食事性β-グルカンによる微生物叢の調節が脂肪性肝疾患の進行を予防する

2024年1月3日 21:13

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研究論文|プレスリリース, 100987
食事性β-グルカンによる微生物叢の調節が脂肪性肝疾患の進行を予防する

https://www.jhep-reports.eu/article/S2589-5559(23)00318-X/fulltext?dgcid=raven_jbs_aip_email

ユリウス・W・イェーガー
アネット・ブラント
桂文芳
イナ・ベルクハイム
クリスチャン・トラウトヴァイン
カイ・マルクス・シュナイダー #
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脚注を表示オープンアクセス掲載:2024年01月02日DOI:https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100987

ハイライト

オート麦β-グルカンはMASLDにおいて強い肝保護効果を示し、特に線維化の進行に対して有効である。

オート麦βグルカンのサプリメントは、単球由来マクロファージの浸潤とPRR駆動性の自然免疫反応を抑制する。

オート麦β-グルカンは、TLR4リガンドのトランスロケーションを減少させるために、保護細菌分類群を促進することによって、腸内細菌叢組成を再構築する。

胆汁酸組成はβグルカンの補給によってほとんど影響を受けない。
概要
背景と目的
代謝機能障害に伴う脂肪性肝疾患（MASLD）に関連する腸内細菌叢の変化は、線維化に向かう疾患進行の重要な促進因子である。したがって、微生物叢の変化を逆転させれば、MASLDの進行を改善できる可能性がある。難消化性多糖類であるオート麦β-グルカンは、MASLDに伴う高脂血症に対して有望な治療効果を示しているが、腸内細菌叢、そして最も重要なMASLDの線維化に及ぼす影響については未知のままである。
研究方法
我々は、西洋風食事（WSD）誘発MASLDモデルにおいて、体組成、耐糖能、脂質代謝を含む詳細な代謝表現型分類を行い、腸-肝臓軸の包括的な特徴付けを行い、初期および進行した肝疾患に対するβ-グルカン介入の効果を評価した。腸内細菌叢は広域抗生物質（Abx）治療により調整した。
結果
オート麦βグルカンの補給はWSD誘発の体重増加、耐糖能異常には影響を与えず、代謝表現型はほとんど影響を受けなかった。
興味深いことに、オート麦βグルカンはMASLDの炎症を抑制し、単球由来マクロファージ（MoMF）の浸潤、線維化炎症性遺伝子の発現を有意に減少させ、線維化の進展を強く抑制した。メカニズム的には、この保護効果は胆汁酸組成の変化やシグナル伝達によってではなく、腸内細菌叢に依存しており、Abx治療によって失われた。
具体的には、オート麦βグルカンは腸内細菌叢の好ましくない変化を部分的に逆転させ、その結果、ルミノコッカスや乳酸桿菌を含む保護的分類群が拡大し、TLRリガンドのトランスロケーションが減少した。
結論
我々の研究結果は、オート麦β-グルカンが、食事誘発性MASLDにおける炎症と線維症の発症を抑制する非常に有効な食品サプリメントであることを明らかにした。これらの結果は、その良好な食事プロフィールに加えて、MASLDの進行を予防するための費用対効果が高く、忍容性の高いアプローチである可能性を示唆しており、臨床試験で評価されるべきである。
影響と意義
我々は、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患（MASLD）モデルマウスにおいて、オート麦β-グルカンが腸-肝臓軸と線維化進展に及ぼす影響を検討した。β-グルカンは肝臓の炎症と線維化を有意に抑制し、これは腸内細菌叢の良好なシフトと関連しており、細菌の移動と線維化炎症経路の活性化を防いでいた。これらのことから、オート麦βグルカンは、MASLDの進行を予防する上で、費用対効果が高く、忍容性の高いアプローチである可能性があり、臨床試験で評価されるべきである。
図解抄録
図サムネイル ga1
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キーワード
MASLD
β-グルカン
微生物叢
線維症
腸-肝臓軸
プレバイオティクス
略語のリスト
Abx（広域スペクトル抗生物質）、ALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、AP（アルカリホスファターゼ）、AST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、AUC（曲線下面積）、CTRL（コントロール）、GLDH（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、 H&E (Hematoxylin and Eosin)、IP-GTT (Intraperitoneal glucose tolerance test)、LefSe (Linear discriminant analysis Effect Size)、LPS (Lipopolysaccharides)、MoMFs (Monocyte-derived macrophage)、 MASLD（Non-alcoholic fatty liver disease）、MASH（Metabolic dysfunction-associated steatohepatitis）、OD（Optical density）、PAMPs（Pathogen-associated molecular pattern molecules）、PCoA（Principal Coordinate Analysis）、PRR（Pathogen Recognition receptors）、SCFA（Short-chain fatty acids）、SR（Sirius Red）、TLR（Toll-like receptor）、WSD（Western Standard diet）、μCT（Microcomputed tomography）。
はじめに
代謝機能障害に伴う脂肪性肝疾患（MASLD）は、世界的に最も罹患率の高い肝疾患となっており、その有病率は着実に増加している。
肝疾患の発症と進行に腸内細菌叢が重要な役割を果たしていることを示唆する新たなエビデンスが得られている3。マイクロバイオームには膨大な酵素レパートリーがあり、胆汁酸代謝4や短鎖脂肪酸（SCFA）の産生など、腸と肝臓における幅広い代謝過程を促進している。腸内細菌叢は腸管バリア機能も制御しており、MASLD患者の腸内細菌叢異常は腸管バリア機能障害と関連している。MASLD患者では、腸内細菌叢を改善することで、線維化と炎症の進行を抑制できる可能性がある。
β-グルカンは、菌類、酵母、穀類に含まれる難消化性の多糖類である。オート麦のβグルカンは腸内細菌叢によって発酵され、SCFAを産生し、腸内細菌叢の構成に影響を与え、プレバイオティクスとして作用する。βグルカンは、胆汁酸の腸内再吸収を阻害し、胆汁酸合成を増加させることで、胆汁酸組成と腸-肝臓軸内のシグナル伝達を変化させることが示されている8,9。これまでの研究では、メタボリックシンドロームの他の構成要素におけるβグルカンの治療可能性、コレステロール低下作用、肝性脂肪症への影響について検討されてきた10。
これまでのところ、後期MASLDに対するオート麦βグルカンの効果、特に肝線維化進展に対する効果に関する研究はない。そこで本研究では、代謝の変化や肝内脂質の蓄積を超えて、MASLDの発症に対するオート麦βグルカンの潜在的な保護効果を調べることを目的とした。さらに本研究では、β-グルカンが腸内細菌叢、胆汁酸組成、プレバイオティクスとしての役割に及ぼす影響についても検討した。
方法
マウスモデル
すべての実験は、ドイツの適切な当局（LANUV、NorthRhine-Westphalia、AZ-84-02.04.2017.A327）の承認を受け、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）発行の「Guide for the Care and Useof Laboratory Animals」（刊行物86-23、1985年改訂版）に概説された基準に従って実施した。雄のC57BL/6Jのみを使用した。すべての動物はSPF条件下、12時間明期／12時間暗期、20-24℃の恒温下で飼育された。肝脂肪症は、Western Standard食（WSD）またはChow食をそれぞれ8週間または24週間マウスに与えることで誘発した。WSDはBrogaarden Research社から入手した（D16022301, Rodent Diet with 40 kcal% Fat (Mostly Non Trans Fat Primex), 20 kcal% Fructose and 2% Cholesterol）。動物実験はすべて2回行った。組織および血液サンプルの採取、血清パラメーターの測定は、既報の通り行った11。
βグルカン経口投与
βグルカン（Soluble Oat Fibre 70% Oat-beta-glucan Gluten Free, Garuda, Exeter, USA）を、1日の水分摂取量を4mlとして、体重1kgあたり1gの濃度で飲料水から投与した。
広域抗生物質投与（Abx）
マウスを4種類の広域抗生物質（1 g/l アンピシリン（Ratiopharm, Ulm, Germany）、160 mg/l ゲンタマイシン（Panpharma GmbH, Trittau, Germany）、1 g/l メトロニダゾール（B. Braun, Melsungen, Germany）、1 g/l バンコマイシン（Dr. Eberth, Urensohn, Germany））で処理した。
腹腔内ブドウ糖負荷試験（IP-GTT）
犠牲となる1週間前にマウスを6時間絶食させ、体重1gあたり2mgのグルコース（Glucose 40% B.Braun、Melsungen、Germany）を腹腔内注射した。血糖は、血糖測定器（ACCU-Check Advantage Glucose monitoring Test system, Roche Diabetes Care GmBH, Mannheim, Germany）を用いて、尾血から15分後、30分後、1時間後、2時間後に測定した。
生体内マイクロCTイメージング
高解像度μCT（U-CT、MILabs B.V.、ユトレヒト、オランダ）を用いて、動物全体をカバーする2つのサブスキャンによる全身μCTスキャンを取得した。ステップアンドシュートモードでフル回転させ、X線管電圧55kV、出力0.17mA、露光時間75ms、低線量（≒0.1Gy/全身スキャン）で480投影（1944×1536ピクセル）を取得した。すべての3D μCT画像は、Feldkamp型アルゴリズム（フィルタードバックプロジェクション）を用いて、等方性ボクセルサイズ80μmで再構成された。脂肪含有組織については、インタラクティブなセグメンテーション操作（Imalytics Preclinical, Gremse-IT GmbH, Aachen, Germany;12）を用いて、μCTデータに基づいて3D臓器セグメンテーションを作成した。
トリグリセリド測定
肝内トリグリセリド濃度の分析は、Triglycerides Liquicolor kit (Human, Wiesbaden, Germany)を用いて、メーカーのプロトコールに従って行った。
H&E
ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色は、標準プロトコールに従って行った。次に、切片をMayer's Hematoxylin（Sigma, Steinheim, Germany）で1分間処理した。次に、エオシン（Sigma, Steinheim, Germany）溶液で対染色した。最後に、切り口を脱水し、Roti® Histokit（Carl Roth, Karlsruhe, Germany）を用いてカバースリップにマウントした13。
Oil-Red-O染色
凍結保存した肝組織切片を7μmの厚さに切り出した。切片はPFAで固定した。続いて、切片をOil-Red-O染色液（60％イソプロパノール中36％Oil-Red-O（Sigma, Steinheim, Germany））で1時間インキュベートし、洗浄した。細胞核の対比染色のために、切片をMayers Hematoxylin（Sigma, Steinheim, Germany）で処理した。
免疫組織化学（IHC）染色
肝組織をパラフィンで固定し、厚さ5μmに切断した。最初に切り口を脱パラフィンし、クエン酸緩衝液（pH6.0）で再水和・加熱した。切片をH2O2溶液（メタノール中3％）で処理した。標本をウシ胎児血清、PBS、3％ウシ血清アルブミンの1：1溶液で20分間ブロックし、一次抗体（CD 45, BD biosciences, Franklin Lakes, US）と一晩インキュベートした。翌日、スライドをPBSで洗浄した後、ImmPRESS Polymer Kit（Vector Labratories, San Francisco, USA）を用いて二次抗体で2時間処理した。最後に、3,3′-ジアミノベンジジン溶液（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）を用いて、顕微鏡下で2-5分間標的シグナルを可視化した。
シリウスレッド（SR）染色
組織切片を脱パラフィンし、再水和した。次に、組織切片を0.1％シリウスレッド（Direct Red 80, Sigma Aldrich, Munich, Germany）溶液（200mlのピクリン酸に2gのシリウスレッドF 3B）中で45分間、続いて0.5％氷酢酸中で2×15秒間インキュベートした。最後に、切片を脱水し、Roti® Histokitを用いてカバースリップでマウントした。コラーゲン沈着は面積率分析（ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD）によって定量化した。
肝内白血球のフローサイトメトリー解析
同量の肝組織をコラゲナーゼIV型（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）で2時間消化し、肝内白血球を既報のように複数回の示差遠心分離工程を経て単離した14。免疫細胞抽出物を、CD11b（BV421; eBioscience, Frankfurt, Germany; 12-0112-82）、CD45（APC-Cy7; BD Biosciences, Erlangen, Germany; 557659）、F4/80（PE-Cy7; eBioscience, Frankfurt, Germany; 25-4801-82）、Ly6G（AlexaFlour 700; Biolegend, San Diego, USA； 127622）、またはCD3（APC; eBioscience, Frankfurt, Germany; 17-0031-82）、CD4（BV421; eBioscience, Frankfurt, Germany; 48-0041-82）、CD8（FITC; eBioscience, Frankfurt, Germany; 11-0081-85）、CD19（Alexa Flour 700; BD Biosciences, Erlangen, Germany; 551001）、CD45（APC-Cy7; BD Biosciences, Erlangen, Germany; 557659）に対するリンパ球パネル。絶対細胞数は、内部参照として一定数のCalibrite APCビーズ（BD Biosciences, Erlangen, Germany）を加えて測定した。解析はFACS LSR Fortessa（BD Biosciences, Erlangen, Germany）を用いて行い、取得したデータはFlowJoソフトウェア（TreeStar, Ashland, OR）で解析した。
定量的リアルタイムPCR
RNAは、Trizol試薬（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて、メーカーのプロトコールに従って肝臓組織標本から単離した。RNA濃度はNanoDrop ND-1000 UV-Vis（Thermo Scientific, Waltham, USA）で測定し、逆転写はOmniscript RT kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてメーカーのプロトコールに従って行った。Real-Time PCR System 7300 (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)を用い、製造元の推奨に従い、Fast SYBR GreenER Master Mix (Thermo Fisher, Waltham, USA)を用いてリアルタイムPCR反応を行った。GAPDH（5'-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3'、3'-CCCACTTGATTTTGGAGGGA-5'）には以下のプライマー配列を用いた、 CCl2（5'-AGCTGTAGTTTTTGTCACCAAGC-3'、3'-TTCCTTCTTGGGTCAGCAC-5'）、CCl5（5'-GCTGCTTTGCCTACCTCTCC-3'、3'-TCGAGTGACAAACACGACTGC-5'）、 Col1（5'-GCTACTACCGGGCCGATGATGC-3'、3'-CCTTCGGGCTGCGGATGTTC-5'）、aSMA（5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3'、3'-TATAGGTGGTTTCGTGGATGC-5'）、 tlr4（5'-ttcagaacttcagtggctggatt-3'、3'-ccatgccttgtcttcaa ttgttt-5'）、tlr9（5'-aatccctcatatccctgtccc-3'、3'-gttgccgtccatgaataggaag-5'）。解析には QuantStudio Flex ソフトウェア（ThermoFisher Scientific, Waltham, USA）を用いた。標的遺伝子のmRNAの発現は、GAPDHの発現に対する相対値として、2-ΔΔCT法を用いて算出した。
免疫ブロッティング
タンパク質は、NP40-Lysis buffer中で、標準プロトコールに従って肝臓組織から単離した。11 濃度は、Bradford assay（Bio-Rad, Hercules, USA）を用いて測定し、2μg /μlを標準とした。その後、Laemmli緩衝液を加え、タンパク質サンプルを96℃で10分間変性させた。タンパク質サンプルは、ドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファーに浸し、140 mVで、プレキャスト4%-12%ポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad, Hercules, USA）上で電気泳動により分離した。次に、分離したタンパク質をTrans-Blot Turbo Transfer System（Trans-Blot Turbo Transfer Pack 0.2 μm Nitrocellulose, Bio-Rad, Hercules, USA）を用いてニトロセルロース膜に移した。ポンソーレッド（Sigma, Steinheim, Germany）で染色し、タンパク質の転写が成功したことを確認した。続いて、非特異的結合部位をブロックするために、Tris-buffered saline tween (TBST)に溶かした5%脱脂乾燥乳でサンプルをインキュベートし、TBSTで希釈した一次抗体（Col1A1, 91144, Cell signaling, Danvers, USA; GAPDH, MCA4739, Bio-Rad, Hercules, USA）で4℃で一晩処理した。翌日、メンブレンをTBSTで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（抗ウサギ）と室温で1時間インキュベートした。その後、メンブレンを洗浄し、ECL基質（Pierce, Waltham, USA）でインキュベートした。メンブレンはLAS mini 4000（富士フイルム、東京、日本）で現像した11。
HEK-Blue™ mTLR4細胞
TLR4リガンドは、HEK-Blue™ mTLR4 Cell assay（Invivogen, San Diego, USA）を用いて、メーカーのプロトコールに従って測定した。次に、細胞を血清サンプルでチャレンジし、分泌された胚性アルカリホスファターゼによる細胞培養液の色の変化を655 nmで測定することにより、TLR4活性を決定した15。
DNA単離と16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定
糞便DNAの単離と16S rRNAの塩基配列決定は、Trizolプロトコル（Trizol, Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany）を用いて、前述16と同様に行った。シーケンスライブラリーは、16S rRNA遺伝子のV4領域をターゲットとして調製した。マスターミックスはPrimeSTAR® HS DNA Polymerase kit (TaKaRa, Beijing, China)を用い、1回目と2回目のPCRは25μl、3回目のPCRは50μlの総容量で、2μlのDNAテンプレート、0.2μM Primer、0.5U Taq primer star HS DNA (TaKaRa, China)を含むように調製した。PCR条件は、95℃で3分間の初期変性に続き、プロトコールに従って1回目と2回目のPCRを10サイクル、3回目のPCRを20サイクル行った： 98℃変性10秒、55℃アニーリング10秒、72℃伸長45秒、最終伸長72℃2分。SequalPrep Normalization Kit（Invitrogen Inc. メタバーコード解析のバイオインフォマティクス部分はQiime2を用いて行った17。Sabre（GitHub - najoshi/sabre, 2023-04-29）を用いてデマルチプレックスを行い、q2-cutadaptによってプライマーを除去した19。分類はRESCRIPt21とVSEARCHベースのコンセンサス22、およびSILVA (v.138.1, 16S 99%) 24データベースに対して事前にフィットしたsklearnベースの23分類器を用いて行った。すべてのオルガネラDNA配列は除去された。系統樹はq2-phylogenyプラグインで作成し、配列アライメントにはMAFFT 7.3、25とFastTree 2.1 26を実装した。β多様性は、Bray-Curtis距離27によって評価し、その後PCoA解析に使用した。
RNA単離とRNA配列決定
RNAはPureLink RNA Mini Kit（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて単離した。RNA濃度はRNA BR Assay Kit（Thermo Fisher, Waltham, USA）を用いてQubit 4 Fluorometerで測定し、RNAの完全性はRNA 6000 Nano Kit（Agilent Technologies）を用いて2100 Bioanalyzerで評価した。シーケンスライブラリーは、独自のデュアルインデックスを持つTruSeq Stranded mRNA Kit（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いて、メーカーのプロトコールに従って500 ngのRNAから作成した。最終ライブラリーの定量は、Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher, Waltham, USA）を用いて行い、DNA 1000 Kit（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いてAgilent 2100 Bioanalyzerでライブラリーサイズを確認した。その後、ライブラリーを正規化し、プールし、1.0 pMに希釈し、500/550 High Output Kit v2.5（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いてIllumina NextSeq 550でペアエンドシーケンス（2x75 bp）を行った。
疑似アライメントはSalmon v1.10.1 31を用いて行い、転写産物レベルの存在量を効率的に定量することができた。得られたデータは、Tximeta v1.16.1 32を使用して整理され、メタデータが管理された。DESeq2 v1.38.3 33 負の二項分布モデルを利用して、サンプルグループ間で発現に差のある遺伝子を同定する遺伝子発現差解析を行った。主成分分析（PCA）の前に、DESeq2のvst()関数を用いて生のカウントデータを正規化した。機能濃縮解析は、org.Mm.eg.db35 v3.16.0のゲノムワイドアノテーションを組み込んだclusterProfiler v4.6.0 34で実施し、濃縮結果はenrichplotパッケージv1.18.3 36を用いて可視化した。さらに、ヒートマップはgplotsパッケージv3.1.3（Warnes G, 2022）を用いてデータの可視化のために作成し、データ操作と可視化はtidyverseパッケージv2.0.0を用いて行った38。すべての解析はRバージョン4.2.2で行った。
統計解析
すべてのデータは平均値±標準偏差で表した。データ解析はGraphPad Prism（San Diego, USA）ソフトウェアバージョン9を用いて行った。有意性の検定は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用い、その後にシダックの検定（Sidak's-test）を行い、多重比較のp値を調整した。正規分布でないデータの場合は、Kruskal-Wallis検定とDunnの検定を用いて有意性を検定した。データはP <0.05で群間で有意とみなされた。
結果
βグルカンは体組成に影響を与えることなく肝臓重量増加を予防する
MASLDの進行に対するβグルカンの潜在的な保護効果を調べるために、我々はC57BL/6マウスを、体重の増加と病的な脂肪組織分布をもたらすよく確立されたマウスモデルであるWestern-Style食（WSD）で処置した39, 40, 41。マウスは、通常の飲料水、または体重1kgあたり1gの濃度のオート麦βグルカンを添加した飲料水のいずれかを摂取した。24週後、WSDを与えたマウスはすべて対照群に比べ体重が有意に増加したが、βグルカンの介入は体重増加に影響を与えなかった（図1AおよびB）。先に示したように、WSD投与は肝臓のリモデリングと線維化の亢進を示す肝体重比を上昇させた42。重要なことに、この影響はβグルカン投与マウスでは部分的に逆転し、肝リモデリングに対する保護効果を示唆した（図1C）。
図のサムネイルgr1
図1代謝表現型はβグルカン投与によって影響を受けない。(A）投与終了時の総体重。(B）24週間の実験を通しての体重増加。(C）実験終了時の肝臓-体重比。(D）μCTスキャンの代表的な断面像。(E-G）体脂肪全体、皮下脂肪および内臓脂肪コンパートメントのμCT分析。データは平均±SDで表した。各点は1匹のマウスを表す。統計的有意性はすべて一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）で評価した。p < 0.05 ()， p < 0.01 ()， p < 0.001 ()， p < 0.0001 () で有意とした。
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脂肪組織の分布を評価するため、犠牲にする1週間前にコンピュータ断層撮影を行った。予想通り、WSD後、マウスは体脂肪全体、皮下脂肪、内臓脂肪の増加を示した。しかし、これらの脂肪区画はいずれもβ-グルカンの補充によって有意な影響を受けなかった（図1 D-G、補足図1）。
βグルカンは脂質代謝と耐糖能に影響しない
βグルカンの補給が脂質代謝に影響を及ぼすかどうかを調べるために、まず血清総コレステロール値を測定した。予想通り、WSD投与はコレステロール値を有意に上昇させたが、βグルカン投与によってコレステロール値は低下しなかった（図2A）。肝内脂質の蓄積を調べるため、オイルレッドO染色を行い、比色トリグリセリド測定法を用いて肝組織中の肝トリグリセリド量を定量した。WSDは、Oil red O染色で明らかになったマクロステアトーシスとミクロステアトーシスの顕著な増加と関連していたが、βグルカン投与群では脂肪空胞の形態に違いはなかった（図2B）。さらに、肝組織中のトリグリセリド濃度はWSD後に有意に増加したが、βグルカン介入後には変化はなかった（図2 C-D）。
図のサムネイルgr2
図2高コレステロール血症、肝脂肪症、耐糖能はβグルカンとは無関係である。(A）投与終了時の血清コレステロール値。(B）オイルレッドO染色の代表写真。(C）オイルレッドO染色の面積率（Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定）。(D）肝臓組織中のトリグリセリド濃度。(E）犠牲の1週間前にブドウ糖を腹腔内に注射した後の血糖値。(F）IP-GTTの曲線下面積。(G）ブドウ糖注射後2時間の血糖値。各ドットは1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性はすべて一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定で評価した。p < 0.05 ()， p < 0.01 ()， p < 0.001 ()， p < 0.0001 () で有意とした。
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さらに、メタボリックシンドロームのもう一つの臨床的特徴である耐糖能に対するβグルカンの潜在的影響を調べるために、腹腔内糖負荷試験（IP-GTT）を行った。以前に示されたように43、WSDの摂食は耐糖能異常を引き起こし、これは糖負荷試験における曲線下面積（AUC）の有意な増加によって反映された（図2 E-G）。重要なことは、対照群とWSD群ではβグルカン摂取による顕著な効果は認められなかったことである。さらに、βグルカンが分子代謝シグナル伝達に及ぼす潜在的影響を評価するために、肝臓における重要な代謝経路を分析した。これまでの知見と同様に、WSDではPpara、Cd36、Srebp、ChrebpのmRNA発現が有意に増加した。しかし、これらの経路に対するβグルカン処理の有意な効果は検出できなかった（補足図2 A-E）。
これらのデータを総合すると、体脂肪分布、肝脂肪蓄積、血清脂質、耐糖能などの代謝表現型は、β-グルカン介入によってほとんど影響を受けなかったこと、そして観察された肝体重比の違いは、β-グルカン補充による肝線維化リモデリングの変化によるものではない可能性があることが示された。
βグルカンの介入はMASLDにおける肝障害を改善する
MASLDの発症に対するβグルカンの潜在的な保護効果を調べるために、次に8週と24週の2つの独立した時点で血清肝障害マーカーを評価した。わずか8週間の投与で、肝酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDLH）、アルカリホスファターゼ（AP）の血清レベルは全群で変化しなかった（補足図3 A-D）。
先に示したように、WSD投与では24週後にALT、AST、GLDHのレベルが有意に上昇した。この時点で、βグルカンの介入は、AST、ALT、GLDHレベルの低下によって証明されるように、肝障害から保護した（図3 A、B、補足図3 E）。
図のサムネイルgr3
図3β-グルカンはMASLDにおける肝障害と肝炎を改善する。(A-B）終了時の血清トランスアミナーゼ。(C）トランスクリプトミクスのPCAプロット。(D）WSDとWSD＋β-グルカンで異なる発現を示した炎症性遺伝子のヒートマップ。(E)WSDマウスとWSD＋β-グルカンの炎症促進経路とコラーゲン異化経路の発現差の遺伝子セット濃縮。(F-G）H&EおよびCD45染色の代表写真。(H-K）MoMFとKupffer細胞の肝内存在量のFACS解析。(L-M）CCl2およびCCl5のmRNAレベルをコントロールに対する誘導の倍数で表した。各ドットは1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性はすべて一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）によって評価した。p < 0.05 ()， p < 0.01 ()， p < 0.001 ()， p < 0.0001 () で有意とした。
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β-グルカンは肝白血球浸潤、特にMoMFの浸潤を減少させる
WSD誘発MASLDにおいて、βグルカンの補充がどのように肝障害を改善するかを調べるために、肝臓RNA配列解析を行った。主成分分析（PCA）を用いて、グローバルな遺伝子発現シグネチャーを比較したところ、WSDは主成分1に沿って、全群のトランスクリプトーム・プロファイルにシフトをもたらしたことが観察された（図3C）。興味深いことに、WSD＋β-グルカン群は、WSD群と普通食のコントロール群の間に位置する、明確なクラスタリングパターンを示した。次に、特にWSD群とWSD＋βグルカン群の比較に注目した。Ccl2やCcr2のような白血球のリクルートに関連する炎症性遺伝子は、βグルカン処理後に有意にダウンレギュレートされた（図3D）。
βグルカン補給によるトランスクリプトームプログラムのグローバルな変化を偏りのない方法で探索するために、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を行った。興味深いことに、GSEAは炎症、白血球、特に骨髄系細胞の遊走、走化性、線維化に関与する経路の抑制を発見し（図3E）、おそらくβグルカン補給後の骨髄系細胞浸潤の減少に寄与している。RNA-seq解析の結果を検証するために、ヘマトキシリン・エオジン染色した肝臓切片と汎白血球マーカーCD45に対する免疫組織化学的検査を用いて、免疫細胞の浸潤を特徴付けた。肝内白血球浸潤はWSD後に有意に増加した。この表現型はβグルカンの介入によって改善された（図3 F-G）。特定の白血球亜集団を区別する目的で、フローサイトメトリーを用いて肝ミエロイドおよびリンパ球細胞集団を分析した（補足図4）。B細胞、T細胞、NK細胞を含むリンパ系細胞集団はほとんど変化しなかったが（補足図5）、骨髄系細胞集団は有意な変化を示した（図3 H-K）。WSD後、マウスは好中球、単球由来マクロファージ（MoMF）、クッパー細胞の増加を示した（図3 H-K）。重要なことは、β-グルカン処理後、MoMFとクッパー細胞が有意に減少したことである（図3 J-K）。MoMFは、Ccl2およびCcl5依存的にリクルートされるMASHの必須ドライバーとして同定されている44。これと同様に、βグルカンの補充は、WSD投与動物においてCcl2およびCcl5の発現レベルを有意に減少させた（図3 D、L-M、補足図6）。
βグルカンは肝線維症の進行を抑制する
肝線維化はMASLDの臨床的に意味のあるエンドポイントである。そこで我々は、様々な直交アプローチを用いて肝線維化の進展を特徴付けた。まず、シリウスレッド染色を用いて線維化繊維の沈着を可視化し、肝内コラーゲンネットワークを定量化した（図4 A）。コラーゲン沈着はWSD後に顕著に増加したが、βグルカン投与はコラーゲン量を強く改善した（図4 A-B）。次に、肝組織におけるCol1のタンパク質発現をウェスタンブロット法で評価した。シリウスレッド染色と同様に、肝組織におけるCol1のタンパク質発現はβグルカン投与マウスで有意に減少した（図4 C-D）。同様に、aSma mRNA発現はWSD後に有意に増加し、βグルカン処理マウスでは強く減少した（図4 E）。さらに、RNAシークエンシングにより、プロフィブロティック遺伝子のより包括的な解析を行った。その結果、βグルカンを投与したマウスでは、肝線維化の進展に関与する様々な遺伝子がダウンレギュレートされていることが観察された（図4 F）。
図4βグルカン
図4βグルカンは肝線維化を抑制する。(A) シリウスレッド染色の代表画像。(B）偏光下でのSR染色面積（Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定）。(C-D) Col1のタンパク質およびmRNA発現。 (E) aSMA mRNAはコントロールに対する誘導の倍数で表した。(F)WSDとWSD+βグルカンで発現が異なるプロフィブロティック遺伝子のヒートマップ。各ドットは1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性は、特に断りのない限り、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）によって評価した。実験は、p < 0.05 ()，p < 0.01 ()，p < 0.001 ()，p < 0.0001 () で有意とみなされる。
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βグルカン投与は胆汁酸組成に影響しない
これまでの報告では、β-グルカンが胆汁酸代謝を変化させる可能性が示されている。9 胆汁酸を介してβ-グルカンが腸-肝臓軸に及ぼす潜在的影響を調べるために、まずHPLC-MS/MSを用いて異なるコンパートメント中の異なる胆汁酸種を測定した。WSDを摂取させたマウスでは、盲腸便、糞便、全身循環において総胆汁酸の有意な増加が見られたが、βグルカン投与後には顕著な差は見られなかった（補足図7）。介入群間に大きな差はなかった。さらに、肝臓と腸管組織におけるFxrの発現と、胆汁酸代謝の重要な酵素であるCyp7a1の発現を解析した。これらのデータと一致して、胆汁酸代謝に対するβグルカン投与の有意な効果は認められなかった（補足図8）。
β-グルカンはWSD後の腸内細菌異常を緩和する
胆汁酸組成はβグルカン処理によって変化しなかったので、我々はβグルカンの肝保護効果を媒介する他の分子機序について研究した。
これまでの研究で、β-グルカンは強力なプレバイオティクスとして同定されている7。我々は、β-グルカンの肝保護効果は、腸内細菌叢への影響を介して得られるのではないかと考えた。腸内細菌叢がこの効果を媒介する可能性を検討するため、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて腸内細菌叢組成を評価した。
Bray-Curtis非類似度に基づく順序解析の結果、各グループのクラスタリングが明らかになり、食事とβグルカン介入の両方がマイクロバイオーム組成に深く影響していることが示唆された（図5 A）。各群間の差異をもたらした主要な特徴を特定するため、線形判別分析の効果量（LefSe）分析を行った。この解析により、βグルカン投与群ではWSD群と比較して、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Lactobacillusに分類される特徴が増加していることが明らかになった（図5 B）。注目すべきは、前述したすべての特徴が、WSD群と比較して対照群でより多く発現していたことである（補足図9）。したがって、βグルカンの介入は、WSD後の腸内細菌叢の完全性を部分的に回復させるようであった（図5 C）。重要なことは、同定された分類群が短鎖脂肪酸（SCFA）の産生増加と関連していることである45。βグルカン投与がその後のSCFAの増加につながるかどうかを評価するため、便中の酪酸、プロピオン酸、酢酸レベルを測定した。WSDを投与したマウスでは、SCFAの総量だけでなく、酢酸とプロピオン酸の量も有意に減少していた（補足図6）。腸内細菌叢に対するβ-グルカンの効果と同様に、β-グルカンはSCFAsの総量および酢酸、プロピオン酸、酪酸の個々の量を増加させた。しかし、この効果は、SCFAsと酪酸の総量に関しては、対照食を摂取したコホートにおいてのみ有意であった（補足図10）。
図サムネイルgr5
図5β-グルカンは肝保護プレバイオティクス効果を示すが、微生物叢が減少すると失われる。(A）便サンプルの16S rRNA配列決定のBray-Curtis距離に基づく順序解析。(B)線形判別分析Effect Size(LEfSe)分析により、WSD群とWSD+β-グルカン群の間で有意に豊富な特徴を同定した。(C) 16S rRNA配列決定に基づく細菌分類群の相対的存在量。(D) HEK-Blue™ mTLR4 Cell assayで測定した血清中のTLR4リガンド。(E) TLR4 mRNAはコントロールに対する誘導の倍数で表した（Kruskal-Wallis検定に続くDunnの多重比較検定）。(F) TLR9 mRNAをコントロールに対する誘導の倍数として表した。(G）WSD対WSD＋β-グルカンの「外部刺激に対する反応」経路のヒートマップ。(H-I）広域スペクトル抗生物質で処理したマウスのALTおよびGLDH血清レベル。(J)偏光下のSR染色面積（Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定）。各点は1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性は、特に断りのない限り、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）によって評価した。p < 0.05 ()， p < 0.01 ()， p < 0.001 ()， p < 0.0001 (****) で有意とした。
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腸内細菌叢異常症はしばしば、病原体関連分子パターン分子（PAMPs）や代謝産物が門脈の静脈ドレナージを通じて肝臓に移行することと関連している。TLR4リガンドはWSD後に有意に増加した。重要なことは、βグルカンの介入を受けた群は、WSD群と比較してTLR4リガンドの量が有意に少なかったことである（図5 D）。
細菌の移行は病原体認識受容体（PRR）の活性化につながり、この受容体がMASLDの進行を促進することが示されている5。そこで、Tlr4とTlr9の肝発現を測定した。両者の発現はβグルカン介入後に著しく低下した。しかし、Tlr9の発現のみが有意レベルに達した（図5 D-F）。これらのデータと一致するように、トランスクリプトーム解析の結果、遺伝子セット濃縮解析では、「外部刺激に対する反応」というパスウェイが、発現低下パスウェイの上位に挙げられていた。注目すべきは、PAMP認識、抗原提示、自然免疫応答に関与する遺伝子のうち、WSDコホートと比較してβグルカンコホートでは炎症性遺伝子の有意なダウンレギュレーションが見られたことである（図5 G）。
βグルカンの介入は、WSDによって誘発された微生物叢組成の好ましくない変化を部分的に逆転させ、PAMPsのトランスロケーションとPRRの肝発現を減少させ、その結果、肝炎を改善した。
βグルカンの肝保護効果は微生物叢に依存する
観察された肝保護効果に腸内細菌叢が必要であるかどうかをさらに解明するために、我々は飲料水を介して広域抗生物質（Abx）で腸内細菌叢を枯渇させた。抗生物質投与とβ-グルカンと抗生物質経口投与の二重介入は、いずれも肝障害マーカーと線維症の有意な減少を示したが、二重介入は抗生物質のみの介入と比較して追加的な効果を示さなかった。興味深いことに、βグルカンを投与すると、GLDH値から明らかなように肝障害が有意に増加し、トランスアミナーゼと線維症も増加する傾向が見られた（図5 H-J）。
これらのデータを総合すると、βグルカンの肝保護効果は、腸内細菌叢の存在と、プレバイオティックな方法でその組成を形成するβグルカンの能力に大きく依存していることが示唆される。
考察
MASLDは世界で最も一般的な肝疾患であり、その有病率は増加の一途をたどっている。その疫学的関連性にもかかわらず、治療薬の種類が限られているため、MASLDの臨床管理は依然として困難である2。
これまでの研究で、オート麦βグルカンはメタボリックシンドロームの他の病態に対する強力な治療オプションであることが確認されている。高コレステロール血症46、耐糖能異常47、肝脂肪症48の場合、費用対効果が高く、忍容性の高い治療選択肢であることが証明されている。しかし、これまでの研究のほとんどは、真菌由来のβグルカンを用いたものであり、肝内脂肪症などの初期の病期を対象としたものであった49。オート麦βグルカンの潜在的な肝保護効果、特にMASHやMASLDにおける線維化などのMASLDの後期病期に対する効果に関する証拠は、まだ乏しい。そこで我々は、後期MASLDに対するオーツ麦βグルカンの役割について理解を深めるため、24週間マウスに投与した。
血清コレステロール値に対するβグルカンの効果を研究したRCTのメタアナリシスを行ったHoらは、LDL-コレステロール、非HDL-コレステロール、アポBに対するβグルカンの低下効果を観察した50。これは、我々の実験期間が長かったためかもしれない。過去に実施された研究の大半が最大13週間51であったのに対し、我々の研究はMASLDの進行段階を評価することを目的としており、そのため過去に発表された研究のほぼ2倍の期間にわたって実施された。従って、動物の代謝に対するβグルカンの有益な効果は、WSDへの慢性的な暴露によって上書きされる可能性がある。さらに、他のほとんどの研究では、β-グルカンはマウスが摂取する固形食の一部として含まれていたが、我々の研究では、飲料水を介してβ-グルカンを毎日摂取するようにした。固形食の一部としてβ-グルカンを摂取することで、食物繊維の摂取量が増加し、マウスに予備的な満腹感をもたらし、その結果カロリー摂取量が減少した可能性がある。この仮説は、Vitaglioneらによって発表された以前の研究によって支持されている。彼らは、β-グルカンを補充した食事を摂取したプロバンドにおいて、満腹感の増加と摂食量の減少を観察した52。β-グルカン投与後の病的耐糖能改善に関する既報の知見を再現することができなかったため、この効果は胃の通過に依存している可能性があると結論した。
MASLDの疾患進行に対するβグルカンの効果の基礎となる分子メカニズムを、特に腸-肝臓軸に焦点を当てて研究するために、腸内細菌叢の組成を分析した。注目すべきは、β-グルカン投与後にLachnospiraceae属、Ruminococcaceae属、Lactobacillus属の増加が観察されたことである。これらの細菌は短鎖脂肪酸（SCFA）を産生することが知られている54。微生物組成のこうした変化がSCFAレベルの増加にもつながるかどうかを評価するため、便中のSCFA濃度を分析した。注目すべきことに、βグルカンの介入を受けたマウスでは、総SCFAと酪酸のレベルが上昇していた。SCFAsは代謝経路を調節し、MASLDの発症と進行に対する抗炎症剤として働くことが示されている55。
以前の研究では、MASLDの役割における単一の微生物、特にルミノコッカス科の微生物の対照的な役割が示されている。Boursierらは、肝線維化の程度が高い患者において、Ruminococcaceae属の存在量が有意に増加していることを観察した56。これらの知見とは対照的に、Leeらは、LachnospiraceaeとRuminococcaceaeのサプリメントが、MASLDにおける肥満、炎症、腸内細菌異常症、肝線維化を予防することができると報告している57。これは、βグルカン治療後にこれらの科に属する成分の存在量が増加し、その結果MASLDの進行が改善するという我々の知見と一致している58。他の研究では、MASLDの促進因子としてルミノコッカス科が果たす役割の可能性がさらに疑問視されている59,60。これらの二律背反的な知見は、ルミノコッカス属のスペクトルが不均一であることで説明される56。この変化はβ-グルカン投与後に部分的に逆転したことから、ルミノコッカスが恒常的な腸内微生物組成の一翼を担っていることがさらに示された。
さらに、β-グルカンを投与したマウスでは、血清中のTLR4リガンドの存在量が減少し、肝臓のTLR発現が減少していることが観察された。これは、腸内恒常性の回復による細菌の移動の減少を示唆している。これまでの研究で、TLR4リガンドはクッパー細胞および肝星状細胞のリクルートを通じて、肝内線維化の必須ドライバーであることが同定されている61。このことは、MASLD進行のよく確立されたドライバーであるMoMFおよびクッパー細胞の有意な減少が観察されたことから、さらに裏付けられた44,62。TLR9の活性化は、自然免疫系、特にクッパー細胞の活性化の増加と、さらに肝内線維症の進展を媒介するIL-1βの下流産生の減少に関連している63。
したがって、β-グルカンは腸内微生物の組成を回復させ、WSDに関連した生物学的異常を回復させ、SCFAsやPAMPsのような微生物由来の産物を介して、腸-肝臓軸に多面的な効果を示すと結論づけた。観察された治療効果に腸内細菌叢が必要かどうかをさらに調べるため、マウスに広域抗生物質を経口投与し、観察された表現型のマイクロバイオーム依存性を評価した。興味深いことに、β-グルカンまたは抗生物質それぞれの単独投与による保護効果にもかかわらず、両投与の組み合わせでは相乗効果は得られず、代わりに肝障害がわずかに増加した。
本研究で得られたデータは、β-グルカンがMASLDを患う患者に対する有望な治療薬となりうることを示唆している。高コレステロール血症の治療薬としてのβグルカンの有効性に関するこれまでの研究で、ヒトにおけるβグルカンの忍容性と費用対効果はすでに実証されている。その結果、2010年に欧州食品安全機関（EFSA）の栄養製品・栄養・アレルギーに関するパネル（NDA）は、これらの重要な知見に関連するヘルスクレームの科学的立証について、以下のような科学的見解を発表した。血中コレステロールを低下させることは、（冠動脈）心臓病のリスクを低減させる可能性がある」とし、さらにこの効能を表示するためには、食品は少なくとも3gのオート麦β-グルカンを提供する必要があるとしている（EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies, 2010）。小規模のヒト試験でも、1日3gのオート麦β-グルカンを2回に分けて摂取すると、肝機能変化の徴候がある過体重者の血清中のALTとASTが有意に低下することが示されている65。
我々の研究は、単一のマウスモデルを用いたという点で限界があった。βグルカンの線維症特異的作用の可能性をさらに詳しく検討するためには、特定の肝線維症モデル（例えばCCL4）を用いたさらなる実験が有益であろう。Wangらは、DEN/CCl4モデルを用いて、肝細胞癌の発生に対するβグルカンの潜在的効果を調べたが、線維症の発生は評価しなかった。PAMPsのトランスロケーションとそれに続くシグナル伝達経路はβ-グルカンによって強く抑制されたが、我々のデータは、β-グルカンが炎症や線維化を抑制する他のメカニズム（例えばSCFAや他の代謝産物を介して）の寄与を否定することはできない。最後に、今回の知見をヒトに応用するためには、十分にコントロールされたランダム化比較試験が必要である。
要約すると、我々はオート麦βグルカンのMASLD、特に線維症発症に対するこれまで知られていなかった肝保護効果について述べ、その有効性のメカニズム的説明を行った。β-グルカンは腸内不和を部分的に逆転させ、循環TLR-アゴニストを低下させ、それに続いて肝臓における自然免疫反応を低下させた。この効果は腸内細菌叢に依存していた。
したがって、オート麦β-グルカンは、腸内細菌叢を再構築することによってMASLD線維症を予防する新規治療薬となりうることが明らかになった。
引用されていない文献
18, 64.
引用されていない文献
37, 37..
データ入手に関する声明
データは対応する著者の合理的な要求により入手可能である。シングルセルRNAシーケンスの生データはENAデータベース（プロジェクトID PRJEB61876）にアップロードされている。RNAシーケンスデータはGEOデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE246738）にアップロードされている。
財務情報
本研究は、ドイツ研究財団CRC1382、A08およびB09（Project-ID 403224013）、DFG Tr 285/10-2からC.T.、連邦教育研究省（ObiHep grant #01KU1214AからC .T.）、HDHL-INTIMIC Di-Mi-LivからC.T.、I.B. A.S.、K.M.S.およびH.U.M.、BMBF Knowledge Platform on Food, Diet, Intestinal Microbiomics and Human HealthからC.T.の助成を受けた、 K.M.S.は、連邦教育研究省（BMBF）およびドイツ・ノルトライン＝ヴェストファーレン州文化科学省（MKW）より、連邦政府および各州の卓越性戦略の下で資金援助を受けている。K.M.S.は、ドイツ・ノルトライン＝ヴェストファーレン州文化科学省（MKW）のNRW Rueckkehrプログラムの支援を受けている。K.M.S.とF.K.は、それぞれRWTHアーヘン大学医学部内のInterdisciplinary Centre for Clinical Research（IZKF）の助成金（OC1-9）と（PTD 1-11）を受けた。
CReditの貢献
Julius Werner Jaeger（構想：サポート；データキュレーション：リード；形式分析：執筆-原案：執筆-原案：リード；執筆-校閲・編集：リード：同等)
Annette Brandt (データキュレーション：サポート；正式分析：方法論：執筆 - レビューと編集：サポート）
Wenfang Gui (データキュレーション：サポート)
Timur Yergalieyev (形式分析：支持；調査：支持；方法論：ティムール・エルガリエフ (形式分析：サポート、調査：サポート、方法論：サポート)
Angélica Hernández-Arriaga（データキュレーション：支持、形式分析：支持、調査：支持、方法論：支持支援する；方法論：方法論：支持
Mukil Marutha Muthu（データキュレーション：支持；形式分析：支持、調査：支持、方法論：支持支援する：方法論：支持）
Ahmed Elashy (データキュレーション：サポート)
Karolina Edlund (データキュレーション：支援) 支持；形式的分析：支持；方法論：方法論：支持）
Antonio Molinaro (執筆 - 査読 & 編集: 助手)
Diana Möckel (データキュレーション：執筆 - 査読 & 編集：支持：サポート
ヤン・フィリップ・サルジェス (データキュレーション：サポート)
Jan Hengstler (概念化：支援; 形式分析：支援、プロジェクト管理：支援する：支援、監督：執筆-原案：支援する；執筆-校閲・編集：支援)
エメリア・ハリバシック（執筆-校閲・編集：支持）
ミヒャエル・トラウナー (構想策定：支援; 執筆-校閲・編集：支援)
フローリアン・カーレス (構想策定：サポート; 執筆-校閲・編集：サポート)
Ulrike Rolle-Kampczyk (データキュレーション：支援; 形式分析：サポート；調査：支援; 方法論：方法論：支持）
Carolin Victoria Schneider (執筆 - 査読 & 編集: 助手)
Twan Lammers (執筆 - 査読 & 編集: 助手)
Hanns-Ulrich Marschall (構想：資金獲得：リード；プロジェクト管理：支援：執筆 - 査読と編集：執筆-校閲・編集：支援)
アメリア・シルバ（構想策定：支援；資金獲得：リード；プロジェクト管理：支援：執筆 - 査読と編集：執筆-校閲・編集：支援)
マーティン・フォン・ベルゲン (執筆 - 査読 & 編集: 助手)
Ina Bergheim (構想策定：支援；資金獲得：リード；プロジェクト管理：支援：執筆 - 査読と編集：執筆-校閲・編集：支援)
Christian Trautwein MD（概念化：リード；データキュレーション：同等；形式的解析：同等、資金獲得：リード；方法論：プロジェクト管理：主導；監督：バリデーション：同等；執筆-原案：執筆-原案：支持)
Kai Markus Schneider, MD, PhD（概念化：リード；データキュレーション：同等、形式的解析：同等、資金獲得：リード；方法論：プロジェクト管理：主導；監督：バリデーション：同等；執筆-原案：執筆-原案：支持)
利益相反
著者の誰一人として、本研究に関連して申告すべき利益相反はない。詳細については、添付のICMJEディスクロージャーフォームを参照されたい。
謝辞
Sonja Strauch女史とBettina Jansen女史（ドイツ、アーヘンのRWTHアーヘン大学病院）の優れた技術支援に感謝する。また、チュービンゲン大学Zentrum für DatenverarbeitungのHigh Performance and Cloud Computing Group、バーデン＝ヴュルテンベルク州によるbwHPC、ドイツ研究財団（DFG）による助成金No. Inst 37/935-1Fugg.
付録A. 補足データ
以下は本論文の補足データである：
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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オート麦β-グルカンのLDL-コレステロール、非HDL-コレステロールおよびアポBに対するCVDリスク低減効果：無作為化対照試験のシステマティックレビューおよびメタアナリシス。
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クロス
グーグル奨学生
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オート麦β-グルカンのLDL-コレステロール、非HDL-コレステロールおよびアポBに対するCVDリスク低減効果：無作為化対照試験のシステマティックレビューおよびメタアナリシス。
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論文で見る
スコープス (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
三尾健司
山中千尋
松岡毅
他
高脂肪食誘発肥満モデル雄マウスの回腸、肝臓および脂肪組織におけるグルコースおよび脂質代謝に及ぼすβ-グルカンリッチ大麦粉の影響（DNAマイクロアレイによる解析）。
Nutrients. 2020; 12 (3546 12) (2020): 3546
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スコープス (23)
クロス
グーグル学者
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ルマーガ R.B.
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β-グルカン濃縮パンは、エネルギー摂取量を減少させ、短期的に血漿グレリンとペプチドYY濃度を変更します。
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日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ウォレバー T.M.S.
トッシュ S.M.
スプルイルS.E.
他
朝食におけるオート麦βグルカンの粘度増加は、胃排出を遅らせ、血糖およびインスリン反応を低下させるが、健康なヒトにおける食欲、食物摂取、血漿グレリンおよびPYY反応には影響を及ぼさない：無作為化プラセボ対照クロスオーバー試験。
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スコープス (49)
PubMed
概要
全文
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グーグル奨学生
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肝硬変におけるヒト腸内細菌叢の変化。
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非アルコール性脂肪肝と腸内細菌叢。
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スコパス (46)
クロスリファレンス
グーグル
論文情報
発表履歴
受理 2023年12月6日
改訂版受理 2023年11月16日
受理：2023年11月16日受理日：2023年5月7日
出版段階
プレスジャーナル事前校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100987

著作権
© 2023 The Author(s). 欧州肝臓学会（EASL）を代表してエルゼビアB.V.が発行。
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図1βグルカン投与による代謝表現型の変化。(A）実験終了時の総体重。(B）24週間の実験を通しての体重の変化。(C）実験終了時の肝臓-体重比。(D）μCTスキャンの代表的な断面像。(E-G）体脂肪全体、皮下脂肪および内臓脂肪コンパートメントのμCT分析。データは平均±SDで表した。各点は1匹のマウスを表す。統計的有意性はすべて一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）で評価した。実験は、p < 0.05 ()，p < 0.01 ()，p < 0.001 ()，p < 0.0001 ()で有意とみなされる。
図サムネイルgr2
図2高コレステロール血症、肝脂肪症および耐糖能はβ-グルカンとは無関係である。(A）投与終了時の血清コレステロール値。(B）オイルレッドO染色の代表写真。(C）オイルレッドO染色の面積率（Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定）。(D）肝臓組織中のトリグリセリド濃度。(E）犠牲の1週間前にブドウ糖を腹腔内に注射した後の血糖値。(F）IP-GTTの曲線下面積。(G）ブドウ糖注射後2時間の血糖値。各ドットは1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性はすべて一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定で評価した。p < 0.05 ()， p < 0.01 ()， p < 0.001 ()， p < 0.0001 () で有意とした。
図サムネイルgr3
図3β-グルカンはMASLDにおける肝障害および肝炎を改善する。(A-B）終了時の血清トランスアミナーゼ。(C）トランスクリプトミクスのPCAプロット。(D）WSDとWSD＋β-グルカンで異なる発現を示した炎症性遺伝子のヒートマップ。(E)WSDマウスとWSD＋β-グルカンの炎症促進経路とコラーゲン異化経路の発現差の遺伝子セット濃縮。(F-G）H&EおよびCD45染色の代表写真。(H-K）MoMFとKupffer細胞の肝内存在量のFACS解析。(L-M）CCl2およびCCl5のmRNAレベルをコントロールに対する誘導の倍数で表した。各ドットは1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性はすべて一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）によって評価した。実験結果は、p < 0.05 (), p < 0.01 (), p < 0.001 (), p < 0.0001 () で有意とみなされた。
図サムネイルgr4
図4β-グルカンは肝線維化を減少させる。(A) シリウスレッド染色の代表画像。(B）偏光下でのSR染色面積（Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定）。(C-D) Col1のタンパク質およびmRNA発現。 (E) aSMA mRNAはコントロールに対する誘導の倍数で表した。(F)WSDとWSD+βグルカンで発現が異なるプロフィブロティック遺伝子のヒートマップ。各ドットは1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性は、特に断りのない限り、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）によって評価した。実験結果は、p < 0.05 (), p < 0.01 (), p < 0.001 (), p < 0.0001 () で有意とみなされる。
図サムネイルgr5
図.5β-グルカンは、微生物叢が減少すると失われる肝保護プレバイオティクス効果を示す。(A）便サンプルの16S rRNA配列決定のBray-Curtis距離に基づく順序解析。(B)線形判別分析Effect Size(LEfSe)分析により、WSD群とWSD+β-グルカン群の間で有意に豊富な特徴を同定した。(C) 16S rRNA配列決定に基づく細菌分類群の相対的存在量。(D) HEK-Blue™ mTLR4 Cell assayで測定した血清中のTLR4リガンド。(E) TLR4 mRNAはコントロールに対する誘導の倍数で表した（Kruskal-Wallis検定に続くDunnの多重比較検定）。(F) TLR9 mRNAをコントロールに対する誘導の倍数として表した。(G）WSD対WSD＋β-グルカンの「外部刺激に対する反応」経路のヒートマップ。(H-I）広域スペクトル抗生物質で処理したマウスのALTおよびGLDH血清レベル。(J)偏光下のSR染色面積（Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定）。各点は1匹のマウスを表す。データは平均値±SDで表した。統計的有意性は、特に断りのない限り、一元配置分散分析（one-way ANOVA）とシダックの多重比較検定（Sidak's multiple comparisons test）によって評価した。実験はp < 0.05 ()，p < 0.01 ()，p < 0.001 ()，p < 0.0001 (****)で有意とみなされる。
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