI Appendix, 図S9G）。これは、トランスクリプトーム全体で観察されたものと一致し（図2、3、SI Appendix、図S9H）、摂食による転写仲介効果の変化に関する他の報告とも一致する（27、28）。さらに、特定の代謝関連転写因子は、他の転写産物への影響と並行して、マイクロバイオームのTFおよび喪失に反応した（SI Appendix, Fig.S9 I-N）。我々は、循環系遺伝子のグローバルな変化は、報告された操作、特にTFによって影響された特定の転写因子の変化の下流にあることを示唆する。
ヒストンアセチル化はリズムのある餌によって影響を受け、周期的に発現する遺伝子のレベルに影響を与える。
宿主の遺伝子サイクルにマイクロバイオームとTFが大きな影響を及ぼすことを踏まえ、これらの影響をどのようなメカニズムで媒介するのかを検討した。ヒストンアセチル化は、マウスのマイクロバイオームが宿主の遺伝子発現に与える影響に関与している（15）ので、ここではそのメカニズムとして検討した。その結果、TFは無菌ハエの腸内で、いくつかのヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）のサイクルを促進し、アセチル化ヒストンH4（H4ac）のサイクルも促進した（図4 AおよびB）。TFはマイクロバイオームを持つハエにはあまり影響を及ぼさなかったが、それでも有意な循環を引き起こした（図4 AおよびB）。アセチル化H4は、無菌のハエとマイクロバイオームを含むハエの間で検出できるほどの違いはなかった（図4B）ので、TFの効果に注目した。
図4.

ヒストンのアセチル化はTFと循環し、代謝系転写産物の発現を制御している。(A) リズミカルに発現する4つのHDAC遺伝子の異なる時間帯の転写量とJTK_amplitude。発現は、上記のRNAseq解析の際に、AS、TS、AM、TMの条件下でアッセイされた。データは平均±SEM、*P < 0.05, ***P < 0.001 および ****P < 0.0001 は一元配置分散分析および Tukey's multiple comparison test によって決定した。(B) AM、TM、ASおよびTS条件下で、12：12時間のLDサイクルの異なるタイムポイントにおけるH4acの腸内タンパク質レベルを示すウェスタンブロットである。データは平均±SEM、n = 5から7の独立した実験。pCycleは、JTKサイクル分析を用いたリズムの存在を示す。(C) HDAC阻害剤（PBA）注入12時間後のH4acタンパク質発現レベルの比較。データは平均±SEM、n = 5生物学的複製、**P < 0.01はスチューデントのt検定で決定。(D) PBA投与12時間後の代表的な代謝遺伝子16個の発現量。データは平均±SEM、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 および ****P < 0.001 はスチューデントのt検定によって決定されます。N = 7生物学的複製。(EおよびF）2つの代表的な転写因子（CrebAおよびFOXO）および3つの時計遺伝子（per、timおよびclock）のPBA注入後12時間の発現。データは平均±SEM、*P < 0.05はスチューデントのt検定で決定。N = 7生物学的複製。
ヒストンアセチル化がTFによるサイクリングの強化に関与しているかどうかを調べるために、ad lib feed iso31ハエにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を注入し、TFでより強いサイクリングを示した遺伝子に焦点を当てて、ハエの体内での遺伝子発現を調べた。HDAC阻害剤であるフェニル酪酸ナトリウム（PBA）は、H4acの発現を増加させ（図4C）、TFと周期的に発現する多くの遺伝子の発現も増加させた。これは、TFによるヒストンアセチル化のリズムが、これらの遺伝子の周期に関与していることを示している（図4D）。別のHDAC阻害剤であるバルプロ酸（VA）はH4acを一貫して増加させなかったが、それでも転写因子CrebAや時計遺伝子per、tim、Clk（SI Appendix、図S10 A-C）など、おそらく他のヒストンへの影響を通して多くの遺伝子レベルを上昇させた。いくつかの遺伝子は、一方のHDAC阻害剤であるPBAまたはVAによって優先的に影響を受け、他方では受けなかった（SI Appendix, Fig.S10D）。TFのヒストンアセチル化に対する影響と、HDAC阻害剤によってTFが標的とする遺伝子の発現が増強されることから、ヒストンアセチル化がTFのサーカディアン転写産物に対する影響を媒介する主要メカニズムであることが提案された。
TFはストレスに対するハエの抵抗性を増加させない。
次に、マイクロバイオームとTFの生理機能への影響を調べ、これらの有益な効果が関連しているかどうかを確認した。例えば、TFパラダイムは代謝の健康を促進するため、その健康効果にマイクロバイオームが必要なのかどうかを検討しました。TFの有益な効果を可視化するためのパラダイムを確立するために、我々はストレスに対する反応に注目しました。そこで、5〜7日齢のハエを4日間または21日間、自由摂取条件またはTFに曝露し（SI Appendix, 図S11A）、その後、異なるストレス要因（飢餓、細菌注入、熱ショック）で処理し、生存率を評価した。21日間のプロトコルは、TFの有益な効果にこの期間が必要であった以前の研究に基づいている(29)。驚くべきことに、4日間のTFは飢餓に対する反応に影響を与えなかったが、21日間のTFは実際に生存率を低下させた（SI Appendix、Fig.S11 BおよびC）。最初の実験では、TFは14時間の絶食（ZT0から10まで食物入手可能、上記の通り）で構成されていたが、絶食の期間を10時間に減らしても実験の結果は変わらないことが分かった。14時間の絶食と同様に、10時間の絶食は21日間のプロトコルで実際に生存率を低下させた（SI Appendix、図S11B）。
TFパラダイムがハエの健康に明らかな影響を与えるかどうか、特に21日後に判断するために、まず、用いた3つのTFパラダイムのそれぞれの4日後および21日後の雌ハエの体重を測定した。TFで維持されたハエの体重はad lib feedのハエより少し低かったが、その差は4 dと21 dで同じであり、体重の変化はこれら2つの時点での反応の違いを説明しないことがわかった（SI Appendix, Fig. S12 A and B）。また、高解像度の活動モニタリングが可能なマルチビームDrosophila Activity Monitors (DAM)を用いて、異なる摂食条件を与えたハエの運動量も測定した。雄ではなく雌の活動量が、アドリブ給餌のハエよりも高いものがあったが、同じTFパラダイムで常に高いというわけでも、断食の期間と関連しているというわけでもない。また、このパラメータに関するデータは、4日間および10日間のTFで同様であった（SI Appendix, Fig.S12 C and D）。したがって、TFによる生存率の低下は、健康／機能における明らかな障害によるものではなく、おそらく内因性代謝の変化から生じるものである。
TFはまた、雌雄ともに細菌感染または熱ショック時の生存率を低下させた。これらの実験では、10時間、12時間、14時間の絶食の影響を調べたが、いずれの場合もZT0に摂食を開始した。しかし、一般に、絶食は感染や熱ショックに対するハエの生存に有害であった（Fig.） TFは代謝の健康を促進する一方で、ストレスへの反応には最適でない可能性があると推察される。
図5.

TFパラダイムで飼育されたハエは、細菌感染や熱ショックストレスに対してより敏感である。(A-F) アドリブまたはTFで飼育した雌雄のハエにS.marcescensを胸腔内に注射し、毎日生存率を測定した。(A) 4日間または21日間、毎日10時間の絶食後、ZT2時に感染させた（TF (T) 対 AF (A), 4日間雌 P値 < 0.001, 4日間雄 P < 0.05, 21日間雌 P < 0.001, 21日間雄 P = 0.36)．(B) 毎日10時間の絶食後、ZT12で4または21日間ハエに感染させた（TF対AF、4-d雌P < 0.004, 4-d 雄P = 0.7, 21-d 雌P = 0.15, 21-d 雄P = 0.27)．(C) 4日または21日間、毎日12時間絶食させた後、ZT2で感染させた（TF vs AF、4日メスP < 0.02、4日オスP < 0.04、21日メスP < 0.0005、21日オスP = 0.18). (D) 4日間または21日間、毎日12時間絶食させた後、ZT12で感染させた（TF vs AF、4d雌P = 0.42、4d雄P = 0.30、21d雌P < 0.016、21d雄P < 0.0014). (E) 4日間または21日間、毎日14時間絶食させた後、ZT2に感染させた（TF vs AF、4-d雌P < 0.05, 4-d 雄P < 0.008, 21-d 雌P = 0.083, 21-d 雄P = 0.061)．(F) 毎日14時間の絶食後、ZT12で4日間または21日間、ハエに感染させた（TF vs AF、4-d雌P < 0.0013, 4-d 雄P < 0.0002, 21-d 雌P < 0.0001, 21-d 雄P < 0.0001)．(G-L) アドリブまたはTF処理した雌と雄のハエを37℃に暴露し、12時間ごとに生存率を測定した。すべての条件において、TFはAFと比較して生存率を低下させた（P < 0.0001）。(G) 4日または21日間、毎日10時間絶食した後、ZT2において37℃に曝露した。(J) 毎日12時間の絶食後、ZT12で37℃に暴露した。 (K) 毎日14時間の絶食後、ZT2で37℃に暴露し、4日間または21日間暴露した。
マイクロバイオームを持たない無菌バエは、明暗サイクルの変化により、より迅速にリセットされた。
上記のフィットネスパラダイムではTFの有益性が示されなかったため、TFの有益な効果をマイクロバイオームが仲介しているかどうかを判断するために使用することはできなかった。その代わりに、我々はマイクロバイオームの機能的影響を評価する他の方法を検討した。マイクロバイオームが代謝や免疫に与える影響についてはよく研究されていますが（1-3）、健康維持に重要な概日リズムとの生理的関連性についてはほとんど知られていません。マイクロバイオームを持つハエは、無菌のハエに比べて概日リズムの振幅が減少しており、この概日リズムの減衰が宿主にとって有益なのかどうかという疑問が生じます。そこで、異なる環境サイクルによる腸内時計のリセットがマイクロバイオームによって影響を受けるかどうかを調べるため、無菌のハエとマイクロバイオームを含むハエに、2日ごとに明暗（LD）サイクルを6時間遅らせる概日リズムシフトパラダイムを行った（Fig.6A）。9日目には元のLDサイクルに戻り、この日、頭部と腹部のperとtim遺伝子の概日発現を調べ、元のLDサイクルにずっといたコントロールと比較した（図6 B-E）。
図6.

腸の時計は、微生物を含んだハエでは明暗サイクルの変化に対して遅い適応を示す。(A) 明暗サイクルの変化を生じさせるために用いた実験プロトコルと、メスの腸または頭部のサンプリング時間帯を示す模式図。(BおよびC）9日目の異なるタイムポイントにおけるAMおよびAS系統の頭部perおよびtimの発現。mRNAレベルはqPCRによって測定され、RP49に対して正規化された。データは平均±SEM（n = 3）。(対照AM：黒線；明：暗変化AM：黒破線；対照AS：青線；明：暗変化AS：青破線）。(DおよびE）9日目の異なるタイムポイントにおけるAMおよびAS系統の腸のperおよびtim mRNAの発現。 mRNAレベルはqPCRによって測定し、RP49に対して正規化した。データは平均±SEMである（n = 3）。(FおよびG）9日目、すなわちLD変化後のAMおよびASの腸におけるperおよびtim RNAの相対的ピーク時間値の比較。ピークタイムはmeta2d解析に基づく。データは平均±SEM、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001はStudentのt検定で決定。(HおよびI）4日目の異なる時間帯におけるAMおよびAS系統の腸のperおよびtimの発現。 mRNAレベルはqPCRによって測定され、RP49に対して正規化され、データは平均±SEM（n＝4）、（コントロールAM：黒線；明：暗変化AM：黒破線；コントロールAS：青線；明：暗変化AS：青破線）を示す。(J）腸内の分子リズムに対するマイクロバイオームとTFの効果を示すモデル。RNAリズムは、TFまたはマイクロバイオームの消失（AS）により強化される。この2つの操作が組み合わさると、リズムはさらに強くなる（TS）。下は、無精子症のハエがLDサイクルの変化に伴ってより速くシフトすることを示している。
9日目、実験ハエの頭部におけるperおよびtimの発現は、シフトしていない対照と異なっており、元の周期にシフトしていないことがわかった（図6 BおよびC、SI Appendix, Fig. S13A）。我々は、マイクロバイオームの存在が腸内の概日リズム遺伝子発現の振幅を減少させるものの、頭部ではperとtimの周期を増加させるようであることに注目した。明暗の変化を与えたマイクロバイオーム含有ハエの腸では、perとtimの発現は頭部のそれと同様であった、すなわち、シフトしていない対照とは異なり、9日目のLDサイクルに再同期しなかった（図6 DおよびE）。驚くべきことに、LD変化を受けた無菌ハエのperおよびtimの発現は、対照と区別できないプロファイルを示し、これらのハエが9日目のLDサイクルに非常に迅速に適応したことが示された（図6 FおよびG）。これらのハエにおけるtim発現はそれほど迅速にシフトしなかったが、それでも無菌ハエはシフトしていない対照の位相と一致するように著しいシフトを示している。
実験終了時の無精子症のハエの位相は、終始同じ LD サイクルにある対照の位相と一致したため、無精子症のハエが実験の早い段階で明暗差に反応してシフトしたことを確認しようとした。この日は新しいLDサイクルの初日であり、9日目とほぼ同じであるが、3日目の新しいLDへの移行は18時間の暗期を含み、9日目の移行は18時間の明期を導入している。3日目にはperとtimは過渡期を示し、無菌とマイクロバイオームのハエの間に明らかな違いは見られなかった（SI Appendix, Fig. 次に、新しいLDサイクルに移行してから2日目、すなわち実験4日目の腸におけるperとtimの発現を調べた。このとき、perの発現は、無菌のハエと微生物を含むハエで新しい体制に移行していた。timの発現は、無菌のハエで顕著な移行を示したが、微生物を含むハエではまだ過渡期を示した（図6 HおよびI）。腸内では、tim RNAの発現はper RNAよりもゆっくりとシフトするが、無菌状態のハエでは、マイクロバイオームを持つハエよりも両者のシフトが速くなると推察される。このように、マイクロバイオームが存在すると、環境が変化しても腸内時計が安定化する。
考察
我々はここで、ショウジョウバエのマイクロバイオームは循環しないが、腸の概日リズムのトランスクリプトームを制御し、環境サイクルに応じた急激な変動を防いでいることを報告した（図6J）。
哺乳類の腸内ではマイクロバイオームが循環しているという報告があることから、ショウジョウバエの類似体が循環していないことは驚きである（7-10）。その理由は不明である。構成が循環しないのは、ハエのバイオームが比較的多様性に乏しく、常に必要とされる可能性のあるラクトバチルスとアセトバクター種で主に構成されているためかもしれない（30）。一方、ハエの腸内細菌量はほぼ摂食によって決まるため（31）、ハエは一日中食べている可能性がある。実際、アドリブ・フライは摂食の概日リズムを示すが、そのリズムはあまり強固ではなく、摂食はオフピークの時間帯にも見られる (23, 25, 26) (SI Appendix, Fig. S4)．食物が主要な刺激であれば、TFパラダイムがサイクリングを駆動することが期待されるが、この条件下でもクロックレスフライでのみ限定的なサイクリングが観察された。体内時計がマイクロバイオームの循環を抑制している可能性がある。おそらく、循環するマイクロバイオームはハエにとって有益ではないからだろう。
TFプロトコルは、マイクロバイオームの循環を促進することができず、さまざまなストレスに対して宿主を保護することができなかった。この場合、ストレス反応を測定したときのハエの年齢が高くなるため、以前、TFによって心臓血管の健康が増進されたと報告された高齢のハエに年代的に近くなる(13)。しかし、それでも効果は見られなかった。このように、TF は代謝の健康を促進するが、ストレス応答には相当な栄養源が必要であり、給餌量が制限されることでそれが損なわれる可能性がある。このことは、種を超えて寿命を延ばすカロリー制限は、免疫機能を高める一方で、無傷の病原体に対する感受性を高めることを示す研究によって裏付けられている（32、33）。我々は、今回および以前（13）に用いた標準的なTFパラダイムでは、ショウジョウバエの寿命が延びなかったことにも注目する。このことは、ショウジョウバエの寿命延長には、TFのプロトコルを微調整する必要があることを示唆している。
しかし、TFとマイクロバイオームの消失という2つの操作はそれぞれ、宿主の腸内で循環するトランスクリプトームに大きな影響を及ぼした。哺乳類で以前に報告されたように、マイクロバイオームを持たないハエでは、循環転写産物の構成が変化した(7, 20)。代謝タンパク質をコードする転写産物は、無菌状態のハエにおいて、おそらく通常マイクロバイオームによって付与されるはずの代謝特性の損失を補うために、サイクリングが増加することを示した。一方、発生や分化に関わる遺伝子では、サイクルが減少していた。これは、腸がマイクロバイオームを受容するために必要なのかもしれない。特に顕著だったのは、酸化的リン酸化とエネルギー代謝に関わる転写産物のサイクルが、TF条件下で失われたことである。これは、TFがエネルギーを生み出す細胞内プロセス（ミトコンドリア機能など）の活性に直接影響を与えるため、関連タンパク質をコードする遺伝子の周期的な発現が必要ないためと推測される。
また、サイクリングの振幅は、TFやマイクロバイオームの消失によって増強されたことを報告した。TFはサイクリングを促進し、トランスクリプトームの構成を変化させるだけでなく、遺伝子発現の位相も変化させることがわかった。TFによってのみ発現が周期化する遺伝子は、食物摂取に反応するものの、時計によって駆動されていない遺伝子を反映していると思われる。時計遺伝子は、TFやマイクロバイオームの消失に対して様々な反応を示したため、それらがどの程度、周期的なトランスクリプトームに寄与しているのかという疑問が生じた。興味深いことに、周期的な転写因子を解析したところ、トランスクリプトーム全体で見られた結果とほぼ一致する結果が得られ、周期性におけるグローバルな変化は、上流の転写因子の活性が変化した結果であることが示唆された。このことは、TFの影響を調べた過去の報告（27, 28）とよく一致する。サイクリング転写因子の活性が時計に依存しているかどうかはまだ不明であるが、その多くは時計に依存している可能性が高い。一方、今回報告されたヒストンアセチル化の一部（下記参照）は、時計をバイパスしている可能性がある。
ヒストンアセチル化により、サイクリングの振幅が増加する。我々は、特に不妊症のハエにおいて、ヒストンアセチル化の強固なリズムを駆動し、TFによって影響を受ける多くの遺伝子がヒストンアセチル化に応答することを見出した。後者は、HDAC阻害剤で処理するとこれらの遺伝子の発現が増加することで示される。ただし、ここで用いた阻害剤の1つ（PBA）は、他の効果も持ちうることを認めている（35）。また、TFによるサイクリング増強を示すすべての遺伝子がHDAC阻害剤に反応するわけではなく（例えば、図4CおよびSI Appendix、図S10参照）、他のメカニズムも関与していることが示された。
一見すると、我々のマイクロバイオームのデータは、バイオームが宿主のサイクリングを減衰させるという点で、これまでの哺乳類の研究とは異なっているように見える。しかし、実際に異なるのは、マイクロバイオームの消失が宿主のサイクリングを抑制することを見出したLeoneらの研究だけである（17）。Gachonらは、より性差に焦点を当てたが、彼らのデータは、軸索動物でより良いサイクリングを示している（20）。Montagnerらは、マイクロバイオームを持たない動物におけるサイクリングの変化を報告し、やはり彼らのデータを検証したところ、振幅が大きくなっていることが示唆された（18）。最後に、ThaissとGachonは概日リズムのトランスクリプトームの構成に変化を示したが、これは我々のデータと一致している(7, 20)。
微生物が時計遺伝子の循環を弱めるという事実は、循環は宿主に利益をもたらすので、適応的な微生物によって強化されるはずだという考え方に反している。しかし、宿主の腸内トランスクリプトームの周期が低ければ、他の体内組織とより容易に同期できるようになり、有益である可能性もある。例えば、腸のサイクルは、マイクロバイオームを含むハエを明暗サイクルの異なる場所に移動させたときに、頭部のサイクルと同期していることがわかった。一方、マイクロバイオームを含む腸の時計は、明暗サイクルの変化に対する感度が低く（ハエの腸は直接光に反応する可能性があることに注意）、概日機能のランダムな変動を防ぐことができる。実際、光に対する反応性が低下していることも、これらのハエのサイクリングが弱くなっていることの理由となり得る。不妊症のハエでは、腸の時計遺伝子のサイクルが環境の明暗の変化に非常に敏感であるため、頭部のサイクルが変化しない場合でも、サイクルが変化するのである。全体として、私たちのデータは、頑健なマイクロバイオームが腸内の概日リズムを安定化させ、生物内の同調性を促進し、環境の急激な変化に抵抗していることを示唆している。これらの知見は、現代社会の一般的な状況に対して重要な示唆を与えている。
材料と方法
ハエ系統の作製と維持
本研究で存在するw118 iso31, per01フライラインは、特に指定しない限り、12:12 LD条件下、25℃の標準コーンミール/糖蜜培地で維持された。腸内細菌群の16S配列決定のために、我々はまずハエを1mMカナマイシン（11815024、ThermoFisher）で処理してWohlbachiaを除去した、そうしないと配列決定において他の細菌のシグナルを振り切ってしまうからであった。その後、他のハエが以前使用していた培地から、ラクトバチルスとアセトバクター細菌を含むウォルバキアのいないマイクロバイオームをハエに再増殖させた。無菌ハエの生成とTFプロトコルの説明は、（SI Appendix, SI Methods）に記載されている。
サンプルの収集と16S配列の決定
5〜7日齢の雌および雄のハエを別々に新鮮な滅菌培地バイアルに4時間ごとに移した。バイアル当たり少なくとも35匹のハエを維持し、上記のAFまたはTF処理法と組み合わせた12：12LD条件下で25℃で排泄させた。16S配列決定のための糞サンプルの処理は、（SI Appendix, SI Methods）に記載されている。
免疫・抗ストレス試験
熱ショックおよび感染ストレス試験については、4齢のハエを12：12の明暗サイクルで維持し、毎日10時間、12時間、または14時間絶食させ、4日後または21日後に試験した。試験の詳細は、SI Appendix, SI Methodsに記載されている。
RNA-seq およびデータ解析。
各RNAseq実験について、SV Total RNA Isolationキット（Z3105、Promega）を用いて少なくとも30匹の雄の腸から総RNAを抽出した。RNA単離、ライブラリーの調製、RNAseq解析の詳細は、（SI Appendix, SI Methods）に記載されている。
HDACインヒビターの投与
2種類のヒストンデアセチラーゼ阻害剤である4-フェニルブチレート（PBA）ナトリウム（HY-15654、MedChenExpress）およびVA（PHR1061、Sigma）それぞれを1％青色食品着色料を含むPBSに溶解し、雌ハエの体内に皮下注入した。注入濃度はPBAが30mM、VAが10mMであった。対照として、1%青色食品着色料を含むPBSを用いた。ヒストンアセチル化および標的遺伝子の発現は、いずれかの阻害剤を注入した12時間後に、ウェスタンブロットまたはqPCRによって調査した。また、実験中、ハエの死亡率もモニターした。
定量的リアルタイムPCRおよびウェスタンブロット分析。
詳細は、SI Appendix、SI Methodsに記載されている。
概日リズムシフトアッセイ（Circadian Phase Shift Assay）。
概日数位相シフトアッセイのために、微生物含有および無菌雌ハエを、2dごとに、すなわち3日目、5日目、7日目および9日目にLDサイクルを6時間遅らせて、9日目にハエが元の位相に戻るようにさせた。雌ハエの内臓をZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20、およびZT24のタイムポイントで解剖した。対照のハエは、25℃で元のLD体制（午前9時：午後9時）で維持した。各時点で、微生物含有ハエおよび無菌雌ハエについて、それぞれ3つの反復サンプル（1サンプルあたり>30 guts）を収集した。すべての試料をqPCR解析に供した。
統計解析。
実験の統計的詳細は、図の説明文に記載されている。サーカディアン統計解析は、JTK_CYCLEv3.1を用いてRで実施した。Holm-Sidakポストホック補正検定を伴う一元配置ANOVAはGraphPad Prism 9で行い、実験群はWelchの補正を伴う対応のないt検定で比較した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. エラーバーは、図の説明で特に明記されていない限り、±SEMを表す。
データ、材料、ソフトウェアの入手方法
マイクロバイオームデータはNCBI BioProjectのアクセッション番号PRJNA923004で公開されている。RNAseq解析のメタデータは、https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA922929?reviewer=dteltea5m87afl41vn49jrche5 で入手可能。研究データの一部は、論文および/またはSI Appendixに含まれています。
謝辞
この研究は、Volkwagen Stiftung (Life?) からの助成金により行われた。Y.Z.は、中国国家自然科学基金（31972308）およびCARS-RICE用耳寄り基金（CARS-01）の支援を受けた。A.S.はHHMIの研究者である。原稿にコメントをくれたChristoph Thaissと、有益な議論をした研究室のメンバーに感謝する。本論文はHHMIの出版物へのオープンアクセスポリシーに従ったものである。HHMIの研究室長は、これまで研究論文において、一般には非排他的なCC BY 4.0ライセンスを、HHMIにはサブライセンス可能なライセンスを付与してきた。これらのライセンスに従い、本論文の著者承諾済み原稿は、出版後直ちにCC BY 4.0ライセンスの下で自由に利用できるようにすることができる。
著者貢献Y.Z., J.F., and A.S. designed research; Y.Z., A.F.B., S.B.N., and F.L. performed research; Y.L. J.F., and A.S. contributed new reagents/analytic tools; Y.Z., Y.L., S.B.N., J.A.W., S.G.D.,K.B.,J.F. and A.S. analyze data; and A.S. wrote the paper.
競合する利益著者らは競合する利益を宣言しない。
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著作権©2023米国科学アカデミー。All rights reserved. | オンライン ISSN 1091-6490

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