酵素と唾液タンパク質を含むフッ素入り歯磨き粉の歯周病菌に対する影響（ブラックステイン被験者）．パイロットスタディ
酵素と唾液タンパク質を含むフッ素入り歯磨き粉の歯周病菌に対する影響（ブラックステイン被験者）．パイロットスタディ
https://www.thieme-connect.de/products/ejournals/html/10.1055/s-0043-1761193
マリア・カレッリ 、イウリア・ザトーチナ 、アンジェラ・サンドリ 、グロリア・ブルラッキーニ 、アンジェリカ・ローザ 、フランチェスカ・バッチーニ 、カテリーナ・シニョレッ ト
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ブラックステイン - 酵素入り歯磨き粉 - 口腔衛生 - 歯周病菌．
はじめに
はじめに
ブラックステイン（BS）は、外因性歯牙異色症の一種で、2005年にWilkinsによって、線状または不完全な合体点を持つ暗点として記述された[1]。歯冠の歯頸部3分の1を超えることは稀であるが、溝や歯窩の底にも影響を及ぼすことがある[2]。Kochらは、本症を歯肉縁に沿った歯面上の連続または破線の黒線と定義した。 [3］本症の有病率は1％～20％と報告されており、どの年齢でも起こりうるが、その有病率は小児期にピークを迎えるようである［4］。 若い被験者では、思春期の発達や成人への移行とともに本症は退縮する傾向がある［5］。研究により、男女とも同じ有病率が示されているが［4］、女性により素因があるという報告もある［6］。
本症の原因は完全には解明されていないが，口腔内に存在する発色性細菌が関与していると考えられている[7] [8] ．これらの細菌は硫化水素などの鉄結合物質を産生することから，口腔内では通常遊離している硫黄や金属イオンが不溶性の強色化合物を形成して歯に沈着する可能性があると考えられる[9] （【図1】）．本症の形成に関与する細菌としては，Porphyromonas gingivalis，Prevotella intermedia，Aggregatibacter actinomycetemcomitans， Tannerella forsythia，Treponema denticola， Actinomyces naeslundii， Actinomyces spp. および Veillonella spp. 興味深いことに，いくつかの研究では，本症を患うとむし歯が少なくなるとされています [10] [11] [12] [13].
図1 本症に罹患した歯の写真（被験者P05）。
本症に関する科学的データはほとんどなく、家庭での通常の口腔衛生管理では除去できないこのタイプの色覚異常の患者を管理するためのプロトコルは定義されていない。電動ブラッシングはプラークスコアの改善に役立ちますが、本症の除去に関する報告はありません[14] 専門的な衛生管理は一時的な解決策ですが、本症色素の形成の真の原因には対処できません。本症の効果的な治療は、歯科衛生士にとって依然として課題である[15]。したがって、本症の管理のための代替の効果的な戦略が必要である。Adamsらは、酵素とタンパク質を含む歯磨き粉でブラッシングすると、健康な被験者の口腔内微生物群集の生態系が経時的に変化し、唾液による自然な防御力が高まることを示した。このような細菌群集の一般的な変化は、結果として、歯肉の健康に有利な細菌の増加や、本症などの歯周病の原因菌の減少につながるため、口腔内の健康と関連しているようです[16] [17] [18] [19] 。
健康な被験者で得られたこれらの結果を受け，我々は酵素と唾液タンパク質を含むフッ素入り歯磨き粉の本症に関連する歯周病菌に対する効果を評価することを目的とした．また、副次的な目的として、本症の患者を管理するための適応症を明らかにすることを目的とした。
材料と方法
素材と方法
パイロットスタディデザイン
26名の被験者が登録されました。本症のない被験者10名と本症のある被験者16名である。本症の被験者には，同数でテスト群（n=8）とコントロール群（n=8）に無作為に割り振った。試験群にはフッ化ナトリウム，酵素，唾液タンパク質を含む歯磨き粉を，対照群にはフッ化アミンを含む歯磨き粉を使用した（「試験で使用した歯磨き粉」参照）．試験群、対照群ともに、指定された歯磨き粉を1日2回、14週間使用した。パイロット試験は二重盲検化され、試験用または対照用の歯磨き粉を入れた連番付きの不透明な密封封筒が準備された。
試験開始時（T0）に，すべての被験者は，年齢や性別などの社会人口統計学的変数に関する質問を含むアンケートに回答した。また，本症の被験者（試験群および対照群）には，歯ブラシの種類（手動または電動）などの口腔衛生習慣，鉄分の補給や飲用水の種類などの食習慣についても質問した。対象者：6歳以上50歳未満の男女で、歯科治療歴がない者。除外基準：鉄分の消費量の増加、例えば、鉄分サプリメント、水道水、チーズ、赤身肉の頻繁な摂取（本症の他の原因）。
試験対象者と対照対象者は、登録時（T0）に家庭での歯科衛生に関するトレーニングを受け、2週間ごとに歯科衛生士から電話で連絡を受け、プロトコルの遵守を確認した。14週間後（T1）、試験群および対照群の参加者は、アンケートを通じてプロトコルに関するフィードバックを提供した。
登録されたすべての被験者は、イタリア、ロヴェレートにあるAzienda Provinciale per i Servizi Sanitari of TrentoのDental Hygiene Unitで追跡調査を受けました。本研究は、第64回世界医師会ヘルシンキ宣言の倫理原則に基づき、良好な臨床実践に合致していた。すべての参加者は、書面によるインフォームドコンセントに署名した。
研究で使用された歯ブラシ
試験群では、1450ppmのフッ化ナトリウム、酵素、唾液タンパク質を含む歯磨き粉（Zendium；成分。水、水和シリカ、ソルビトール、グリセリン、ステアレス-30、キサンタンガム、香料、カラギーナン、リン酸二ナトリウム、フッ化ナトリウム、アミログルコシダーゼ、クエン酸、グルコン酸亜鉛、安息香酸ナトリウム、グルコース酸化酵素、サッカリンナトリウム、チオシアン酸カリウム、コロストラム、リゾチーム、ラクトフェリン、ラクトプロキシダーゼ）。対照群には、1450ppmのフッ化アミンを含む歯磨き粉（Elmex；Aqua、Hydrated Silica、Sorbitol、Hydroxyethylcellulose、Olaflur、Aroma、Saccharin、Limonene CI 77891）を使用しました。
臨床検査および試料採取
本症の被験者全員（試験群，対照群とも）は，登録時（T0）と14週間後（T1）に，同一の歯科衛生士による口腔内検査と専門的口腔衛生を受けた。さらに、口腔内写真も収集した。本症の臨床的評価は、Shourie index（本症の鑑別診断の基準となる本症の色素沈着を数値化したもの）を用いて行われた。各患者の本症スコアは以下のように割り振られた。1＝黒点なし、2＝色素斑の不完全な線、3＝色素のある実線。各患者の口腔の健康状態は、プラークコントロール記録指数（O'Leary）、ブリーディングジンバイバル指数（GBI、Ainamo & Bay）、平均崩壊・欠損・充填乳歯数指数（DMFT/dmft）の算出により評価した。
サンプルの収集
試験群および対照群の被験者は、登録時（T0）および14週間後（T1）に歯垢と唾液の採取を受けた。陰性対照群の歯垢と唾液の採取は、登録時（T0）のみとした。歯肉縁上歯垢約1mgを歯面からプラスチックスケーラーで掻き取って採取し、滅菌歯内紙ポイントに移し、TE緩衝液（Tris-EDTA）を含む滅菌DNAおよびRNAフリーEppendorfチューブで-20℃に保存した。合計4mLの非刺激性全唾液サンプルを滅菌チューブに吐き出して採取した。
分子生物学的解析
GenElute Bacterial Genomic DNA Kits（Sigma-Aldrich）を用いて、歯垢と唾液のサンプルから細菌DNAを抽出した。P. gingivalis、P. intermedia、A. actinomycetemcomitans、[20]およびT. forsythia、T. denticola、A. naeslundiiの存在を確認するために2種類の多重PCRが行われた[21] さらに、アクチノミセス属[22]、ベイロネラ属[23]、S. mutansを確認するために単一PCRが行われた[24] プライマーおよびPCR条件はオンラインでのみ入手できる [Supplementary Table S1] において報告している。PCR反応は、5Prime Hot Master Mix (Quantabio)を用いて、製造者の指示に従って行った。
表1
参加者の人口統計学的特徴および衛生習慣
グループ
テスト
コントロール
ネガティブコントロール
年齢（平均±SD）
22.5 ± 12.7
19.8 ± 15
12.9 ± 5.7
性別
男性
2
3
4
女性
6
5
6
ビーエス
はい
8
8
0
いいえ
0
0
10
歯ブラシ
電気
2
3
NA
マニュアル
6
5
NA
統計解析
本症患者および本症でない患者における調査した微生物種の有病率の統計解析は、カイ二乗検定により行った。試験群と対照群における治療後の調査した種の有病率の変動は、t-testによって分析された。有意水準は0.05とした。すべての分析は、GraphPad Prism 7.0を使用して行われた。
結果
結果
本症のボランティア16名と本症でない被験者10名を本研究で募集した。本症の被験者は、試験中に使用する歯磨き粉によって、テスト群（n = 8）とコントロール群（n = 8）に分けられた。平均年齢は、テスト群が22.5±12.7歳、コントロール群が19.8±15歳、本症のないボランティアが19.9±5.7歳であった（【表1】）。年齢は本症の有無と関連性を示さなかった。本症の女性参加者は、男性5名に対して11名であったが、サンプル数が少ないため、性別は本症の危険因子とみなすことはできない。参加者は口腔衛生について質問されたが、毎日使用する歯ブラシの種類に関連した本症の出現の差は見出されなかった。食生活に関しては、本研究に参加した被験者の中で、毎日鉄分サプリメント、水道水、チーズ、赤身肉を摂取していると報告した者はいなかった（除外基準）。試験群では、コンプライアンス不良により2名の被験者が試験から脱落した。
本症の患者における口腔内の健康状態の評価
本症の被験者の口腔の健康状態は、DMFT/dmft指数、GBI、プラークコントロールレコードを用いてT0時に評価した（【表2】）。興味深いことに、本症の被験者の多く（56％）は、乳歯および永久歯の崩壊、欠損、充填も認められた（DMFT/dmft > 1、中央値 = 0.5）。
表2
DMFT/dmft指数、プラークコントロールレコード指数（％）、歯肉出血（GBI、％）など、参加者の口腔内の健康状態に関連するリスクファクターを評価する。
グループ
ペイシェント
DMFT/dmftインデックス
プラークコントロール記録(%)
GBI (%)
テスト
P01
0
23
3
P05
0
18
0
P06
0
16
6
P07
3
25
17
P09
5
75
35
P10
2
14
10
P14
1
16
0
P16
3
7
0
コントロール
P02
0
25
18
P03
1
26
0
P04
0
60
9
P08
0
23
0
P11
0
12
7
P12
0
18
16
P13
2
37
25
P15
6
40
9
歯周病菌の有病率
登録された被験者全員（本症16名、本症なし10名）からT0時に合計26個の唾液と歯垢サンプルを採取し、PCRアッセイにより分析した。本症を有する被験者のすべての唾液サンプルにおいて、P. intermedia、A. actinomycetemcomitans、Veillonella spp.、Actinomyces spp.の存在が確認された。本症の被験者の唾液で同定されたその他の細菌種は、P. gingivalis（64％）、A. naeslundii（29％）、T. forsythia（29％）、T. denticola（10％）。また、歯垢中では、同じか同等の有病率が観察された（[Fig.2]）。興味深いことに、本症の有無で比較すると、本症では唾液中のP. gingivalis検出率が有意に高く（p = 0.0129）、歯垢中のA. naeslundii検出率は有意に低かった（p = 0.0064）。
図2 T0時点の黒染め患者（BS）と陰性対照（CN）の唾液（A）および歯垢（B）に存在する調査対象菌の有病率（％）。統計解析はカイ二乗検定で行い、*p < 0.05、**p < 0.01とした。PG = P. gingivalis; PI = P. intermedia; AG = A. actinomycetemcomitans; AN = A. naeslundii; TF = T. forsythia; TD = T. denticola; AC = Actinomyces spp.; VE = Veillonella spp.; SM = S. mutans.
歯周病菌に対する酵素および唾液タンパク質の影響
本症の被験者内で、試験群（n = 8）は1450ppmのフッ化ナトリウム、酵素、唾液タンパク質を含む歯磨き粉を1日2回、14週間使用し、対照群（n = 8）は1450ppmのフッ化アミンを含む歯磨き粉を使用しました。T1の時点で、テスト参加者とコントロール参加者から14の唾液と歯垢のサンプルを採取し（コンプライアンス不良のため2名の被験者を除外）、PCRアッセイで分析しました。T0とT1では、両群で調査対象菌に関する統計的有意差は認められなかったが、試験対象者は対照対象者に比べて唾液中のP. gingivalis, A. naeslundii, Veillonella属の減少率が高かった（[Fig. 3]）。
図3 T0およびT1における被験者の唾液（A）および歯垢（B）中に存在する調査対象菌の有病率（％）。PG = P. gingivalis; PI = P. intermedia; AG = A. actinomycetemcomitans; AN = A. naeslundii; TF = T. forsythia; TD = T. denticola; AC = Actinomyces spp./VE = Veillonella spp.
酵素と唾液タンパク質の口腔保健への影響
T1において、Shourie indexは試験群、対照群ともにわずかな減少を示したが（それぞれ平均8％、12％の減少）、その差は統計的に有意ではなかった（【図4】）。また，本症患者の86％がShourie indexの低下を認めた（[Table 3]）。特に、電動歯ブラシを使用している患者では、手動歯ブラシを使用している患者よりも減少率がやや高いことが確認された。
表3
T0とT1における本症の参加者のシュウリ指数
グループ
ペイシェント
シュリーインデックス
シュリー指数変動率(%)
T0
T1
テスト
P01
90
89
-1.1%
P05
126
108
-14.3%
P06a,b
NA
NA
NA
P07a
100
78
-22.0%
P09
58
63
+8.6%
P10
94
88
-6.4%
P14
87
86
-1.1%
P16b
NA
NA
NA
コントロール
P02
71
67
-5.6%
P03
54
54
0%
P04a
69
50
-27.5%
P08a
61
50
-18.0%
P11
71
70
-1.4%
P12a
92
74
-19.6%
P13
87
68
-21.8%
P15
88
86
-2.3%
注：aは電動歯ブラシを使用している患者を示し、bindは脱落者（コンプライアンス不良によるもの）を示す。
PCR；TD、T. denticola；TF、T. forsythia；VE、Veillonella spp.
図4 T0時およびT1時の試験群および対照群のシュウリ指数。各棒は各群の平均値±SDを示す。
考察
ディスカッション
最近の研究では，酵素と唾液タンパク質を含む歯磨き粉が，口腔内細菌叢，口腔内細菌の生存率，歯肉の健康に影響を与え，口腔内の健康を促進する細菌を増加させ，口腔内の問題を引き起こす他の細菌を減少させることが強調されている［16］［17］［18］［19］我々はこの仮説を，本症の被験者16名を対象にパイロットスタディで検証した．先行研究と同様に[16] [18] 酵素と唾液タンパク質を含むフッ素入り歯磨き粉を使用した被験者と、酵素とタンパク質を含まない通常のフッ素入り歯磨き粉を14週間使用した被験者を比較した。注目すべきは、口腔内細菌叢の完全な評価を得るために、歯垢の細菌叢に加えて、唾液の細菌叢も評価したことである。本症の微生物学的組成は、A. naeslundiiや他のActynomices種を含む放線菌、T. forsithya, T. denticola, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, Veillonella sppなどのグラム陰性嫌気性細菌で占められていると考えられる。 したがって、これらの歯周病原体の存在が、歯垢および唾液中の両方で変化しているとすれば、本症の形成と関連していると考えられる。
酵素と唾液タンパク質を含む歯磨き粉を14週間使用した結果、被験者の口腔内細菌叢の構成や口腔内の健康状態に、対照群と比較して有意な影響は認められなかった。また、本症に関連するいくつかの病原性細菌の減少は、被験者の唾液で観察されたが、歯垢では観察されなかった。このことから，歯磨剤に含まれる酵素やタンパク質は，唾液中の浮遊性細菌に対しては部分的に有効であるが，歯垢のバイオフィルムを形成する細菌に対してはほとんどあるいは全く作用していないと考えられる。このことは，唾液中の細菌は，歯垢中の細菌よりも酵素の作用を受けやすく，外側の多糖類の層がバイオフィルム内の様々な物質の侵入や拡散を妨げているという事実によって説明できる[25]。本研究は，本症の患者16名を対象に14週間という短期間で追跡した小さなサンプルに限られているので，歯垢中の微生物構成の変化の可能性を評価するにはより大きなサンプルで長期間にわたってモニターするさらなる研究が必要である．
本症の有無による口腔内細菌の比較では、A. naeslundiiとP. gingivalisにのみ大きな違いが認められた。後者は本症の被験者から採取した唾液サンプルで有意に高い有病率を示し、一方、A. naeslundiiは変色していない被験者の歯垢でより高い有病率を示しました。この結果は、本症患者の歯垢中のA. naeslundiiの存在量が本症患者でない被験者と比較して高いことを報告した先行研究とは対照的である[12] [26] しかしながら、別の研究では、本症患者と対照者におけるActinomyces属の有病率は同等であると報告している[27] P. gingivalisについては、以前の研究で本症の沈着物には存在しないことが報告されているが、本症患者の唾液に関するデータはない[15]。唾液は口腔環境における浮遊菌の媒体であるため、プラークバイオフィルムの形成と密接な関係があり、おそらくそれに寄与している。また，多くの研究が，唾液の微生物相と口腔の健康関連状態との関連を強調している[28] [29] そのため，本症に関連する潜在的な病因を特定するために，唾液とプラークの両方の微生物相の関与を評価する研究を実施する必要がある．
また、ほとんどの研究では、本症の存在と齲蝕経験の低下との間に相関関係があることが報告されている。しかし、我々の研究では、本症の被験者の多く（56％）が、むし歯、充填、または抜歯をした歯を有していた。さらに、本症の有無によるS. mutansの有病率に有意差は認められず、Costaらによる既報と同様であった[27]。これは多くの文献と明らかに対照的であるが、食習慣、社会経済状態、鉄分補給などの他の要因が、口腔微生物叢の変化に加えて本症の形成に寄与すると考えられる。
臨床レベルでは、登録から14週間後に本症の86％が、使用した歯磨き粉とは無関係に、黒ずみ色素の数値指標であり、黒ずみ汚れの鑑別診断の基準となるShourie indexの低下を示した。この結果は、本症の除去には、家庭での丁寧な口腔衛生手順による機械的除去が最も重要であることを示している。さらに、電動歯ブラシを使用した被験者は、手動歯ブラシを使用した患者の平均的な減少に比べ、Shourie indexの減少が大きいことを示した。この観察は、電動歯ブラシと手動歯ブラシを使用する被験者の数が不均衡であるため、統計的な有意性はありませんが、手動歯ブラシと比較してはるかに速い揺動運動により、おそらく歯垢、食物残渣、および外因性汚れを除去する上で電動歯ブラシの高い有効性を報告する以前の科学的証拠を支持するかもしれません [14].
結論
結論
我々は、酵素と唾液タンパク質を含む歯磨き粉の使用だけでは、この変色を起こしやすい被験者の本症の形成を防ぐのに十分でないことを確認した。したがって、機械的な洗浄、特に電動歯ブラシを使用した洗浄が、本症の形成に対抗するための主要なケアであることに変わりはない。さらに、本症に関連する潜在的な病因として、唾液レベルでのP. gingivalisの存在を強調することができ、本症の形成と持続に関与しうる微生物群集の複雑さをさらに明確にすることができた。しかし、今回の試験的研究は、年齢幅の大きい16名の参加者に限定されたものであり、より明確で完全なビジョンを持つためには、登録する患者コホートを拡大し、より一貫した規模にする必要があります。しかしながら，これらの結果は，臨床ルーチンの中で本症を扱い，患者の歯の健康をサポートするための新しい解決策を模索している歯科医療専門家にとって興味深いものであろう。
参考文献
数値
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