ストレスに敏感な神経回路は十二指腸腺を介して腸内細菌叢を変化させる
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ストレスに敏感な神経回路は十二指腸腺を介して腸内細菌叢を変化させる
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674%2824%2900779-7
オープンアクセス掲載:2024年08月08日DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.019
ハイライト
-ブルンナー腺からのムチンの分泌は腸内乳酸菌の増殖を促進する
-中枢扁桃体ニューロンは迷走神経を介してブルンナー腺を刺激する
-ストレスは中枢扁桃体を抑制し、ブルナー腺の活動を抑制する。
-腺活動の低下は、乳酸菌集団と宿主の免疫力を低下させる。
まとめ
ネガティブな心理状態は、腸内細菌叢を変化させることで免疫に影響を与える。しかし、脳の状態とマイクロバイオームの構成との関係は不明なままである。われわれは、十二指腸のブルンナー腺が、ストレスに敏感な脳回路と細菌の恒常性を結びつけていることを示した。ブルンナー腺は、迷走神経刺激に応答する腸内乳酸菌種の濃縮を媒介した。腺を細胞特異的に切除すると、乳酸菌数が著しく抑制され、感染に対する脆弱性が高まった。前脳では、迷走神経を介した、扁桃体の中心核とブルンナー腺をつなぐポリシナプス回路をマッピングした。慢性ストレスは中枢扁桃体活動を抑制し、腺病変の影響を模倣した。逆に、中枢扁桃体または副交感神経迷走神経ニューロンのいずれかを興奮させると、ブルンナー腺が活性化し、腸内マイクロバイオームと免疫に対するストレスの影響が逆転した。この発見は、心理状態と宿主防御を結びつける、扱いやすい脳と身体のメカニズムを明らかにした。
グラフィカル抄録
キーワード
はじめに
腸内マイクロバイオーム、すなわち腸粘膜の微生物群集は、栄養の消化を促進し、食中毒病原体から身を守る。
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心理的状態が宿主のマイクロバイオームを変化させることにより、全身の免疫に影響を与えることを示す証拠が増えている、
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は、脳の活動と腸内細菌の恒常性との間に因果関係があることを強調している。実際、数多くのヒトを対象とした研究や前臨床試験で、心理的ストレスとマイクロバイオームの変化との関連が報告されている。
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ヒト以外の霊長類では、母体分離のようなストレスモデルは、日和見感染に対する脆弱性を高めると同時に、有益な乳酸桿菌のレベルを著しく低下させる。
これと一致して、げっ歯類の研究では、プロバイオティクスの投与が不安モデルにおける情動的・生理的マーカーを改善する可能性が示されている。
脳の状態が腸内細菌叢に及ぼすこのような影響は、粘膜と細菌の相互作用の変化を介して起こる可能性がある。
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このように、小児では、心理社会的ストレスは、分泌型免疫グロブリンA濃度の低下と日和見感染症の増加の両方を反映する粘膜免疫防御の欠陥と関連していた。
逆に、心理的リラックスを誘導すると、逆の効果が観察される。
実際、霊長類では、ストレスによる乳酸菌レベルの抑制は、腸粘液分泌の阻害によって引き起こされたと推定されている。
残念ながら、脳の状態がマイクロバイオームに影響を与えるような形で粘膜分泌をどのように制御しているのかは不明なままである。
我々の主な目的は、脳が粘膜-マイクロバイオーム系に影響を与えることを可能にする神経細胞経路を同定することであった。十二指腸粘膜下層に限局した外分泌構造であるブルンナー腺は、主に粘液産生細胞から構成されている。
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決定的なことは、ブルンナー腺は神経末端によって明確に標的化されており、粘液分泌には神経刺激が必要であるということである。
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注目すべきは、これらの末端のかなりの割合が迷走神経由来であることである。
したがって我々は、ブルンナー粘膜腺の迷走神経支配が、マイクロバイオームに対する心理的状態の影響を媒介するという仮説を立てた。そこで、単一核の配列決定、アブレーション、眼内イメージング、電気生理学的研究、行動学的研究などの細胞特異的アプローチを用いて、この神経-腺回路を調べた。
結果
In vivoにおけるBG制御の迷走神経シグナル
ブルンナー腺（BG）は、十二指腸粘膜下層上皮の下に位置している（図S1A）。我々はまず、迷走神経が生体内のBG活性に及ぼす影響を明らかにした。グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）受容体はBGの分子マーカーである、
そこで、GLP1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-D[GCamp6]×Ai9（以下、GLP1r[GCamp6]）マウスを作製し、BGで蛍光カルシウム指標GCamp6を細胞特異的に発現させた（図S1B-S1E）。その後、Glp1r[GCamp6]マウスに腹部のガラス窓を移植し、BGの細胞内カルシウム活性の眼内イメージングを行った（図1A;Video S1）。迷走神経を介してBGを刺激するために、栄養応答性腸管ペプチドコレシストキニン（"CCK"
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図S1F）。このモデルを用いて、我々はin vivoでの腺の挙動を評価した。CCK投与により、BG全体に強固なカルシウム過渡現象が誘導され（図1B-1E；ビデオS2）、カルシウム電流は近位から遠位への時空間パターンをたどった（図S1G）。BGからのCCK誘導粘液分泌をin situで確認した（図1F、S1H-S1K）。この現象における迷走神経の役割を評価するために、横隔膜下迷走神経切断（「VGx」）または腸特異的感覚迷走神経脱神経を持続させたGlp1r[GCamp6]マウスで同じ実験を行った。どちらの場合も、迷走神経伝達を遮断すると、CCKに対するBG反応が消失した（図1G-1JおよびS1L-S1P）。このように、感覚迷走神経線維は、in vivoでのBGのCCKリクルートメントに必要である。
図S1迷走神経シグナルはブルンナー腺を介してマイクロバイオームを制御する。
図1ブルンナー腺を介してマイクロバイオームを制御する迷走神経シグナル
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ビデオS1. 図1に関連したブルンナー腺におけるカルシウム過渡現象のイントラビタルイメージングブルンナー腺のGCaMP6fとtdTomato（赤チャンネル）のシグナル。tdTomatoは、同じ腺で強いカルシウム過渡現象が起こっているにもかかわらず、安定したまま変化していない。
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ビデオS2. 眼内イメージング中、コレシストキニンはブルンナー腺に強いカルシウム過渡を誘導した。
これらの所見を裏付けるために、迷走神経幹にカフ電極を埋め込み、Glp1r[GCamp6]マウスの神経に電気パルスを与えた。同時に眼内BGイメージングを行った。その結果、迷走神経刺激は、BG全体にわたって強固なカルシウム過渡現象を誘導するのに十分であることがわかった（図1KおよびS1Q）。また、左と右の神経幹を刺激した場合では、微妙ではあるが有意差が認められ、右神経の方が潜時が早かった（図1Lおよび1M）。
Gs分泌物は乳酸菌の増殖を促進する
CCKが迷走神経を介してBG粘膜分泌に関与する能力があることから、この神経-腺結合がマイクロバイオームを調節するかどうかを評価した。CCKを毎日7回注射したところ、小腸と大腸の両方の組織から培養した乳酸桿菌の著しい増殖が観察され、この効果は糞便サンプルでも検出された（図1NおよびS1R-S1T）。同様に、CCKを毎日注射すると、ラクトバチルス・ラムノサス（American Type Culture Collection、[ATCC] 27773）をマウスの腸に播種した後、顕著な増殖を誘導した（図1O）。小腸および大腸サンプルの16S配列決定のnbiased volcano plot解析から、CCKが異なる乳酸菌種、特にL. johnsoniiの増殖を促進することが明らかになった（図1Pおよび1Q）。
BGの役割を調べるために、管腔組織と腸管組織を温存しながら十二指腸球周囲の粘膜下層からBGを切除する外科的アプローチを考案した（詳細はSTAR Methodsと Table S1を参照）。CK誘発性乳酸菌増殖は、BG切除後に完全に消失した（図1R-1TおよびS1U-S1HH）。
次に、迷走神経への病変がBG切除の効果を再現するかどうかを評価した。ensory迷走神経脱神経は、CCK誘発乳酸菌増殖を同様に消失させ（図1U-1W）、BG分泌活性の阻害と一致した（図1X）。迷走神経脱神経とBG切除は、pH値に影響を与えることなく、十二指腸の粘膜厚を著しく減少させた（図S1II-S1PP）。
迷走神経の求心性神経はBGとシナプス結合しており、BGは単細胞レベルで分泌促進性コリン作動性レセプターを発現している。
なぜなら、CCKは求心性迷走神経回路に作用し、胆道および膵臓の分泌を誘導するからである、
は、迷走神経背側運動核（DMV）の遠心性ニューロンがBGの活動を制御していると仮定した。まず、膵臓腺がDMVによって直接神経支配されていることを確認した。Cre依存性構築物AAV9-hSyn-DIO-GFPをコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）-Irs-CreマウスのDMVに注入し、迷走神経遠心性副交感神経線維を標識した。迷走神経遠位性神経支配は、BGでは検出されたが、腸全体の上皮杯粘液細胞では検出されなかった（図2Aおよび2B）。この結果から、粘液分泌に対する迷走神経の影響はBGに特異的であり、上皮性粘液細胞には関与しないことが明らかになった。さらに、BG上の副交感神経シナプス終末を検出するために、Cre依存性コンストラクトAAV1-hSyn-FLEx-mGFP-2A-Synaptophysin-mRubyをChAT-ires-CreマウスのDMVに注入した。ほとんどの迷走神経シナプス終末はBG上ではっきりと検出されたが、その上にある絨毛上ではほとんど標識は検出されなかった（図2C）。この神経-腺配置は、ヒト腸管サンプルの切片で観察されたものと類似している（図2D；図S2A参照）。
図2ブルンナー腺を制御する迷走神経系。
図S2 図2に関連する、ブルンナー腺を制御する迷走神経遠心性神経系。
前述の所見と一致して、近位十二指腸組織からのRNA転写物の単一核配列決定により、十二指腸細胞の中でBGに特徴的なムチン遺伝子Muc6を発現している細胞が明らかになった、
ムスカリン受容体M3遺伝子（Chrm3）を明確に共発現している唯一の細胞タイプであることが明らかになった。
図2EおよびS2B-S2H）。解剖学的追跡とin situハイブリダイゼーション研究により、DMV線維が標的とするBGにおいて、Chrm3とGlp1rの共発現が明らかになった（図S2I）。Glp1rは成体のBGでは比較的低レベルで発現しているが、in situ観察により、可視化されたすべての腺で発現していることが明らかになった。トランスクリプトミクスの所見と一致して、特異的ムスカリン受容体M3遮断薬ダリフェナシンの投与は、CCKによるBGの活性化を完全に消失させた（図S2J）。同様に、ダリフェナシンの投与は、糞便サンプル中の乳酸菌レベルを顕著に抑制した（図S2K）。
迷走神経背側運動核の活性化は、腸内マイクロバイオームの調節に必要かつ十分である。
DMVとBGの活動の時間的関係を評価するため、Glp1r-ires-Cre×Ai148マウスのDMVの単一ニューロンを記録し、同時にBGのカルシウム過渡変化を画像化した。その結果、CCK注射後、DMVニューロンの活性化がBGカルシウムシグナルの上昇に確実に先行することがわかった（図2F-2IおよびS2L）。CCK注入後、DMVニューロンが最大値の50％に達するまでの時間は約12.6秒であったのに対し、BGのそれは約32.3秒であった。
次に、ChAT-ires-CreマウスのDMVにCre依存性デザインレセプター構築物AAV9-DIO-hM3D(Gq)-mCherryを注入し、迷走神経遠心性ニューロンの細胞特異的な化学遺伝学的活性化を誘導した。ChAT-ires-Creマウスの別のグループに、迷走神経遠心性ニューロンの細胞特異的切除を誘導するために、Cre依存性構築物AAV1-flex-taCasp3-TEVpをDMVに注入した（図2JおよびS2M-S2O）。その結果、DMVの活性化は乳酸菌数の顕著な増加を誘導したのに対し、DMVのアブレーションは乳酸菌数を顕著に抑制した（図2K-2M）。さらに、DMV活性化は十二指腸粘液厚を増加させたが（回腸粘液厚や大腸粘液厚は増加しなかった）、DMVアブレーションは粘液厚を顕著に減少させた（図2NおよびS2P-S2S）。
最後に、上記の所見の解剖学的特異性を評価するために、十二指腸粘膜下部のBG領域にサポリン（SAP）結合化合物である抗ChAT-SAPを注射して、BGを標的とするコリン作動性線維のアブレーションを行った。その結果、DMVニューロンが選択的に切除され（図S2T）、CCK誘発BG活性化（図S2U）、乳酸菌増殖（図2O-2Q）、粘膜分泌（図2R）、十二指腸粘液厚増強（図S2V-S2Y）が完全に消失した。
まとめると、迷走神経コリン作動性求心性ニューロンはBGを支配し、ムスカリン受容体M3を介して粘液分泌と乳酸菌増殖を刺激する。
BGをell特異的に切除すると、脾臓の異常、交感神経系の活性化、病原体感染による死亡率、腸管透過性の亢進が起こる。
BGがマイクロバイオームの構成に重要であることが判明したため、BGの切除が免疫学的および腸管バリア機能不全につながるかどうかを検証した。BGを細胞特異的に切除する戦略を考案した。ジフテリア毒素（DTx）受容体（DTR）をBG細胞にのみ発現させるため、Glp1r[GCamp6]×ROSA26iDTRの三重変異マウスを作製した。Glp1r[GCamp6]×ROSA26iDTRマウスの十二指腸粘膜下層にDTxを注射したところ、野生型マウスの外科的切除が再現された。BG細胞の切除では、十二指腸および膵臓のGLP1R+細胞は温存された（図3A-3DおよびS3A-S3E）。いずれのアブレーションアプローチも体重を軽度ではあるが有意に減少させたが（図3Eおよび3F）、食物繊維の豊富なペレットと食物繊維を含まないペレットとでは、食物繊維の豊富なペレットの方が嗜好性が高かった（図3G、3HおよびS3F-S3K）。
図3ブルンナー腺の切除は免疫不全症候群を引き起こし、腸内感染で死亡する。
腸内細菌叢もまた、腹部交感神経ニューロンの過剰活動を誘導する。
そこで、BGを切除したマウスの腹腔神経節（CG）における神経細胞活性レベルを測定した。BG切除マウスとBG-DTxマウスのCGにおいて、Fos反応性の顕著な増加が観察された（図3Iおよび3J）。これらの動物は、腹部交感神経緊張の亢進と一致して、激しい胃膨満（図3K、3L、S3L-S3Q）と脾臓収縮（図3M-3Q）を示した。
BG-DTxマウスの胃と脾臓の表現型は、セリ切除により逆転した（図S3RとS3S）。上記の交感神経誘導作用と同様に、BGに支配された副交感神経線維の切除は、脾臓機能に対するBG切除の効果を再現した（図S3T-S3DD）。最後に、脾臓の異常は、BG-DTxマウスの結腸における粘膜リンパ濾胞の顕著な増大を伴っていたことに注目したい（図3R）。
図S3ブルンナー腺の切除は免疫不全症候群を引き起こし、 図3に関連して腸管感染時に死亡する。
我々は、脾臓および粘膜リンパ組織の変化が、進行中の免疫反応を示している可能性があると考えた。まず、BG-DTxマウスの消化管感染感受性を調べた。大腸菌EcAZ-2をBG-DTxマウスとBG-生理食塩水対照マウスの腸内に経口投与し、BG-DTxマウスの排泄物中のEcAZ-2数の増加を検出した（図3Sおよび3T）。次に、病原性ブドウ球菌（Staphylococcus xylosus）株（ATCC 29971）を用いて同様の実験を行った。
BG-DTxマウスはS. xylosusに感染すると顕著な死亡率を示したが、BG-生理食塩水対照マウスはすべて感染を免れた（図3U）。
さらに、感染に対する脆弱性と関連して、BG-DTxマウスおよびBG-切除マウスでは、腔内投与後に全身循環中のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストランを測定することにより評価したところ、腸管透過性がより高いことが観察された（Duo-lesion切除コントロールの透過性は、手術からの回復後に正常値に戻った、図S3EE-S3GG）。同様に、腸内コロニー形成後、BG-DTxマウスの血液中には高レベルのS. xylosusが検出されたが、対照マウスでは検出されなかった（図3Vおよび3W）。全体として、ブルンナー腺を切除すると、腸内感染と闘う能力が著しく低下し、腸管バリア透過性が亢進する。
BG欠損動物からの細胞移植は腸内感染に関連した死亡を引き起こす
次に、BG-DTxマウスにおけるマイクロバイオーム変化の生理的影響を評価した。BG-生理食塩水マウスとBG-DTxマウスの両方から糞便を採取し、2種類の液体希釈液を調製して、あらかじめ抗生物質を7日間投与した2群の野生型マウスに経口投与した。その結果、BG-DTxマウスの糞便は、病原性細菌を1回経口投与しただけで著しい死亡率を示したが、BG-生理食塩水マウスの糞便を投与された動物はすべて実験を生き延びた。図3X、3Y、およびS3HH-S3OOは、BG-DTXマイクロバイオーム移植の効果の詳細を示している。
マイクロバイオーム組成の関連性をさらに検証するため、抗生物質を投与していないマウスを用いて、さらに2瓶嗜好性試験を行った。その結果、BG-DTxマウスでは生きた乳酸菌＋ビフィズス菌プロバイオティクスを含む溶液に対する嗜好性が顕著に増加したが、対照マウスでは見られなかった（図3Z）。プロバイオティクスの嗜好性の増加は、BG切除後の食物繊維含有食品の摂取量の増加と類似している可能性がある（図3Gおよび3H）。
抗生物質またはムチンの投与はBG切除に伴う症候群を相殺する
もしBG切除後の免疫学的症候群が本当に微生物叢の変化によるものであれば、プロバイオティクスやムチンの投与がその症状を改善する可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、BG-生理食塩水マウスとBG-DTxマウス（すなわち、BGの細胞特異的切除を維持したマウス）の盲腸にカテーテルを留置し、乳酸菌＋ビフィズス菌の12株プロバイオティクスカクテル（「Probiotics[Lac+Bif]」；詳細はSTAR Methodsを参照）または中性溶液を2×2デザインで投与した（図4A）。アクトバチルス＋ビフィズス菌は、CCKによって増強されることから選択された（図1Pおよび1Q参照）。興味深いことに、BG-DTxマウスの盲腸にProbiotics[Lac+Bif]を投与すると、BG切除後の交感神経、脾臓、リンパ球の異常が完全に回復した（図4B-4I）。robiotics[Lac＋Bif]はまた、BG-DTxマウスの体重を正常レベルまで回復させた（図S4A）。これらの効果は、摂餌量や探索活動に有意な変化がないにもかかわらず生じた（図S4BおよびS4C）。さらに、BG-DTxマウスにProbiotics[Lac+Bif]を盲腸に注入すると、S. xylosusによる腸内感染後の死亡率が有意に減少した（図4J-4L）。さらに、Probiotics[Lac+Bif]は、BG-DTxマウスの腸内にEcAZ-2株を播種した後、細菌性大腸菌の増殖を阻止した（図4M）。
図4プロバイオティクスとムチンは免疫機能を回復させ、ブルンナー腺欠損動物の生存を促進する。
図S4プロバイオティクスとムチンが免疫機能を回復させ、ブルンナー腺欠損動物の生存を促進する（ 図4関連
私たちは当初、BGが粘膜とマイクロバイオームの相互作用において重要な役割を果たしているのではないかという仮説を立てたので、動物にムチン溶液を投与すれば、プロバイオティクス[Lac+Bif]によって誘導される効果と同様の効果が得られるだろうと考えた。実際、BG-DTxマウスにムチン溶液を投与すると、BG切除後の交感神経、脾臓、粘膜リンパ球の異常を逆転させ、Probiotics[Lac+Bif]の効果を模倣した（図4N-4U）。ucinの効果には、腸管バリアの再構成、十二指腸粘液の厚さ（図S4D-S4K）、そして驚くべきことに乳酸菌レベル（図4V）が含まれる。
さらに、ムチンの摂取はS. xylosusによる腸内感染後の死亡率を減少させた（図4W-4Y）。ucin溶液はまた、BG-DTxマウスの腸内に大腸菌EcAZ-2株を播種した後の細菌増殖を阻止した（図4Z）。まとめると、BGによるムチンの分泌は乳酸菌増殖のための条件を提供し、それが腸透過性、交感神経緊張、脾臓の形態、および粘膜リンパ球の増大を制御しているようである。
eはまた、B細胞数に対するプロバイオティクス投与の効果も評価した。その根拠は、脾臓は未熟なB細胞を貯蔵する主要なリンパ組織であるという事実に基づいている。BG病変のあるマウス（脾臓の形態が変化している）では、B細胞数やその他の免疫因子が変化していることが予想された。BG-生理食塩水マウス（コントロール）、BG-DTxマウス、およびBG-DTx+Probiotics[Lac+Bif]マウスの免疫シグネチャーを特徴付けた。これは、脾臓、骨髄、および腸間膜リンパ節サンプルのCyTOF（飛行時間型サイトメトリー）分析を行うことによって達成された（図S5A）。
図S5免疫およびメタボロミクスシグネチャーは、 図5に関連するブルンナー腺を欠損した動物におけるプロバイオティクス処理によって救済される。
ブルンナー腺の切除はB細胞数全体の著しい減少を引き起こしたが、この影響はプロバイオティクス[Lac+Bif]によって（場合によっては部分的にのみ）正常化された（図5A、5B、S5B）。組織全体では、未熟なB細胞がBG病変の影響を受けた細胞型で、Probiotics[Lac+Bif]に最も顕著に反応した（図5C）。一方、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、単球、樹状細胞については、特に脾臓で組織特異的な反応が観察された（図5D-5I、S5C-S5G）。骨髄マクロファージはBG病変によって強く誘導されたが、Probiotics[Lac+Bif]によって抑制された（図5E）。
図5免疫およびメタボロミクスシグネチャーは、ブルンナー腺を欠損した動物におけるプロバイオティクス処理によって救済される。
十二指腸球の切除はヒトの免疫反応を誘発する
十二指腸球部（BGを含む十二指腸の最初の部分）の切除を受けたヒト被験者の所見と、BG切除後の免疫学的プロファイルの変化が類似しているかどうかを検証した。対象は胃十二指腸間質腫瘍患者であり、比較群は同様の十二指腸切除を受けたが、十二指腸球部から遠位の切除であった。llの患者は非転移性で、化学療法や放射線療法は受けていない（手術は治癒的であった；STAR Methodsを参照）。十二指腸球を切除した患者では、より遠位の十二指腸部位を切除した場合に比べて、白血球数、リンパ球数、好中球数、単球数が増加する有意な群間効果を認めた。手術はこの効果を緩和しなかった（図S5H-S5K）。BGに特異的ではないが、これらの観察結果は、十二指腸球がヒトにおける免疫調節の部位であることを示唆している。
ランナー腺病変は炎症性サイトカインの発現を増加させ、短鎖脂肪酸プロフィールを変化させる。
ブルナー腺病変は、炎症性サイトカインの発現を増加させ、短鎖脂肪酸のプロフィールを変化させる。
上述と同じマウスの血液サンプルを用いて行ったロテオミクス（Olink）解析の結果、BG切除によって、循環系と大腸組織の両方で、炎症性サイトカインとアポトーシス性サイトカインのレベルが有意に上昇することが明らかになった；これらの影響はProbiotics[Lac+Bif]によってほとんど逆転した（図5J-5SおよびS5L-S5O）。
最後に、全身生理学に影響を及ぼすことが知られている主要な細菌代謝産物である短鎖脂肪酸の血中含量を分析した。
その結果、BG-DTxマウスでは酢酸、プロピオン酸、吉草酸の濃度が著しく低下していた。Probiotics[Lac+Bif]は代謝物を正常レベルまで回復させた（図5T-5V）。酪酸、イソ酪酸、ヘキサン酸、イソヘキサン酸の変化はそれほど顕著ではなかった（図S5P-S5S）。
迷走神経を介してCeAとブルンナー腺をつなぐ神経回路
次に、BGを支配する迷走神経副交感神経線維を制御する脳領域を同定しようとした。まず、Glp1r-ires-Creマウスの近位十二指腸粘膜下層に、Cre依存性、多シナプス性、逆行性偽ウイルス株（PRV）PRV-CAG-DIO-TK-GFPを注入した。背側迷走神経複合体（DVC）の迷走神経副交感神経ニューロンに加え、自律神経制御に関連する領域、特に視床下部傍および視床下部の視床下部、軌跡、島皮質で、BG由来の明確な標識が検出された。興味深いことに、情動調節に深く関与している脳領域である扁桃体中心核（CeA）の内側に、高密度の標識が観察された。
この配線が迷走神経に依存していることを確認するため、両側横隔膜下迷走神経切断術を受けたGlp1r-ires-Creマウスでトレース実験を繰り返した。その結果、迷走神経を腹部で切断すると、DVCとCeAの標識が完全に消失することがわかった（図6A）。これとは対照的に、交感神経CGと脾神経を切断すると
を切除しても、CeAを含むほとんどの領域での標識には影響がなかった（図S6A、追加対照を含む）。このことから、CeAは脊髄/交感神経経路ではなく迷走神経経路を介してBGに神経接続していることがわかる。
図6扁桃体中心核はブルンナー腺分泌の調節を介して腸内マイクロバイオームを制御する。
図S6扁桃体中心核はブルナー腺の分泌調節を介して腸内マイクロバイオームを制御する（ 図6に関連
逆の実験を行うために、CckarCre×Ai9マウスの内側CeAに（Cre非依存性の）シュードラビーズ構築物PRV-152-CMV-EGFPを注入した。ホールシストキニンA受容体（Cckar）は、腸を支配する結節ニューロンのマーカーである。
エトログレード標識は、孤束核（NTS）および左右両方の結節神経節で可視化された（図6B）。ウイルス発現のかなりの割合がCckarマーカーと重なった。このことは、CeAが迷走神経を介したBGの制御に加えて、CCKのような腸の感覚シグナルによっても調節されている可能性を示唆している。
次に、この双方向性の腸-脳回路が機能的かどうかを検証した。Glp1r[GCamp6]マウスのCeAに刺激電極の先端を片側植え込んだ。同時にBGの眼内イメージングを行った（図6C）。まず、CeAに短時間の電気刺激パルスを加えた後、BGのカルシウム過渡現象が有意に増加しないことが観察された。次に、マウスにCCKの閾値以下の量を注射して、BGのベースライン活動レベルをプライムすることにした（「CCKLow」）。このような条件下で、CeAを短時間電気刺激すると、BGカルシウム過渡電流がしっかりと、超相加的に増加した（図6Dと6E；ビデオS3）。脾臓（交感神経）病変のある動物では、BG過渡現象は変化しなかった（図S6B）。
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ビデオS3。扁桃体中心核を電気刺激すると、図6に関連するブルナー腺に強いカルシウム過渡現象が誘発された。
BGを活性化するCeAの能力をさらに詳しく調べた。CCKによる迷走神経のプライミングによらず、BGを活性化するためには、相前後しての神経細胞活性化とは異なり、緊張性の神経細胞活性化が十分であるかどうかを検証した。覚醒動物のCeAニューロンの活性を調節するために、野生型マウスのCeAにAAV5-hSyn-hM3D(Gq)-mCherryを発現させ、デザイナードラッグであるclozapine-N-oxide（CNO）を投与することで、興奮性デザイン受容体の化学遺伝学的活性化を行った。CeAが副交感神経のモジュレーターとして働くという考えに沿うように、CNO注射はDMVに強い神経細胞活動を誘導した（図S6C）。予想に反して、BGの持続的で緊張性の活性化は、CCK注射を必要とせずに観察された（図6F-6H）
。
CeAがBGの持続的活性化を引き起こす能力は、マイクロバイオームの調節における扁桃体の役割の可能性を示している。CeAの化学遺伝学的興奮は、刺激されたマウスの排泄物中の乳酸菌数を著しく増加させるのに十分であることがわかった。上記のBGイメージング実験と一致して、この効果はBGをCCKLowでプライミングすることでさらに拡大した（図6I）
。
次に、CeA刺激が外因性腸内細菌の増殖を抑制する能力を試験した。再びマウスに大腸菌EcAZ-2株を経口投与した。EcAZ-2の増殖を抑制するには化学原性興奮で十分であり、この効果はCCKLowに依存しなかった（図6J）。さらに、同じ処理で脾臓の胚中心が中程度に、しかし統計的に有意に拡大することがわかった（図6K）。さらに、乳酸菌数と胚中心面積の間に、CeAを介した有意な被験者内相関が再び観察された（図6L）。最後に、マイクロバイオームの調節は粘液放出に依存するため、化学遺伝学的CeA活性化によってBG排泄が強く誘導されることが確認された（図6M）。
これらの
所見は、
CeAが
マイクロバイオームを介して末梢の免疫関連組織を調節していることを示している。
中枢扁桃体-迷走神経-腺結合は、マイクロバイオームと
免疫に対する
慢性ストレスの影響を媒介する。
ヒト以外の霊長類、ヒト、および実験用げっ歯類におけるこれまでの研究から、ストレス後に乳酸菌が一貫して減少することが示されている
。
は
、このような効果がCeA-DMV-BG回路によって媒介されるかどうかを検証しようとした。
まず、急性拘束ストレス（1回）または慢性拘束ストレス（1日6回暴露；STAR Methods参照）に暴露された雌雄マウスのCeAにおける大規模な神経細胞アンサンブルを記録した。ベースラインの活動と比較すると、慢性拘束ストレスはCeA全体の神経細胞活動に広範な抑制をもたらした。この効果は、それほど顕著ではなかったが、急性ストレス中にも存在した（図7A-7Hおよび非ストレス対照のS7A-S7H）
。
図7扁桃-迷走神経-腺神経回路は慢性ストレスによって抑制され、ストレスによって誘導される腸内細菌叢の変化と免疫
媒介する。
画像の
これらの知見は、CeA-DMV-BG軸がストレス要因への曝露によって阻害されることを示している。これまでの研究や我々の仮説と同様に、慢性ストレスは乳酸菌数を強く抑制しただけでなく、驚くべきことに、非ストレスマウスでCeAを化学遺伝学的に阻害すると、この効果が再現された。一方、慢性ストレスマウスでは、CeAを化学遺伝学的に刺激すると、乳酸菌数の力強い増殖が観察された（図7I）。つまり、CeAはマイクロバイオームの構成、特に乳酸菌の増殖を双方向的に制御している
。
上記と同様に、非ストレスマウスにおけるストレス物質への曝露とCeAの阻害は、いずれもBG病変に関連する表現型を再現した：ストレスのかかった雄および雌マウスは、腸内感染に対してより脆弱であり、腸透過性の増大を示し、脾臓の形態と免疫プロファイルに変化を示した（雄については図7J-7MおよびS7I-S7L、雌については図7O-7SおよびS7N-S7Q）。同様に、ストレッサー曝露とCeA阻害の両方がBG粘液分泌を抑制した（それぞれ雄と雌について図7Nと7T）。さらに、乳酸菌数の抑制は身体的拘束に特異的なものではないことに注意されたい：マウスでは母体分離も同様に乳酸菌数を抑制した（霊長類で観察されたパターンを再現；雄と雌についてそれぞれ図7Uと7BB）
。
もしCeA-DMV経路の阻害がストレスの免疫学的影響を媒介するのであれば、どちらかの経路を活性化すれば、これらの影響を逆転させるのに十分なはずである。その結果、ストレスを受けた雄マウスと雌マウスのCeAを化学遺伝学的に刺激すると、乳酸菌レベルが回復し、感染症が予防され、腸管透過性が低下し、脾臓の形態が正常化し、BG粘液分泌が再活性化した（雄については図7J-7Nと S7I-S7L、雌については図7O-7Tと S7N-S7Qを参照）。これらの効果がCeA-DMV-BG回路によって媒介されるという仮説に沿うように、乳酸菌増殖を誘導するCeA活性化の能力は、BG病変によって消失した（それぞれオスとメスについて図S7MとS7R）
。
図S
扁桃-迷走神経-腺回路は慢性ストレスによって阻害され、ストレスによって誘導される腸内細菌叢の変化と免疫不全を媒介する。
Cを
上記と矛盾することなく、これらの効果はDMVの化学遺伝学的活性化によって再現された：ストレスを受けた雌雄マウスにおけるDMVの化学遺伝学的刺激は、乳酸菌レベルを回復させ、消化管感染を予防し、腸の透過性を制限し、脾臓の形態を正常化し、BG粘液分泌を再活性化した（雄については図7V-7AA、雌については図7CC-7HHを参照。 その他の詳細および化学遺伝学的アプローチの検証については図S7S-S7FFも参照）。要約すると、ストレスがマイクロバイオームと免疫に及ぼす影響を完全に逆転させるには、中枢性扁桃体か迷走神経の副交感神経系のいずれかを活性化すれば十分である
。
考察
脳の状態と腸内細菌叢の変化を結びつけるストレス感受性神経腺回路を同定した。オプション関連の脳回路は迷走神経を介してブルンナー腺を制御し、これらの腺からの粘膜分泌物は微生物、特に乳酸菌の増殖をサポートする。ヒト以外の霊長類、実験用げっ歯類、ヒトから得られたいくつかの証拠は、ラクトバチルス属の腸内細菌がストレス時に著しく減少することを示している
。
A
腸粘液分泌の神経上皮回路は、杯細胞で実証されている。具体的には、腸管感覚侵害受容器線維がカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）-Ramp1経路に関与し、杯細胞の空排出と粘液分泌を誘導する
。
興味深いことに、腸の侵害受容器の遺伝子破壊は、重篤な炎症と腸内細菌叢の変化（伝達性腸内細菌異常症を含む）を引き起こす
。
これらの知見は、外在性消化管神経が粘液分泌細胞を標的としてマイクロバイオームの制御に重要な役割を果たしていることを示している。さらに、最近の知見では、心理的ストレスと腸の炎症との関係に大腸腸管ニューロンが関与していることが示唆されている
。
本研究は、迷走神経線維が上部腸の粘膜下腺を標的として細菌の恒常性を促進する神経腺回路を明らかにすることで、この新たな知見に加えている
。
この結果は、慢性的なストレス因子に反応して変化する免疫の生成に、迷走神経が関与していることを示唆している。BGからのムチン放出は乳酸菌増殖の基質となる。ストレスが粘液分泌を抑制すると、乳酸菌の増殖も同様に抑制される。後者の影響には、腸管透過性の亢進、交感神経の過緊張、リンパ組織の異常（特に脾臓の収縮と粘膜リンパ濾胞の過剰増殖）が含まれる。乳酸菌＋ビフィズス菌の投与は腸管バリアの完全性を回復し、交感神経の活動を抑制したが、抗生物質投与動物は腸管透過性の亢進を示した。
これらの
知見は、常在菌、特に乳酸菌が上皮のタイトジャンクションタンパク質をアップレギュレートすることによって腸のバリア機能を高めることを示した研究と一致している
。
,
O
したがって、この知見は、遠心性迷走神経線維が免疫機能と抗炎症シグナル伝達を促進するという考え方と直接一致する
。
特に興味深いのは、迷走神経コリン作動性シグナル伝達が脾臓機能に及ぼす有益な作用が報告されていることである
。
これは、ブルンナー腺と脾臓の特徴を関連付ける我々の知見と類似している。提案された回路は、一方では、迷走神経が脾臓を介して炎症状態を軽減するメカニズムを明らかにするかもしれない。迷走神経刺激が交感神経の作用に反して脾臓組織を拡張させることが示された。迷走神経刺激の有益な効果は、粘膜の完全性の増強によって媒介されるのかもしれない。ヒト被験者にストレスホルモンを静脈内投与したところ、迷走神経刺激は小腸の透過性を低下させた
。
この効果は、迷走神経刺激がストレスによる腸管透過性の変化を逆転させた前臨床研究と一致している
炎症性腸疾患の症状を抑制した
。
しかし、迷走神経コリン作動性シグナル伝達と腸管バリアの完全性との関連メカニズムは、いまだ不明である
。
本研究は、ブルンナー腺とその粘液分泌が、迷走神経刺激による腸粘膜免疫の保護作用の少なくとも一部を担っている可能性を示唆している。この考え方に沿って、我々の知見は、迷走神経の副交感神経活動が、ストレス因子に応答する場合も含めて、マイクロバイオームの組成を双方向に調節することを示している
。
コリン作動性シグナル伝達に加え、迷走神経の感覚枝もマイクロバイオームの調節に関与している可能性がある。その結果、消化促進性腸管ホルモンであるCCK
その作用は迷走神経の感覚神経節に依存している
BGを介した乳酸菌集団の拡大を示唆している。これは、迷走神経栄養感知線維の活動に反応して乳酸菌集団が拡大する可能性を示唆している。さらに、迷走神経感覚線維は腸内微生物の含有量を感知することができる。オビオティック投与は、不安のげっ歯類モデルにおいて生理学的マーカーを改善したが、これは迷走神経感覚によって媒介される効果である
。
迷走神経知覚神経節は、細菌の代謝産物を感知し、細菌のシグナル伝達に対する自律神経反応の発生を媒介する
。
これらの知見は、ブルンナー腺に病変を持つマウスが、食物繊維を豊富に含むペレットやプロバイオティクスを含む飲料液を好むようになったという我々の観察と一致している。エタリーファイバーは乳酸菌と ビフィズス菌の増殖を促進する
を促進し、マイクロバイオームが変化した動物のメタボリックシンドロームを抑制する
。
つまり、変化したマイクロバイオームの影響は、間受容経路を介して感知される可能性があるの
。
,
,
代償的な行動反応の引き金となる
。
最後に、側頭葉の中の皮質下領域であるCeAが、BGを制御し、マイクロバイオームを調節していることがわかった。腹側扁桃体ニューロンは情動行動に基本的に関与している
,
,
,
中枢扁桃体は、条件づけられた恐怖と不安において主要な役割を担っている
,
,
このように、ストレスはネガティブな心理状態とマイクロバイオームの変化との間に重要な関連性を持つ可能性がある。は、ストレッサー暴露が中枢性扁桃体の神経細胞活動を強力に抑制すること、そして中枢性扁桃体の抑制が腸内マイクロバイオームと免疫に対するストレスの影響を再現することを発見した。この考えと一致して、腸管迷走神経感覚シグナルが中枢扁桃体を介して不安状態を調節することが示された
。
前述の知見と一致するように、我々がCCKによって制御されることを発見した乳酸菌の一種であるL. rhamnosusは、迷走神経を介して中枢性扁桃体の主要な神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸（GABA）の前脳レベルを調節することにより、ストレス誘発性の不安および抑うつ様行動を軽減した
。
これらの知見は、中枢性扁桃体の活動がマイクロバイオームの組成を双方向的に調節していることを示している。扁桃体処理における変化は、その重症度がマイクロバイオームの変化の程度と相関する精神疾患の根底にある可能性がある
。
研究の
限界
本研究の重要な限界は、無菌動物におけるBG病変を含む実験がなかったことである。実際、BGを病変させるための我々のアプローチは、いずれも侵襲的な処置を伴うため、被験者の無菌状態が損なわれる可能性があった。幸いなことに、われわれの単一細胞トランスクリプトーム解析では、BGに特異的な明確な遺伝マーカーを明らかにすることができなかった（すなわち、生物全体を考慮した場合）。この限界は我々の結論には直接影響しないが、将来的には交差遺伝学的アプローチによって、侵襲的介入を必要とせずにBGを標的にできるようになるかもしれない。最後に、我々は主に神経免疫回路に焦点を当てたが、今後の研究によって、BG、乳酸菌、宿主免疫の関連メカニズムについての理解が進むはずである
。
AR
★
方法K
Yリソース
表
AGENT or RESOURCE SOURCE IDENTIFIER
A
抗体
R
bbit-anti-c-Fos Abcam Cat # ab190289; RRID:AB_2737414
G
抗 GFP 抗体 (FITC) Abcam Cat # ab6662; RRID:AB_305635
A
exa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno Research Labs Cat # 711-585-152; RRID:AB_2340621
T
ITC 標識アフィニピュア ヤギ抗ウサギ IgG（H+L） Jackson Immuno Research Labs Cat # 111-025-144; RRID:AB_2337932
F
TC 標識アフィニピュア ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs Cat # 111-095-144; RRID:AB_2337978
F
TC-conjugated affinipure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs Cat # 705-095-147; RRID:AB_2340401
T
ITC 標識アフィニピュア ロバ抗ヤギ IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs Cat # 705-025-147; RRID:AB_2340389
G
抗ウサギ IgG 抗体 (H+L), DyLight™ 649 Vector Laboratories SKU # DI-1649-1.5; RRID:AB_3065224
A
exa647 標識抗マウス IgD 抗体 Biolegend Cat. 405707; RRID:AB_893528
B
イリアントバイオレット421結合抗マウスCD21/CD35抗体 Biolegend Cat. 123421; rrid:ab_2650891
a
exa488-conjuncted anti-mouse/human Ki-67 antibody Biolegend Cat # 151204; RRID:AB_2566800
A
ti-Mouse CD45 (30-F11)-89Y Standard BioTools Cat # 3089005B; RRID:AB_2651152
A
ti-Mouse CD90.2 (30-H12)-113ln# Biolegend Cat # 105333; RRID:AB_2563765
A
ti-Mouse Ly-6G (1A8)-141Pr Standard BioTools Cat # 3141008B; RRID:AB_2814678
A
ti-Mouse CD11c (N418)-142Nd# Biolegend Cat # 117341; RRID:AB_2562807
A
ti-Mouse TCRb (H57-597)-143Nd Standard BioTools Cat # 3143010B
A
ti-Mouse CD24 (M1/69)-144Nd# Biolegend Cat # 101829; RRID:AB_2563732
A
ti-Mouse F4/80 (BM8)-146Nd Standard BioTools Cat # 3146008B; RRID:AB_2895117
A
抗マウス CD11b (M1/70)-148Nd Standard BioTools Cat # 3148003B; RRID:AB_2814738
A
ti-Mouse CD19 (6D5)-149Sm Standard BioTools Cat # 3149002B; RRID:AB_2814679
A
ti-Mouse IgD (11-26c.2a)-150Nd# Biolegend Cat # 405737; RRID:AB_2563774
A
ti-Mouse CD25 (3C7)-151Eu Standard BioTools Cat # 3151007B; RRID:AB_2827880
A
ti-Mouse SiglecF (S17007L)-163Dy# Biolegend Cat # 155502; RRID:AB_2810420
A
ti-Mouse CD335 (NKp46) (29A1.4)-153Eu# Biolegend Cat # 137625; RRID:AB_2563744
A
ti-Mouse CD64 (X54-5/7.1)-156Gd# Biolegend Cat # 139301; RRID:AB_10613107
A
ti-Mouse CD117 (2B8)-166Er# Biolegend Cat # 105829; RRID:AB_2563710
A
ti-Mouse CD62L (MEL-14)-160Gd Standard BioTools Cat # 3160008B
A
ti-Mouse CD103 (2E7)-161Dy# Biolegend Cat # 121401; RRID:AB_535944
A
ti-Mouse Ly-6C (HK1.4)-162Dy Standard BioTools Cat # 3162014B; RRID:AB_2922921
A
ti-Mouse CD8a (53-6.7)-168Er Standard BioTools Cat # 3168003B; RRID:AB_2811241
A
ti-Mouse CD206/MMR (C068C2)-169Tm Standard BioTools Cat # 3169021B; RRID:AB_2832249
A
ti-Mouse NK1.1 (PK136)-170Er Standard BioTools Cat # 3170002B; RRID:AB_2885023
A
ti-Mouse CD44 (IM7)-171Yb# Biolegend Cat # 103051; RRID:AB_2562799
A
ti-Mouse CD4 (RM4-5)-172Yb 標準 BioTools Cat # 3172003B; RRID:AB_2811242
A
ti-Mouse MHCII (I-A/I-E) (M5/114.15.2)-Bi209# Biolegend Cat # 107602; RRID:AB_313317
A
ti-Human/Mouse CD45R/B220 (RA3-6B2)-176Yb Standard BioTools Cat # 3176002B; RRID:AB_2895123
T
uStain FcX™ (抗マウス CD16/32) 抗体 Biolegend Cat # 101319; RRID:AB_1574975
P
PE 標識抗マウス IL-1a 抗体 Biolegend Cat # 503203; RRID:AB_315281
P
PE 標識抗マウス CXCL9 (MIG) Biolegend Cat # 515603; RRID:AB_2245490
G
at-anti-ChAT 抗体 Millipore Cat #AB144 ; RRID:AB_90650
R
βIIIチューブリンに対する bbit ポリクローナル Abcam Cat# ab18207; RRID:AB_444319
C
医薬品、ペプチド、組換えタンパク質
C
K-SAP Advanced Targeting Systems Cat # IT-31
B
ank-SAP Advanced Targeting Systems Cat # IT-21
A
ti-ChAT-SAP Advanced Targeting Systems Cat # KIT-42
I
G-SAP Advanced Targeting Systems Cat # KIT-42
C
K8 AnaSpec Cat # AS-20739
D
phtheria Toxin Sigma-Aldrich (Merck) Cat # D0564-1MG
F
TC-デキストラン Chondrex Cat # 4013
S
クラロース Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 69293-100G
C
ozapine N-oxide (CNO) Enzo Life Sciences Cat # BML-NS105-0025
K
ebs-Henseleit Buffer Modified Sigma-Aldrich (Merck) Cat # K3753-10L
R
Ascope® Probe Mm-Glp1r ACDBio Cat # 418851
R
Ascope® Probe Mm-Cckar-C2 ACDBio Cat # 313751-C2
R
Ascope® プローブ Mm-Chrm3-C3 ACDBio Cat # 437701-C3
2
5 二重鎖マウス陽性コントロールプローブ ACDBio Cat # 321651
2
プレックス陰性コントロールプローブ ACDBio Cat # 320751
V
ncomycin Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 1709007
M
トロニダゾール Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 1442009-100MG
A
ピシリン Sigma-Aldrich (Merck) Cat # PHR2838
N
omycin Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 1458009-200MG
C
rbenicillin disodium Fisher Scientific Cat # AC455360010
C
loramphenicol Sigma-Aldrich (Merck) Cat # C0378-25G
U
エタン Sigma-Aldrich (Merck) Cat # U2500-100G
D
リフェナシン臭化水素酸塩 Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 1164200
D
クロロメタン Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 270997
H
過酸化水素水 Sigma-Aldrich (Merck) Cat # H1009
M
THANOL SIGMA-ALDRICH (Merck) Cat # 34860
D
ベンジルエーテル Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 33630
F
uoroGold（FG）メーカー：F Fisher scientific から購入 Cat# NC0560981
C
V
CTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector Laboratories Cat# PK-6100
R
Ascope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 ACDBio CAT# 323110
H
E Staining Kit (Hematoxylin and Eosin) Abcam Cat # ab245880
P
riodic Acid Schiff (PAS) Stain Kit (Mucin Stain) Abcam Cat # ab150680
O
ink® Target 96 Mouse Exploratory Olinkhttps://olink.com/products-services/target/biological-process/
E
実験モデル: O ガニズム／系統
M
使用: C 7BL/6J (B6) The Jackson Laboratory JAX: 000664
M
使用：G p1rtm1.1(cre)Lbrl/RcngJ(Glp1r-ires-Cre) The Jackson Laboratory JAX: 029283
M
使用：C 7BL/6-Gt(ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/J(B6-iDTR) The Jackson Laboratory JAX: 007900
M
使用：B .129S-Chattm1(cre)Lowl/MwarJ(B6J.ChAT-ires-Cre::Δneo) The Jackson Laboratory JAX: 031661
M
使用：B .Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai9) The Jackson Laboratory JAX: 007909
M
使用：B .Cg-Igs7tm148.1(tetO-GCaMP6f,CAG-tTA2)Hze/J(Ai148D) The Jackson Laboratory JAX: 030328
M
使用：B ;129-Gt(ROSA)26Sortm5(CAG-Sun1/sfGFP)Nat/J(CAG-Sun1/sfGFP) The Jackson Laboratory JAX: 021039
C
7BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem1(CAG-Cd63/EmGFP)Adly/J(CD63-emGFPl/s/l) The Jackson Laboratory JAX: 036865
M
使用：C karem1(cre)Shah/J The Jackson Laboratory Jax: 037017
M
使用：B J.ChAT-ires-Cre::Δneo The Jackson Laboratory Jax: 031661
M
使用：B .Cg-Tg(Chat-COP4∗H134R/EYFP,Slc18a3)6Gfng/J (ChAT-ChR2-EYFP) The Jackson Laboratory Jax: 014546
B
cterial and virus strains
A
V1 hSyn FLEx mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby Dr. Luo-Addgene AAV Viral Service Addgene Viral Prep: 71760-AAV1
A
V8.2-hEF1a-DIO-synaptophysin-EYFP Viral Gene Transfer Core, McGovern Institute for Brain Research, Massachusetts Institute of Technology N.A.
A
V-DJ-hSyn-DIO-EGFP Dr. Roth - Duke Viral Vector Core Addgene Plasmids: 50457
A
V5-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry Addgene Addgene Plasmids: 50474
A
V1-flex-taCasp3-TEVp Dr. Shah - University of North Carolina's Vector Core Addgene Plasmids: 45580
A
V9-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry Addgene Addgene Plasmids: 44361
A
V5-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry Addgene Addgene プラスミド: 50475
P
V CMV-EGFP NIH Center for Neuroanatomy with Neurotropic Virus # 152
P
V CAG-DIO-TK-GFP NIH 神経刺激性ウイルス 解析センター Ba-2017
E
coliEcAZ-2 Amir Zarrinpar博士からの寄贈 EcAZ-2
S
アフィロコッカス・キシロサス ATCC ATCC 29971
L
ctobacillus rhamnosus ATCC ATCC 27773
1
株プロバイオティクス[Lac+Bif] RenewLife エクストラケアプロバイオティクス
億個の生きた培養物 ラクト・プロバイオティクス:L ラクトバチルス・プランタラムLp-115®;ラクトバチルス・ラムノサスGG;ラクトバチルス・アシドフィルスNCFM®;ラクトコッカス・ラクチスLI-23™;ラクトバチルス・カゼイLc-11®;ラクトバチルス・パラカゼイLpc-37®;ラクトバチルス・アシドフィルスLa-14®;ラクトバチルス・ブレビスLbr-35™; ビフィド・プロバイオティクス：B フィドバクテリウム・ラクティスBI-04®；ビフィドバクテリウム・ラクティスHN019™；ビフィドバクテリウム・ラクティスBi-07®；ビフィドバクテリウム・インファンティスBi-26™。
D
仮定データ
R
w 16S sequencing BioProject PRJNA1126813
B
行動学的、電気生理学的、グラフ、イントラビタ ルイメージングの生データ Mendeley Data DOI: 10.17632/pw7y7wtsg2.2
S
ftware and algorithms
I
またはPro 6.36 WaveMetricshttps://www.wavemetrics.com/
E
hoVision XT 11.5 Noldushttp://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
L
bView 2014 LabViewhttp://www.ni.com/download/labview-development-system-2014/4735/en/
G
aphPad Prism 9 GraphPadhttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
A
obe design standard CS6 Adobehttp://shop.adobe.com/
I
M SPSS statistics 24.0 IBM Predictive Softwarehttps://www.ibm.com/docs/en/spss-statistics
W
n Movie Maker VideoWinSoft Softwarehttp://www.VideoWinSoft.com
I
ageJ NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
F
ji ImageJ フィジーhttps://imagej.net/software/fiji/
P
thon 3 Python Software Foundation https://www.python.org/
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enCV 4.5.3 OpenCV teamhttps://opencv.org/
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彼女
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C
ll-ID™ 20-Plex Pd Barcoding Kit Standard BioTools Cat # 201060
C
llaca MX High-throughput Automated Cell Counter Nexcelomhttps://www.nexcelom.com/nexcelom-products/cellaca-3/
H
発熱モニタリングシステム Harvard Apparatus Cat # 55-7020
T
ngsten 2 チャンネル電極 (B ツイストワイヤー) Protech International MS303T/3-B/SPC
S
2C/SB 2チャンネル整流子、シングル
ush プロテック・インターナショナル SL2C/SB
3
5-BNC 5cm～100cm、メッシュx62(cm)接続ワイヤー付き Protech International 305-BNC-WM
N
nofil アプリケーションキット (マイクロインジェクション) World Precision Instruments Cat # Beveled (IO-KIT)
N
noFil ニードル（マイクロインジェクション） World Precision Instruments Cat # Beveled, 36G (NF36BV-2)
P
mp 11 エリートナノマイト（マイクロインジェクション） Harvard Apparatus Cat # 70-4507
S
Inal Cord Hook (Vagal operation) Fine Science Tools Cat # 10162-12
M
Use Spinal Adaptor（脊髄操作） Stoelting Cat # 51690
M
Use Transverse Clamps (脊髄操作) Stoelting 社の Cat # 51691
D
ライセンス縫合糸結束鉗子 (マイクロサージェリー) Fine Science Tools Cat # 11063-07
F
rmvar-Insulated Nichrome Wires (EMG recording) A-M system Cat # 761000
M
Crowire connections (EMG recording) Neuralynx Cat # EIB-16
1
TDT systems Cat # OMN1005
M
sterflex® ナイロン、メスルアー（フィスチュラ） Cole-Parmer Cat # UX-45502-20
M
sterflex®、ポリプロピレン、雄ルアーロック (フィスチュラ) Cole-Parmer Cat # EW-30800-30
R
und Cover Slip German Glass #1 .5, 15 mm (Intravital microscopy) Electron Microscopy Sciences Cat # 64-0713
U
tra Gel Control Super Glue (Intravital window) ロックタイト Cat # 45208
S
ainless steel large penny fender washers M12x24x1.5mm (Intravital microscopy) ダイウィスキー Cat # 304
L
w Toxicity Silicone Adhesive (Intravital microscopy) WPI Cat # KWIK-SIL
F
uoroDish 細胞培養皿 50mm WPI Cat # FD5040-100
C
マウス頸静脈用テーター、1～3Fr、10.5cm、カラー @1.2cm。Ts 22ga. (Gastric balloon) Instech laboratories Cat # C10PU-MJV1403
M
クロレナセンチューブ (OD 0.025") (イレオカテーテル) Braintree Scientific Cat # MRE025
P
tch Clamp Amplifier Molecular Devices 社製 Cat # Multiclamp 700B
C
nfocal microscope Leica TCS SP8 STED 3X
C
共焦点顕微鏡 Zeiss LSM980 Airyscan 2
S
ngle ユニット記録アンプ TDT RZ5
D
ジタイザーおよびシーケンサー CED Micro 1401
L
スライス照明用 D Mightex LCS-0470-50-22
M
ltenyi Tyto マイクロ流体ソーター Miltenyi Biotec Cat # 130-103-931
B
MendeleyData.com https://doi.org/10.17632/zkjm36wp8s.1
V
vo 2100 小動物用マイクロ・イメージング・システム FUJIFILM VisualSonics Vevo 2100
R
脂肪10kcal%添加デント食（D12451にSucroseを適合） 研究用飼料 D12450H
R
脂肪45kcal%研究用飼料 D12451
R
脂肪 45kcal%含有歯牙用食事療法（繊維フリー） 研究用飼料 D13121101
D
高繊維（セルロース）入り研究用飼料 D22072013
R
脂肪 10kcal% 餌 研究用飼料 D12450B
R
高タンパク質飼料 リサーチダイエッツ D17120803
P
オビオティック 500億個の生きた培養物入り RenewLife Amazonで注文 Cat. 1148061
O
eTouch Ultra 血糖測定用テストストリップ One Touchhttps://shop.onetouch.com/onetouch-test-strips
O
e Touch Ultra 2 血糖モニタリングシステム One Touchhttps://www.onetouch.com/products/glucose-meters/onetouch-ultra2
M
S 寒天 Sigma-Aldrich (Merck) Cat # 41782-500G-F
L
寒天 kan50 Fisher Scientific Cat # 50842594
B
心臓注入ブロス Fisher Scientific Cat. CM1135B
M
tsubishi pouch-anaero 20/pk Fisher Scientific Cat # 23246379
A
ar, granulated 500g Fisher Scientific Cat # BP9744500
F
可撓性プラスチックチューブ経口ガベージニードル（20本入りボックス） GavageNeedle SKU# PDAFN2030NB
1
-チャンネル可動式電気生理学的記録バンドル Innovative Neurophysiology 仕様：1 -チャンネルシングルドライブ可動式バンドル、23umタングステン電極、カニューレ長4.5mm、可動距離4mm、アース線付き O ネティックス
9014-001 コネクター
I
プランタブル光ファイバー ドリカムレンズ、カナダ MFC_200/240-0.22_6mm_ZF1.25(G)_FLT
L
w 毒性シリコーン接着剤 (眼内顕微鏡) WPI Cat # KWIK-SIL
S
ngle Unit Recording Amp TDT RZ5
#.
CyTOF分析用に標識された抗体は、
Human Immune Monitoring Centerで結合されたものです。
R
入手先
L
広告
連絡
先
その他の情報およびリソースや試薬のリクエストは、リードコンタクトのIvan E de Araujo(Ivan.DeAraujo@tuebingen.mpg.de)、テクニカルコンタクトのHao Chang(hao.chang@mssm.edu)およびWenfei Han(wenfei.han@tuebingen.mp
g.de)
までお願いします。
資料の利用
可能
性
本研究では新規のユニークな
試薬は
使用していない。
ta およびコードの利用
可能
性
行動データ、電気生理学的データ、解剖学的データ、および処理後の眼内イメージングデータは、Mendeley Dataに寄託されており、発表日現在、一般に入手可能である。主なリソースの表に記載されている。本論文で報告した16S配列決定データのアクセッション番号はBioproject: P JNA1126813である。本論文で
報告された16S
シーケンシングデータの
アクセッション番号はBioproject: PRJNA1126813
です
。
本論文はオリジナルコードを生成していない
。
本論文で報告されたデータセットの再解析に必要な追加情報は、要請があれば技術連絡先から提供される
。
実験モデルと研究参加者の
詳細
本研究で発表された実験は、NIHの動物研究ガイドラインに従って実施され、アイカーン医科大学マウントサイナイ校のInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認された
。
実験
動物
1078匹の成体雄性マウスを用いた。雨の詳細と匹数は以下の通りである
4
。
7 C57BL/6J (Jax Mouse Strain #000664 ).
1
Glp1r-ires-Cre（Jaxマウス系統番号029283）
4
。
Glp1r-ires-Cre x Ai148D（Jaxマウス系統#029283および#030328）
1
.
Glp1r-ires-Cre x CD63-emGFPl/s/l（Jaxマウス系統#029283および#036865）
3
。
Glp1r-ires-Cre x Ai148D x Ai9（Jaxマウス系統#029283および#030328および#007907）
4
。
3 Glp1r-ires-Cre x ROSA26iDTR (Jax Mouse Strain #029283および #007900).
3
。
Glp1r-ires-Cre x Ai148D x ROSA26iDTR（Jaxマウス系統#029283および#030328および#007900）
3
。
Ai9×Glp1r-ires-Cre（Jaxマウス系統#007914および#029283）
5
。
Glp1r-ires-Cre x CAG-Sun1/sfGFP（Jaxマウス系統#029283および#021039）
7
。
B6J.ChAT-ires-Cre::Δneo (Jax Mouse Strain #031661 ).
3
CckarCrex Ai9（Jax Mouse Strain #037017および #007909）。
ChAT-ChR2-EYFP line 6 (Jax Mouse Strain #014546 ).
A
。
行動実験に使用したlマウスは、12時間の明暗サイクルの下で個別に飼育した。行動実験時、動物は8～20週齢で、体重は約25～28gであった。lの動物は初めて科学実験に使用された。薬理学的物質や代替食への曝露歴はない。すべての動物で健康状態は正常であった。解剖学的トレース研究に使用された動物は群飼いで、注射時に3週齢であった。外科手術の詳細は表S
1
Mを参照のこと。
方法の
詳細
以下に、各マウス系統のウイルスおよび薬剤注射、カテーテル留置、脱神経、脳電極植え込み、イントラビタルイメージング準備の詳細を示す（主要リソース表も参照）。手術はバイオセーフティレベル2が承認された実験室で行った。手術用マウスを含むl匹のマウスはマウントサイナイの特定病原体フリー（SPF）動物施設で飼育した。手術マウスは毎日体重と摂餌量をモニターした。すべての症例で、術前鎮痛：0.05mg/Kgブプレノルフィン（s.c.）、麻酔は3％イソフルランで誘導し、1.5％～2％イソフルランで維持した。手術部位はヨード石鹸で剃毛・洗浄し、70％イソプロピルアルコールで清拭した。切開部はバイトリル軟膏で十分に消毒した。手術は実体顕微鏡下で行い、動物は加熱パッド（CMA 450; Harvard Apparatus, Holliston, MA）の上に置いた。手術後、動物がケージの非加熱側で過ごすことを選択するまで、赤外線ヒーター下で回復させた
。
ブルナー
腺の切除
ブルナー腺の外科的切除（BG-resected）
T
8時間摂食制限した動物の腹部を剃毛し洗浄した。腹部に正中切開を加えた。正中切開から胃を外装し、幽門肛門を左腹直筋に緩く縫合し、近位十二指腸の視野を最大にした。十二指腸を隔離するために手術用ガーゼを当て、十二指腸球を綿の先で押さえた。メスの先端は腸間膜血管を避けるように注意深く操作した。十二指腸球の腹側（十二指腸-幽門括約筋接合部から5mmの遠位方向）に縦切開を加えた。内腔を細いピンセットで開き、内腔の内容物を生理食塩水で静かに洗浄した。幽門括約筋下の粘膜下組織を電気焼灼器で切除した。十二指腸切開を8-0吸収性ビクリル縫合糸（Ethicon V548G、米国）で縫合し、胃に付着した緩んだ縫合糸を除去し、腹直筋/皮膚切開を滅菌縫合糸で閉鎖した
。
オデナム切除術（Duo-lesion）
T
は上記のブルンナー腺切除のコントロールである。マウスの十二指腸を上記のように露出した。十二指腸の下行部（およそOddi括約筋の位置）を綿の先端で押さえた。メスの先端は腸間膜血管を避けるように注意深く操作した。十二指腸の腹側を縦に切開した（長さ約5mm、十二指腸幽門接合部から少なくとも10mm遠位、Brunner腺を避ける）。内腔を細いピンセットで開き、生理食塩水でわずかに洗浄した。幽門括約筋下の粘膜下組織を電気焼灼器で切除した。十二指腸切開を8-0吸収性ビクリル縫合糸（Ethicon V548G、米国）で縫合し、胃に付着した緩んだ縫合糸を除去し、腹直筋/皮膚切開を滅菌縫合糸で閉鎖した
。
am手術（陰性対照）
T
マウス十二指腸を露出させ、約5mmの縦切開を行った。十二指腸切開を8-0吸収性ビクリル縫合糸（Ethicon V548G、USA）で縫合し、胃に付着した緩んだ縫合糸を除去し、腹直筋/皮膚切開を滅菌縫合
糸で
閉鎖した。
ウナーDTx/生理食塩水注射（BG-DTxおよびBG-生理食塩水）
T
8時間摂食制限した動物の腹部を剃毛し洗浄した。腹部の正中線を切開した。胃を正中切開部から外出し、幽門肛門を左腹直筋に緩く縫合し、近位十二指腸を最大限観察できるようにした。2mg/mLのジフテリア毒素（Sigma D0564）または生理食塩水をNanofil™ 36G斜め針（WPI、フロリダ州サラソタ）に装填し、Nanofil™チューブ（WPI、フロリダ州サラソタ）をPump 11 Elite Nanomite（Harvard Apparatus、マサチューセッツ州ホリストン）に装着したNanofil™ 10μlシリンジ（WPI、フロリダ州サラソタ）に接続した。十二指腸球の粘膜下層（幽門括約筋にほぼ3 mm以内）を標的 とする均等な穿刺に、10nL/秒で25nLずつ（総容量200 nL）注入した。針先は腸間膜血管を避けるように注意深く操作した。輸液が終了した後、完全に吸収されることを確認するため、抜針前に針を5秒間留置した。胃に付着した緩い縫合糸を除去した後、滅菌した縫合糸を皮膚に貼付
した
。
ti-ChAT-SAPおよびウサギIgG-SAP注射によるブルナー腺コリン作動性
除
神経S
マウスに200nLのAnti-ChAT-SAPまたはRabbit IgG-SAP（商品番号KIT-42、Advanced Targeting Systems社、米国）を注射した以外は、上記のブルナー腺への注射と同様の手順で行った
。
腸間膜へのオデナムDTx注射（Duo-DTx）
T
は上記のBrunner腺切除のコントロール法である。上記のように十二指腸球を露出させた。2mg/mLのジフテリア毒素（Sigma D0564）または生理食塩水をNanofil™ 36G斜め針（WPI、フロリダ州サラソタ）に装填し、Nanofil™チューブ（WPI、フロリダ州サラソタ）をNanofil™ 10μlシリンジ（WPI、フロリダ州サラソタ）に接続し、Pump 11 Elite Nanomite（Harvard Apparatus、マサチューセッツ州ホリストン）に装着した。球根から10mm下の十二指腸の腸間膜層を標的として、均等に分散した穿刺に10nL/秒で25nLずつ（総容量200nL）注入した。針先は腸間膜血管を避けるように注意深く操作した。点滴が終了した後、完全な吸収を確実にするため、針を抜去する前に5秒間そのままにした。胃に付着した縫合糸の緩みを除去した後、滅菌した縫合糸を皮膚に貼付した
。
gal、脾神経、交感神経節病変
N
投与CCK-SAP病変
M
非共役サポリン（Blank-SAP）またはコレシストキニン共役サポリン（CCK-SAP）を注射したceは手術時3週齢であった。投与ガングリオン注射は前述したように行った
。
まず、腹側正中線を頸部の長さに沿って切開し、顎下腺を胸骨舌骨筋および耳下腺筋とともに後退させ、気管と頸動脈を露出させた。迷走神経をSpinal Cord Hook（FST, Foster City, CA）を用いて頸動脈から切り離し、結節神経節に到達できるようにした。Nanofil™36G斜め針（WPI、フロリダ州サラソタ）およびSilflex™チューブ（WPI、フロリダ州サラソタ）に、ラールまたは化学物質の分注を装填した。Pump 11 Elite Nanomite（Harvard Apparatus社、マサチューセッツ州ホリストン）に取り付けたNanofil™ 10μlシリンジ（WPI社、フロリダ州サラソタ）を用いて、各結節神経節に合計500nL量のBlank-SAPまたはCCK-SAPを50nL/分で送液した。その後、無菌縫合
糸を
皮膚に適用した。
横隔膜
迷走
神経切開3
週齢の動物は手術前に8時間の摂食制限を行った。腹部を剃毛し洗浄した。腹部正中線を切開した。肝臓と胃を脇に引っ込め、食道を露出させた。胃を支配する迷走神経の枝を食道と左胃動脈から注意深く切り離し、電気焼灼器で両側から切断した。その後、筋肉と皮膚に無菌縫合を
施した
。
脾臓
摘出
脾臓摘出時のイマルは3週齢であった。腹部を剃毛し、洗浄した。腹部に正中切開を加えた。正中切開により胃を外装した。腹腔動脈と上腸間膜動脈にそれぞれ付着している腹腔神経節と上腸間膜神経節を露出させるために、胃底を肝臓の方に引っ張った。第5～11胸部の感覚および交感神経を支配する大、小、小脾神経を同定し、腹腔動脈と大動脈から注意深く分離し、小型鉗子とスプリングシザーズ（FST社、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて剥離した。その後、皮膚に無菌縫合を
施した
。
リアクトミー
臍帯切除時のイマルは3週齢であった。腹部を剃毛し、洗浄した。腹部の正中線を切開した。正中切開から胃を外装した。腹腔神経節を露出させるため、胃底を肝臓側に引っ張った。腹腔神経節をミニチュア鉗子（FST社、カリフォルニア州フォスターシティ）で腹腔動脈から注意深く切り離した。切除前に腹腔神経節の基部を結紮した。その後、皮膚に無菌縫合を
施した
。
定位
手術
脳定位手術とプローブ
植え込み
A
手術時のイマルは6週齢であった。注射はハミルトン社製1.0μL Neuros Model 7001KHシリンジを用い、20nL/minの速度で行った。以下、各マウス系統について、まず注入したウイルス構築物または移植したデバイスを列挙し、次に関連する定位座標を記述する。脳定位座標は、マウスの脳の標準化アトラスに従って、ブレグマを基準として示している
。
M
使用系統
ChAT-ires-CreI
接合部位
DMVV
ral コンストラクトAAV1 hSyn FLEx mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby (300nL 両側), AAV8.2- hEF1a-DIO-synaptophysin-EYFP（両側300nL）、AAV1-flex-taCasp3-TEVp（両側300nL）、AAV9-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry（両側300nL）、またはAAV9-Ef1a-DIO EYFP（各両側300nL）。
座標：A : - .5mm, ML: ±0.3mm, DV: -5.5 ∼-5.3mm.
M
.
使用系統 Glp1r-ires-Cre x Ai148D.
I
接合部位 CeM.
V
ral constructAAV5-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry (各300nL, 両側)
。
接合座標：A : - .0mm, ML: ±2.5mm, DV: -4.8mm∼5.2mm.
M
.
使用株 B6.
I
注射位置 CeM.
V
ral constructAAV5-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry (各300nL, 両側) または AAV5-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry (各300nL, 両側)
。
接合座標：A : - 0mm、ML：±2.5mm、DV：-4.8mm～5.2mm。3μL/side.
M
使用株 CckarCre x Ai9.
I
接合部位 CeM.
V
ral コンストラクトPRV-152-CMV-EGFP.
I
接合座標：A : - 0mm、ML: ±2.5mm、DV: -4.8mm ∼ 5.2mm。右側1μ
L
。
使用系統 Glp1r-ires-Cre x Ai148D.
I
植物の位置 CeM.
S
耳介電極植え込み.
E
電極タイプ：B ツイストワイヤー2チャンネル電極（Protech
international）E
電極座標：A : - 0mm、ML：±2.5mm、DV：-5.0mm。
使用ストレイン B6.
I
植物の位置 CeM.
S
耳介電極植え込み.
E
電極タイプ：B ツイストワイヤー2チャンネル電極（Protech
international）E
電極座標：A : - 0mm、ML：±2.5mm、DV：-5.0mm
。
オプトタギングを
用いた生体電気生理学的記録F
アレイ植え込み後、ChAT-ChR2-EYFPマウスを腹腔内カテーテル留置後（詳細は後述）、脳定位固定装置上に置き、16チャンネルの可動性バンドル（23μmタングステン、Innovative Neurophysiology, Inc.製、米国）を含む1つの電極をDMV（AP: -7.5mm、ML: ±0.3mm、DV: -5.4mm）に植え込んだ。植え込んだ光ファイバー束を30分間目的の場所に留置した後、麻酔をウレタン1.0～1.5g/kgに切り替え、神経細胞記録を開始した。電極の位置は組織学的に確認した。記録はマルチチャンネル獲得プロセッサー（Tucker-Davis Technologies）のスパイクモジュールを用いて行った。 A 12分間のベースラインと生理食塩水の注入の後、10μg/KgのCCK8を0.1mL/minの速度で0.1mL注入した。記録セッションの最後に、473nmの青色刺激を1Hz、0.5秒オン/0.5秒オフのサイクルで与え、どの単離されたユニットのDMV ChAT+（コリン作動性副交感神経）ニューロンを同定した。光電アーチファクトを防ぐため、光強度を最小にし、複数の部位でテストを行った
。
ストレッサー曝露中の vivo電気生理学的記録
F
C57BL6/Jマウスを脳定位固定装置に乗せ、16チャンネルの可動束（23μmタングステン、米国Innovative Neurophysiology社製）を含む電極をCeM（AP: -1.0mm、ML: ±2.5mm、DV: -4.3mm）に1本植え込んだ。電極の位置は組織学的に確認した。コーデ ィングはマルチチャンネル収集プロセッサー（Tucker-Davis Technologies）のスパイクモジュールを用いて行った。7日間の回復期間中、マウスはイソフルランで短時間麻酔され、束は初日に200μm、その後6日間連続で50μmねじ込まれた。
ceを
フレキシブルケーブルで整流子に接続し、記録条件への馴化を行った。
n
-ストレスM
ceは、ベースラインを評価するため、1日目にホームケージ内で15分間自由に動いて記録され、その後イソフルランで短時間麻酔された。回復後、2回目の15分間の記録を行った
。
急性
ストレス
2日目、消灯時間中の12時間、アクリルプラスチック板の上に仰向けに寝かせ、サージカルテープで固定した。3日目、ベースラインを評価するため、マウスをホームケージ内で15分間自由行動させた。その後、イソフルランで短時間の麻酔をかけ、マウスを再び拘束した。ボード上の円形開口部により、記録ケーブルを頭部インプラントOmneticsコネクタに接続することができた。麻酔からの回復後、拘束されたマウスは、急性ストレッサー暴露のために2回目の15分間の記録を
行った
。
緊張
ストレス
ceは、その後6日間（Day3-Day8）連続で毎日6時間、アクリルプラスチック板に繰り返し再拘束された。9日目、マウスはまずベースライン評価のために最初の15分間、ホームケージ内で自由に動く様子を記録した。イソフルランで短時間麻酔した後、マウスをアクリル板上に固定した。覚醒後、拘束したマウスを慢性ストレス下で2回目の15分間記録した
。
麻酔、アクリル板、サージカルテープ、繰り返し接続などの他の因子がCeM電気生理に及ぼす影響を除外するため、同じプロトコルを1日目から9日目まで拘束なしで繰り返した。2回目の15分間は、麻酔から回復した後、自由に動ける状態で記録した
。
共焦点顕微鏡用トラビタルウィンドウ
F
ブルンナー腺および膵臓（コントロール）のカルシウム過渡変化を共焦点顕微鏡で観察するために、Glp1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-Dマウス（Cre駆動GCaMP6f発現）およびGlp1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-D×Ai9マウス（Cre駆動GCaMP6fとtdTomatoの複合発現）を作製した。本文中ではGlp1r[GCamp6]と略記した。6週齢の8時間摂食制限動物に以下の外科的処置を施し、その後、近位十二指腸/膵臓腹部ガラス窓を設置し、眼内共焦点顕微鏡観察を行った。 A 腹直筋と腹部皮膚の間の切開端に財布のひもを縫合した。胃は正中切開で外装した。カバーガラス越しに十二指腸近位部と膵臓の視野を最大にするため、幽門肛門を左腹直筋に緩く縫合した。その後、縫合糸を特注のチタンリング（内径φ14mm、外径φ32mm、幅1mm、米国Send Cut Send社製）の溝に締め付けた。低毒性シリコーン接着剤（KWIK-SIL、WPI社製、フロリダ州サラソタ）を十二指腸近位部と膵臓の外面に注意深く塗布した後、丸いカバースリップ（φ15mm、Electron Microscopy Sciences社製、ペンシルベニア州ハットフィールド）に接着し、さらに2つ目の大きなチタンリング（内径φ14mm、外径φ46mm、幅1mm、米国Send Cut Send社製）に接着した。麻酔をウレタン1.0～1.5g/kgに切り替えてから、共焦点顕微鏡に取り付けた。ライカSP8共焦点顕微鏡を用い、10倍の対物レンズと0.75倍の増幅ハードウェアセッティングでカルシウムイメージングを行った。ピクセルは1フレームあたり400×400で、ピンホールは最大値で使用した。GCaMP6fを発現するブルンナー腺を可視化するために、連続撮影を約3.2フレーム/秒、FOV=2.25mm2、400X400フレームの走査速度で行った
。
コレシストキニン注入を併用した動注イメージング
B
イントラビタルウインドウ植え込みの前に、MicroRenathaneチューブ（0.025"、Braintree Scientific社、マサチューセッツ州Braintree）を腹腔内に挿入し、23ゲージの針で誘導し、チューブの周囲をパースストリングで皮膚に締め付けた。オレシストキニン（CCK8）または生理食塩水を新たに調製した。12分間のベースラインおよび生理食塩水画像取得期間の後、10μg/KgのCCK8 0.1mLを0.1mL/分で経静脈カテーテルから注入し、注入後の一連の画像を取得した。加齢は、注入前、注入後、注入後を通して連続的に取得された
。
トラバイタルイメージングとダリフェナシンおよびコレシストキニン注入の併用
S
ダリフェナシン臭化水素酸塩（Sigma-Aldrich、#1164200）20 mg/kgを、CCK8 i.p.注入の6分前にマウスにi.p.注入した。ダリフェナシンの投与量は既述の通りであった
。
I
コレシストキニン注入と迷走神経病変
Tを
併用したトラバイタルイメージング
上記に対する感覚迷走神経除神経の影響を評価するために、結節神経節にCCK-SAPまたはBlank-SAPを注入した。b横隔膜迷走神経切開は窓内留置の直前に行った。腹膜カテーテル留置およびCCK/生理食塩水注射は前述のとおりで
あっ
た。
コレシストキニン注入と
BGAにおける
ChAT陽性末端の病変を組み合わせた動注イメージング
前述したように、Glp1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-Dマウスに、少なくとも腹腔内ウインドウ植え込みの2日前に、十二指腸球の粘膜下層（幽門括約筋に隣接）に200nLのAnti-ChAT-SAPを注射した。 I 腹膜カテーテル留置およびCCK/生理食塩水注射は前述の通り。経時的画像は、注入前、注入後、注入後の各期間を通じて連続的に取得した
。
迷走神経電気刺激と組み合わせた血管内イメージング
G
p1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-Dマウスを用いた。眼窩内窓移植の前に、左（腹側）または右（背側）の横隔膜下迷走神経幹をSpinal Cord Hookで食道から切り離した。 M 外傷性の弾性カフ電極（Micro Cuff Sling, 200 μm/3pol/2,5mm/cable entry top, CorTec GmbH）を神経の下にそっと置いた。カフ電極のケーブル端をオス型ミニチュアピンコネクタ（520200、A-M Systems）にはんだ付けし、Grass S48 Pulse Stimulator（A-M Systems）に接続した。12分間のベースライン画像取得期間の後、TTL信号（約1.8mA、2ms）により1Hzの電気パルスをトリガーし、1分間の休息期間を設けた。このサイクルを複数回繰り返した。このサイクルを
複数回繰り返し
、24分間のシミュレーション後画像を記録した
。
扁桃体中心核の電気刺激とtravital imagingの組み合わせ
G
これらの実験にはp1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-Dマウスを用いた。上記のように、脳刺激電極（Protech international; タングステン2チャンネル電極（Bツイストワイヤー、MS303T/3-B/SPC））の植え込みは、脳内ウインドウ植え込みの7日前に行った。実験当日は、眼窩内窓とi.p.カテーテルの両方を留置した。刺激電極はGrass S48 Pulse Stimulator（A-M Systems社製）に接続した。最大電流0.2 mAのTTL信号をトリガーとして、20 Hzの電気パルスを扁桃体中枢に1サイクル与えた。カルシウム過渡現象のイメージングにおける実験デザインは以下の通りである。1サイクルの電気刺激（ES1）、2）200μLの閾値未満用量のCCK（0.05μg/Kg）のi.p.注入、3）2回目の電気刺激サイクル（ES2）、4）3回目の電気刺激サイクル（ES3）、5）最後の電気刺激サイクル（ES4）。刺激サイクルは1分間で、その間に10～20分のインターバルを置いた。シミュレーション前のベースラインは1分間、刺激後の安静期間は10分間で、正規化と比較のためにスキャンした
。
扁桃体中心核の化学遺伝学的刺激中のtravital
imagingG
これらの実験にはp1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-Dマウスを用いた。上述したように、Creに依存しないコンストラクトAAV5-hSyn-hM3D(Gq)-mCherryを、眼内窓移植の7-14日前にCeA（AP：-1.0mm、ML：±2.5mm、DV：-4.8mm〜-5.2mm）に注入した。実験当日は、眼内窓とi.p.カテーテルの両方を留置した。Oまたはビヒクルの輸液を新たに調製した。12分間のベースラインおよびビヒクル画像取得期間の後、0.1mLの5mg/kg CNOを0.1mL/minの速度でi.p.カテーテルから注入した。加齢は、注入前、注入後、注入後の各期間を通じて連続的に取得された
。
迷走
神経背側運動核におけるブルンナー腺のイントラビタルイメージングとin vivo単一ニューロン記録。
実験にはp1r-ires-Cre×Ai148(TIT2L-GC6f-ICL-tTA2)-Dマウスを用いた。眼内窓とi.p.カテーテル留置により、16チャンネルシングルドライブ可動式記録バンドル（Innovative Neurophysiology, Inc.米国）をDMV（AP：-7.5mm、ML：±0.3mm、DV：-5.3mm）に留置した。コーデングは、マルチチャンネル収集プロセッサー（Tucker-Davis Technologies）のスパイクモジュールを用いて行った。電極の位置は組織学的にも確認した。CCK8ポンプ注入と画像取得のスタンプは、TTL信号で取得プロセッサに入力され、単一ユニットのデータと整列された
。
生体超音波
研究
ceは1.5%イソフルラン吸入で麻酔状態に保たれた。マウスは37℃の加温台の上で仰臥位に保たれ、心拍数と呼吸数が終始モニターされた。ほぼ同じ麻酔、心拍、呼吸パラメーターのもとで、l個のデータビデオを記録した。異なる実験条件下での胃の大きさを測定するため、食道方向と十二指腸方向の両軸に沿って胃全体を撮影したビデオを記録した。年齢はVisual Sonics Vevo 2100高解像度超音波イメージングシステムで解析した。十二指腸の動きを追跡・評価するため、動きの交絡を避けるために呼吸期間を考慮した
。
t透過性
M
4kDaFITC-デキストラン25mg/ml（Chrondex #4013 ）を経口投与（20mL/kg）する前に4時間絶食させた。投与8時間後、マウスをイソフルランで麻酔し（導入5%、維持1.5%イソフルラン、0.7L/min N2O、0.3L/min O2）、眼窩後血液を採取し、ヘパリンコートチューブに保存した。 A その後、安楽死させた。サンプルを遠心分離（4℃、7分、8000g）し、血漿を透明なエッペンドルフチューブ（Fisherbrand™ Premium）に採取した。標準曲線の定義には、PBSを投与したコントロールマウスの血漿を用いた。血漿中のTC-デキストラン濃度は、分光光度計（SpectraMax 340PC Microplate reader, Molecular Devices, San Jose, CA, USA）を用いて、励起λ=490nm、発光λ=520nmの条件下で二重分析した
。
腹膜ブドウ糖負荷試験
A
16時間食餌制限した動物に20％グルコース溶液（2gグルコース/kg）を腹腔内注射した。ブドウ糖注射後0分、15分、30分、60分、120分にOneTouch Ultra2 Blood Glucose Monitoring Systemを用い、未使用のテストストリップ（OneTouch Ultra Test Strips）に尾の血液を少量滴下し、血糖値を測定した。 A 実験終了後、マウスを清潔なケージに戻し、水と餌を与えて観察した
。
アルグルコース負荷
試験
マウスにグルコース溶液を経口投与した以外は上記と同様の手順で行った
。
行動
試験
嗅覚嗜好性
試験
ceは試験前に少なくとも1週間単独飼育された。試験開始前に、2種類の餌（合計約10g）をケージに均等にばらまき、24時間放置した。その後、それぞれの餌の残量を量り、ケージに戻し、これをまったく同じ時間帯に3日間繰り返した。そして、餌の種類ごとの摂取量の一日平均を算出した。脂質、糖質、タンパク質、食物繊維の含有量が異なる4組の餌の摂取量を比較した。4種類の食品はResearch Diets, Inc.から購入した。比較は以下の通りである： 1 H 高脂肪（D12451）vs.食物繊維なし高脂肪（D13121101）；2. 高脂肪（D12451）vs.普通食（D12450B）；3. 食物繊維なし高脂肪（D13121101）vs.食物繊維なし高タンパク質（D17120803）；4. 食物繊維なし高タンパク質（D17120803） vs. 高タンパク質（D22072013）。
抗生物質嗜好性
試験
ceは一晩水を飲まなかった。2種類の芳香溶液（バナナ対リンゴ、1:1000）を入れた水筒を秤量し、1時間自由摂取させた。試験後、溶液の残量を測定した。各マウスについて、好ましくない方のフレーバーを同定し、プロバイオティクス・カクテル（300mg/10mlの水；プロバイオティクスはRenewLife, lncから購入）に混ぜた。これらの混合物を3日間マウスのコンディショニングに供した。トレーニングの各日、マウスは一晩水を与えられず、その後プロバイオティクスと（あまり好まれない）フレーバーが継続的に与えられた。3日間のコンディショニングの後、マウスは一晩水を奪われ、2種類のフレーバーを1時間提供された（プロバイオティクスはなし）。トレーニング前後の味覚嗜好を算出した
。
オープンフィールド
試験
オープンフィールド試験では、自動ビデオ分析装置（EthoVision XT11.5、Noldus）を使用した。イマルをプレキシグラスのアリーナ（Med Associates社製、25cm×30cm）に設置した。総面積は中央部（8.3×10cm）と周辺部のサブエリアに分けられた。中央のサブエリアのほぼ上方で、150Wのランプを作動させ、この場所への自然嫌悪を誘導した。イマルはこのアリーナで1回テストされた。セッションはデジタル録画され、自動ビデオ解析アルゴリズム（EthoVision XT11.5、Noldus）を用いて動物の活動を直ちに解析した
。
行動
評価の
ための
短時間
拘束ストレスプロトコール
手順は記録に用いたものと同様である。マウスを処置室に移した。急性拘束ストレスでは、マウスを手製の筒型拘束器に入れ、消灯時間中に12時間物理的に拘束した。12時間の拘束ストレスセッションは19:00に開始し、19:
00に
終了した。
行動
評価の
ための緊張拘束ストレスプロトコール
マウスを処置室に移した。慢性拘束ストレスでは、マウスを上記のように毎日6時間、6日間連続で固定した。各拘束セッション終了後、動物をホームケージに戻し、次のセッションまで邪魔しないようにした
。
母仔
分離
psは分娩後2日目（PD2）から14日目（PD14）まで毎日4時間ずつ母仔分離された。リング分離後、仔ウシは点灯時間中、清掃用寝具を入れた紙コップに移した。ヒーティングパッド（32℃±2℃）を仔馬の下に置いた。4時間後、仔ウシは再び母親と一緒に元のケージに移された。14日目以降、
仔
ウシはホームケージに留まり、離乳および試験まで干渉されないようにした。
子宮
操作
乳酸菌
Bの
腸内および糞便中レベルの評価
マウスに無菌0.9％生理食塩水（ビヒクル）または10μg/Kg CCK溶液を7日間毎日腹腔内投与した。すべての腸内容物、大腸内容物および糞便を採取し、滅菌ddH2Oに希釈した。小腸内容物は回腸遠位部から、大腸内容物は結腸近位部から採取した。いずれの場合も、長さ10mmの腸管セグメントからサンプルを採取し、糞便サンプル（0.1mg）を滅菌水で1:10000に希釈し、CFU測定のためにMRSプレートに塗布した
。
胆汁と共培養した乳酸桿菌とブドウ球菌のin
vitroT
この実験では、クロラムフェニコール耐性株であるLactobacillus rhamnosus(Hansen)Collins(ATCC 27773)とStaphylococcus xylosus(ATCC 29971)を用いた。leは5匹の餌を与えないマウスから採取した。キシロサス ブドウ球菌およびラムノサス乳酸菌を100μLの生理食塩水または100μLの胆汁に室温で約30分間希釈した。アフィロコッカス・キシロサス溶液は、37℃の脳心筋注入（BHI）プレートで培養した。rhamnosus は、嫌気培養セット（Thermo Scientific社製、 AnaeroPack™）を入れた37℃、20 mg/Lのクロラムフェニコール入りMRS寒天培地プレートで培養した
。
プロバイオティクスの
経口投与
この実験では、クロラムフェニコール耐性株Lactobacillus rhamnosus(Hansen)Collins(ATCC 27773)を用いた。マウスに滅菌0.9%生理食塩水（ビヒクル）または10μg/Kg CCK溶液を3日間毎日投与した。3日目に、マウスに約108CFUのラクトバチルス・ラムノサスを経口投与した。さらに2日間、生理食塩水またはCCKを毎日投与し続け、その後糞便サンプルを採取した。サンプル（1mgの糞便を滅菌水で1：1000に希釈した溶液から100μl）を、あらかじめ20mg/Lのクロラムフェニコールで処理したMRSプレートに塗布し、クローンをカウントした
。
プロバイオティクスの
脳内注入A
実験時のイマルは6週齢であった。腹部と背部皮膚を剃毛し、洗浄した。頚背部を小切開し、腹部正中線を切開した。盲腸は正中切開から外装された。パースストリング縫合糸を遠位盲腸壁、盲腸リンパパッチの近位に置き、その中にマイクロレナセンチューブ（0.025"、Braintree Scientific社、マサチューセッツ州Braintree）の先端を挿入した。チューブの周囲に財布の紐を締め、腹筋に開けた小さな穴から背部まで皮下にトンネルを通した。その後、カテーテルの外装を可能にするため、肩甲 板の間を背部まで小さく切開した。腹部切開は滅菌縫合糸で閉鎖した。輸液（Renew Life Extra Care Probiotic、6mg/mice/day）は0.1mLの濾過したddH2Oで新たに調製し、0.1mL/分で注入
した
。
病原体コロニー形成
実験
実験では、Staphylococcus xylosus（ATCC29971）または大腸菌EcAZ-2（Amir Zarrinpar博士より提供）を用いた。S. xylosusの実験では、ブルンナー腺を欠く動物、またはその適切な対照動物に、プロバイオティクス（膀胱内注入、上記参照）またはムチン（飲料水中）を3日間投与した。その後、マウスに毎日約108CFUの細菌を7日間経口投与した。致死率は毎日記録した。ストレッサー暴露実験 ストレッサー暴露実験 ストレッサー暴露実験 ストレッサー暴露実験 ストレッサー暴露実験 ストレッサー暴露実験 ストレッサー暴露実験では、まずマウスを上記のよう に異なるストレス条件に暴露した。enマウスにはS. xylosus(ATCC 29971)を3日間毎日約108CFU経口投与した。大腸菌
EcAZ-2-2については、大腸菌
EcAZ
-2-2(ATCC 29971)を
3
日間経口
投与
した
後、100μLをBrain Heart Infusion (BHI)プレートで37℃で培養した
。
大腸菌EcAZ-2実験では、ブルンナー腺を欠失した動物、または適切な対照動物に、プロバイオティクス（頭蓋内注入、上記参照）またはムチン（飲料水中）を3日間投与した。日間、マウスに約1010CFUの細菌を経口投与した。日後、新鮮な便を採取し、50μg/mLカナマイシンを添加したLB寒天培地上で培養し、得られたクローンを数えた。ストレッサー曝露実験 ストレッサー曝露実験では、まずマウスを上記のような異なるスト レス条件に曝露した。enマウスに約1010CFUの細菌を1回経口投与した。日後、新鮮な便を採取し、50μg/mLカナマイシンを添加したLB寒天培地で培養し、クローンをカウントした
。
抗生物質治療と糞便微生物叢
移植
T
マウスモデルに対する広範な抗生物質投与については、以前にも報告されている
。
具体的には、広域抗生物質カクテル（バンコマイシン0.25g、メトロニダゾール0.25g、アンピシリン0.5g、ネオマイシン0.5g）を500mLの濾過水に溶解した。この抗生物質溶液の苦味をマスクするため、人工甘味料（スレンダ）5gを加えた。得られた溶液をステリカップ（0.22μm）でろ過した。実験にはマウントサイナイSPF施設で飼育されているC57BL/6マウスを用いた。C57BL/6マウスに抗生物質混合溶液を7日間連続で飲水として自由摂取させた。その後、ブルナー腺病変マウス（BGx-DTx）または対照マウス（BG-生理食塩水）の糞便から新鮮な溶液を調製し、1g/mLの濃度で7日間毎日経口投与した。致死
率は
毎日記録した。
中枢側扁桃体への化学原性
刺激
脳内窓移植の2週間前に、脳内ウイルス注射を行った。実験期間中、化学遺伝学的デザイン薬であるクロザピン-N-オキシド（CNO、5mg/kg）と閾値以下のCCK（CCKLow、0.05μg/kg）を毎日腹腔内注射した。 A 投与7日後に新鮮な糞便サンプルを採取し、MRSプレートに添加した。EcAZ-2のコロニー形成を含む化学遺伝学的実験では、マウスをCNOとCCKLowで3日間処理した後、1010CFUのEcAZ-2を1回経口投与した。さらに3日間CNOとCCKLowの投与を続けた。経口投与から7日後に新鮮な便を採取し、MRSプレートで培養し、得られたクローンをカウントした
。
マイクロバイオーム組成の解析
B
大便および腸管サンプルの採取
A
動物には術前鎮痛剤（0.05 mg/Kg ブプレノルフィン s.c.）を投与し、安楽死まで3％イソフルランによる深麻酔下に維持した。腹部は剃毛し、ヨード石鹸で洗浄し、70％イソプロピルアルコールで拭いた。腹部皮膚を滅菌ドレープで覆い、正中線を切開した。採血のために下大静脈を露出させるため、腸を手術用ドレープの上に引っ張った。十二指腸をピロリ菌から切り離した後、腸全体を腹腔から引き出し、滅菌ドレープの上に静かに伸ばした。その後、異なる腸管セグメントを同定し、さらなる分析のために分離
した
。
糞便サンプル
採取
行動良好な動物を、寝具のない無菌ケージに移した。糞便は-80℃で保存した。糞便サンプルはDNA抽出と
塩基
配列決定の前に-80℃で保存した（最長1ヶ月）。
cteria DNA抽出と標的ライブラリー
調製
B
小腸・大腸内容物および糞便から、ZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA Kit（Zymo Research, Irvine, CA）を用いて細菌DNAを抽出した。cterial 16S ribosomal RNA（rRNA）遺伝子の標的配列決定は、Quick-16S™ NGS Library Prep Kit（Zymo Research, Irvine, CA）を用いて行った。16Sプライマーは、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅した。これらのプライマーは、高感度を維持しながら16S rRNA遺伝子の最良のカバレッジを提供するようにZymo Research社によってカスタム設計された。シーケンシングライブラリーは、PCR反応をリアルタイムPCR装置で行い、サイクルを制御することでPCRキメラの形成を制限するという革新的なライブラリー調製プロセスを用いて調製された。最終PCR産物はqPCR蛍光測定で定量され、等モルに基づいてプールされた。最終的にプールしたライブラリーはSelect-a-Size DNA Clean & Concentrator™ (Zymo Research, Irvine, CA)で洗浄し、TapeStation® (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)とQubit® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, WA)で定量した
1
。
Sアンプリコンの塩基配列
決定
最終ライブラリーは、v3試薬キットを用いてイルミナ® MiSeq™でシーケンスした（600サイクル）。シーケンシングは10% PhiXスパイクインで行った。細菌DNA抽出および16Sアンプリコンシークエンシングのためのサンプル採取の前に、手術用マウスを含むl匹のマウスをSPFレベルのマウントサイナイ動物施設で飼育した。
インフォマティクス
解析
DADA2パイプラインを用いて、生のリードからiqueアンプリコン配列のバリアントを推定した
。
DADA2パイプラインを用いて、シーケンシングエラーやキメラ配列を除去した。xonomy assignはQiime v.1.9.1のUclustを使用し、Zymo Research Database（16S rRNA遺伝子データベース）に適用した。Qiime v.1.9.1.
使用して、mpositionの可視化、アルファ多様性、ベータ多様性解析を行った。
また、
6 を用いて、異なるグループ間で有意な存在量を示す分類群を同定した。
デフォルト設定により同定した。ヒートマップ、Taxa2ASV Decomposer、PCoA プロットを含むその他の解析は、Zymo Research 社独自のスクリプトで行った。また、確認と異なる参照データベースの影響を排除するために、One Codex パイプラインとその Targeted Loci データベースを使用してアンプリコン配列を解析しました。Targeted Loci Databaseの解析結果から、有意に濃縮された菌種、属、科が確認された
。
細菌培養と同定
1
小腸内容物または大腸内容物、あるいは糞便サンプルを滅菌水で0μl希釈し、嫌気培養セット（Thermo Scientific社製、AnaeroPack™）を入れたMRS（deMan、Rogosa、Sharpe、Millipore、#110660）プレートに塗布し、37℃に維持した。薬剤耐性菌Lactobacillus rhamnosus（ATCC27773）については、細菌または糞便サンプルの滅菌希釈液を、嫌気性培養セット（Thermo Scientific社製、AnaeroPack™）を入れた37℃の20mg/Lクロラムフェニコール入りMRS寒天培地プレートに静置した。Staphylococcus xylosus（ATCC29971）については、凍結乾燥菌または血液サンプルの滅菌希釈液100μlを、37℃でBrain Heart Infusion（BHI）プレートまたは20mlのBHI培地にプレーティングした。大腸菌EcAZ-2株の場合、細菌または糞便サンプルの滅菌希釈液をLB寒天プレート（クローン計数用）に置くか、50μg/mLカナマイシンを添加したLB培地（in vivo用）で37℃で培養した。細菌株の同定には、滅菌PBS溶液を用いてMRSプレートからコロニーを洗浄し、16S rRNA遺伝子配列決定のためにDNAを抽出した
。
胞および膜分泌の解析
G
p1r-ires-Cre×CD63-emGFPl/s/lマウスを用いて、CCK処理前後の小胞の移動と分布を評価した。CD63はエンドソーム、リソソーム、分泌小胞、細胞膜に存在し、これらのコンパートメント間を輸送される。ブルンナー腺から強固な分泌が起こるたびに、CD63-emGFPは先端膜領域に凝集する。可溶性トランスジェニックマウスは一晩餌を与えられた。翌日、生理食塩水または10μg/Kg CCKを2群のマウスに注射した。ter1時間後、動物を濾過生理食塩水で灌流し、続いて4％パラホルムアルデヒドで灌流した。灌流後、ブルンナー腺セグメントを4％パラホルムアルデヒド中に24時間置き、0.02Mリン酸カリウム緩衝液（KPBS、pH7.4）中の20％スクロース溶液に48時間移した。m切片をクライオトーム（Thermo Fisher社製）を用いて得、共焦点イメージング用にマウント
した
。
雄ウイルスの
追跡
8時間摂食制限した動物の腹部を剃毛し、洗浄した。腹部を正中切開した。横隔膜下迷走神経切断術または臍帯切除術
横隔膜下迷走神経切開術またはセリアクトミー術の直後に、胃を正中切開から外挿し、幽門肛門を左腹直筋に緩く縫合し、近位十二指腸の視野を最大にした。V-イントロベント-
7
をNanofil™ 36G斜め針（WPI、フロリダ州サラソタ）およびSilflex™チューブ（WPI、フロリダ州サラソタ）に装填し、Nanofil™ 10μlシリンジ（WPI、フロリダ州サラソタ）に接続し、Pump 11 Elite Nanomite（Harvard Apparatus、マサチューセッツ州ホリストン）に装着した。十二指腸球の粘膜下層（幽門括約筋に隣接）または対照例の十二指腸下行部（Oddi括約筋に隣接）に10nL/秒で100nL注入した。針先は腸間膜血管を避けるように注意深く誘導した。点滴終了後、針を5秒間留置し、完全に吸収されるのを確認してから抜去した。胃に縫合した縫合糸を外し、滅菌した縫合糸を皮膚に縫合した
。
ブルンナー腺からの非シナプス性逆行性トレース
S
マウスに100nLの1％FluoroGold™（米国Fluorochrome社製）溶液を注射した以外は、上記と同様の
手順で
行った。
低リスク胃十二指腸間葉系腫瘍（GIST）患者における免疫学的パラメータの小断面解析
L
2020年から2024年までに広州第一人民病院で行われたw-risk GIST手術症例（男性、n=16、55.7±13.4歳；女性、n=13、63±10.1歳）を横断解析のために選択した（倫理承認番号#K-2024-045-01）。wリスクGISTは手術のみで治療され、術後7日以内の放射線治療/化学療法は必要ない。免疫系に対する放射線療法/化学療法の影響を除外するため、術後5～7日の間に術前術後の全血球計算（CBC）を採取した
。
適格基準は以下の通りであった。消化管出血が初発症状であった；超音波検査/内視鏡検査/CT検査で腫瘍が胃十二指腸領域に及んでいることが確認された；術後の病理診断で低リスクの消化管間葉系間質腫瘍（GIST）であることが確認された（すなわち、腫瘍が固有筋層に限局しており、漿膜やリンパ節への浸潤が検出されず、腫瘍が切開断端を超えていない）。閉鎖基準には、膵臓、脾臓、肝臓/胆道系を含む手術、敗血症、悪液質、急性腎不全、高リスク高血圧、脾梗塞などの重篤な合併症が含まれた。記録に不備のある症例、妊娠中、授乳中の症例も除外した。十二指腸球部切除（ブルンナー腺を含む）と十二指腸球部温存（ブルンナー腺より遠位の十二指腸部位）に分類した。白血球数、リンパ球数、好中球数、単球数などの組織学的パラメータは、2×2、術前・術後×切除部位デザインで解析した
。
組織学的
解析
組織学的
手順
ceをケタミン/キシラジン混合麻酔薬（ケタミン400mg+キシラジン20mg/kgBW I.P.）で深麻酔した。濾過生理食塩水で灌流した後、4%パラホルムアルデヒドで灌流した。灌流後、脳または腸切片を4％パラホルムアルデヒドに24時間漬け、0.02Mリン酸カリウム緩衝液（KPBS、pH7.4）中の20％スクロース溶液に2日間移した。その後、凍結し、凍結ステージを備えたスライド式ミクロトームで40μmの切片を4連に切り出した。電極の位置を確認し、関連する切片を同定してスライドにマウントした。その後、切片を明視野下および蛍光下で撮影した。疑似狂犬病ウイルスの可視化：ウイルス注射の3,4,5日後にマウスを灌流し、脳を40μmで切断した
。
染色
A
濾過した生理食塩水と4％パラホルムアルデヒドで灌流した。精巣組織および脾臓組織を後固定し、OCTに包埋し、5μmで凍結切片化した。切片をH&Eで染色し、Zeiss Axio Imagerで10倍および40倍の対物レンズを用いて画像化
した
。
S染色に基づく空洞スコア
T
ブルナー腺、杯細胞、腸粘液層を保存し、生体外で事後分析するために、切除直後の組織を4℃で2時間Carnoyの溶液（60％エタノール、30％クロロホルム、10％氷酢酸）に浸し、その後100％エタノールに
。
,
xed組織をOCTに包埋し、5μmで凍結切片化した。組織を過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色キット（Abcam、#ab150680）で染色し、Zeiss Axio Imagerで10倍および40倍の対物レンズを使用して画像化
した
。
ディープラーニングによる
空隙スコアの算出
ブルンナー腺は、杯細胞と同様に、粘液が完全にない状態と粘液で完全に満たされた状態の中間的な状態にあることがほとんどである。したがって、各腺のムチン貯蔵量をおおよそ定量化するために、「空隙スコア」を生成した。自動セグメンテーションアルゴリズム "Segment anything model"（SAM）
使用した
ムチン含量を定量化した。個々の腺のラベル付けに矩形を用いると、アルゴリズムはその外側の境界を定義する。w、与えられた腺が比較的少量のムチンを含む場合、アルゴリズムはその内側の境界を定義する。外側の境界の面積に対する内側の境界の面積の商を、その腺の "void score "と定義し、この腺におけるムチンの貯蔵量を表す。ボイドスコアが0.05未満の場合は、その腺は "ボイド "とみなされた
。
シンの厚さの測定
A
上述したように、十二指腸、回腸、大腸のサンプルをCarnoy's溶液で固定し、5μmで凍結切片した。その後、Periodic Acid Schiff (PAS) Stain Kit (Abcam, #ab150680 )を用いて染色し、Zeiss Axio Imager (40X)で画像化した。各画像の30-40の異なる領域にわたってムチンの厚さを測定し、厚さの平均値を算出するためにimageJを用いた
。
ムノヒスト化学染色
T
免疫蛍光法でFosを可視化し、切片をRabbit Anti-c-Fos抗体（Rabbit Anti-c-Fos ab190289、1:1000）、続いてDyLight™ 649標識ヤギ抗ウサギ抗体（IgG (H+L) DI-1649-1.5, Vector Laboratories、1:200）でインキュベートした。発現の解析と定量は以下のように行った。約160μm間隔で採取したローナル切片を10倍の倍率で撮影し、解剖学的ランドマークを保存するためにImageJでモンタージュした。各切片のs+ニューロンを検出し、ImageJを用いて数え、各動物の関連領域内のFos+ニューロンの累積総和として表した
。
免疫蛍光法でB細胞、細胞増殖、FDCライトゾーンを可視化し、10μm脾臓切片をAlexa647標識抗マウスIgD抗体（Biolegend、#405707、1:200、Clone: 11-26c.2a） Alexa647標識抗マウスIgD抗体（Biolegend, #405707 , 1:200, Clone: 11-26c.2）、Brilliant Violet 421標識抗マウスCD21/CD35抗体（Biolegend, # 123421, 1:200, Clone: 7E9）、Alexa488標識抗マウス/ヒトKi-67抗体（Biolegend, # 151204, 1:200, Clone: 11F6）と4℃で一晩インキュベートした。
氷を
KPBS溶液で3回洗浄し、Zeiss LSM980 Airyscan 2を用いて10倍の対物レンズで画像化した
。
10μmの腸切片をRabbit Anti-MUC2 抗体（Abcam, #ab272692 , 1:1000）とインキュベートし、続いてDyLight™ 649標識アフィニピュア・ヤギ抗ウサギ（IgG (H+L) DI-1649-1.5, Vector Laboratories, 1:200）とインキュベートした。
氷を
KPBS溶液で3回洗浄し、Leica STED 3Xと10倍の対物レンズを用いて画像化
した
。
ブルナー腺のDMV神経支配を免疫蛍光法で可視化するため、10μmのブルナー腺スライスを4℃で一晩、DMV線維についてはヤギ抗GFP抗体（FITC）（Abcam、#ab6662、1:10 DMV線維はヤギ抗GFP抗体（FITC）（Abcam, #ab6662 , 1:00）、DMVシナプトフィジンはウサギポリクローナルmCherry抗体（Abcam, #ab167453 , 1:1000）、コリン作動性ニューロンはヤギ抗ChAT抗体（Millipore, #AB144 , 1:1000）、ニューロンはウサギポリクローナルβIIIチューブリン（Abcam, #ab18207 , 1:1000）を用いて4℃で一晩インキュベートした。d抗体は、DyLight™ 649 標識ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) DI-1649-1.5, Vector Laboratories, 1:200) または FITC 標識ロバ抗ウサギ IgG (H+L), Jackson Immuno Research Labs, 705-095-147, 1:200) を用いて室温でインキュベートした。氷をKPBS溶液で3回洗浄し、Leica STED 3X、10倍の対物レンズで画像化した。大腸におけるサイトカインIL1aおよびCxcl9シグナル分布を可視化するために、10μmの大腸切片をPE標識抗マウスIL-1a（Biolegend、#503203）およびPE標識抗マウスCXCL9（MIG）（Biolegend、#515603）と別々に4℃で一晩インキュベートした。切片をマウントした
氷を
KPBS溶液で3回洗浄し、Leica STED 3Xを用い、10倍の対物
レンズで
画像化した。
リアク神経節ホールマウント免疫染色と組織清拭
W
組織クリアリングは、前述の
腹腔神経節をまず4％PFAで4℃、24時間以上固定し、組織をPBSで1時間、4回洗浄した。次に、一連のメタノール／B1n溶液（20％、40％、60％、80％、100％、100％）中で、室温で各濃度30分ずつ脱水した。脱脂（ジクロロメタン、一晩）および変色（10% H2O2/メタノール、一晩）を4℃で行った後、組織を一連のメタノール/B1n溶液（80%、60%、40%、20%、0%、0%）中で室温で再水和した。1:1000の一次抗体を含むPTxwH溶液に移し、37℃のインキュベーターで72時間振動させた。48時間PTxwH溶液で十分に洗浄した後、組織を1:500二次抗体PTxwH溶液で72時間振盪し、48時間洗浄した。次に、組織をジクロロメタン（シグマ社製）／メタノール（2容量／1容量）の混合液に3時間浸漬し、100％ジクロロメタンで15分間浸漬する操作を2回行った。その後、組織をカバーガラス底のチャンバーに移し、最後に100％ジベンジルエーテル（Sigma）で1時間、2回洗浄し、共焦点イメージングに備えた
。
AscopeA
動物は術前に鎮痛剤（0.05mg/Kgブプレノルフィン s.c.）を投与され、2％イソフルランで深麻酔に誘導された。腹腔内を氷冷クレブス-ヘンセライト緩衝液（K3753-10L、Sigma-Aldrich）で経心灌流した。投与神経節を露出させ、既述のように解剖した
。
十二指腸の近位3mm端（ブルンナー腺がある十二指腸球を含む）を採取した。採取した新鮮な組織を直ちにドライアイスで冷却したクライオモールドに入れ、-80℃で凍結する前にOCTで包埋した。その後、10μmで凍結切片化し、Superfrost Plusスライドにマウントして-80℃で保存した。4%PFAで4℃、1時間の短時間固定後、スライドをPBSで洗浄し、エタノールで脱水した。RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 with TSA Vivid Dyes（Cat No. 3270）、Mm-Glp1r（418851 RNAscope®）、Mm-Cckar-C2（313751-C2 RNAscope®）、Mm-Chrm3-C3（437701-C3 RNAscope®）、2.5デュプレックスマウス陽性コントロールプローブ（321651 RNAscope®）、および2プレックス陰性コントロールプローブ（320751 RNAscope®）のRNAscope®プローブを用いた
。
ヒトブルナー腺の組織学的研究
H
人体
標本
A
十二指腸切片サンプルは、チュービンゲン大学病院で十二指腸重複症の手術を受けた12ヶ月の女性患者から得た。サンプルは、地元の倫理委員会（Project Nr.066/2023BO2）の承認後、ヘルシンキ宣言
Bに従って
患者の両親の同意を得て採取された。
包埋前に、組織サンプルは4％リン酸緩衝パラホルムアルデヒド（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）で4℃で一晩固定し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄した。パラフィン包埋のため、固定した組織サンプルを上行アルコール系列で脱水し、次いでキシレンを加え、標準的な組織プロセッサー（Citadel tissue processor; Shandon-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて60℃で一晩パラフィンを浸透させ、脱水とパラフィンへの転写を行った。染色前に、パラフィン切片（HM355 SSミクロトームで5μm、Microm International, Walldorf, Germany）をSuper Frost Plusスライド（Microm International, Walldorf, Germany）に置き、脱脂（Xylolで3×5分間）し、アルコール濃度を下げて（100％、96％、70％で各5分間）蒸留水で再水和した。組織評価には、ハイデンハインのアザン染色を用いた
。
抗原回収のため、切片をクエン酸一水和物緩衝液（10 mM、pH 6.0、Merck, Darmstadt, Germany）中で蒸し器で加熱し、TBS緩衝液で5分間ずつ3回洗浄した。サンプルを、4 %ロバ血清（BioRad, Hercules, CA, USA）、0.1 %ウシ血清アルブミン（Roth, Karlsruhe, Germany）、および0.1 %トリトン® X-1を含むPBSで30分間ブロックした。 Triton® X-100 (Roth, Karlsruhe, Germany)で希釈した抗βチューブリンIII型（1:1000, Biolegend, San Diego, CA, USA, #802001 ）をPBSで希釈し、0.1 %ウシ血清アルブミンと0.1 % Triton® X-100を加え、恒温恒湿器内で4℃で一晩インキュベートした。その後、サンプルをPBSで3回、5～10分間洗浄した。二次抗体（donkey-anti-rabbit-alexa-488, 1:400, Life Technologies, Eugene, OR, USA, #A21206 ）をPBS、0.1 % Triton X-100、0.1 % BSAで希釈し、室温で60分間インキュベートした。4′，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（200ng／ml，Roth，Karlsruhe，Germany）で染色した。PBSで5分間洗浄するステップを2回行った後、サンプルを蒸留水で5分間洗浄し、続いてKaiser's glycerol gelatine（Merck, Darmstadt, Germany）でマウントした
。
腸切片をZeiss Axio Imager.Z1蛍光顕微鏡（Apotomeモジュール、励起波長358、488、543、647 nm、適切なフィルターセット付き）で画像化した。年齢はZENソフトウェアを用いて取得した。免疫蛍光染色では、DAPIの露光時間は6.4ms、TUJの露光時間は21.6msで、20倍対物レンズ（Plan-Apochomat 20x/0.8 M27）を使用した
。
ngle核
配列
決定D
ブルナー腺を含むオデナール切片を、氷冷した1X改変Krebs-Henseleit緩衝液（Sigma, K3753-10X1L）で灌流後、迅速に抽出した。サンプルは-80℃で1ヶ月間保存した。凍結した組織は、核抽出バッファー1mL中で、氷上で10分間、タングステンカーバイトストレート11.5cmファインシザー（ファインサイエンスツールズ、#14558-11）を用いて穏やかにスライスしながらバラバラにした。rge debris を 40μm のストレーナー（Falcon, #352340 ）で除去した。残ったホモジネートを1000xg、8分間、4℃でスピンし、ペレットを1回洗浄した後、1mlの1% BSA in PBSに懸濁した。トリパンブルー染色でカウントし、血球計数装置で1000核/μlに希釈した。clei（サンプルあたり約2000個）を10X Genomics Chromiumプラットフォームにロードし、細胞および転写産物特異的バーコードを持つcDNAを作製した。Chromium Single Cell 3'′ Library & Gel Bead Kit 3を用いてシーケンスライブラリーを構築した。ライブラリーは、ペアエンドシーケンスを用いてIllumina NextSeqでシーケンスした。
TOFS
サンプル
調製
A
術前に鎮痛剤（0.05 mg/Kg Buprenorphine s.c.）を投与し、2%イソフルランで深麻酔をかけた。腹部皮膚を剃毛し、腹部正中線を切開した。脾臓と腸間膜リンパ節（MLN）を採取した。採血のため下大静脈を露出した。大腿骨と上腕骨を剥離し、両骨端を取り除いて切開した。新骨髄（BM）を洗い流し、採取した。 M Ns）／脾臓／BMサンプルを、RPMI1640培地（ギビコ、#21870092）＋10％FBS（サーモサイエンティフィック、#A5256701）を入れた1.5mlチューブに入れた。タングステンカーバイトストレート11.5cmファインシザー（ファインサイエンスツールズ、#14558-11）を用いて、静かに切片を作成した。70μmのセルストレーナー（Fisherbrand、#22-363-548）を50mLチューブ（Thermo Scientific、#339652）に入れ、2mLのRPMI 1640培地＋10％FBSで洗浄した。リーンサンプルをセルストレーナーに入れ、シリンジプランジャーで粉砕した。mLのRPMI 1640培地＋10％FBSをストレーナーに流した。サンプルを500-600xg、5分間、4℃で遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを2-5mLの冷1x RBC Lysis buffer (Bioscience, #00 -4300-54)に懸濁した。懸濁液を室温で5分間インキュベートした。細胞懸濁液を10-20mLの冷RPMI1640培地＋10％FBS（赤血球溶解バッファー の10倍）で洗浄した。最後に、細胞を500-600xg、4℃で5分間遠心し、上清を捨てた。ペレットを2mLのRPMI1640培地＋10％FBSで再懸濁し、染色まで氷上で保存した。MLN/脾臓/BMから採取したサンプルは、主要リソース表に記載したマウス抗体パネルを用いて染色した。サンプルはCyTOF取得の前に一晩イリジウムインターカレーターで染色した。サンプルは水で2回洗浄し、正規化ビーズ（Fluidigm）に再懸濁し、セルストレーナーでろ過した
。
サンプル
処理
サンプルは新鮮な培地で処理施設（Mount Sinai HIMC）に運ばれた。細胞数はNexcelom Cellaca Automated Cell Counter（Nexcelom Biosciences, Lawrence, MA, USA）を用いてカウントし、細胞生存率はAcridine Orange/Propidium Iodide viability staining reagent（Nexcelom）を用いて測定した。細胞染色バッファー（CSB）（Fluidigm Corporation）で細胞を洗浄した後、Fcレセプターブロッキング（Biolegend Inc. llsはその後CSBで2回洗浄し、eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Setを用いて固定・透過処理した。固定/透過バッファーで氷上30分間インキュベートした後、Fluidigm Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit（Fluidigm社製）を用いて、各サンプルについてパラジウムバーコーディングを製造元の指示に 従って行った。室温で 30 分間インキュベートした後、サンプルを CSB で 2 回洗浄し、プールした。サンプルを eBioscience Permeabilization wash で洗浄し、細胞内 CyTOF 染色を行った。好酸球への細胞内抗体の非特異的結合を防ぐため、パリンブロッキング（100単位/mL）を利用した
。
氷上で30分間インキュベートした後、細胞をPermeabilization washで2回洗浄し、最終固定を行った。125nMのイリジウム-193（Fluidigm）と2nMの四酸化オスミウム（EMS）の細胞標識は、サンプルの固定と同時に行った
。
室温で30分間インキュベートした後、サンプルをCSBで2回洗浄し、FBS+10%DMSO中、-80℃で保存した
。
データ取得
／
処理
データ取得の前に、サンプルをCell Acquisition Solution（Fluidigm）で洗浄し、EQ Normalization beads（Fluidigm）の1:20希釈液を含むCell Acquisition Solutionに100万細胞/mlの濃度で再懸濁した。その後、ワイドボアサンプルインジェクターを装備したHelios Mass Cytometerで、イベントレート<400イベント/秒でサンプルを取得した。取得後、同じサンプルの繰り返し取得をFluidigmソフトウェアを用いて連結し、正規化した。FCSファイルは、Mt.SinaiのHuman Immune Monitoring Centerの内部パイプラインを使ってさらにクリーニングされた。パイプラインは、細胞サンプリングイベントレートが高すぎたり低す ぎたりする（平均値から2標準偏差）3秒以内の異常な取得時間ウィンドウを削除した。また、DNAシグナル強度が低いイベントとともに、各取得にスパイクされ、正規化に使用された正規化ビーズが除去された。また、パイプラインを使用して、洗浄およびプールされた FCS ファイルを単一サンプルファイルにデマルチプレクスしました。バッチで使用される可能性のあるすべてのバーコードに対する各細胞のPdバーコーディ ング・チャンネルの余弦類似度が計算され、最も類似度の高いバーコードに割り当てられました。細胞がサンプル・バーコードに割り当てられた後、最も高い類似度スコアと2番目に高い 類似度スコアの差が計算され、S/Nの指標として使用された。S/Nの低い細胞はマルチプレットとしてフラグが立てられ、そのサンプルか ら取り除かれた。最後に、Heliosマスサイトメーターによって取得されたガウスパラメーターResidualとOffsetに基づいて、取得マルチプレットを除去した
。
TA
解析
サンプルはRのPremessaパッケージを用いて正規化し、デバーコードした。細胞集団はFCS Expressを用いて手動でゲーティングした（https://www.standardbio.com/products/software/fcs-express、ゲーティング戦略、図S6A）。細胞頻度はCD45+細胞の割合として計算され、一重項細胞の割合として定量された。全B細胞、T細胞、未成熟B細胞、成熟B細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、樹状突起細胞、マクロファージ、単球など、主要な細胞タイプの相対量を算出した
。
インクプロテオミクス解析
B
下大静脈からの血液採取は上記のように行った。遠心分離した血液からラムを分離した。インクデータは血清サンプルをOlink Proteomicsに提出し、92検体のOlink Target 96 Mouse Exploratoryパネルアッセイを用いて解析した（表S2）。92個のタンパク質のうち、69個が75％以上のサンプルで検出され、解析に使用された。taは正規化タンパク質発現値（NPX、Olink Proteomicsのlog2スケールでの任意単位）として表示されている。Olink欠損値については表S2を
参照
。
短鎖脂肪酸のタボロミクス解析
T
マウントサイナイのNeurometabolomics and Neuroinformatic Coreは、メタンを反応ガスとする化学イオン化（CI）源を備えたAgilent 5977B GC/MSDガスクロマトグラフィー質量分析システムを用いて全脂肪酸分析を行った。まず、40μlの血漿を40μlのHCl 5Nで酸性化した300μlの氷冷水に溶解し、さらに300ulのジエチルエーテルで抽出した。この後、抽出したジエチルエーテル溶液に25μlの1％ペンタフルオロベンジルブロミド（PFBBr）と25μlの1％ジイソプロピルエチルアミンを加え、室温で30分間暴露してSCFA-PFB誘導体を生成した。最後に、1μlのサンプルをGC/MSに注入し、サンプルの内部サロゲートとしてd7-イソ酪酸を採用した内部標準検量線を用いて濃度を推定した
。
分析と統計
解析
すべてのN（常に動物数）、df、T/F、p値の正確な値は、本文／凡例のスペースの都合上、統計の詳細を含む表S3に報告されている。図中の凡例は、関連する場合はいつでもp値を報告している
。
筋電図／電気生理学的／カルシウムイメージングデータを除いたta解析は、SPSS（v.21.0、IBM Predictive Software）、Ethovision XT 11.5（Noldus）、GraphPad Prism 7（GraphPad）、Matlab（v.17b、MathWorks）を用いて行った。 b．実験前、異なる実験条件に割り当てられた動物群は、ナイーブな同胞で形成されたため、無作為化または他の先験的基準はグループ割り当てに採用されなかった。実験操作は、適宜、被験者内反復測定計画に従って解析した。実験条件の導出は、被験者間でランダムに割り当てられた。サンプルサイズは、同様のイントラビタルイメージング、電気生理学的、行動学的、神経細胞アブレーションアプローチを用いた過去の研究に基づいて選択した。本研究で採用したサンプルサイズは、最小限の倫理的動物使用を実施するInstitutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインを遵守しつつ、確実な効果量を検出するのに十分なものであった。実験者は実験条件について盲検化されていない。手術後に苦痛／感染／出血／食欲不振の徴候を示した動物は除外した。実験に使用されたすべての動物からのtaは、最終的な分析およびプロットに含まれた
。
行動データ
解析を
使用する
細胞タイプ標的病変、または化学遺伝学的実験の結果を含むすべての行動学的研究において、解析は標準線形モデル（ピアソン相関）、および多重比較を補正するための一元または二元（反復測定）ANOVA、および関連する場合はポストホックt検定検定を使用した。データは平均値±SEMで報告した。すべての場合、サンプルサイズ（N）は使用した動物の数を示す。t 検定のp値は両側検定に対応し、すべての事後検定はBonferroni補正を用いて多重比較を補正した。非正規性に関連した偽結果の可能性を評価し、すべての有意な効果は適切なノンパラメトリック検定を用いて検定を再実行することで確認した。l データは個別にプロットし（Prism 7、GraphPad）、対応する精度測定の棒グラフ（平均±SEM）を図に重ねた。すべてのN、df、T/F、p値の正確な値は、統計の詳細を含む表S3に報告されている。対応する統計量が厳密に0.05未満のp値（適切な場合はボンフェローニ補正）と関連するときはいつでも、影響は統計的に有意であるとみなされた
。
カルシウムイメージングデータ
解析
カルシウムイメージングデータの時空間強調のための自己教師付きディープラーニング法であるNoise2Voidを用いて、カルシウム過渡現象の生データをまずノイズ除去した
。
Noise2NoiseベースのDeepCADのように
ise2Voidはペア画像を必要としない。具体的には、スタック全体の最初の2000フレームを(32, 64, 64)フォーマットのパッチに転送し、その70%をトレーニングに、30%をテストに使用した。学習エポック数は約150-200回で、最適なモデルを得ることができた。学習レートは0.0004から開始し、10エポック以内に機能喪失値が減少しない場合は、学習レートを0.5×現在のレートとした。次に、スタック全体が最適モデルを用いてノイズ除去されたデータセットに転送された。データはNoRMCorre.
動き補正された。
次に、タイムラプス画像の最大強度投影を生成し、ディープラーニングベースのセグメンテーション手法であるCellpose、またはMask R-CNN plus PointRendを利用した
個々の腺をセグメンテーションした。個々の腺の関心領域（ROI）に対応する出力ファイルは、ImageJ ROIファイルとして保存された。動き補正された画像データとセグメンテーションROIファイルから、CaImAnソフトウェアパッケージの戦略に従って、各個々の腺のROI GCaMPシグナル（ROI-SignalMean）と周囲の背景（Background-SignalMean）の平均値を算出した
。
各腺のカルシウム信号は、ROI-SignalMean-Background-SignalMeanとして定義された。次に、各腺に関連する生データを、ガウスフィルターを用いてノイズ除去した。次に、各腺について、何の刺激もない6分間のベースライン期間から得られた平均値と標準偏差を用いて、カルシウム信号のzスコアを計算した。データ解析に使用したPythonベースのパッケージには、NumPy（バージョン1.22.0）、SciPy（バージョン1.7.1）、Pandas（バージョン1.4.1）、Matplotlib（バージョン3.4.3）、Seaborn（バージョン0.11.2）が含まれる
。
電気生理学的データ
解析
電気生理学的データは TDT データ保存構造に保存した。データの並べ替えはofflinesorter（Plexon）を用いて手動で行った。データは Python にインポートし、自作のソフトウェアを用いて解析した。解析のためのコードはリクエストに応じて提供する。DMV記録では、単一ユニットの発火率を5秒ビンに離散化した。リングレートをZ変換し、実験的注入に反応した全記録ユニットの変換レートの主成分を計算した。CCK反応時間（最大zスコア値の50％）を計算するために、単一ユニットとBGカルシウム信号の両方のデータのCCK注入時間を0とした。zスコア値が閾値より大きい時間間隔を出力した。K非応答ニューロンとBGは解析から除外した。CeMの記録では、単一ユニットの発火率を5秒のビンに離散化した。リングレートをZ変換し、実験注入に対する全記録ユニットの変換レートの主成分を計算した。 S ngleユニットの発火頻度（発火イベント/秒）は、ベースライン15分と、ストレスなし、急性ストレス、慢性ストレスを含む実験条件における15分について計算した。15分間の実験条件の平均発火頻度を15分間のベースライン条件の平均発火頻度に正規化することにより、fold changeのg2値を算出した。DMVオプティカル・タギング・データのChAT+ニューロンは、刺激関連スパイク潜時試験（SALT）を用いて検証した
。
,
S
ngle核シークエンシングデータ解析
T
Cell Ranger（v.7.1.0）処理で得られたユニーク分子識別子（UMI）カウントマトリックスを、SoupX（v.1.6.1）パッケージ
を用いてセルフリー mRNA のコンタミネーションを除去した。
R プログラミング環境。フィルタリングされたマトリックスは、Scanpy（v. 1.9.1）パッケージで解析された
。
パッケージ78 を用いて解析した。下流の解析では、以下の基準に基づいて低質細胞を除去した。ミトコンドリア遺伝子の割合が相対的に高い細胞を除去した。i）遺伝子が120個未満の細胞を除去した。ii）Scrubletパッケージを用いて推定したダブレットスコアが0.4より高い細胞を除去した。また、下流での比較のため、10,000リード/セルで正規化した。上位3,000の可変遺伝子をあらかじめ選択し、PCAによる次元削減に用いた。次に、共有最近傍グラフを構築して細胞クラスターを検出した。検出された細胞クラスターは、PAGA combined UMAP アルゴリズムにより可視化された。クラスターを固定した後、ウィルコクソン順位検定を用いてマーカー遺伝子を同定した。Scanpyとmatplotlibパッケージを用いてdotplotと umapのネルを作成した。細胞オントロジーのクラスはPanglaoDB(https://panglaodb.se/index.html)
を用いて
アノテーションした。
謝辞
od Allergy Science Initiative Consortium（I.E.d.A.へ）、NIH-NCCIH R01 AT011697-01（I.E.d.A.へ）、Modern Diet and Physiology Research Center（I.E.d.A.へ）。大腸菌EcAZ-2株を提供してくれたAmir Zarrinpar博士に感謝する。CyTOFおよびOlinkサンプルの処理にご協力いただいたMount Sinai Human Immune Monitoring CenterのGeoffrey KellyおよびKai Nieに感謝する。また、Mount Sinai Microscopy CoREのNikos Tzavaras博士、Shilpa Kumar博士、Glenn Doherty博士には、カルシウム過渡現象の眼内イメージングを手伝っていただき、Mount Sinai Neurometabolomics and Neuroinformatics CoreのManuel Gonzalez-Rodrigues博士には、短鎖脂肪酸の処理と解析を手伝っていただいた
。
貢献
I
H.C.とW.H.はすべてのマウス実験の計画、実施、解釈、解析を行った。Q.は16S配列決定を行い、解析した。C.とW.H.はイントラビタルイメージングを実施した。 M H.P.は電気生理学的システムを導入した。S.N.は行動評価を行った。H.N.とS.S.がヒト組織解析を実施した。 T Z.はヒト患者データの取得と解析を行った。 R L.はマイクロバイオーム解析を監修した。 I.E.d.A. E.d.A.、W.H.、H.C.は原稿を執筆した。I
.E.d.A.、W.H.、H.C.
が原稿を
執筆
。
利害
関係の明確化
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
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