ニワトリの概日リズムのずれに対するトランスクリプトームプロファイルと細胞エネルギーの結果について、糞便微生物叢移植が洞察を与える

哉百名

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家禽科学

103巻 9号 2024年9月 103926号

ニワトリの概日リズムのずれに対するトランスクリプトームプロファイルと細胞エネルギーの結果について、糞便微生物叢移植が洞察を与える


https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579124005054?via%3Dihub

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ABSTRACT

概日リズムの乱れは動物に悪影響を及ぼす。家禽は、CMによって引き起こされる長時間の照明光周期のために、健康と福祉の問題に苦しんでいる動物の一つである。しかし、ニワトリの臓器発達、細胞成長、代謝、免疫に対するCMの役割はまだ不明である。本研究では、中国原産の両用種を用い、CMが脳のトランスクリプトームパターンと細胞のエネルギー生合成に及ぼす影響を調べ、さらに糞便微生物叢移植（FMT）を行い、CMによる苦痛からの「治療」効果を調べた。その結果、CMはニワトリの脳と小腸の発育不全を引き起こした。CMは細胞増殖、エネルギー産生、mtDNAコピー、細胞周期やミトコンドリア生物遺伝学に関連する遺伝子の発現を低下させ、活性酸素種（ROS）レベルや炎症感受性を上昇させた。興味深いことに、FMTはCMによって誘発された臓器の発達不全と細胞の機能不全を回復させた。サーカディアンのズレは、鳥類の組織や細胞の発達、エネルギー生合成、免疫反応に異常をもたらした。この研究は、CMとFMTが鳥の発達と福祉に及ぼす調節を理解するための包括的な視点を提供した。

キーワード

ニワトリ

概日リズムのずれ

ミトコンドリオン

糞便微生物叢移植

免疫

はじめに

昼夜周期は最も重要で観察可能な概日リズムの一つであり、すべての生物にとって食事や睡眠などの生理や行動を調節する主要な原動力となっている。動物は概日時計に従って生理的プロセスを同期させ、昼夜の光サイクルに適応している（高橋ら、1980）。場合によっては、その周期が日の出と日の入りからずれることがあり、これを概日リズムのずれ（CM）と呼ぶ（Kudo et al.） これまでの研究で、CMはコルチゾール濃度を調節し、慢性的な概日リズムのズレは、血漿中の炎症性タンパク質および抗炎症性タンパク質の濃度を上昇させることが示されている（Wright et al.、2015）。その上、CMは1日の総エネルギー消費量を減少させ、ヒトの研究では望ましくない体重増加や肥満の一因となっている（McHillら、2014年）。従って、動物の協調的な概日時計は、健康と積極的な代謝に不可欠な役割を果たしている。

現在までのところ、CMに関する研究は主にヒトや実験動物を対象としており、病気や気分の変化、ホルモン分泌、免疫、さらには寿命にまで関係している（Cheng et al.） よく知られているように、鳥類の松果体は、視床下部のマスタークロックを除けば、哺乳類のものと機能的に類似しており、体内時計機構全般の研究に便利なモデルとなっている（Turkowska et al.） したがって、ニワトリはCMの影響による悪影響を調べるのに理想的なモデルでもある。家禽は光周期の支配下にある動物のひとつである。特に成長の早い品種では、摂食を促して成長を促すために、長時間の照明光周 期下で飼育される（Classen and Riddell, 1989;Sanotra et al. 管理条件下において、照明スケジュールは鶏の福祉（Wuら、2022；Okeら、2023）、胚発育（Tainika and Bayraktar、2022）、枝肉形質、肉質に影響を及ぼす最も重要な関心事のひとつである（Liら、2010）。松果体細胞の直接的な光感受性は、鳥類やニワトリにおいて、メラトニン放出を介して概日リズムや季節的繁殖パターンが調節される一つの方法である（Meissl, 1986）。しかし、CMの影響を受けた家禽の逆効果についてはほとんど知られていない。これらの知見のギャップを総合すると、CMが脳のトランスクリプトーム・プロファイルや細胞のエネルギー活動にどのような影響を与えるかをより深く理解する必要性が浮き彫りになった。このことは飼育戦略や動物福祉の面で大きな価値があり、照明体制のさらなる改善や鳥類の感覚生物学のより深い理解に貢献する可能性がある。

一方、糞便微生物叢移植（FMT）は、腸内細菌叢の組成と機能を正常化するために、健康なドナーの糞便微生物叢を患者のレシピエントに移植するものである（Seekatz et al .） 腸炎や痛風など特定の疾患の治療に広く用いられている重要な治療法である（Surawiczら、2013；Klingensmith and Coopersmith、2016）。ニワトリでは、サルモネラ菌に対する抵抗性を向上させるために、健康な個体からの糞便微生物叢の投与が、孵化したばかりのヒナのコロニー形成に用いられてきた（Nurmi and Rantala, 1973）。生後早期における飼料効率の高いドナーからのFMTは、飼料効率を改善する可能性があり（Siegerstetterら、2018）、FMTは生後早期におけるブロイラーの恐怖行動を軽減することができる（Yanら、2021）。したがって、CMに罹患している鳥は、健康な鶏からFMTの治療により回復する可能性があると推測される。

本研究では、中国の両用在来品種である武蒙黒骨鶏を用いて、脳のトランスクリプトームパターン、mtDNAコピー数を含む細胞エネルギー生合成、細胞活性酸素含量、酸素消費率アッセイ、ならびに細胞周期、ミトコンドリア生合成、炎症に関連する遺伝子発現に対するCMおよびFMTの影響を調べた。この研究により、鳥類の発育に対する光体制効果の幅広い理解が得られるだろう。脳のトランスクリプトーム・プロファイルと細胞エネルギー生合成の悪影響を理解することは、光スケジュールに関連した健康懸念の診断、予防、治療を進める上で有益である。

材料と方法

動物

中国農業大学（CAU）の実験動物管理ガイドラインに従い、実験プロトコルはCAUの実験動物管理使用委員会の承認を得た（承認番号：#CAU1807）。実験は貴州省畢節市納永県の有機農場で実施した。中国南西部の兼用品種である武蒙黒骨鶏（n＝128；雌）を用い、孵化後すぐに実験に供した。ニワトリは最初、単一のペンでブロイダーランプの下、1週目は32～34℃、2週目は28～30℃で飼育された。照明体制は、孵化中は23時間明：1時間暗で、最初の7日間は1日1時間明を減らした。鳥はネットケージ（1.5 m×2.5 m）に入れられ、ネットは床から50 cmの高さにあった。すべてのヒナに餌と水を与えた。実験期間中、同じ飼料（New Hope Group, 成都, 四川省, 中国）を市販の給餌器（トウモロコシ-大豆粕飼料）とともに給餌した。

CMとFMTのプロセス

実験スキームを図1に示す。詳細な設計は以下の通りである。孵化21日後（22日齢）、CM群（n=16、4羽ずつ計64羽）と対照群（n=16、4羽ずつ計64羽）に無作為に割り付けた。CM群では、8時から20時までケージ内を暗色の布で覆い、暗い環境を保ち、この間、餌と水は与えなかった。午後8時から翌朝8時までは、照明スケジュール下で飼育し、餌と水を自由に摂取できるようにした。つまり、CM鳥類は概日時計に逆らった明暗サイクルで飼育された。

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図1. 実験スキーム。

20日間の明暗サイクル処理の後（42日齢）、CM鳥の各群8羽を無作為に選んで別のペンに移し、Con鳥として処理した（CMCon、n = 8、4羽の重複、合計32羽）。

食後1時間後、CMとConの両方から糞便を採取し、FMTを行った。糞便はすべて、使用前に下痢や消化障害がないことを確認するためにスクリーニングした。その後、CM鳥4羽をConドナーのFMTに供し（CMFMT、n＝4、4羽の重複、計16羽）、Con鳥をCMドナーのFMTに供した（ConFMT、n＝4、4羽の重複、計16羽）。ケージの床は金網で、金網の高さは地上0.5mであった。金網の下にトレイを置き、排泄物の回収を容易にした。トレイは毎回洗浄、消毒、乾燥してから使用した。新鮮な糞便は、糞便が落下したら直ちに回収した。尿酸を主成分とする排泄物の白い部分を除去した。投与は、1:5(w/v)の糞便を5mLの生理食塩水(0.2g/mL)で完全に溶解した溶液を50mLのビーカーに入れ、無菌環境下で行った。8層の医療用ガーゼをコニカルフラスコに入れ、溶液から大きな粒子状物質を分離した。初回に続いて一次産物を繰り返した。その後、最終的な糞便懸濁液に5％グルコースを加えた。糞便懸濁液はFMT期間前に毎日再調製した。最終的に、16のドナーの糞便懸濁液と同等のものをプールし、ドナーの微生物相を調べるための複合試料とした。属レベルで支配的な微生物はFMTとConドナーで一致しており、上位20の微生物は表SM1であった。

糞便を移植する前に1時間断水し、注射器を用いて各鳥に0.2mLの糞便液を経口注入し、これを7日間連続で実施した。一方、Con鳥には0.2mLの生理食塩水を注射した。その後、すべての鳥を検査し、外見的表現型をモニターした。

16日目から、1日の飼料消費量を計算するために、与えた餌の重量と残量を記録した。21日目、28日目、35日目、42日目、51日目にすべての鳥の体重を測定した。

トランスクリプトーム・プロファイル

TRIzol Reagent（Invitrogen Life Technologies, USA）を用いて、各群の脳海馬サンプル6個（各複製群でランダムに1～2羽）から、製造者の指示に従って全RNAを抽出した。ライブラリーはNEBNext® Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB, Beverly, MA）を用いて構築し、Illumina Hiseqプラットフォームを用いてペアエンド150 bpリードを作成した。生配列は、アダプターやploy-Nを含むリードや低品質リードを除去することで品質管理され、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のアクセッション番号PRJNA525938に登録された。

参照ゲノムおよび遺伝子モデルアノテーションファイルとしてGallus_gallus-5.0(Ensembl release 91)を用いた。HISTA v0.1.6-betaは、クリーンリードをゲノムリファレンスにマッピングするために導入した（Kim et al., 2015）。参照ゲノムのインデックスはBowtie v2.2.3 (Langmead and Salzberg, 2012)を用いて構築し、遺伝子発現レベルのカウントはRSEM v1.2.12 (Li and Dewey, 2011)を用いて列挙した。差次的発現解析は、負の二項分布に基づくDESeq2を用いて行った（Love et al.） P値は、偽発見率をコントロールするためのBenjamini手順を用いて調整した。q値＜0.05の遺伝子は、fold change≧2で差次的に発現しているとした。遺伝子オントロジー（GO）濃縮は、GOseq Rパッケージ（Young et al.、2010）によって実装され、補正P値（q値）＜0.05のGO用語は濃縮されているとみなされた。差次発現遺伝子（DEGs）のGOアノテーションを得た後、WEGOソフトウェアを用いてDEGsのGO機能分類を行い、マクロレベルでの種の遺伝子機能分布を把握した。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)のパスウェイ解析にはRのPhyperを用い、P≦0.01を統計的基準とした。

細胞の単離、培養、リポ多糖刺激

一次線維芽細胞は、コラゲナーゼ消化法を用いて、各群4羽（各複製群でランダムに1羽）の心臓から単離した。簡単に説明すると、ニワトリの心臓をトリミングして余分な血管を取り除き、ピンセットを用いて心臓から血液をそっと出した。その後、心臓を70％アルコールとリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、3mLのコラゲナーゼ消化バッファー（DMEM中2mg/mLコラゲナーゼ；Solarbio社、北京、中国）を入れた皿に個々に入れ、さいの目に切り、37℃の恒温振盪器で約2時間インキュベートした後、組織消化液を遠心分離し、心臓線維芽細胞を板状にした。すべての細胞は、10％FBS（ギブコ、ビリングス、MT）、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン（ギブコ、ビリングス、MT）を補充したDMEM（ギブコ、ビリングス、MT）中で、37℃、5％CO2/95％空気で培養した。

LPSはTLR4シグナル伝達経路を活性化するために用いられた。LPS培養後、遺伝子発現検出のために細胞を回収した。

細胞増殖および活性酸素アッセイ

細胞増殖アッセイにはEnhanced Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Beyotime, China)を用い、96ウェルプレートに5×103細胞/ウェルを播種した。0、1、2、3、4、5、6、7日間培養後、各ウェルに10μLのCCK-8溶液を添加した。さらにプレートを37℃で2時間インキュベートした。450nmの吸光度を、650nmを基準波長として、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。実験は3回繰り返した。

活性酸素レベルは、ROS Assay Kit (Beyotime, China)の説明書に従って測定した。6ウェルプレートに4×105個の細胞を入れ、最終濃度10 mMのDCFH-DAと37℃で20分間インキュベートし、DMEM培地で3回洗浄した。細胞内の活性酸素産生は、励起波長488 nm、発光波長525 nmで蛍光測定し、任意単位で表した。実験は3回繰り返した。

ミトコンドリア呼吸能力アッセイ

初代細胞約1.8×104個をXF96細胞培養マイクロプレート（Seahorse Bioscience, North Billerica, MA）の96ウェルに播種した。呼吸解析のため、細胞はSeahorse XF Cell Mito Stress Test kit（Agilent, Santa Clara, CA）に記載されている手順に従って解析した。OCRのベースライン測定後、各ウェルにオリゴマイシン（最終濃度2μM、ATPターンオーバーに必要な呼吸を測定）、FCCP（最終濃度0. 5μM終濃度、カルボニルシアニド4-トリフルオロメトキシ-フェニルヒドラゾン、最大呼吸を誘導するプロトン性脱共役剤）、およびロテノン＋アンチマイシンA（それぞれ0.5μM終濃度、非ミトコンドリアOCR寄与を測定するためにミトコンドリア呼吸鎖を完全に阻害する）を各ウェルに順次添加した後、OCRを測定した。全OCRから非ミトコンドリアOCRを引くと、ミトコンドリアOCRが得られる。実験は3回繰り返した。XFe96アッセイからのすべてのデータは、Seahorse Bioscience社（North Billerica, MA）のXFリーダーソフトウェアを用いて収集した。

リアルタイム定量的逆転写酵素PCR

Tissue/Cell DNA/RNA extraction kit (Aidlab, China)を用いて細胞のDNAと全RNAを製造者の指示に従って抽出し、TRUE script One Step RT-PCR Kit (Aidlab)で2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。mtDNAの相対コピー数と、ミトコンドリア生合成（TFAM、TFB1M、NRF1、PPARGC1A、PPARA、TFB2M）、細胞周期（CCND1、CCNG1、CDK6、 CDC14A、PCNA、PTEN）、炎症（IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IFNG、NOS2、TNF-a）を、それぞれの遺伝子配列に従ってデザインしたプライマーを用いてqPCRで測定した（表S2）。HBBAおよびACTBは、それぞれmtDNAコピー数および遺伝子発現を検出するための内部対照として使用した（表S2）。 2装置（ANALYTIKJENA、ドイツ）を用い、2×SuperReal PreMix Plus（Tiangen Bio、北京、中国）10μL、各フォワードプライマーおよびリバースプライマー（10μM）1μL、cDNA（またはDNA）1μL、ddH2O 7μLを含む20μL容量で、以下のプログラムに従って行った： 95℃で15分間、95℃で10秒間、アニーリング温度で20秒間、72℃で20秒間を40サイクル。各反応のCtを決定するために、qPCRsoftソフトウェア（ANALYTIKJENA、ドイツ）のベースライン調整法を使用した。すべてのサンプルは3連で増幅した。

データ解析

すべてのデータはSAS 8.2 (SAS Inst. Inc., Cary, NC)で解析し、平均値±標準誤差(SE)で表示した。図または表に示され、統計解析に用いられた平均値は、少なくとも3つの独立した試験を表している。各群間の差は、ANOVA、続いて一般線形モデル手順を用いたダンカンの多重範囲検定によって分析した。群間差の検定では、P値が0.05未満または0.01未満の結果を統計的に有意または極めて有意とみなした。

結果

脳および小腸の形態変化

ニワトリの脳および腸の発達に対するCMおよびFMTの影響を確認するために、組織切片を作成して観察した（図S1）。図2Aに示すように、小腸の断面積はConFMT群が最も大きく（約37mm2）、次いでCon群とCMFMT群が31mm2、CMCon群が26mm2であった： CM群の面積は最も小さく23mm2であった。ConFMT群のニワトリの脳断面積は約170mm2と最も大きかったが、CM群の面積は約125mm2と他の群と比較して最も小さかった（図2B）。従って、CMは脳と小腸の形態に明らかな変化をもたらし、FMT治療はそれに一定の効果をもたらすと思われる。

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図2. 断面積。(A）小腸。(B）脳。

概日リズムのずれと糞便微生物叢移植が脳海馬のトランスクリプトーム・プロファイルに及ぼす影響

5群から採取した脳組織のシーケンスライブラリを合計30個構築した。アダプター配列、未知の塩基（N）の割合が10％を超える配列、低品質リードをフィルターすることにより、1ライブラリーあたり平均1,000万個のクリーンリードを得た。アダプターの除去とフィルタリングを行った結果、98.6%以上のリードがクリーンリードとして認定された（図S2）。各グループのサンプルの生物学的リピートのピアソン相関（R2）は0.96以上であった。クリーンリードをニワトリゲノムにマッピングしたところ、各サンプルでそれぞれ90%以上のリードがマッチし、86%以上が一意にマッチした（図S2）。

CMのニワトリへの影響を調べるために、RNA-seqデータをConとCMのニワトリの間で解析した。Con対CMのニワトリで合計325の異なる発現遺伝子（DEG）が見つかり、188遺伝子が発現上昇、137遺伝子が発現低下していた（図S3）。325のDEGは、406の生物学的プロセス、33の細胞成分、77の分子機能注釈を含む516の機能グループに分類された。KEGGパスウェイ解析では、16のパスウェイがCon対CM群で有意に濃縮された： アラキドン酸代謝"、"血小板活性化"、"上皮細胞への細菌侵入"、"神経活性リガンド-受容体相互作用"、"α-リノレン酸代謝"、"リノール酸代謝"、 "VEGFシグナル伝達経路"、"エーテル脂質代謝"、"卵巣ステロイド形成"、"ファゴソーム"、"オキシトシンシグナル伝達経路"、"レニン-アンジオテンシン系"、"GnRHシグナル伝達経路 "など（P< 0. 05). 図3.

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図3. CON群とCM群で濃縮されたパスウェイが異なる。

188のDEGがCON vs ConFMTニワトリで見つかり、100遺伝子が発現上昇、88遺伝子が発現低下していた（図S3）。188のDEGは、104の生物学的プロセス、29の細胞成分、64の分子機能注釈を含む197の機能グループに分類された。アラキドン酸代謝"、"インスリン抵抗性"、"薬物代謝-チトクロームP450"、"アポトーシス"、"オキシトシンシグナル伝達経路"、"サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用 "などを含む合計15のパスウェイが、Con vs. ConFMT群で有意に濃縮された（P< 0.05）図4。

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図4. CON群とCONFMT群で異なる濃縮パスウェイ。

CON群とCMCon群では、142個のDEGが検出され、62個の遺伝子が発現を増加させ、88個の遺伝子が発現を減少させた（図S3）。142のDEGは、192の生物学的プロセス、22の細胞成分、63の分子機能注釈を含む277の機能グループに分類された。注目すべきは、いくつかのDEGが "細胞外領域"、"ホルモン活性 "および他のいくつかの用語に有意に濃縮されていたことであり、これはCon対CM群における用語解析と一致していた（P< 0.05）。KEGGパスウェイ解析では、CON vs. CMニワトリで4つのパスウェイが有意に濃縮された： 「上皮細胞への細菌の侵入」、「ファゴソーム」、「血小板の活性化」、「レニン・アンジオテンシン系」であった（P< 0.05）。さらに、"エンドサイトーシス"、"細胞接着分子（CAMs）"、"スフィンゴ脂質シグナル伝達経路"、"グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー生合成 "など、いくつかの他の経路もCon vs CMConのニワトリで有意に濃縮された。"不整脈源性右室心筋症（ARVC）"、これらはCON対CMConのニワトリでは濃縮されなかった（P< 0.05）図5。

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図5. CON群とCONCM群で濃縮されたパスウェイが異なる。

CMニワトリに対するFMT効果を検出するために、CMニワトリとCMFMTニワトリのRNA-seqデータを解析した。CM対CMFMT鶏で合計246のDEGが見つかり、105遺伝子が発現上昇、141遺伝子が発現低下していた（図S3）。246のDEGは、390の生物学的プロセス、30の細胞構成要素、92の分子機能注釈を含む512の機能グループに分類され、これらの用語の中で「ホルモン活性」、「細胞外領域」、「ヘモグロビン代謝プロセス」、「イオン恒常性」、「頭部発達」が最も有意に濃縮された。KEGGパスウェイ解析の結果、「神経活性リガンド-受容体相互作用」、「甲状腺ホルモンシグナル伝達経路」、「血小板活性化」、「ECM-受容体相互作用」、「ギャップ結合」、「細胞接着分子（CAMs）」、その他17のパスウェイを含む、合計23のパスウェイが存在することが示された（P< 0.05）図6。

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図6. CM群とCMFMT群で濃縮されたパスウェイが異なる。

CM群とFMT群では、発現の異なる遺伝子とその関連機能に有意な変化が見られた。Con群と他の群との比較の概要として、「上皮細胞への細菌の侵入」、「ファゴソーム」、「血小板の活性化」、「レニン・アンジオテンシン系」など、従来の免疫関連シグナル伝達経路に関連する経路がCMに特異的に反応した。また、FMTの治療は、免疫およびホルモン関連経路に効果を示したが、概日リズム関連経路への効果は限定的であったようである。

概日リズムのずれと糞便微生物叢移植が初代細胞の培養に及ぼす影響

細胞におけるCMとFMTの効果を評価するために、まずニワトリ初代心筋線維芽細胞をコラゲナーゼ消化法を用いて構築した。図7Aに示すように、細胞は古典的な線維芽細胞の形態を示した：シャトルまたは不規則な三角形の形である。

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図7. 細胞の形態と増殖。(A）ニワトリ初代心筋線維芽細胞の形態（原倍率40倍）；（B）5群の細胞増殖。細胞増殖は、0日、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日培養後、CCK-8キットを用いて測定した。異なる文字は、同日における極めて有意な差を示す。

CCK-8テストの結果、5群間の細胞生存率は0～2dまで正常であり、類似していた（図7B）。一方、ConFMT群、CMCon群、CMFMT群の細胞数が最も多く、次いでCon群、3～5dではCM群の細胞数が最も少なかった（P< 0.01）。6日目および7日目では、CM群の細胞数は他の群と比較して最も少なかった。

概日リズムのずれと糞便微生物叢移植が細胞周期関連遺伝子の発現レベルに及ぼす影響

細胞生存率の群間差の理由を調べるため、6つの細胞周期関連遺伝子（CCND1、CCNG1、CDK6、CDC14A、PCN1、PTEN）の発現をqPCRで測定した。CM群におけるCCND1の発現は、ConFMT群およびCMFMT群よりも有意に低かった（P< 0.05、図8A）。Con群、ConFMT群およびCMFMT群におけるCDK6のmRNAレベルはCM群よりも高かった（P＜0.01、図8B）。CM群におけるCDC14aの発現は、他の群と比較して低かった（P< 0.01、図8C）。CCNG1とPCN1については、CM群とCMCon群の発現が他の3群に比べて有意に低かった（P< 0.01、図8Aおよび8E）。PTENの発現については、5群間で有意差は認められなかった（図8F）。この結果からわかるように、ほとんどの細胞周期の変化は、CM治療後には低下し、FMT治療後には回復することで一致していた。

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図8 細胞周期関連遺伝子のmRNA発現。線維芽細胞におけるCCND1（A）、CCNG1（D）、CDK6（B）、CDC14A（C）、PCN1（E）およびPTEN（F）の発現をqPCRにより検出した。異なる小文字と大文字はそれぞれ有意差または極めて有意な差を示し、P < 0.05またはP < 0.01。

概日リズムのずれと糞便微生物叢移植がmtDNAコピー数と細胞内活性酸素量に及ぼす影響

図9Aに示すように、mtDNAのコピー数は5群間で有意差があり、150から210の範囲であった。ConFMT群のmtDNAコピー数が最も高く、Con群よりも極めて高かった（P< 0.01）。また、CM群のmtDNA量は他の群と比較して最も少なかった（P< 0.01）。活性酸素量測定では、CM群が最も高い蛍光値を示し、次いでCon群、CMCon群、CMFMT群であったが、ConFMT群は最も低い活性酸素量であった（P< 0.01、図9B）。図4からわかるように、mtDNA量だけでなく、呼吸能力に関連するすべての指標は5群すべてで同様の傾向を示し、CM処理による代謝状態の悪化とFMTによる回復効果が示唆された。

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図9 細胞内のmtDNAコピー数と活性酸素量。A、qPCRにより各群のmtDNAコピー数を測定したところ、群間で有意差が認められた。Con群のmtDNAコピー数はConFMT群より有意に低く、CM群は他の群と比較して最も低いコピー数であった。B,ROSアッセイキットを用いて5群のROS含量を検出したところ、CM群のROS濃度が最も高く、次いでCon群、CMCon群、CMFMT群であり、ConFMT群の蛍光値は最も低かった。ニワトリ初代線維芽細胞のOCRアッセイ。C、各群のミトコンドリアOCRアッセイを示す；D、5群間のATP産生のOCR；E、5群間の基礎呼吸のOCR；F、5群間の最大呼吸のOCR；G、5群間の予備呼吸能力のOCR。異なる文字は極めて有意な差を示す、P < 0.01。

概日リズムのずれと糞便微生物叢移植が酸素消費速度測定に及ぼす影響

細胞のエネルギー代謝におけるCMおよびFMTの影響を調べるために、ミトコンドリアの酸素消費率（OCR）を検出した（図9C）。図4Dおよび4Eに示すように、ATP産生および基礎呼吸におけるOCR値は、ConFMT群が最も高く、次いでCon群およびCMFMT群であった；一方、CM群およびCMCon群は最も低かった（P＜0.01）。最大呼吸（図9F）および予備呼吸容量（図9G）についても、ConFMT群のOCR値が5群中最も高く、次いでCon群、CMFMT群、CMCon群であり、CM群は最も低かった（P＜0.01）。これらの結果は、活性酸素の相対含量の結果と逆の傾向であった。CM群でOCRと活性酸素の含量が最も低いことは、CM処理による代謝状態の悪化とFMTからの回復効果を示唆しているのかもしれない。

概日リズムのずれと糞便微生物叢移植がミトコンドリア生合成関連遺伝子の発現レベルに及ぼす影響

群間で異なるミトコンドリアOCRに寄与する潜在的要因をさらに見出すために、6つのミトコンドリア生合成関連遺伝子をqPCRで測定した（図10）。ConFMT群は最も高いNRF1mRNAレベルを有し、次いでCon、CMFMTと続き、CMは最も低いレベルであった（P< 0.01、図10A）。PPARGC1A遺伝子については、ConFMTにおけるそのレベルは、CMおよびCMFMTにおけるそれよりも有意に高かった（P < 0.05、図10C）。TFAMおよびTFB2Mの発現は、各群間で同様のパターンを示した：ConおよびConFMT群における発現は、他の3群よりも極めて有意に高かった（P< 0.01、図10Dおよび10F）。さらに、ConFMT群におけるTFB1Mの発現はCM、CMConおよびCMFMT群よりも高く、CMFMTにおけるそのレベルはCMおよびCMCon群よりも高かった（P< 0.01、図10E）。PPARAの発現には群間で有意差は認められなかった（図10B）。ほとんどのミトコンドリア生合成関連遺伝子の相対発現は、CMおよびFMT処理に反応して同様の傾向を示した。これらの結果は、CMとFMTによる回復効果によって、代謝状態、細胞機能、細胞運命が損なわれ、神経調節が損なわれたことを証明するものである。

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図10. ミトコンドリア生合成に関与する遺伝子の発現。7つの炎症関連遺伝子のmRNA発現： NRF1（A）、PPARA（B）、PPARAGC1A（C）、TFAM（D）、TFB1M（E）およびTFB2M（F）の7つの炎症関連遺伝子のmRNA発現をqPCRで検出した。異なる小文字と大文字は、それぞれ有意差または極めて有意な差を示し、P < 0.05またはP < 0.01であった。

炎症関連遺伝子の発現レベルに及ぼす概日リズムのずれと糞便微生物叢移植の影響

LPSによって誘導された炎症刺激に対する細胞応答におけるCMおよびFMTの効果をさらに調べるために、炎症に関与する7つの遺伝子（IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IFNG、NOS2、およびTNF-a）の発現をqPCRによって調べた。一方、炎症性サイトカインであるIL-1b、IL-6、IL-8、TNF-a（図11A、11B、11C、11G）については、LPS無添加の通常培養条件下では各群の発現量は同程度であったが、LPS添加後はいずれも有意に発現量が増加した。CM-LPS群では、CMFMT-LPS、Con-LPS、ConFMT-LPSよりも発現が高かった（P< 0.01）。ConFMT-LPSにおけるIL-6およびIL-8の発現は、Con-LPSと比較して有意に低かった（P< 0.01、図11Bおよび11C）。さらに、CM-LPSにおけるNOS2のmRNA発現は、他のどのグループよりも最も高く、Con-LPSおよびConFMT-LPSにおけるそのレベルは、LPSで処理した他の3つのグループよりも低かった（P< 0.01、図11F）。一方、抗炎症性サイトカインIL-10の発現は、Con群ではCM群よりも有意に高く、Con群とConFMT群では他の3群よりも有意に高かった（P＜0.01、図11D）。さらに、ConFMT群のみがLPS刺激後にIFNGの発現を有意に上昇させた（P＜0.01、図11E）。ほとんどの免疫関連遺伝子は、LSP処理後のCM鳥で他のグループよりも高い発現を示し、FMTはそれらに保護効果を有するようであった。

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図11. 炎症に関与する遺伝子の発現。7つの炎症関連遺伝子のmRNA発現： IL-1b（A）、IL-6（B）、IL-8（C）、IL-10（D）、IFNG（E）、NOS2（F）、TNF-a（G）の7つの炎症関連遺伝子のmRNA発現をqPCRで検出した。異なる文字は極めて有意な差を示す。

考察

CMが脳機能に応じて報酬関連行動と生理を制御していることが報告されており、その報酬関連行動は、内側前頭前皮質におけるドーパミントランスポーターの発現、概日機能障害関連遺伝子の発現の反応と並行していることが示されている（Sleipnessら、2007）。さらに、CM鳥と対照鳥の間で、脳機能の交代をいくつか決定した。同様に、CM鳥（CM鳥とCon + CM鳥）と対照鳥の間でも、「メラトニン受容体活性」、「概日行動」、「リズム行動」、「運動リズム」、「概日リズム」に関するGO用語でDEGが濃縮されることがわかった。中枢時計の主要な出力シグナルのひとつであるメラトニンもまた、ニワトリの概日時計の制御に重要な役割を果たしている可能性があり、これはげっ歯類の報酬関連プロセスや行動と関連していることが以前に知られていた（Zhdanova and Tucci, 2003）。特に、Con群とCM群、Con群とConCM群、Con群とCMFMT群の比較の概要として、「細菌の上皮細胞への侵入」、「ファゴソーム」、「血小板の活性化」、「レニン-アンジオテンシン系」がCMに反応する特異的な経路であることがわかった。これらの経路は、主に従来の免疫関連シグナル伝達経路と相対的であり（Yang et al., 2021）、CMニワトリによる細菌侵襲の好ましくない影響を示唆しているのかもしれない（Usman and Arzai, 2008）。このうち血小板の活性化は、ヒトのトランスクリプトームの概日制御に関する4日間の模擬夜勤作業プロトコルで実施されたヒトの研究で明らかにされた（Archerら、2014）。さらに、CMの強さによる違いも示唆された。さらに、CMが長い鳥は、「神経活性リガンド-受容体相互作用」、「α-リノレン酸代謝」、「VEGFシグナル伝達経路」、「オキシトシンシグナル伝達経路」に関与していた。一方、CMが短い鳥類は、さらに「不整脈源性右室心筋症（ARVC）」経路に関与していた。実際、げっ歯類やヒトの研究で、CMが心疾患や神経細胞関連の側面を引き起こすことが実証されている（Morrisら、2012；Zhangら、2021）。治療強度の違いによる影響は、一定期間後の課題に対する適応的対処能力によるものかもしれない。とはいえ、さらなる調査が必要である。行動については観察されなかったが、CM投与により「概日行動」、「リズム行動」、「運動リズム」、「概日リズム」、「神経活性リガンド-受容体相互作用」、「オキシトシン・シグナル伝達経路」などの行動関連経路が変化したことが示唆された。興味深いことに、CM処理の期間が長いほど、鳥の苦痛はより深刻であった。これらの知見は、CM鳥の福祉像が損なわれていることを示唆している。

CM鳥とFMT鳥の比較、およびCM鳥と対照鳥のFMT鳥の比較では、メラトニン活性、概日・リズム行動、概日リズムに関するGO用語やKEGGパスウェイの違いは見られなかった。これらの結果は、FMT治療によって回復する概日リズムの悪影響は限定的であることを示している。注目すべきことに、FMT後、GO用語およびKEGGパスウェイに対する免疫およびホルモン関連が観察され、これは、FMTの治療によって免疫の側面が変化することを示す先行研究（Xiong et al.） さらに、脳と腸の組織切片は、Con群の断面積がCM群の断面積よりも高いという同様の傾向を示し、ConFMT群の脳と腸の断面積はともに最高値を示した。これは、CM鳥からのFMTが、ひいてはチャレンジにポジティブな刺激をもたらす可能性を示唆している。これまでの研究で、FMTがニワトリの恐怖行動と飼料効率を低下させることが実証されている（Yanら、2021；Siegerstetterら、2018）。今回の研究でも、根拠となるメカニズムのさらなる研究が必要であるにかかわらず、FMTの免疫関連の潜在的な効果が示された。したがって、農家にとって、動物の行動をモニターするセンサー技術と同様にFMTの応用は、動物の福祉と生産性を向上させる可能性がある（Abdoli et al.）

概日リズムは、ほとんどのサイクリン、CDK、腫瘍抑制遺伝子の制御を通じて、グルコース恒常性（Mauryら、2014）、細胞周期、細胞増殖・分裂などの生理的プロセスを制御している（Borgsら、2009）。細胞周期のリズムパターンは概日時計の影響を受け、肝臓、肺、心臓、松果体などの組織の発生プログラム、照度、代謝サイクルによって変化する（Borgsら、2009；Khapreら、2010）。従って、これらの細胞周期関連遺伝子は概日リズムパターンに必須である。それにもかかわらず、CMチャレンジ後の変化を報告した文献は限られている。本研究では、CM鳥は他の鳥に比べて細胞増殖が少なく、これはCCND1、CCNG1、CDK6、CDC14A、PCN1などの細胞周期関連遺伝子のmRNA発現と一致していた。これらの結果は、ニワトリのCMが脳細胞の発達に悪影響を及ぼすことを示唆している。

知られているように、酸素消費量は、代謝状態、細胞機能、細胞運命を評価するための重要な指標であり、神経調節の異常とともに評価される（Brito et al.） ATP産生量、基礎呼吸量、最大呼吸量、予備呼吸量におけるOCRの値は、CM群およびCMCon群よりもCon群で高く、mtDNA含量においても同様の傾向がみられたことから、CMによる神経調節異常の代謝状態、細胞機能、細胞運命の悪化が示唆された。これは、CM群の活性酸素含量が他の群より高く、過剰な活性酸素がミトコンドリアにダメージを与え、ミトコンドリアのオートファジーを引き起こすことと一致するかもしれない（Green and Van Houten, 2011）。これらの結果は、ミトコンドリア生合成関連遺伝子の相対発現の所見から、再び証明された。ほとんどの場合、CM群よりもCon群で高い発現が見られた。

FMTは、健康なドナーの糞便微生物叢をレシピエントに移植し、腸内細菌叢の組成と機能を正常化するものであり（Seekatzら、2014；Shankarら、2014）、重要な治療法として機能し、特定の疾患の治療に用いられている（Surawiczら、2013；Klingensmith and Coopersmith、2016）。本研究では、FMTはCM鳥とCon鳥の翻訳に関係なく、細胞の発達と細胞のエネルギー活性にプラスの効果があると思われる。例えば、ConFMT群およびCMFMT群の細胞数は、Con群およびCM群の細胞数よりもかなり多く、これは糞便マイクロバイオーム翻訳鳥の細胞周期関連遺伝子発現、OCR値、mtDNAコピー数、ミトコンドリア生合成関連遺伝子発現の結果と一致していた。興味深いことに、これらの指標はすべて、ConFMT群のパフォーマンスがCMFMT群よりも優れているという同様の傾向を示しており、FMTが宿主のマイクロバイオームの機能を変化させるほど強くはないものの、その構成や機能の一部に干渉していることが示唆された。我々の以前の研究でも、FMTはレシピエント動物の微生物組成を変化させるが、行動には変化を与えないことがわかった（Yanら、2021）。

その結果、LPS処理後のCM鳥では、IL- 10を除き、IL-1b、IL-6、IL-8、IFNG、NOS2、TNF-αの遺伝子発現が他のグループよりも高かった。この結果は、同様のエビデンスと相まって、CMがニワトリの免疫系に異常をきたすことを示している。

結論

概日リズムの狂いは、中核遺伝子や経路の発現を制御することにより、組織や細胞の発達、細胞のエネルギー産生、免疫反応に異常な欠陥を誘発した。乱れた概日リズムはFMTでは容易に回復しなかったが、FMTはニワトリの組織や細胞の発達や活動を部分的に回復させることができた。本研究では、ニワトリをモデルとして、サーカディアンリズムのずれの根底にある分子メカニズムに関する新たな知見を提供し、光スケジュールに関連する健康問題の診断、予防、治療を推進する。

免責事項

著者らは利益相反がないことを宣言する。

謝辞

本研究は、農業バイオ育種主要プロジェクト（2023ZD0406401）、中国国家自然科学基金（32102596）、広東省自然科学基金（2024A151501233）、広東省動物分子設計精密育種重点実験室（2019B030301010）の助成を受けた。

研究期間中のサポートとWeiningのヒナを提供してくれた中国貴州省畢節市553300の貴州名永遠生育有限公司のスタッフに心から感謝する。また、Rong He氏およびQianlong有機農場関係者の協力にも感謝する。

著者の貢献 S.C.とX.Z.が研究を計画し、S.C.、H.L.、C.Y.が原稿を執筆した。S.C.、H.L.、T.S.、L.X.、J.L.は実験結果の収集と分析を行った。C.Y.とX.Z.は原稿の執筆と修正に参加した。著者全員がデータの解釈に貢献し、原稿の最終版を承認した。

データの利用可能性に関する声明 本研究で作成および/または解析されたデータセットは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。

付録 補足資料

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表S1：ニワトリの行動の定義、表S2：本研究で使用したプライマー配列、図S1：ニワトリの脳と腸の組織切片、図S2：クリーンリード、図S3：アップレギュレート遺伝子とダウンレギュレート遺伝子。

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