消化された二酸化チタンナノ材料のヒト腸管細胞における遺伝毒性に関する検討

2023年4月16日 12:59

食品・化学物質毒性学
第161巻 2022年3月号 112841号
消化された二酸化チタンナノ材料のヒト腸管細胞における遺伝毒性に関する検討

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691522000382

著者リンクオーバーレイパネルAdriana Vieira a, Nádia Vital a, Dora Rolo a, Rossana Roque a, Lídia M. Gonçalves b, Ana Bettencourt b, Maria João Silva a c, Henriqueta Louro a c
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https://doi.org/10.1016/j.fct.2022.112841Get 権利と内容
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二酸化チタンナノ材料（TiO2 NMs）は、歯磨き粉や食品接触材料などの食品や消費者製品に広く使用されており、これらのナノ材料（NMs）のヒト経口曝露の関連性を示唆し、消化管（GIT）における有害作用の可能性を提起している。
我々は以前、TiO2 NMsのin vitro消化が腸管細胞における毒性を増加させる可能性があることを示しました。本研究では、Caco-2およびHT29-MTX-E12腸管細胞を用いて、3種類のTiO2 NM（NM-102、NM-103およびNM-105）の生理的濃度で遺伝毒性および細胞内活性酸素種の誘導を、NMの物理化学特性における消化プロセスの影響を考慮しつつ解析した。その結果、DNA損傷効果はNMに依存し、ルチル/アナターゼNM-105では、細胞培地中の流体力学的サイズが小さいためか、より関連性が高いことが明らかになった。さらに、小核アッセイの結果、HT29-MTX-E12細胞において、試験したすべてのTiO2 NMが、特にin vitro消化後に、発がんリスクの指標である染色体の完全性に影響を及ぼすことが示唆されました。本研究は、EFSAが最近報告した食品添加物としてのTiO2 NMsの使用に関する懸念の根拠となるものであり、摂取によりヒトへの暴露を促進する可能性のある消費者製品への使用に関するものである。
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キーワード
酸化チタン
ナノマテリアル
In vitro 模擬消化
腸管上皮細胞
遺伝毒性

はじめに
二酸化チタンナノ材料（TiO2 NM）は、歯磨き粉、医薬品、コーティング、紙、インク、プラスチック、食品、化粧品、繊維を扱う産業で最も頻繁に適用されるナノ材料（NM）の一つです（Waghmode et al.、2019）。食品添加物として、TiO2 NMは、乳製品、ペストリー、キャンディー、スイーツ、チューインガムなどの一部の製品の白色を強化し、その使用は、野菜、ナッツ、スープ、ソースなどの非白色食品の風味を改善し、ビール、サイダー、ワインなどの飲料の清澄化のためにも可能です（Weirら、2012；Winklerら、2018）。このクラスのNMは、食品接触材料に適用することもできる（He et al.、2019）。ごく最近、食品添加物（E171）としてのTiO2の適用は、欧州食品安全機関であるEFSA（EFSA Panel on Food Additives and Flavourings et al.、2021a）によりもはや安全ではないとみなされました。それにもかかわらず、医薬品、個人衛生、または化粧品産業におけるTiO2 NMの広範な使用は、同様に説明されている。そのため、食品とは別に、栄養補助食品、歯磨き粉、口紅などの製品もナノサイズTiO2の曝露源となり、これらのNMへの曝露による健康リスクに寄与する可能性がある（Heringa et al.、2016）。これらの製品が食品分野の規制対象外であることは注目すべきことである。
TiO2 NMの幅広い使用により、ヒトへの曝露の可能性が高まり、ヒトの内部曝露はすでに実証されている（Heringa et al.、2018）。さらに、オランダ人を対象とした研究では、幼児のTiO2 NMs摂取に最も寄与する製品は、実際には歯磨き粉（TiO2 NMs摂取量の57％以上に寄与）である一方、成人では、摂取量は生牛乳サンプルを含む多くの食品に広がり、おそらく背景または間接ソースに由来する（Rompelbergら、2016）ことが示されました。この暴露データは、消化管（GIT）での有害作用の可能性を補強するものです。In vivoのげっ歯類モデルは、TiO2 NMが消化過程で受ける修飾を含む全器官的な現実的アプローチを提供しながら、摂取時のそのような影響を調べるために使用されてきた（Bettini et al., 2017; Bettini and Houdeau, 2014; Murugadoss et al, 2020; Urrutia-Ortega et al, 2016）、ヒトとげっ歯類の間の生理学とGITの取込みにおける相違は適切なリスク評価の妨げになりうる（Sohol et al., 2018a）。したがって、ヒトの模擬消化モデルの使用は、動物モデルに代わるNMsのハザード特性評価のための貴重な初期段階のツールとなる。in vitro消化はNMsに特化したものではないが、INFOGEST調和法は、食品摂取後のNMsに使用すべき重要なアプローチであるとEFSAは考えている（EFSA et al.、2021b）。
In vitro研究の結果は矛盾しており（EFSA Panel on Food Additives and Flavourings et al., 2021aでレビュー）、多くは腸細胞におけるTiO2 NMsの遺伝毒性のいくつかの証拠を示しているため、GITにおけるTiO2 NMの潜在毒性はまだ明らかにされていない（Dorier et al., 2017; Gerloff et al., 2012; NanoGenoTox, 2013; Schneider et al., 2017; Vila et al., 2018; Zijno et al, 2015）. 摂取されたTiO2 NMの比較毒性評価に消化プロセスを含めるために、我々は以前に、3つの異なるTiO2 NM（NM-102、NM-103、NM-105）に対する標準化静的INFOGEST 2.0 in vitro消化法の適用を説明しました。用量は、経口摂取後のヒトの腸に生理学的に関連するものとして選択された（Richterら、2018；Guoら、2017）。興味深いことに、NM-105の流体力学的サイズは消化後に減少し、原形と比較して、HT29-MTX-E12細胞でより毒性作用が生じた（Bettencourtら、2020）。この消化後の流体力学的サイズの減少は、その遺伝毒性にも影響を及ぼすと考えられる。本研究の目的は、摂取したTiO2 NMの生物学的影響をさらに検討するために、模擬消化過程を経た同じTiO2 NMの遺伝毒性を2つの腸管細胞株で調べ、その結果をその第一および第二の物理化学的特性と関連づけることである。酸化ストレスはTiO2 NMによって誘発される毒性と頻繁に関連しているため（Proquin et al.、2017）、活性酸素種（ROS）の補完的な分析がこの調査に含まれた。
材料と方法
2.1. TiO2 NMの物理化学的性質と試料調製法
本研究で使用した3つのTiO2 NM、NM-102、NM-103、NM-105は、共同研究センター（JRC、イスプラ、イタリア）から親切に提供され、国際ベンチマーク（Rasmussen et al, 2014）として考えられている。それらの主要な物理化学的特性は、JRCによって提供された（Rasmussen et al.、2014）。22～30nmの主要なサイズを持つ3つのTiO2 NMは、結晶構造、表面積、凝集体/凝集体のサイズに違いが見られます。NM-102とNM-103はそれぞれアナターゼとルチルの結晶相からなり、NM-105はアナターゼ81.5%とルチル18.5%の混合結晶性である。さらに、NM-103は、疎水性Alコーティングからなる唯一のコーティングされたNMである（Rasmussenら、2014）。
各NMの2.56 mg/mLストック分散液は、0.5%絶対エタノール（96%）で粉末をあらかじめ濡らし、その後、滅菌ろ過した0.05 wt%の牛血清アルブミン（BSA）-水を加え、氷水浴で冷却した400ワットのBranson Sonifier S-450D (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA) でサンプルを16分間探針超音波処理して分散することにより調製した（Jensen et al., 2011）。ストック分散液は、細胞培養液で希釈した後、静的消化プロセス（消化サンプル、DIGをもたらす）または物理化学的特性評価および生物学的アッセイのために直接（未消化サンプルに対応）、直ちに使用された。
標準化されたINFOGEST 2.0 in vitro消化法（Brodkorbら、2019）に基づく静的消化プロトコルの使用により、TiO2 NMのヒト消化を模倣した。模擬消化後、TiO2 NMs試料を細胞培養液で希釈し、遺伝子毒性アッセイで直ちに使用するために、消化されたNMsの最終濃度0.14、1.4および14 μg/mLにした。
模擬GIT培地の効果を含む、DLS、ゼータ電位およびTEM-EDSを用いた生物学的培地中のNMの二次特性の特性化は、我々のグループによって以前に記述されていた（Bettencourtら、2020）。簡単に説明すると、DLSデータは、消化後のNM-105は原始的なものよりも平均サイズが小さいことを示し、他のNMについては大きな違いは観察されなかった。未消化および消化されたNMはすべて負のゼータ電位を示し、TEMで測定した培養液中に分散したNMのサイズは20.4～25.7nmであった（Bettencourt et al.、2020年）。
2.2. 細胞培養と暴露
試験管内実験モデルとして、未分化のCaco-2細胞とHT29-MTX-E12細胞（ECACC、英国）の2種類の異なるヒト腸管細胞株を選択した。小腸の粘膜は、腸管内腔に直接露出する成熟分化した絨毛状腸細胞と、内腔面下のクリプトに存在する低分化増殖性腸細胞の両方から構成されていると認識されているため、未分化細胞を使用した（P. Greaves, 2007）. 両細胞株は、HT29-MTX-E12細胞またはCaco-2細胞について、それぞれ1％Amphotericin B（0.25 mg/mL）、ペニシリン10,000単位/mLおよびストレプトマイシン10,000μg/mLの1％溶液、2.5％HEPES Buffer、10％または15％牛胎児血清（FBS）添加Dulbecco変法Eagle Medium (DMEM) で保持した。すべての試薬はThermo Fisher (Waltham, MA, USA)から入手した。細胞は、37℃、5％CO2の雰囲気で維持した。
未消化または消化されたTiO2 NMsサンプルを細胞培養液で希釈し、最終濃度を0.14、1.4および14μg/mLにした。この濃度は、現実の経口曝露に基づき、0.14μg/mLをヒトの腸に到達する現実的な濃度とみなした公開研究に基づいて選択しました（Richterら、2018；Guoら、2017）。さらに、私たちの以前の結果は、未消化サンプルも消化サンプルも選択した濃度範囲内で細胞毒性を示さないことを示した（Bettencourt et al.、2020）。
コメットアッセイのために、Caco-2およびHT29-MTX-E12細胞を24ウェルプレートにウェル当たり7x104細胞の密度でプレーティングし、暴露前に24時間インキュベートした。暴露液を添加し、24時間の暴露期間を設けた。ポジティブコントロールは、5mMのメタンスルホン酸エチル（EMS；Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、USA）を用い、細胞採取の1時間前に添加した。
CBMNアッセイについては、HT29-MTX-E12細胞を6ウェルプレートに0.5x105細胞/ウェルの密度で、Caco-2細胞を各25cm2フラスコに1.5x105細胞/mLの密度で播き、ともに24時間インキュベートしてから暴露した。ポジティブコントロールとして、Mitomycin C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を最終濃度0.3μg/mLで使用した。
NMを分散させるために使用したBSA-水の溶液、および消化陰性対照（NMなし）に対応する消化BSA-水（DIG Control）。消化ネガティブコントロールは3種類使用した： C1は、NM濃度0.14μg/mLの培養液中に存在する消化産物の割合に対応し、C2は、1.4μg/mL、C3は、14μg/mLである。
2.3. コメットアッセイ
NMへの24時間の曝露後、細胞を収穫し、アルカリコメットアッセイを以前に記載されたように実施した（Louro et al.、2019）。コメットアッセイの従来のバージョンとホルムアミドピリミジンDNAグリコシラーゼ（FPG）修飾バージョンの両方を実施した。FPGのようなDNA修復エンドヌクレアーゼの使用により、一本鎖または二本鎖切断、アルカリ可逆部位に加えて、DNA酸化病変を検出することができます。簡単に説明すると、曝露後、細胞懸濁液を0.8％低融点アガロース（Sigma-Aldrich）と混合し、あらかじめ1％通常融点アガロースでコーティングした顕微鏡スライドに載せ、カバースリップで覆った。スライドを溶解液（NaCl 2.5 M, Na2EDTA.2H2O 100 mM, Tris-HCl 10 mM; pH 10; 10% DMSO and 1% Triton-X100）に4℃で一晩浸漬した。スライドをFPG酵素反応バッファ（Fバッファ；HEPES 40 mM、KCl 100 mM、酸性EDTA 0.5 mM、BSA 0.2 mg/ml；pH8）で洗浄した。Fバッファで希釈したFPG酵素（ノルウェー、オルソ大学、A. R. Collins博士の好意により提供）、またはFバッファのみを各ゲルに加え、スライドを37℃の加湿器内で30分間インキュベートした。電気泳動バッファー（NaOH 0.3M, Na2EDTA.2H2O 1mM; pH = 13）中で30分間インキュベートした後、4℃で25分間、0.8V/cmで電気泳動しました。最後に、スライドを中和バッファー（Trizma-base 0.4 M in water, with 9,5%vol HCl 4 M; pH = 7.5）およびMilliQ水で洗浄した。得られたスライドを、コメットアッセイIV画像解析システム（Perceptive Instruments、英国）を用いて蛍光顕微鏡（Leica Dm500、ドイツ）で解析する前に、エチジウムブロマイド（12.5μg/mL）で染色した。暴露条件ごとに独立した実験からの3つの複製を、2つのゲルで、処理条件ごとに100細胞のスコアで分析した。各サンプルからテール内の%DNAの中央値を算出した。3つの独立した複製物の中央値の平均±標準偏差（M±SD）を使用して、結果を表した。酵素処理したスライドのDNA移動量から、基底レベルのDNA移動量（% DNA in tail）を差し引くことで、Net FPG感受性部位を決定した。
2.4. サイトキネシスブロック小核アッセイ（CBMN）アッセイ
細胞質分裂阻止小核アッセイは、曝露の24時間後にシトカラシン-B（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）を添加するなど、NMsの干渉を克服するための若干の変更を加えた国際ガイドラインに従って行った（OECD、2016； Louro et al. 倍加時間の違いや以前の予備実験の関係から、NMへの曝露開始から合計72時間（HT29-MTX-E12細胞）または52時間（Caco-2細胞）インキュベートした。得られたギムザ染色スライドを明視野顕微鏡（Axioskop 2 Plus, Zeiss, Germany）でコード化し、ブラインドスコアリングした。微小核は、2つの独立した培養物から少なくとも4000個の二核細胞でスコアリングした。2000個の細胞あたりの微小核発生二核細胞の頻度（MNBC/1000 BC）を決定した。単核、二核または多核細胞の割合は、合計1000個の細胞で決定し、細胞質分裂阻止増殖指数（CBPI）、および複製指数（RI）は、OECDガイドライン（OECD、2016）を使用して計算した。
2.5. 細胞内活性酸素種（ROS）測定
細胞内ROSは、いくつかの適応を伴う以前に記載された手順（Silvaら、2017年）に従って、十分に特徴付けられたプローブ、2′，7′-Dichlorofluorescein diacetate（H2DCF-DA；Life Technologies、英国）を使用して決定した。簡単に言えば、Caco-2およびHT29-MTX-E12細胞株を、96ウェルプレートの各ウェル（ウェルあたり2×104細胞）に、ウェルあたり100μLの細胞培養液で等密度で播種し、37℃で24時間インキュベートした。細胞を20μMのH2DCF-DAとともに、暗黒下、37℃で30分間プレインキュベートした。その後、プローブ溶液を除去し、試験する異なるサンプル（NM-102、NM-103、NM-105、BSAの溶液、消化したNM-102、NM-103、NM-105、BSA）を最終濃度0.14、1.4、14 μg/mL, 3反復で含む新しい培地を追加した。過酸化水素水溶液（250μM）を細胞における活性酸素の誘導のためのポジティブコントロールとして、細胞培養液のみをネガティブコントロールとして使用した。細胞は、処理物の存在下、37℃で1時間および24時間インキュベートした。DCFレベルは、蛍光マイクロプレートリーダー（FLUOstar BMGLabtech, Ortenberg, Germany）を用いて、励起485nmおよび発光520nmの波長で測定した。3つの独立した実験からのデータは、それぞれのコントロールにおけるROSレベル（同じ実験条件からの曝露細胞の蛍光／未曝露コントロールの蛍光）と比較して、平均相対ROSレベルとして表現されるように報告された。
2.6. H2O2産生の測定
ROS-Glo™ H2O2 Assay kit, from Promega Corp. (Madison, WI, USA), used to measure the level of ROS, directly in cell culture, using non-lytic procedure, according to the manufacturer's instructions, with minor modification, as following. 簡単に説明すると、NMによる曝露処理の24時間前に、96ウェルプレートの各ウェルに等密度で細胞を播種した（ウェルあたり2 x104細胞）。一晩培養した後、細胞培地を曝露培地に交換した。18時間後、H202基質溶液を添加し（25μM）、24時間まで培養した。処理終了後、各サンプルウェルの培地50μLとROS-Glo™検出溶液50μLを別の不透明白色96ウェルプレートに合わせ、プレートを遮光して室温で20分間インキュベートした。ROS-Glo™ アッセイからの発光シグナル（相対発光単位、RLU）は、プレートリーディングルミノメーター（GloMax® 96 Luminometer）を用いて測定しました。結果は、Caco-2およびHT29-MTX-E12の両細胞において、ネガティブコントロール（消化しないBSA-水）に対する相対値として表されます。
ネガティブコントロールとポジティブコントロールを併用しています。使用したネガティブコントロールは、NMで使用した最高濃度（14μg/mL；C3）を模倣した試験化合物ビヒクル（BSA-Water）であり、NMについて上述したように処理した。ROS生成の陽性対照として、製造者の提案により、50μMのメナジオン（Sigma）を選択した。25μMのH2O2基質溶液の存在下で、細胞をポジティブコントロールと共に2時間インキュベートした。
2.7. 統計解析
結果の統計分析は、IBM SPSS Statistics 26（Armonk, NY, USA）またはPrismソフトウェア（6.01, GraphPad, San Diego, CA, USA）を用いて実施した。NM処理およびビヒクル処理した培養物の小核細胞の頻度を比較するために、フィッシャーの正確検定を適用した。CBPI、RIおよびDNA損傷は、一元配置分散分析およびポストホックテストを用いて分析した。さらに、同じ濃度での消化処理条件と未消化処理条件、およびFPG酵素とROSレベルの有無による結果の比較には、Studentのt-testを使用した。コントロールに対するサンプル間のH202の生成量を比較するために、データが正規分布に従うことを条件に、一元配置分散分析に続いて多重比較のためのDunnettのポストホックテストを実施し、コントロールに対する複数の処理結果を比較した。それ以外の場合は、Kruskal-Wallisなどのノンパラメトリック検定を適用し、試験濃度とネガティブコントロールの間の差異を比較した。p値が0.05未満の差は、統計的に有意であるとみなされた。
結果
3.1. 消化されたTiO2 NMsによって引き起こされるDNA損傷
24時間暴露後、従来のコメットアッセイとFPG修飾コメットアッセイを用いて評価した両タイプのヒト腸管細胞のDNA損傷の定量結果を図1、図2に示します。Net FPG感受性部位は、両方の細胞株について表1に示した。
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図1. 未消化および消化（DIG NM）されたTiO2 NMに24時間曝露した後の、Caco-2細胞における従来の（A-C）またはFPG-cometアッセイの結果（D-F）： NM-102（A、D）、NM-103（B、E）およびNM-105（C、F）。0-ネガティブコントロール（BSA-wasterを含む培地）；C1、C2、C3-それぞれ0.14、1.4、14μg/mLのNMを消化したネガティブコントロール；EMSポジティブコントロール、5mM. 結果は、独立した3反復の平均テール内DNA %（±SD）で表される。* - それぞれの陰性コントロールまたは消化陰性コントロールと有意に異なる（p < 0.05, One-Way ANOVA and Post-hoc tests）。** - 消化したNMサンプルは、同じ濃度で、未消化のNMサンプルと有意に異なる（p < 0.05, Student's t-test）。
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図2. 未消化および消化（DIG NM）されたTiO2 NMに24時間曝露した後の、HT29-MTX-E12細胞における従来の（A-C）またはFPG-cometアッセイの結果（D-F）： NM-102（A、D）、NM-103（B、E）、NM-105（C、F）。0-ネガティブコントロール（BSA-wasterを含む培地）；C1、C2、C3-それぞれ0.14、1.4、14μg/mLのNMを消化したネガティブコントロール；EMSポジティブコントロール、5mM．結果は、独立した3反復の平均テール内DNA %（±SD）で表される。* - それぞれの陰性コントロールまたは消化陰性コントロールと有意に異なる（p < 0.05, One-Way ANOVA and Post-hoc tests）。** - 消化したNMサンプルは、同じ濃度で、未消化のNMサンプルと有意に異なる（p < 0.05, Student's t-test）。
表1. コメットアッセイで測定されたネットFPG部位、曝露24時間後。
ネットFPG感受性部位（平均±SD）Caco-2 CellsHT-29-MTX-E12 cellsNM-102NM-103NM-105NM-102NM-103NM-10501.25 ± 0.664.82 ± 0.703.94 ± 0.013.75 ± 1.12DIG C12.21 ± 2.162.26 ± 1.411.74 ± 1.131.58± 1. 40DIG C20.75±0.232.68±1.662.69±0.493.32±0.64DIG C33.19±1.843.31±0.212.58±1.022.14±1.450.141.71±1.172.62±0.244.25±0.853.61±1.421,28±0,691,95±0,641.41.58±1.101.64 ±1. 013.56 ± 2.014.16 ± 2.621,56 ± 0,911,73 ± 0,73144.07 ± 1.884.01 ± 0.712.88 ± 1.203.16 ± 2.683,15 ± 1,692,21 ± 1,31dig 0.142.35 ± 1.781.68 ± 0.293.74 ± 1.422.66 ± 0.313,14 ± 2.381,16 ± 0,6dig 1. 42.40 ± 0.850.98 ± 0.535.02 ± 0.633.94 ± 1.023.38 ± 1,281.84 ± 0,87dig 142.21 ± 2.163.53 ± 2.543.40 ± 2.762.24 ± 1.013.82 ± 2,022.74 ± 1,75ems15.99 ± 1.6214.58 ± 1.239.18 ± 2.3411.16± 2.04
0-ネガティブコントロール（BSA-waster）；C1、C2、C3-それぞれ0.14、1.4、14μg/mLのNMについて消化したネガティブコントロール；対応するネガティブコントロールと有意に異なる、p < 0.05 Student's t-test. 消化したサンプルと未消化のサンプルを比較した場合、有意差は認められなかった（p > 0.05 Student's t-test）。SD- 標準偏差。
Caco-2細胞では、消化したNM-102およびNM-103（図1AおよびB）を14μg/mLに曝露した24時間後に、それぞれの未消化の対応物と比較して、DNA損傷の著しい増加が観察された（p = 0.037, p = 0.001; Studentのt-test）。FPG-cometアッセイでは、未消化試料と比較して、1.4μg/mLの消化NM-102の後（図1D、p = 0.018, Student's t-test）および14μg/mLの消化NM-105の後（図1F、p = 0.010 ）、DNA酸化損傷の増大がみられた。
消化したNM-103および消化したNM-105に24時間曝露することによって誘導されるDNA損傷において、それぞれの陰性対照との関係で有意差が検出された（p = 0.015 および p = 0.046, One-Way ANOVA）。消化したNM-103（1.4および14μg/mL）および消化したNM-105（14μg/mL）によって誘発されたDNA損傷は、それぞれのネガティブコントロールよりも有意に高かった（p = 0.031, p = 0.011 and p = 0.034 Student's t-test）. しかし、消化NM-103に関連する値は、当社の過去のネガティブコントロールデータの分布の95%信頼区間内に含まれ、テール内の%DNAで下限が4.038、上限が5.861であり、DIG NM-105の値はこの区間の外側である、より適切である。
Net-FPG感受性部位は、Caco-2細胞でもHT29-MTX-E12細胞でも、消化後の酸化的損傷の有意な増加を明らかにしなかった（表1）。
未消化または消化されたNMに3時間短時間曝露した後に測定したDNA損傷のレベルは、いずれの細胞株においても、それぞれのコントロールに対する有意差を示さなかった。同様に、各消化NMサンプルと対応する未消化NMサンプルとの間でも、DNA損傷の有意差は観察されなかった（結果は示さず）。
さらに、ネガティブコントロールであるBSA水と比較して、消化したネガティブコントロール（C1～C3）を数濃度曝露しても、両細胞型（図1、図2）においてDNA損傷に有意差は認められなかった（p > 0.05, Student's t-test）。一方、ポジティブコントロールでは、DNA損傷および酸化的病変が有意に増加し、DNA一本鎖および二本鎖切断を検出する本アッセイの感度が確認された。
HT29-MTX-E12細胞（図2）については、1.4μg/mLの消化NM-103試料に曝露した細胞の結果を、未消化の試料と比較すると、従来法とFPG-comet法の両方で有意差が認められた（それぞれ、p = 0.0054 および p = 0.012; Studentのt-検定）。さらに、消化したNM-105は、0.14μg/mLの濃度で、FPG非存在下（p = 0.044）および14μg/mLの酵素あり（p = 0.014）で、同じ濃度の未消化試料と比較して尾部のDNA比率を増加させた。また、HT29-MTX-E12細胞では、最高濃度の消化NM-105は、従来のコメットアッセイおよびFPG修飾コメットアッセイにおいて、陰性対照と比較してDNA損傷レベルの軽度な有意な増加をもたらした（それぞれp = 0.028 および p = 0.025、Tuckey post-hoc test）。DIG NM-105で観察された有意な値は、過去の陰性対照データの分布の95％信頼区間外であり、1.673～2.314％のDNA in tail（従来のコメットアッセイ）または4.094～5.331％のFPG結合コメットアッセイに及ぶ。DNA酸化損傷の増加は、未消化試料と比較してNM-105の消化後に関連する発見であってCaco-2で見られた効果であると考えられる。
得られた結果の解釈を助けるために、所定の遺伝毒性試験における陽性反応の同定に関するOECD基準を使用することができる（OECD、2017）。明確な陽性結果は、3つの基準、すなわち、少なくとも1つの濃度について統計的に有意な増加、用量反応、および関連する結果が適切な過去の陰性対照データの分布の外にある場合に考慮されます（OECD、2017）。さらに、1つ以上の濃度で統計的に有意な増加が得られたが、関連する結果が過去の陰性対照データの分布の内側に含まれている場合、その結果は等閑視することができる（NanoGenoTox Joint Action, 2013）。コメットアッセイの結果に記載された基準を適用すると、検討された最高濃度のNM-105消化物のみが、FPG酵素がない場合、両方の腸管細胞株でDNA損傷の増加、またはFPGによるアッセイを考慮するとHT29-MTX-E12細胞でDNA酸化損傷の増加を引き起こす可能性がある。
3.2. 消化されたTiO2 NMによって誘発される染色体損傷
未消化および消化されたTiO2 NMに曝露されたCaco-2およびHT29-MTX-E12細胞におけるCBMNアッセイの結果を、図3、図4に示します。
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図3. 未消化および消化（DIG NM）されたTiO2 NMに52時間曝露した後の、Caco-2細胞におけるCBMNアッセイの結果である： NM-102（A）、NM-103（B）およびNM-105（C）。C1、C2、C3-それぞれ0.14、1.4、14μg/mLのNMを消化したネガティブコントロール；MMC-ポジティブコントロール、0.3μg/mL。結果は、独立した2つの複製（n = 2）の平均MNBC/1000 BC ± SDとして表される。 - それぞれのネガティブコントロール、すなわち未消化のNMサンプルについては同等の濃度のBSA水、消化したNMサンプルについては消化ネガティブコントロール（DIGコントロール）と有意に異なる（p < 0.05, Fisherの正確検定）。** - 消化されたサンプルは、同じ濃度で、未消化のサンプルと有意に異なる（p < 0.05, Fisher's Exact test）。MNBC/1000 BC - 1000個の二核細胞あたりの微小核発生細胞。
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図4. HT29-MTX-E12 細胞において、未消化および消化（DIG NM）TiO2 NM に 72 時間曝露した後の CBMN アッセイの結果： NM-102（A）、NM-103（B）およびNM-105（C）。C1、C2、C3-それぞれ0.14、1.4、14μg/mLのNMを消化したネガティブコントロール；MMC-ポジティブコントロール、0.3μg/mL。結果は、独立した2つの複製（n = 2）の平均MNBC/1000 BC ± SDとして表される。* - それぞれのネガティブコントロール、すなわち未消化のNMサンプルについては同等の濃度のBSA水、消化したNMサンプルについては消化ネガティブコントロール（DIGコントロール）と有意に異なる（p < 0.05, Fisherの正確検定）。** - 消化されたサンプルは、同じ濃度で、未消化のサンプルと有意に異なる（p < 0.05, Fisher's Exact test）。MNBC/1000 BC - 1000個の二核細胞あたりの微核化二核化細胞。
Caco-2細胞（図3）において、消化したNM試料と未消化のNM試料を同じ濃度で比較したところ、消化したNM-102とNM-103を14μg/mL投与した後の小核の発生頻度に統計的有意差が認められた（p = 5.6 × 10-8 and p = 1.9 × 10-4, Fisherの正確検定). しかし、最高濃度の消化陰性コントロール（C3）は、消化していない陰性コントロールと比較して、MNBC/1000 BCの有意な増加を誘導することができたことに留意すべきである（p < 0.05, Fisherの正確な検定）。この背景となる遺伝毒性を念頭に置き、同程度の濃度のネガティブコントロールを使用したため、消化したネガティブコントロールのそれぞれのネガティブコントロールとの比較が可能であったが、消化したNMに関連すると考えられる小核頻度の有意な増加は見られなかった。小核頻度の有意な増加は、14 μg/mLの未消化NM-105を曝露した後にのみ、陰性対照と比較して観察された（p = 0.009, Fisherの正確検定）が、他の未消化または消化NMは、それぞれの陰性対照と比較してCaco-2細胞で有意な変化を引き起こさなかった。
HT29-MTX-E12細胞（図4）では、消化したNM-102は、1.4および14μg/mLの濃度で、未消化試料と比較して小核頻度の増加を誘導した（p = 0.023 および p = 0.000016, Fisherの正確な検定結果）。同様に、消化したNM-103も、最高濃度で小核細胞の頻度を有意に増加させたが（p = 0.001、フィッシャーの正確検定）、試験した最低濃度で有意な減少をもたらした（p = 0.04、フィッシャーの正確検定）。しかし、Caco-2細胞で観察されたように、消化コントロールによる小核の誘導は、最高濃度では、14μg/mLの濃度でのエビデンスを弱める。しかしながら、HT29-MTX-E12では、すべての濃度の未消化および消化NM-102に暴露した後、それぞれの陰性対照と比較して、小核の頻度に有意な増加が観察された（p < 0.05, Fisherの正確検定）。この増加は、未消化または消化されたNM-102に起因していると考えられる。さらに、0.14および1.4μg/mLの濃度の未消化および消化NM-103に曝露した細胞では、陰性対照と比較してMNBC/1000BC頻度の増加が観察された（それぞれp = 0.000037 およびp = 0.016; Fisherの正確なテスト）。また、未消化のNM-105は、陰性対照と比較して、すべての濃度の曝露後に小核細胞の頻度の増加を誘導したが、消化したNM-105の0.14μg/mLの濃度のみが小核の頻度の統計的に有意な増加を誘導した（p = 0.0004, Fisherの正確検定）。したがって、陽性反応の同定に関するOECD基準（OECD、2017）を考慮すると、試験条件下でHT29-MTX-E12細胞において、NM-102、NM-103およびNM-105を潜在的に遺伝毒性があり、一般的に消化シミュレーション後に染色体損傷の増加を誘発するが、Caco-2細胞ではそのような効果は生じない、と認定する。
3.3. 消化されたTiO2 NMsによって誘導される活性酸素種
Caco-2細胞およびHT29-MTX-E12細胞を異なる未消化および消化TiO2 NMに曝露した後の細胞内ROS生成量を、まずH2DCF-DA試薬で評価した（図5、図6）。両細胞株において、未消化試料に1時間または24時間曝露した後、対照培養液と比較して有意な増加は観察されなかった。最高濃度では、未消化試料と比較して、すべての消化試料で1.5倍から2倍の活性酸素レベルの増加が観察された（p < 0.05, Student's t-test）。しかし、この増加は、NMの存在とは無関係であったため、明らかに消化液そのものに起因するものであった。消化液の活性酸素誘導剤としての効果は10倍希釈で消失したが、試験した濃度に1時間または24時間曝露しても、直接または消化後のTiO2 NMに起因すると思われる活性酸素の誘導は観察されなかった。
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図5. Caco-2 (A,B,C) および HT29-MTX-E12 (D,E,F) において、未消化および消化 (Dig NM) した TiO2 NM を 0.14, 1.4, 14 μg/mL で 1 時間処理したときの細胞内 ROS 量： NM-102（A,D）、NM-103（B,E）およびNM-105（C,F）。ROSレベルは、コントロール細胞のROSレベルと比較して、fold-changeで表されます。(平均値±標準偏差、n = 3）。* - それぞれの陰性培養液コントロールと有意に異なる（p < 0.05）。** - 消化されたサンプルは、同じ濃度で、未消化のサンプルと有意に異なる（p < 0.05）。
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図6. Caco-2 (A,B,C) およびHT29-MTX-E12 (D,E,F) において、未消化および消化 (Dig NM) TiO2 NMを 0.14, 1.4, 14 μg/mL で24時間処理したときの細胞内ROS量： NM-102（A,D）、NM-103（B,E）、NM-105（C,F）。ROSレベルは、コントロール細胞のROSレベルと比較して、fold-changeで表されます。(平均値±標準偏差、n = 3）。* - それぞれの陰性培養液コントロールと有意に異なる（p < 0.05）。** - 消化したサンプルは、同じ濃度で、未消化のサンプルと有意に異なる（p < 0.05）。
図7は、発光型ROS-Glo™ H2O2 Assayを用いて細胞培地中で測定したH202生成に関するデータです。一般に、Caco-2細胞でのみ有意な増加が見られたものの、最高濃度の消化陰性コントロールそれ自体がH202生成を誘導することができることも観察された。
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図7. 未消化および消化（DIG）のNM102（A）、NM103（B）およびNM105（C）を異なる濃度で24時間曝露した後のCaco-2（A，B，C）およびHT29-MTX-E12（D，E，F）培地のH202生成。 H202レベルは、BSA-水（未消化）におけるH202レベルとの比較でfold-changeとして表される。(平均値±標準偏差、n = 3）。* 未消化濃度に対する消化濃度のH2O2の統計的有意差（*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001）; +未消化BSA-Water（濃度14に相当）に対するポジティブコントロール（メナジオン、50μM、2時間暴露）のH202生成の統計的有意差を示す。
陽性コントロールが過酸化物産生の大きな増加を引き起こしたのに対し、いずれの細胞においても、消化されたナノ材料もそうでないナノ材料も、明確な増加を示さなかったが、すべての消化されたナノ材料について試験した最高用量に曝露したCaco-2細胞では、小さいながらも有意な増加を示した（図7-A、B、C）。しかし、この効果は、消化されたネガティブコントロールそのものによるものであり、ナノマテリアルによるものではない可能性があります。HT29-MTX-E12細胞では、14μg/mLの消化済みTiO2 NMsに曝露した後、H202の発生がわずかに減少したことが確認された。細胞が存在しない場合、消化BSA-水は最高用量でH202発生量の増加を示し、これは消化NM-102とNM-103の両方で有意であった（データは示さず）。一般に、ROS-Glo™ H2O2 AssayはH2DCF-DA法よりも感度が低いと思われるが、これはH2DCF-DA法を用いて細胞内で検出できるヒドロキシル、パーオキシルなどの活性酸素種（ROS）ではなくH2O2を検出するという特異性のためと考えられる。さらに、後者は細胞内の活性酸素を検出するのに対し、H2O2測定（図7）は細胞外レベルに言及しています。
考察
本研究では、3種類のTiO2 NM、NM-102、NM-103およびNM-105について、腸管細胞培地中のNM-105の二次的な物理化学的特性に影響を与えることができることを以前に示した（Bettencourt et al., 2020）、in vitro消化処理を受けた後の遺伝毒性を調べることを目的としている。コメットアッセイの結果は、検討した最高濃度の消化NM-105が、FPG酵素の非存在下で、両方の腸管細胞株においてDNA損傷の増加、またはFPGを用いたアッセイで、HT29-MTX-E12細胞においてDNA酸化損傷の増加を誘導することを示唆した。逆に、NM-102、NM-103およびNM-105は、HT29-MTX-E12細胞において潜在的に遺伝毒性を示し、染色体損傷をもたらすが、その効果は消化されたNMによって維持され、Caco-2細胞では影響が生じなかった。相補的な活性酸素分析では、直接または消化プロセスの後に、酸化ストレスの誘導を明らかにしなかった。
TiO2 NMに曝露された細胞において、消化プロセスの直接または後にROS誘導がないことは、FPG-cometアッセイで観察された低いレベルの酸化的DNA損傷と一致し、ヒト腸の生理学的に適切な濃度（Richterら、2018；Guoら、2017）では、これらの影響は懸念されないことを示唆しています。多くの研究がROS誘導を報告しているが、より高いTiO2濃度（Dorierら、2019）、または反復暴露条件（Dorierら、2017）に対して、低用量ではほとんどの研究が負の効果を報告している（Abbott Chalew and Schwab、2013；de Angelisら、2013；Jaliliら、2018；Jensenら、2019）。例えば、細胞内ROSの発生は、0.125〜125μg/mL E171に3時間曝露した後の未分化Caco-2細胞においても（Jensen et al、 2019）、または分化したCaco-2細胞において、0〜256μg/mLのTiO2 NMルチル疎水型（JRCベンチマークNM-103、25nm）およびルチル親水型（JRCベンチマークNM-104、25nm）への3時間または24時間の曝露後に（Jalili et al.、2018）。逆に、未分化Caco-2細胞培養物において、サイズの異なる2つの消化アナターゼ（99および26 nm）の100 μg/mLおよび200 μg/mLに24時間曝露した後、ROS生成の増加が観察されたが、分化Caco-2細胞には影響しなかった（Song et al.、2015）。興味深いことに、E171の0.143および1.43μg/cm2（1および10μg/mLに相当）、およびTiO2 NM（10-30 nm）への24時間の曝露後、電子スピン共鳴分光法で測定したように、2つのヒト結腸癌細胞株（Caco-2および/またはHCT116）において、0.05％BSAからなる培地においてROS発生が阻害されました（Proquin et al.、2017）。著者らは、粒子表面と活性酸素前駆体の接触を抑制することで活性酸素の生成を防ぐと考えられるタンパク質コロナによるスカベンジング効果または抑制効果を示唆した。本研究では、細胞曝露培地にFBSやBSAなどのタンパク質が含まれていたため（分散培地）、このような活性酸素抑制効果の発生を否定することはできない。しかし、NMを含まない消化陰性対照は、最高濃度でROSレベルを増加させることができ、このバックグラウンド効果は、NMの消化に使用した溶液の組成によって説明できるかもしれない（Brodkorb et al.、2019）。最高濃度で両方の細胞株で見られた、消化されたネガティブコントロールのこの酸化作用は、他の消化プロトコルにおいて問題であると既に報告されていた、模擬消化プロトコル、特に小腸相における胆汁酸塩の高い含有量を含むことなど、いくつかの要因の結果であると考えられる（DeLoid et al.、2017）。一貫して、この濃度では小核アッセイでバックグラウンド効果が観察されたが、コメットアッセイやFPG-cometアッセイでは効果が検出されなかった。おそらく、バックグラウンドの増加につながる消化されたネガティブコントロールの効果は、コメットアッセイ（24時間）と比較して、小核アッセイに使用されたより長い曝露期間（52～72時間）後にのみ検出可能であった。陰性コントロールの最高消化濃度におけるこのようなバックグラウンドの遺伝毒性は、両方の細胞株でCBPIとRI（MNアッセイで計算）の関連する減少が観察されなかったため、潜在的な毒性に起因するものではない（データは示さず）。これと一致して、以前の結果では、同じNMに24時間曝露しても細胞毒性は認められなかった（Bettencourt et al.、2020）。
コメットおよびMNアッセイを通じて腸管細胞で観察されたTiO2 NMの遺伝毒性は、ROS誘導の可能性とは別に、DNA分子との直接相互作用、複製プロセスおよび/または細胞機能の干渉など、他のメカニズムでも説明できるかもしれない（Magdolenovaら、2014；Gurrら、2005）。以前、我々のグループは、DLSによって評価したin vitro消化シミュレーションプロセス後に、NM-105の流体力学的サイズが減少することを観察した（Bettencourt et al.、2020）。小さいNMsは表面積が大きく、その結果、生物系において高い反応性を示す可能性がある（Dorier et al.、2017）。実際、より小さなNMは、細胞に取り込まれる可能性が高く、細胞区画を移動し、最終的に核に到達することができます。その結果、これらの粒子はDNA分子と相互作用し、遺伝毒性損傷につながる可能性がある（Magdolenova et al.、2014）。
文献には、腸管細胞に関するTiO2 NMの遺伝毒性試験でin vitroコメットアッセイを使用した報告がいくつかある。これは、試験したNMsの物理化学的特性（すなわち、サイズ、形状、結晶相）、および実験条件（曝露期間、NMsの濃度範囲を含む）が異なることに関連しているかもしれません（NanoGenoTox Joint Action, 2013）。NM-102とNM-103については陰性、NM-105については弱い陽性という我々の知見と一致して、Caco-2細胞において、1.2～80μg/cm2濃度の2種類のルチル型酸化チタンNM、NM-103とNM-104で3～24時間処理してもDNA鎖切断レベルの増加は検出されませんでした（Jalili et al.、2018）。NM-103（9、28、85、128、256μg/mL）を用いた別の報告でも、3時間または24時間の曝露後のCaco-2細胞において、従来のコメットアッセイおよびFPG修飾コメットアッセイでDNA損傷を示さなかった（Dorier et al.、2015）。NM-102、NM-103、NM-105の3時間暴露では陰性が報告されているが、これらのNMでは256μg/mLまでの24時間暴露で陽性が報告されている（NanoGenoTox、2013）。HT29細胞（HT29-MTX-E12とは異なるクローン）において、8および10μg/mLのアナターゼ/ルチルTiO2 NM（21 nm）に24時間曝露すると、DNA鎖切断レベルおよび酸化的病変が増加したという報告が1件だけあった（Schneider et al.、2017）。ある報告では、Caco-2およびHT29-MTXの共培養体を50μg/mLのNM-105またはE171に曝露したが、コメットアッセイで遺伝毒性作用を示さなかった（Dorier et al.、2019）。
染色体損傷に関して、Caco-2細胞の小核アッセイに関する過去の報告では、NM-102、NM-103、NM-104およびNM-105に52時間曝露した後に陰性結果が示唆され（NanoGenoTox、2013）、我々の結果と一致する。1～20μg/cm2のアナターゼ型酸化チタンNMを用い、6時間および24時間曝露したCaco-2でも陰性結果が報告された；同様の陰性結果は、分化Caco-2細胞で試験したNM-103およびNM-104についても報告されている（Jaliliら、2018；Zijnoら、2015年）。ヒト結腸腺がん（HCT116）細胞株では、E171の5〜50μg/cm2後に陽性の小核誘導が観察された（Proquin et al.、2017）。なお、HT29-MTX-E12細胞におけるこれらのNMの遺伝毒性に関する研究は、文献上発見されなかった。したがって、HT29-MTX-E12細胞における3種類のTiO2 NMの潜在的な遺伝毒性（消化後により関連性が高い）の今回の指摘は、その危険性とリスク評価に関連する新規の知見となる。小核は、有糸分裂の際の染色体の切断や消失に起因する可能性がある（Fenech et al.）一方、アノイゲニック効果は、主に物質と有糸分裂繊維との相互作用とその結果としての破壊に起因するものである。顕著な酸化DNA損傷が観察されず、したがって、NMとDNA分子との間に付加体が形成されないと考えられるので、ナノ粒子が細胞に内在することによる分裂繊維の破壊が起こった可能性が高いという仮説を立てることができる。
ヒト腸管細胞のモデルとして用いた2つの細胞株を比較すると、HT29-MTX-E12細胞はCaco-2細胞よりも、TiO2 NMsによって引き起こされる染色体損傷に対して、その形態にかかわらず高い感受性を示し、コメットおよびROSアッセイにおいても同様の感受性が観察されることが示されました。両細胞株は腸がん組織由来であり、未分化の状態で使用したが、Caco-2は吸収性腸管細胞へ、HT29-MTXは粘液分泌細胞へ分化することが可能である。したがって、これらの細胞は生理的機能に応じて異なる特性を有しており、そのことが、取り込み能力の違いなど、感受性の違いを説明すると考えられる。各細胞株におけるナノ細胞間相互作用、すなわち細胞の取り込みと輸送に関するさらなる研究が、この違いとその基礎的なメカニズムを調べるために進行中である。
まとめ
酸化チタンNMsに曝露した後、いくつかの種類の腸内細胞におけるDNAまたは染色体損傷の評価を報告した多くの研究（EFSA Panel on Food Additives and Flavourings et al., 2021aでレビュー）にもかかわらず、我々の知る限り、摂取した酸化チタンNMsの遺伝毒性を調査するためにこれらのNMのin vitro消化法を用いた研究はない。
摂取したNMの物理化学的特性における消化プロセスの重要性と生物学的媒体の影響を考慮し、本研究では、生理学的に関連する濃度の3種類のTiO2 NMの腸内細胞における遺伝毒性を分析した。その結果、DNA損傷効果はNMに依存し、ルチル/アナターゼのNM-105でより顕著であった。これは、おそらくこのNMが腸管内で有する流体力学的サイズが小さいためである（Bettencourt et al.）このポジティブな効果とin vitro消化に伴うNM-105の流体力学的サイズの減少との関連は、観察された効果のメカニズム的根拠を示唆し、取り込み研究によってさらに確認されるであろう。さらに、染色体の完全性破壊の指標として考えられている細胞質分裂阻止小核アッセイは、経口曝露およびNMs消化に伴う腸組織における、3種類のTiO2 NMsの発がんリスクについてさらなる懸念を抱かせるかもしれない。このように、in vitro消化プロセスは、in vivoモデルに一歩近づいた、ナノ毒性評価の知見を向上させるスクリーニングツールとして浮上した。これは、食品に使用されるTiO2 NMsのリスク評価において極めて重要である。今後のin vivo研究は、摂取されたTiO2 NMsのいくつかの形態に関する知見を補完するように設計することができます。
最後に、この研究は、食品添加物としてのE171の使用に関する懸念（EFSA Panel on Food Additives and Flavourings et al.、2021a）、および摂取によるヒトへの暴露を促す可能性がある他の用途でのTiO2 NMsの使用に関する証拠と一致するものである。
CRediT オーサーシップ貢献ステートメント
Adriana Vieira：調査、方法論、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）、全著者は出版された原稿を読み、同意しています。ナディア・ヴィタル調査、方法論、執筆-レビューと編集、すべての著者は出版された原稿を読み、同意しています。ドーラ・ロロ調査、方法論、執筆 - レビューと編集、すべての著者は原稿を読み、公開されたバージョンに同意しています。ロッサナ・ロケ方法論、すべての著者は、公開された原稿を読み、同意した。Lídia M. Gonçalves： Lídia M. Gonçalves：調査、すべての著者は原稿を読み、同意したものとする。Ana Bettencourt： Ana Bettencourt：調査、すべての著者は原稿を読み、同意した。マリア・ジョアン・シルバ資金獲得、調査、執筆-レビューと編集、すべての著者は公開された原稿を読み、同意している。ヘンリケタ・ロウロ概念化、資金獲得、調査、執筆-原案、執筆-校閲・編集。
競合する利益の宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言するものである。
謝辞
本研究は、プロジェクトPTDC/SAU-PUB/29481/2017の下、FCT-Foundation for Science and Technology, I.P.を通じて国家資金により実施されたものである。UIDB/00009/2020; UIDP/00009/2020 (Centre for Toxicogenomics and Human Health - ToxOmics, FCT- Foundation for Science and Technology) の共同研究である。NVはFCT博士奨学金（2020.07168.BD）を保有している。iMed.ULisboa (UIDB/04138/2020 and UIDP/04138/2020) principal investigator grants CEECIND/03143/2017 (L. M. Gonçalves).
同僚であるPaula Alvito、Carla Martins、Ricardo Assunção（INSA, Lisbon, Portugal）のほか、INGESTnanoの全チームメンバーからの支援に感謝します。
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セルロースナノマテリアルの毒性評価：経口曝露
2022年、ナノマテリアル
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