HRMAS 13C NMRとゲノムスケールモデリングによる嫌気性菌の動的代謝の解明

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発行：2023年3月9日
HRMAS 13C NMRとゲノムスケールモデリングによる嫌気性菌の動的代謝の解明

https://www.nature.com/articles/s41589-023-01275-9

エイダン・パヴァオ
ブリンタ・ギリナサン
...
リン・ブライ
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Nature Chemical Biology (2023)この記事を引用する
11 Altmetric（アルトメトリック
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アブストラクト
嫌気性微生物の代謝は、地球規模の生態系、宿主と微生物相の相互作用、および産業応用において重要な機能を駆動しているが、依然として未解明である。ここでは、アミノ酸と炭水化物を発酵させるクロストリジウムの病原体Clostridioides difficileを用いて、偏性嫌気性菌の細胞代謝を精緻化する多用途のアプローチを進めることにした。13C発酵基質で培養したC. difficileの高分解能マジックアングルスピニング核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、病原体のゲノムスケール代謝の動的フラックスバランス解析（dFBA）を可能にしました。解析の結果、酸化的経路と還元的経路がダイナミックに動員され、アラニンの生合成において高流量アミノ酸と解糖系代謝が統合されて、効率的なエネルギー生成、窒素処理、バイオマス生成をサポートすることが判明しました。モデル予測は、13C NMR分光法の感度を活用し、[U-13C]グルコースと[15N]ロイシンから細胞内の炭素と窒素の流れを同時に追跡し、[13C、15N]アラニンが生成されることを確認するアプローチとなった。この結果から、C. difficileが腸内生態系における急速なコロニー形成と拡大を支えるために用いる代謝戦略が明らかになりました。
 

主な内容
偏性嫌気性菌は、哺乳類の腸内細菌叢の大半を占め、Clostridioides difficileなどの病原体も含まれます。また、嫌気性細菌は、地球上の生態系における栄養の流れを調整し1、経済的に重要な産業発酵を行う2。しかし、嫌気性菌の代謝経路や栄養要求量は、大腸菌や枯草菌のような耐好性モデル菌とは大きく異なることが多く、その代謝の多くの側面は十分に解明されていない。そのため、嫌気性菌の代謝を臨床、産業、環境などの分野で活用しようとすると、その特性は限定されてしまいます。
院内感染の主な原因であるC. difficileは、炭水化物やアミノ酸など多様な炭素源3 を発酵させることで腸内環境に定着する4, 5, 6。この病原体は、腸内環境の許容量を超えて増殖すると、傷ついた粘膜から栄養を得るために毒素を放出する7。C. difficileが、エネルギー生成と成長をサポートするシステムと共起する発酵経路をどのように利用するかを定義することは困難であった8,9。しかし、成長を促進する発酵性基質の使用とそれに伴う代謝経路の採用を明確に追跡する方法は、抗生物質だけに頼らないアプローチで感染症を予防・治療する機会を提供します。
高分解能マジックアングルスピニング（HRMAS）核磁気共鳴（NMR）分光法は、生きた細胞におけるリアルタイムの代謝研究をサポートし10,11,12、特に密閉ローターチャンバーが嫌気性環境を維持できるため、嫌気性細菌の研究に適している12。HRMAS NMRは、NMRスペクトル測定時に磁場に対して54.74°の「マジックアングル」で試料を回転させるため、コロイドや半固体の試料における信号検出感度が向上する13。このようにして、低投入量の細胞バイオマスで代謝の詳細な研究を実現することができる12。炭素13 (13C) で一様に標識された基質を用いた細胞代謝と組み合わせることで、HRMAS NMRの感度は、複雑な代謝経路を通る炭素の流れを明確に追跡することができます。
代謝モデリングシステムは、実験的に得られた基質や代謝物のフラックスを、細胞内のパスウェイや遺伝子に結びつけるものです14,15,16,17。モデリングアプローチの中でも、動的フラックスバランス解析（dFBA）は、反応フラックスの制約条件とバイオマスやアデノシン三リン酸（ATP）生産などの生物学的目標がある場合、生物スケールで代謝経路の時間依存性の採用をシミュレーションする18。既存のdFBAアプローチでは、培地組成の経時的な静的測定から交換フラックスを推定し18,19、C. difficileが生成した代謝物のガスクロマトグラフおよび質量分析（GC-MS）分析などの定量プラットフォームが使用されています20。しかし、dFBAシミュレーションを制約するためのNMRの使用は、NMRのスペクトル分解能、信号対雑音レベル、および13C NMRピークの核オーバーハウザー効果（NOE）による振幅歪みの影響を受けやすいという問題があり、NMR信号を信頼できる推定濃度に変換する手段が限られています21。これらの制約を克服する手段として、HRMAS NMRは、微量の生細胞の同位体フラックスを非破壊で測定できることから、dFBAをサポートする有望なアプローチである12,22。
我々は、C. difficileの代謝における複雑なダイナミクスを定義するために、HRMAS 13C NMRを利用して、ゲノムスケールの代謝モデル内でdFBAを制約した。生きたC. difficile細胞から、13C標識基質を経時的に発酵させ、HRMAS NMRスペクトルを取得しました（図1a）。そして、13C NMRの積分信号曲線を実験的標準を用いて正規化し、dFBAシミュレーションの制約を与えた（Methods, Estimation of exchange fluxes for dFBA and Fig. 1b）。解析の結果、アラニン生産はアミノ酸発酵クロストリジウムの中心的な代謝統合点であり、アミノ酸代謝と解糖系代謝にまたがる酸化的・還元的な反応の共起をサポートすることが明らかになりました。モデル予測の確認では、窒素15（15N）のような弱いNMR活性核から13Cのような強いNMR活性核への信号増幅を利用して、細胞代謝を通じた炭素と窒素の流れを同時に追跡する汎用的なNMRアプローチを利用した（図1c）。
図1: 標識基質とdFBAを用いたHRMAS NMRによる代謝統合点同定のフレームワーク。
a, HRMAS NMRは、13C標識基質のライブセル嫌気性代謝を分解する。13C標識基質を含む培地をHRMASローターインサートでC. difficile細胞に接種する。標識基質の代謝をモニターするために、対数期の成長を通じて、成長中の細胞の1H-および13C NMRスペクトルを連続的に取得する。NMRスペクトルは処理され、ピークは1H-13C HSQCスペクトルと参照データを用いて代謝物に割り当てられる。 b, NMR信号の軌跡はdFBAシミュレーションにより代謝統合点を特定する。代謝物のロジスティック曲線は、統合された13C信号の軌跡にフィットし、GCまたはNMRで測定された標準溶液の情報を使用して推定濃度にスケーリングされます。代謝物の交換フラックスの推定値は、dFBAシミュレーションを制約するために、複数のNMRを実行したロジスティック曲線から導き出されます。代謝統合点は、dFBAソリューションが基質が電子または官能基を交換すると予測した場所に特定される。 c, 13C-および15N-標識基質の13C NMRにより、栄養フローに関するdFBAの予測が確認された。C.difficile細胞は、13Cおよび15Nで標識された基質を含む培地で、NMR測定下で増殖する。13C-アラニンα炭素で分割された13C NMRサブピークの相対面積を定量化することにより、13Cバックボーンへの15Nフローを測定した。
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結果
HRMAS 13C NMRでC. difficileの複雑な代謝が解明される
C. difficileのアミノ酸発酵と解糖系発酵の同時進行について調べるため、生きたC. difficile細胞からプロトン（1H）および13C NMRスペクトルのHRMAS NMR時系列を測定しました。培養は、天然同位体の炭素源を一様に標識された炭素13同位体で置き換えた改良ミニマル培地（MMM）で行った。L-[U-13C]プロリン、L-[U-13C]ロイシン、[U-13C]グルコース（図1a）です。HRMAS取得の条件下で培養したC. difficile培養物は、従来の嫌気性培養物と一貫した代謝所見を示した（Extended Data Fig.1, Supplementary Table 1 and Methods, Nonspinning control experiments）。
Stickland amino acid-fermenting Clostridium6として、C. difficileは、プロリンやロイシンなどのアミノ酸とグルコースなどの単糖を優先的に代謝する23。これらの基質は、生体内で病原体を急速に増殖させることが知られており9、症状のある疾患の発症の前提条件となる23,24。C. difficileのプロリン還元酵素は、プロリンを単一の代謝物である5-アミノバレレートに還元します4,25。生化学的およびタンパク質相互作用の研究により、プロリン還元酵素活性と、ATP合成をサポートする細菌Rnf複合体によるプロトン放出との結合が確認されている26,27。L-[U-13C]プロリンを含む培地で培養したC. difficileのHRMAS NMRでは、5時間（h）以内にプロリンが完全に消費され、[U-13C]5-アミノバレレートが生成した（図2a、b、拡張データ図2および補足図1）。
図2: U-13C発酵基質で増殖したC. difficileのHRMAS 13C NMR。
a, 7.0 mM [U-13C]プロリンを含むMMMでの増殖のHRMAS NMRスタックプロット。凡例は、入力プロリン（濃紺）と5-アミノバレレート（濃赤）の色分けを示す。x軸は13C NMR化学シフト（ppm）、y軸は時間（h）、z軸はNMRシグナル（単位なし）を示す。 b, [U-13C]プロリンおよび[U-13C]5-アミノバレレートの推定濃度（mM）と時間（h）のロジスティックプロットである。軌跡は、方法（「時間軸の整列と平均ロジスティック係数の算出」セクション）に記載されているように計算され、正規化されている。c, 7.6 mM [U-13C]ロイシンを添加したMMMにおける成長のHRMAS NMRスタックプロット。イソバレレートとイソカプロエートの25ppmのピーク（灰色）は、広範囲に重なっているため分離できなかった。e, 27.5 mM [U-13C]グルコースを添加したMMMにおける成長のHRMAS NMRスタックプロット。軸はa.と同じ。 f. [U-13C]グルコースと検出された代謝物の推定濃度を時間に対して描いたロジスティックプロット。g,h, 30 mM [U-13C]プロリンを添加したMMMでのC. difficile培養の13C NMR時系列（g）または100 µMセレン酸ナトリウムを添加しない（h）。凡例は、入力プロリン（濃青）と5-アミノバレレート（濃赤）の色分け、軸はaの通り。
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一方、C. difficileはL-ロイシンを酸化的経路と還元的経路に分けて発酵させる5,24。ロイシンのイソバレレートとCO2への酸化的発酵は、2つの還元当量のフェレドキシンと1当量のATPを生成するが、還元的ロイシン経路はイソカプロン酸を生成し、正味4つの還元当量を消費する5, 24, 28. HRMAS NMRにより、L-[U-13C]ロイシンは13時間以内に完全に代謝され、[13C]イソバレレートと[13C]イソカプロエートのレベルはそれぞれ2.7〜8.7時間と7.4〜13.0時間かけて上昇した（図2c、d、拡張データ図3および補足図2）。
C. difficileは、生物のエネルギーと代謝の必要性を支える酸化的および還元的な経路を通して、グルコースを発酵させる。最も高いフラックスの酸化的経路は、解糖系ピルビン酸を酢酸に変換し、ATPを生成し、さらにRnfシステムに供給可能な電子を抽出する。それに対応する高フラックス還元経路は、電子キャリアの再生とともにエタノール、乳酸、酪酸、ブタノールを生成し、さらに電子分岐系を含む反応によって、エネルギー的な必要性を支えるエネルギーを抽出する6,28。U-13C]グルコースで増殖したC. difficileのHRMAS NMRでは、7時間後に[13C]酢酸が、10時間後に[13C]アラニンが確認されました（図2e、f）。還元的グルコース代謝の代謝産物は、13時間後に[13C]エタノール、21時間後に[13C]乳酸、24時間後に[13C]酪酸、35時間後にn-[13C]ブタノールの生成で検出されました（図2e、f、拡張データ図4と補足図3）。
次に、ライブセルHRMAS NMRの代謝擾乱に対する反応性を評価するために、30 mMの[U-13C]プロリン過剰存在下で、セレン依存経路であるC. difficileのプロリン還元酵素代謝を比較した25、29。100μMの亜セレン酸ナトリウムを含むMMMで増殖したC. difficileと比較して、セレン欠乏MMMで増殖した細胞は、わずか7%の[U-13C]5-アミノバレレート信号を生成した（図2gとhを比較）。
代謝シミュレーションを制約するためのNMRデータの使用
次に、HRMAS の 13C NMR トラジェクトリーから代謝物交換フラックスを推定し、NMR データセットとそれを支える代謝パスウェイ、遺伝子、および実験時系列におけるそれらの動的な採用を結びつけました（図 1b）。代謝物濃度の軌跡を推定するために、まず、各13C化合物の経時的な統合NMR信号を、式を用いてロジスティック曲線にフィットさせました。
$$\begin{array}{{20}{c}} {fleft( x ˶ˆ꒳ˆ˵ ) = ˶ˆ꒳ˆ˵ ) {1 + {mathrm{e}}^{ - kleft( {x - x_0}˶ˆ꒳ˆ˵ ) }} + C} \end{array}$$です。
(1)
ここで、Lは上部漸近線、kは成長率、x0はシグモイド曲線の変曲点である（補足表2）。U-13C基質については、定数Cは36時間後の基質残量を示し、生成物については、Cはゼロに等しい。13C標識生成物の最終濃度は、既知のU-13C基質濃度、13C NMRピーク面積の比、NOEによるシグナル増幅のために経験的に決定された補正係数を用いて推定した（Estimation of exchange fluxes for dFBA）。ロジスティック方程式（1）は、反復実行中の推定濃度を用いてスケーリングし、微分してdFBAシミュレーション用の交換フラックス制約を得た（図2b、d、fおよび補足表3）。
$$\begin{array}{{20}{c}} {f,^{prime}} \left( x ˶ˆ꒳ˆ˵ ) = ˶ˆ꒳ˆ˵ ) \right)^2}}}となります。\end{array}$$です。
(2)
dFBAはスティックランド代謝による急速なATP生成を予測している
dFBAシミュレーションでは、C. difficileの代謝モデルとして更新されたicdf843を使用しました（代謝モデルおよび補足表4）。NMR で検出された代謝物のモデル交換フラックスは，36 時間の時系列シミュレーションで評価したロジスティック微分方程式（2）の 95%信頼限界に拘束した（代謝モデルおよび補足表 5）．ソリューションでは、成長期と胞子形成期で一貫性を持たせるため、生物学的目的としてATP加水分解を使用しました（補足表6）。フラックス変動解析（FVA）ソリューションは、各シミュレーションタイムポイントで計算され、最適値の0.5％以内の目的フラックスに対応する反応のフラックスバウンドを推定した（補足表7および8）。
dFBAシミュレーションでは、ATP合成を促進する酸化反応（図3a）と、電子を受け入れて酸化的フラックスを維持するための還元反応が共存する、3段階の代謝を予測しました。この時期の代謝は、ロイシンの急速な酸化的発酵（図3a,bおよび4、反応1）と、イソロイシン（図3a,b、反応2）、バリン（図3a,b、反応3）およびシステイン（図3b、反応9）の酸化的スティックランドアミノ酸発酵経路の漸進的採用で特徴づけられる。この間、酸化的アミノ酸代謝による基質レベルのリン酸化反応は、ATP生成量の27.6%を占めると推定された。シミュレーションでは、酸化的解糖反応（図3a,cおよび4、反応5および6）および混合酸発酵反応（図3a,cおよび4、反応7）が採用され、さらに38.9%のATP生産が予測された。dFBA溶液は、C. difficileのヒドロゲナーゼシステムからの水素分子の発生（図3dと4、反応11）に始まり、ロイシンとプロリンのスティックランド還元反応（図3eと4、反応12と13）、複合酸化発酵を支える還元経路がこの期間に徐々に採用されると予測しました。
図3：dFBAで予測された、解糖とスティックランド代謝をつなぐ主要な代謝中間体の反応フラックスと生成量。
a-i, 36時間の代謝におけるdFBA予測反応フラックス(x軸)。y軸は推定フラックス（mM h-1）を示す。a, イソバレレートキナーゼ（薄緑、1）、2-メチルブチレートキナーゼ（黄緑、2）、イソブチレートキナーゼ（濃緑、3）、ATP合成酵素（薄灰、4）、PGK（濃紺、5）、ピルビン酸キナーゼ（紫、6）、アセテートキナーゼ（赤、7）、ブチレートキナーゼ（黄、8）などATP生成に関わる反応フラックスを時間に対して推定したものである。b-i, アミノ酸代謝と解糖系代謝の統合を含む、酸化的・還元的経路のモデル推定採用。太線はFBAが予測した最適な代謝フラックス、斜線はFVAが予測した最適解の0.5%以内の目的フラックスをサポートするフラックス許容値を示す。 b, シスタチオナーゼ（紫、9）、 イソバレレートキナーゼ（薄緑、1）、2-メチルブチレートキナーゼ（黄緑、2）、 イソブチレートキナーゼ（濃緑、3）で表される酸化的スティックランド発酵のフラックスを予測した。c, PGKによる解糖系フラックス（紺色、5）とピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素（PFOR、ピンク、10）および酢酸キナーゼによる酸化的混合酸発酵（赤、7；網掛けFVA上限（1000 mM h-1）は軸の限界を超えているので表示しない）。 d, 鉄水素化酵素（オレンジ、11）による還元的水素生産。e, イソカプレノイル-CoA還元酵素（薄赤色、12）とプロリン還元酵素（濃赤色、13）による還元的スティックランド発酵。 f, エタノール脱水素酵素（ADH；緑色、14）と酪酸キナーゼ（黄色、8）による還元的混合酸発酵。 g, アセチルCoA合成酵素（青緑、15）によるウッド-ジュンダール酢酸化反応。h, ATP合成酵素（薄灰色、4）および勾配生成Rnf複合体（中灰色、16）で表される膜関連ATP合成。 i, アラニントランスアミナーゼ（中青色、17、網掛けしたFVA上下限（± 1,000 mM h-1 ）は軸の限界を超えるため表示しない）およびグルタミン酸脱水素酵素（水色、18）による窒素循環。グルタミン酸脱水素酵素のフラックスが正の場合は、グルタミン酸を2-オキソグルタル酸に酸化する順反応、負の場合は、x軸より下にある逆反応を表す。
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図4：C. difficileのHRMAS NMRとdFBAを用いた代謝マップ。
図は、C. difficileの代謝マップを更新したもので、窒素循環におけるアラニンの役割（青）と、解糖系発酵と混合酸発酵（黄）、豊富なアミノ窒素を放出するスティックランド酸化反応（緑）および還元反応（暗赤）の統合を強調しています。このマップには、Wood-Ljungdahl経路（青緑）と鉄ヒドロゲナーゼ（「Hyd」）、そしてdFBAによって主要な電子シンクとして機能すると予測されたRnf-ATPaseシステム（酸化的発酵と還元的発酵間のATP生成電子伝達を担う）（灰色）も含まれています。番号のついた反応は、図3および補足表10の反応凡例に対応している。赤線で囲まれたボックスは、解糖系発酵とスティックランド発酵の間でピルビン酸、酢酸、アラニンをつなぐ中心的な反応である。
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ロイシンとプロリンの還元的代謝プールが枯渇した後、モデルシミュレーションでは、ソルボジェニックエタノール発酵（図3fと4、反応14）とヒドロゲナーゼフラックスの継続が主要な電子吸収源になると予測された。
24-36時間かけて行われる後期代謝は、ATP合成全体の残り14.1%を占めると予測され、酪酸とn-ブタノールを生成する還元的なソルボジェニック反応（図3a、f、4、反応8）、およびウッド-ジュンダール酢酸生成（図3g、4、反応15）への移行が顕著である。酪酸発酵における基質レベルのリン酸化は、この間のATP合成の6.1%に相当し、一方、残存する酸化的グルコース発酵は、この間のATP合成の71.3%を維持すると予測された。
代謝の全3段階を通じて、dFBAシミュレーションでは、Rnf複合体（図3hと4、反応14、酸化還元バランスとエネルギー生成）が酸化的代謝と還元的代謝の間のエネルギーカスケードを利用し、C. difficileのF型ATP合成酵素（図3a、hと4、反応7）によるプロトングラデーションとATP生成を生成すると予測しました。モデル解答では、膜関連ATP合成のピークは6.4時間で、アミノ酸発酵による還元的フラックスの最大値と同時であると推定された。その後、シミュレーションでは、ATP生成は主に混合酸発酵反応からRnf複合体とC. difficileのF型ATP合成酵素への電子移動によって維持されると予測した（図3hと図4、反応7）。
dFBAはアラニンでの解糖-スティックランド統合を予測した
HRMAS 13C NMRの軌跡から得たdFBAソリューションは、エネルギー生成、窒素処理、細胞成長をサポートする解糖系とスティックランドアミノ酸代謝の中央統合点として、ピルビン酸からアラニンへのトランスラミネーション（図3iと4、反応15）を予測した（図4、赤線枠）。モデル解答では、代謝の最初の10時間は、特にロイシンの急速な発酵によって、アミノ酸の正味の酸化的脱アミノ化が予測された（図3iと図4、反応16）。11時間後、解糖系代謝が促進されると、ピルビン酸からアラニンへのトランスアミノ化が起こり、ロイシン由来のアンモニアがグルタミン酸を通ってアラニンのアミノ窒素の56.4%を供給すると予測した（図4、アミノ窒素フローおよび補足表6）。
dFBAの代替目標がモデル予測を強化する
代謝の進行と経路統合のタイミングに関するモデル予測の一貫性を評価するため、バイオマス生産とエキソ多糖合成という別のモデル目標を用いてdFBAとFVAシミュレーションを行った（補足図4）。注目すべきは、推定された経路フラックスは、いくつかの反応においてフラックスの大きさとタイミングにわずかな違いがあるものの、目的に応じて一貫していることである。システイン発酵（補足図4b,k,t、反応9）の場合、シスタチオナーゼ活性は、ATP加水分解下の代謝初期に中心炭素プールを供給すると予測された。一方、バイオマスを目的とした場合、シスタチオナーゼのフラックスは代謝後期に最大となることがわかった。最大の違いは、エキソポリサッカライドを目的とした場合、フラックスは時系列を通して一貫して発生し、代謝の最初の10時間に最大となり、生成したピルビン酸を糖新生反応に振り向け、エキソポリサッカライド生合成のためにグルコースを生成する。
さらに、バイオマスシミュレーションでは解糖系フラックスが増加し、エキソ多糖類シミュレーションでは解糖系フラックスが減少している。エキソ多糖を目的とした場合の6時間前後のPGKフラックスがマイナスであることから、エキソ多糖合成経路にグルコース残基を供給するために、逆反応による生成物が糖新生経路に転用されたものと推察される。
上記の違いを除けば、推測されるフラックスの軌道はATP加水分解を目的とした場合と同様であった。また、アラニンの生合成は、脱アミノ化するスティックランド反応から解糖系ピルビン酸へのアミノ基の移動を支える代謝統合点であることが、3つの目的すべてで予測された。
代謝を通じた15Nと13Cの同時NMR追跡
発酵ロイシンから解糖系ピルビン酸へのアミノ窒素の流れに関するモデル予測を確認するために、我々は細胞内の炭素と窒素の流れを同時に追跡するNMRアプローチを開発した。15Nのような感度の低いNMR活性核の細胞内代謝の追跡は、13Cや1Hのような感度の高いNMR活性核の追跡よりも困難でした。なぜなら15Nは13C30に比べて15倍もシグナルが少ないからです。しかし、13Cと共有結合した15NとのNMR Jカップリングにより、13Cシグナルに核スピン-スピン分裂と同位体効果シフトの予測可能なパターンが生じるため、より感度の高い13C NMRスペクトルで感度の低い15N核を検出することができる（15N-13Cピーク分裂の分析）。
感度の低いNMR核からのシグナルを感度の高いNMR核のスペクトルで増幅することの実現性を確認するため、まず、[U-13C]グルコースで培養した細胞の1Hスペクトルにおいて、13Cによる酢酸のピークの分裂を評価しました。13C2]酢酸のメチル水素からのシグナルは二重のピークに分割され、メチル基の13C核とのよく分かれた1Hスピン結合（J約34Hz）とカルボキシル基の13C核との長距離結合（J約53Hz；拡張データ図6b）が示されました。さらに、1Hスペクトルにおける13C信号の増幅は、13Cスペクトル単独よりも30倍高い信号対雑音比（S/N）を示し（拡張データ図6b）、より感度の高いNMRスペクトル（1H）におけるスピン分裂が、比較的感度の低いNMR核種（13C）の検出を強化することを実証しました。
このNMR物理の特性を利用して、[U-13C]グルコースからの13Cバックボーンと[15N]ロイシンからの15Nアミノ基が同時に流れて[13C、15N]アラニンになるのを追跡しました（図1cと4、窒素循環）。
NMRで検出された15N-13C結合により、代謝の統合が確認される
U-13C]グルコースと天然ロイシンの存在下で増殖したC. difficileのHRMAS 13C NMRタイムシリーズは、[2,3-13C]アラニンと[U-13C]アラニンが1：1の比率で存在し（図5a、b、拡張データ図5a、補足表9）、多くのクロストリジアの種でピルベート：フェレドキシン酸化還元酵素を通じて起こることが報告されている、12CO2と [U-13C]acetate が同化した活性を示しています34。U-13C]グルコースと[15N]ロイシンの存在下で増殖したC. difficileは、アラニンのα炭素に関連する13Cピークの15Nによる分割（J⊖5.6 Hz）とアイソトープ効果によるシフト（δ⊖0.025 parts per million（ppm））とアラニンとアラニン混合集団（図5c、d、拡張データ図5bと補足表9）を認めた。15N]ロイシンは出発培地中のアミノ基窒素の33%に過ぎなかったが、[13C]アラニンの57%（標準偏差4%）が15N同位体を持ち（図5e）、発酵した[15N]ロイシンの[13C]アラニンへの15Nアミノ基転移を豊富に確認することが出来た。
図5：13C NMRは、スティックランド発酵ロイシンからアラニンの解糖系13Cバックボーンへの15Nアミノ窒素の流れを検出する。
a, 27.5 mM [U-13C]グルコースと7.6 mM天然ロイシンを含むMMM培地で36時間培養した後のアラニンのα炭素の13C NMRスペクトル (53.0-53.8 ppm). 太い黒線と灰色の網掛けは、3生物学的複製における平均13C NMRシグナル±s.e.mを表す。赤点線は[U-13C]アラニンに関連するJ-coupledピークを示す。オレンジ色の点線は、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素を介した[U-13C]酢酸との12CO2同化により生じた[2,3-13C]アラニンとのJ結合ピークを示す。 b, アラニンのα炭素における24時間代謝中のJ結合ピークの時系列（bに示すように色分けされた）。c, 27.5 mM [U-13C]グルコースと7.6 mM [15N]ロイシンで増殖した後の13C NMRスペクトル。[U-13C、15N] アラニン（青）または [2,3-13C,15N] アラニン（緑）からJ結合した分割ピークが見られる。紫色の線は[U-13C,15N]アラニンと[U-13C,14N]アラニンの混合ピーク、黄緑色の線は[2，3-13C，15N]アラニンと[2，3-13C，14N]アラニンによるピークを示します。13C NMR信号曲線は、aのように中心と変動を示す。 d, cのように色分けされたJ-coupledピークの時系列。 * 水色のピーク上のアスタリスクは、[2，3-13C，14N］アラニン、［2，3-13C，15N］アラニン、［U-13C，15N］アラニンの組み合わせを示す。e, 表は、[U-13C]グルコースと[15N]ロイシンを含む出発培地における14Nおよび15Nアミノ窒素の割合、および36時間の成長後のアラニンに関する結果としての統合14N-13Cおよび15N-13C割合（± s.d.）を示す（補足表9）。15N:14N同位体比の変動性を評価するため、N = 3生物学的複製を使用した。
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ディスカッション
複雑な嫌気性菌の代謝を通じた炭素と窒素の単一フローを追跡するためのHRMAS NMRとゲノムスケールの代謝モデリングの進歩を説明するものである。HRMAS NMRで使用される密閉型ローターチャンバーは、嫌気性環境を維持し、還元状態の維持、質量の保存、生物学的封じ込めを保証します。一方、GCやMS、通常の溶液NMRでは、長期的な分析に対応するために、数桁の容積と細胞量が必要になることが多い。また、HRMAS NMRデータセットの取得は、より迅速で、さらなる抽出や調製を必要としない。さらに、HRMAS NMRは、C. difficileのプロリン還元酵素セレノ酵素による[U-13C]プロリンの代謝に対するセレンの制限の影響によって示されるように、栄養供給源の明確な摂動に伴う代謝のシフトを検出できることも示しています25。
発酵可能な13C標識基質の長期的な追跡は、複雑な栄養条件下で個々の経路を高解像度でモニタリングするのに役立つ。ゲノムスケールの代謝モデルの細胞範囲は、発酵性基質を追跡する複数のNMRデータセットを統合したdFBAソリューションに組み込む手段を提供し、NMR分析では直接捉えられない経路のフラックスや、ATP生成、バイオマス、工業的・生理学的に重要な代謝物の生産などの細胞または実験目的を推論することができる。細胞代謝のゲノムスケール予測にNMR時系列データを使用する際のこれまでの制限を克服するために、我々は統合された13C NMR軌道をフラックス推定値に変換し、dFBAシミュレーションをサポートするアプローチを紹介する（Estimation of exchange fluxes for dFBA）。このアプローチは、プロリン発酵やグルコース発酵のように、直線的な経路だけでなく、複雑な分岐経路にも対応することができる。
NMR感度の低い15N核を感度の高い13C NMRで増幅する15N-13C J-カップリングを用いることで、原子種の同時追跡による化学的・生物学的関連性を明らかにするための概念的基礎を提示した。13C NMRの時系列は、発酵した[15N]ロイシンからグルコース由来の13Cバックボーンへの濃縮15Nフローを定量し、解糖系発酵とスティックランド発酵の間の中心的統合点としてアラニン形成を確認しました。このNMR J-カップリングの利用は、1Hや17Oなどの他のNMR活性核との共有結合にも拡張でき、NMR時系列で異なるスピン活性核を追跡し、dFBA（15N-13Cピーク分割の解析）によって予測される代謝統合点を実験的に確認することができます。
この結果は、C. difficileが、抗生物質で微生物相を破壊した後の生体内で起こる条件である、豊富な発酵性アミノ酸と炭水化物を提示されると、アミノ酸発酵経路を急速に呼び込むことを示し、生体内でのC. difficileの挙動に役立つ9. NMR情報に基づくdFBA溶液は、基質レベルのリン酸化反応とC. difficileの膜関連ATP合成酵素を介した迅速なATP生成を促進するStickland酸化・還元経路の早期採用を示し、一方、解糖・混合酸発酵経路は、発酵性アミノ酸のプールが枯渇すると代謝をサポートすることが予想された。このように、異なる目的モデル間でのdFBAソリューションの一貫性は、複雑な微生物代謝を徹底的に調べ、予測の頑健性を高めるだけでなく、特定の目的に最適化する際に起こりうる代謝や細胞の挙動における特定のニュアンスを特定するために、このアプローチを使用することを示しています。
NMR時系列とゲノムスケールの代謝解析により、スティックランド発酵菌が、スティックランド代謝と高フラックス解糖代謝を統合し、アラニンを生成して細胞成長、エネルギー生成、よりエネルギー効率の高い窒素処理をサポートする独自の戦略も明らかになりました20,35。dFBAシミュレーションでは、窒素の流れが2相に分かれていることが予測された。第1相は、クロストリジウムのスティックランド発酵中にアミノ酸の酸化的脱アミノ化によって大量のアンモニアが放出される（図3b、e、iおよび4、反応18、窒素循環）25。第二段階は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによる放出アンモニアの再同化と、それに伴うピルビン酸のアラニンへのトランスアミネーションが特徴である（図3iおよび4、反応17および18）。U-13C]グルコースとL-[15N]ロイシンを添加して培養したC. difficileのHRMAS 13C NMRでは、ロイシンから解糖系ピルビン酸の炭素バックボーンで形成したアラニンへ窒素が豊富に流れるというモデル予測を確認しました（図4、5c、d、窒素サイクリング）。好ましいスティックランド受容体が枯渇した後（図3e、反応12と13）、アラニンが窒素シンクとして使用されると、還元当量が消費され、高流量解糖および混合酸発酵におけるATP生成酸化反応（図3iと4、反応17と18）35のために酸化電子キャリアを再生し、タンパク質とペプチドグリカンの合成36、エネルギー貯蔵28、37および浸透圧バランス38、39において細胞システムをさらに支える。
ライブセルHRMAS 13C NMRと動的代謝モデリングにより、多様な用途に対応した細胞規模の嫌気性代謝を定義する統一的な方法論が提供されます。この分析手法は、抗生物質に対する微生物の反応や、異なる投入原料から生物活性や工業的に重要な化学物質を生産する条件の最適化など、原核生物の生理学のさらなる分析を支援することができます。
研究方法
ストレインズ
NMR 分析におけるバイオハザードのリスクを軽減するため、C. difficile ATCC 43255 の tcdB、tcdE、tcdA 遺伝子を欠失した病原性遺伝子座（PaLoc）欠失株が作製された。この欠失変異体は、毒素を介した対立遺伝子交換法を用いて作成した40。簡単に説明すると、病原性遺伝子座に隣接する約800bpのDNAを、補足表11のプライマーを用いてC. difficile ATCC 43255からPCRにより増幅した。精製したPCR産物を、NEBuilder HiFi DNA Assemblyを用いてpMSR0ベクターのPmeI部位にクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌NEB10β株（New England Biolabs）に形質転換し、シークエンスにより挿入を確認した。大腸菌は、Luria-Bertani（LB）培地またはクロラムフェニコール（15μg ml-1）を添加したLB寒天培地で37℃にて好気的に培養した。その後、プラスミドを大腸菌HB101（RP4）に形質転換し、50℃で15分間熱ショックしたC. difficile ATCC 43255にコンジュゲートした。トランスコンジュガントは、シクロセリン（250μg ml-1）、セフォキシチン（25μg ml-1）およびチアンフェニコール（15μg ml-1）を用いたBrain Heart Infusion（BHI）寒天プレートで選択した。対立遺伝子交換は、記述された通りに行った40。この菌株は、Girinathanら9.に記載された方法を用いて、ヒト線維芽細胞に対して非毒性であることが示された。
菌株の培養条件
ATCC 43255のΔPaLoc株を補充したBHI培地（Remel）で12時間培養した。細胞を予備調製したPBSで3回紡糸・洗浄し、分子清浄水で調製し、10万個の細胞をHRMAS NMRローターインサートに導入するために希釈して分析した。調製液を連続希釈し、ブルセラ寒天培地（Remel）にプレーティングして、入力調製液に使用した植物細胞と芽胞を定量化した。BHI培地で12時間培養した後の芽胞数は、生細胞の0.1%未満であった。
C. difficile MMM（pH 7.2）は、C. difficile最小培地（CDMM）41に100μMの亜セレン酸ナトリウムと0.5％のグルコースを添加することで調製されました。MMMは、同じ濃度の天然炭素同位体存在量アナログ（Sigma-Aldrich）の代わりに、[U-13C]グルコース（D-glucose-13C6、99原子）、L-[U-13C]プロリン（L-proline-13C5、99原子％）またはL-[U-13C]ロイシン（L-leucine-13C6、98原子％）で置換して準備した。Stickland発酵ロイシンから解糖で生成される[U-13C]ピルビン酸へのアミノ窒素の流れを評価する研究では、L-[15N]ロイシン（Sigma-Aldrich）を使用しました。
HRMAS Kel-F ローターインサート（Bruker BioSpin Corporation）は、MMM を定義するために、嫌気性チャンバーで約 100,000 CFU を装填した。インサートは密閉され、NMR 分析のためにチャンバーから取り出された。
分析後、ローターの内容物はpHを確認し、連続希釈し、ブルセラ寒天培地にプレーティングし、37℃で嫌気的に培養し、細胞バイオマスと汚染種の不在を確認した。また、内容物をグラム染色し、光学顕微鏡で可視化し、細胞の形態を確認した。ローター内で発生した細胞増殖は、補足表1に示すとおりである。36時間の分析後、pHは7.17から7.27の範囲に保たれた。
HRMAS NMR
HRMAS NMR測定は、Bruker Avance III HD 600MHzスペクトロメーター（Bruker BioSpin Corporation）を用いて実施した。嫌気性チャンバーに生細胞を装填した密封Kel-Fインサートを、2μlのD2O（フィールドロック用）とともに4mmジルコニアローターに設置してからローターを密封し、三重共鳴HRMASプローブ内に導入した。1次元および2次元（1D、2D）の1Hおよび13C NMRは、37℃、スピンレート3,600±2Hzで実施した。1次元時系列スペクトルは、水を抑制した1H NOESY（NOE分光法）（約13分）とプロトン脱離した13C（約43分）を実験時間中、交互に連続測定した。2次元1H COSY（相関分光法、約3時間49分）、プロトン脱離13C COSY（約3時間30分）、13C脱離1H-13C HSQC（異核信号量子干渉、約3時間38分）スペクトルは1次元時系列間に挿入された。磁気共鳴スペクトルは、TopSpin 3.6.2 (Bruker BioSpin Corporation)、およびNUTS (Acorn NMR Inc.)を用いて処理した。
非スピニングコントロール実験
HRMAS NMRローターの回転が細胞形態、代謝、バイオマスに与える影響を評価するため、「菌株培養条件」のセクションで説明したように密封したHRMASインサートを準備し、HRMAS NMRを実施したペアインサートを評価する実行期間中は回転させずにインキュベーションした。HRMAS NMRのセクションに記載されているように、インキュベーション期間終了後、スピンしていないインサートから1Dおよび1Dの1Hおよび13C NMRスペクトルを取得し、スピンしたインサートと比較しました。ローターの内容物は、「菌株の培養条件」の項で説明したように分析した（補足表1）。解析の結果、代謝プロファイルは同等であった。グラム染色では、NMRの外で維持されたローターは、胞子と溶解した母細胞の存在によって証明されるように、ポストポーレーション状態への培養の進行がより進んでいた（Extended Data Fig.1）。
2D NMRによる代謝産物の同定
U-13C]グルコース、L-[U-13C]プロリン、L-[U-13C]ロイシンから生細胞内で生成した13C標識代謝物は、Human Metabolome Database (HMDB, https://hmdb.ca) と Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB, https://bmrb.io) から得た13Cおよび1H化学シフト値に従って2D NMR (Extended Data Fig 6) により特定されました。
1Hおよび13Cスペクトルの解析
個々の自由誘導減衰（.fid）ファイルは、NMRPipe42、nmrglue43、およびGitHubリポジトリで利用可能なカスタムPythonスクリプトを使用して処理しました。フーリエ変換されたスペクトルは、スパースな130-160ppm領域のノイズの二乗平均平方根誤差で正規化した（補足図2-4）。正規化されたスペクトルスタックは、MATLAB R2019b (MathWorks)の表面プロットとして、面の明るさが信号のlog2にマッピングされた状態でレンダリングされた。高さがノイズの二乗平均平方根誤差の6倍以上（130-160 ppm）で、他のピークから0.08 ppmだけ離れたピークは、検出可能なシグナルとして分類され、以下のアルゴリズムで化合物に割り当てられました。
(1)
互いに0.3ppm以内のサブピークをクラスター化した。
(2)
クラスターから0.45ppm以内の予想化合物のリファレンスシフトは、クラスターと関連していた。
(3)
一つの参照ピークに関連するクラスターのサブピークは、すべてその参照ピークを生成する化合物に割り当てられた。
(4)
1つのクラスターが複数の参照ピークと関連している場合、HMDBの参照化学シフトと関連する分割パターンに従って、化合物にサブピークを手動で割り当てた。検出されたサブピークの数が、寄与する参照ピークの予想される多重度よりも少ない場合、広範な重複が疑われ、クラスターは分析から除外された。これは、[U-13C]ロイシンの実験における約 24.6 ppm のイソバレレートおよびイソカプロエートのシフトの場合である。手動で割り当てた残りのクラスターは、1D 13C および 1D 1H-13C HSQC スペクトルを使用して、解決可能な重複がある場合にサブピークをデコンボリューションしました。
割り当てられたピークシグナルはシグナルリッジに連結され、代謝物ごとにカラーラベルが付けられ、xy平面へのステムと平滑化スプライン曲線フィットによる散布図としてスタック上に重畳された。各基準ピークの0.5 ppm以内の表面領域が着色された。
13Cスペクトル≦100ppmのピークをVoigt（ガウス-ローレンツィアン畳み込み）線型でカーブフィットし、積分した。代謝物積分値の時間に対するロジスティックカーブフィットは、Pythonで最小二乗回帰（SciPy44 v.1.6.2）を用いて式（1）により算出した（補足表2）。U-13C]グルコース実験の1Hスペクトルの酢酸およびエタノールメチル水素に割り当てられたピークも、自然存在量の酢酸の生成を推定するためにカーブフィットした。
セレン摂動実験
HRMAS NMRは、30mMのL-[U-13C]プロリンを過剰に含むMMMで、100μMの亜セレン酸ナトリウムを含むか含まないかで、上記のように培養を行った。プロリンの枯渇は、最終的な積算[13C]プロリンシグナルと開始時の積算[13C]プロリンシグナルの比として見積もられた。相対的な5-アミノバレレート生成量は、最終積算[13C]5-アミノバレレートシグナルと開始積算[U-13C]プロリンシグナルの比率を比較することにより推定した。
代謝モデリング
C. difficile 630株icdf834のゲノムスケール代謝モデル（文献45）は、COBRApyツールボックス46とカスタムPythonスクリプトを使用して修正した。NMR軌道の制約を受けない代謝物については、交換反応境界を実験的に使用した培地成分のミリモル濃度の3％に設定した（Strain culture conditions）。システインの取り込み上限は、細胞の需要に応じた取り込みを可能にするため、1,000に設定した。その他の交換反応は、フラックスの上限と下限をゼロに設定することでブロックされた。
GitHubリポジトリに含まれるアップデートモデルであるicdf843は、実験データによって支持された補足表4（参考文献5,9,20,28,35）に記載された変更を追加し、エネルギー的および熱力学的に生物学的に関連するプロセスを支持した。また、鉄（II）の交換反応、プロピオン酸、フェニル酢酸、インドール-3-酢酸、酪酸、n-ブタノール、硫化水素の輸送・分泌反応、酢酸、L-アラニン、L-ロイシン、L-プロリン、L-イソロイシン、イソバレレート、イソブチレート、2-メチルブチレート、イソカプレート、5-アミノバレレートに対するプロトン起電力に応じた輸送反応などが加えられた。
dFBAの交換フラックスの見積もり
1H-NMRスペクトルの相対プロトン量とピーク面積の直接的な関係は、試料中の特定の分子コンテキストにおけるプロトンの相対量を推定するのに利用できますが、13C NMRでは、隣接プロトンと13C核の間のNOE交差緩和21などの分子コンテキスト効果により、13C存在量とピーク面積の間に同等の関係が存在しません。このような13C NMRの特性により、相対的な信号強度のみを用いて代謝物濃度を信頼できる形で推定することはできません。
交換フラックスを制約するために代謝物濃度を推定するための13C NMRの限界を克服するために、以下のアプローチを使用した。まず、13C基質のロジスティック微分方程式（3）をMMMの入力濃度でスケーリングし、基質の取り込みフラックスを推定する方程式を作成した。次に、標識基質が発酵する際に生成される代謝物を評価し、単一または複数の代謝経路からの由来を予測した。経路の関連性が不明または不完全に定義されている場合は、より複雑な複数の経路起源のケースを使用しました。
最も単純な方法は、標識基質とその生成物が1：1の関係にあり、生成物フラックスの制約が必要ない場合に用いられ、既知の入力基質濃度でスケーリングしたロジスティック方程式を使用して基質交換フラックスを推定する。C. difficileでは、プロリン発酵は明確に定義されており、5-アミノバレレート4が得られる単一の経路をたどることだけが知られているため、この手法の理想的な候補となります。また、少量のプロリンはタンパク質合成にも使用されます。ここで、[Proline]initはNMR測定時の初期プロリン濃度、LProlineとCProlineはプロリンのロジスティック方程式（1）係数です。プロリン還元酵素を持つスティックランド発酵菌は、この代謝経路でほとんどのプロリンを消費するため、5-アミノバレレートフラックスに制約を与えず、バイオマス生産へのプロリン利用は比較的控えめにしています4,25。この方法は、プロリンのような単一で明確な発酵経路を持つ化合物に最適で、生成物の交換フラックスに制約を加える必要がない。
ロイシンが2つの経路で発酵するように、標識基質が複数の生成物に代謝される場合5,6、炎イオン化検出器付きGCを用いて予想される比率を決定することにより、生成物のイソカプロン酸およびイソバレルの交換フラックスを推定しました。揮発性短鎖脂肪酸は、Girinathanら9の記載に従って、イソロイシンを欠くMMMで培養したC. difficile ATCC 43255 ΔPaLocの定常期培養から抽出・定量し、補足表12に示すように算出した。ロイシン1モルあたりのイソカプロン酸およびイソバレートの収率（YProduct）は、火炎イオン化検出器の読み出し値における各生成物の入力ロイシンに対するモル比を取ることによって推定された。次に、各製品について式(2)に係数[Leucine]init×YProduct/LProductを乗じることにより、NMRランのフラックス軌道を推定した（[Leucine]initはNMRランにおける初期ロイシン濃度である）。
3番目の例では、入力されたグルコース濃度、グルコースと各代謝物の相対的な13C NMRピーク面積、およびU-13C代謝物を含む標準溶液から経験的に導かれたNOEによるシグナル増強の補正係数を用いて、[U-13C] グルコース代謝物の交換フラックスを推定しました。グルコース発酵は中心的な炭素代謝と高度に統合されているため、グルコース発酵由来の酢酸とグリシン発酵由来の酢酸のように、13C入力基質に固有の生成物濃度を推定する方法が必要である。この場合、13C NMR下で実験のダイナミックレンジ内の標準溶液を測定し、ピーク面積を積分して、各化合物の濃度と信号振幅の関係を推定しました。ダイナミックFBAの「結果」で述べたように、13C NMRの信号振幅は、個々の13C原子の分子コンテキストに依存し、予測可能な要因の影響を受けます。最も顕著なのは、1H-13C NOEとスピン回転です21。我々は、13C NMR信号振幅に対するこれらの特性の相対的な効果は、NMR取得パラメータに関係なく13C原子間で一貫していると仮定し、したがって、13C NMR信号増強は、［U-13C］グルコースに対する各生成物の相対NMR信号-濃度比と定義します。補足表13に示す溶液を13C NMRで測定し、上記のHRMAS NMRおよび1Hおよび13Cスペクトル解析の手順で処理した。各標準溶液中の［U-13C］アセテート、［U-13C］アラニン、［U-13C］エタノール、［U-13C］ブチレート（Sigma-Aldrich）の濃度-信号比を、同じ標準溶液中の［U-13C］グルコースの濃度-信号比に対してプロットし、最小二乗回帰を用いて方程式に当てはめた。
$$\begin{array}{{20}{c}} {y = ax} \end{array}$$です。
(3)
ここで、1/aはグルコースに対する各代謝物の13C NMRシグナル増強を表す（Extended Data Fig.7）。低強度のピーク（ピーク面積<18正規化信号単位/ppm）を除外した場合、各化合物について強い相関が観察され（R2値は拡張データ図7に表示）、グルコースに関する各代謝物の13C NMR信号増強は、一貫性のない取得パラメータの下でも実験間で一貫性があることが示唆された。次に、各生成物の正規化スキームを以下のように導出した。
$$\begin{array}{{20}{c}} {left[ {{{mathrm{Product}}}} ㊤]{{mathrm{est}} = ㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊧㊨㊡{{{s_d_dict}}}}}{{lft[ {{{matthrrm}}}}｝}} {{laft[ {{mathmathrrm}}}}｝㏌{{mathmathm}}㐟}}}}}}}}}} \times \frac{{S{{{{\mathrm{Product}}}}}}}{{S_{{{{\mathrm{Glucose}}}}}}} \ʾʾʾʾʾʾʾʾʾ╱╱╱╱╱㍑ \end{array}$$です。
(4)
$$\begin{array}{{20}{c}} {left[ {{{Mathrm{Product}}}} ㊤]{{Mathrm{est}}} = ㊤[ {{{Mathrm{Glucose}}}}} ㊤{S{{{Mathrm{Product}}}}}{{S_{{{Glucose}}}}}}} {{{Mathmathrm {Product}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}{{{{{Mathrm}}}}}}}} {{{{Mathrm{Glucose}}}}}}}{{{Mathrm}}}}{{{Matherm}}}{{{Mathhem}}}}{{{Philter \times \frac{{\frac{{\left[ {{{{\mathrm{Product}}}}} \right]}}{{S_{{\mathrm{Product}}}}}}}{{\frac{{\left[ {{{{\mathrm{Glucose}}}}} \right]}}{{S_{{{{\mathrm{Glucose}}}}}}}}}} \end{array}$$です。
(5)
$$\begin{array}{{20}{c}} {left[ {{{Mathrm{Product}}}} ㊤]{{Mathrm{est}}} = ㊤[ {{{Mathrm{Glucose}}}}} ㊤{S{{{Mathrm{Product}}}}}{{S_{{{Glucose}}}}}}} {{{Mathmathrm {Product}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}{{{{{Mathrm}}}}}}}} {{{{Mathrm{Glucose}}}}}}}{{{Mathrm}}}}{{{Matherm}}}{{{Mathhem}}}}{{{Philter \ʕ-̫͡-ʔ͡-ʔ$$ʘ
(6)
ここで、[Product]estは製品の推定濃度、[Glucose]はランのための[U-13C]グルコースの既知の入力濃度、SProduct/Glucoseは製品とグルコース間の最大統合信号の比、fProduct（36）/fGlucose（0）で求められ、fは式（1）でロジスティック方程式、aは式（3）の製品固有係数である。次に、各製品のロジスティック微分方程式（2）に[Product]est/LProductを、グルコースのロジスティック微分方程式（2）に[Glucose]/（LGlucose + CGlucose）を掛け、方程式をフラックストラジェクトリに変換しました。この方法は、標識生成物が市販されていたり、抽出が容易であったりする、複数の生成物を持つ化合物に最も適している。
1H-NMRでは、積分された信号の比からプロトンの多重度を直接推定することができる。U-13C]グルコース分析における天然物由来の酢酸の濃度とフラックス曲線を推定するために、13C-酢酸の推定濃度に天然物由来の酢酸と13C-酢酸の統合メチルプロトン信号の比を掛け合わせた。
濃度とフラックスの推定値の誤差は、SciPyの最小二乗フィット関数によって決定されたロジスティック係数の誤差を伝播することによって推定された。ロジスティック方程式(1)の標準誤差を表す関数は、以下のように定義した。
$$\begin{array}{{20}{c}} {delta fleft( x ˶ˆ꒳ˆ˵ ) = ˶ˆ꒳ˆ˵ ( {frac{{partial f}}{{partial L}}delta L})^2 +˶ˆ( {frac{{partial f}}{{partial k}}delta ) k} ╱右）^2＋╱左（ {frac{{partial f}}{{partial x_0}}}delta x_0} ╱右）^2＋╱左（ {frac{{partial f}}{{partial C}}delta C}）^2} . } \end{array}$$です。
(7)
ここで
$$\begin{array}{{20}{c}} {frac{partial f}}{{partial L}} = \frac{{f - C}}{L}}. \end{array}$$です。
(8)
$$\begin{array}{{20}{c}} {frac{partial f}}{{partial k}} = \left({f - C}}){{frac{{partial f}}^{k}left( {x - x_0} }}}{{1 + {}mathrm{e}}^{k}left( {x - x_0} ｜ }}}} (右) } ㊟㊟㊟㊟$$$。
(9)
$$\begin{array}{{20}{c}} (右) } ㊟㊟㊟㊟$$$。
(10)
$$\begin{array}{{20}{c}} {frac{partial f}}{{partial C}} = 1}. \end{array}$$です。
(11)
であり、ǖL、ǖk、↪L_1D6FF↩x0、ǖC はロジスティック係数の標準誤差を表す。同様に、ロジスティック微分方程式(2)の標準誤差を表す関数を以下のように定義した。
$$\begin{array}{{20}{c}} {delta f, ^{prime} ㊤＝㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊦㊧×××××＝㊨＋㊧（✞は××××）××× ×××（×は f^{partial f^{partial k}}delta k} ㊤)^2 + ㊦( {frac{partial f^{prime} }}{{partial x_0}}}delta x_0} ㊦)^2} ㊤) } \end{array}$$です。
(12)
ここで
$$\begin{array}{{20}{c}} {frac{partial f^{prime} }}{{partial L}} = \frac{{f^{prime} }}{L}}。\end{array}$$です。
(13)
$$\begin{array}{{20}{c}} {frac{partial f^{partial }}{{partial k}} = \left( f,^{prime} ㊟) ㊟( {frac{1}{k}) - x + x_0 + \frac{{2left( {x - x_0} ╱){mathrm{e}}^{-kleft( {x - x_0} ╱)}}}{1 + {mathrm{e}}^{kleft{{x-x_0}ㅂ}}}}{{{1+}}。(右) } ㊟㊟㊟㊟$$$。
(14)
$$\begin{array}{*{20}{c}} {frac{{partial f^{prime} }}{{partial x_0}}} = \left( f,^{prime} ╱) {frac{k{mathrm{e}}^{-kleft( {x - x_0}╱)} - k}}{1＋{mathrm{e}}^{-kleft( {x - x_0}╱)}}}}{{mathemathod}{k{frac{mathrm{e}}}{{k}} (右) } ㊟㊟㊟㊟$$$。
(15)
時間軸を合わせ、平均ロジスティック係数を算出する。
1H-NMRの0.864ppmのピークで表されるイソカプロン酸の生成速度は、1H-NMRスペクトルで0.864ppmのイソカプロン酸ピークがよく分離され、確実に検出できるため、3つのランの時間軸を合わせるための正規化マーカーとして選択された。1Hおよび13Cスペクトル解析の項で述べたように、各ランの1H時系列における0.864ppmのイソカプロエートのピークにロジスティック曲線（1）をあてはめた。3つのランの時間軸は、イソカプロン酸1Hシグナルへのロジスティックカーブフィットが最大値の5%となる時間を揃えて正規化した（補足図1c、f、i、2c、f、iおよび3c、f、i）。
すべての制約付き代謝物の平均ロジスティック係数を計算し、3つの実験レプリケートで平均をとった。ロジスティック係数の誤差は二乗和のルートとして伝搬した（補足表3）。代謝物が検出されなかったり、シグナルが低すぎてロジスティック曲線フィッティングがうまくいかない場合、濃度推定値は曲線フィッティングが可能なシグナルを持つランの数に比例してスケーリングされた。
ダイナミックFBA
dFBAは、COBRApyツールボックス46とカスタムPythonスクリプトを使用して、時間依存の交換フラックスと定常状態のFBAおよびFVAソリューションを計算することにより実装されました。交換（入力代謝物）および分泌（最終代謝物）の上限および下限は、dFBAの交換フラックスの推定および時間軸の整列と平均ロジスティック係数の計算のセクションで説明したように変換したロジスティック関数微分（2）に設定し、時間ポイントごとに評価した（図2b、d、fおよび補足表4と6）。ロイシン交換フラックスは、モデル許容度が低いため、制約のないままにした。したがって、グルコース交換フラックスは、観察された短鎖生成物が得られると予想される速度でグルコースを取り込むことのみを可能にするよう制限した。また、同化作用に移行したグルコースは、ATP加水分解と競合するため含めなかった。
シミュレーションの前に、モデルにさらなる制約が課された。Neumann-Schaal らは、アミノ酸が豊富な培地では、2-メチル酪酸の分泌は5-アミノバレートの分泌とほぼ一致し、イソ酪酸の分泌はイソカプロン酸の分泌とほぼ一致することを示した23。そこで、2-メチル酪酸の分泌フラックスをイソバレートの軌跡に設定し、半値係数x0が5-アミノバレートのそれと等しくなるようにシフトし、完全発酵を想定して、上漸近線Lが入力イソロイシン濃度と等しくなるようにスケーリングした。同様に、イソ酪酸の分泌フラックスはイソバレートの軌道にロックされ、半値係数x0がイソカプロン酸のそれと等しくなるようにシフトされ、GCで決定されたイソ酪酸/イソバレートの比によってスケールされた（補足表12）。さらに、アセチル-CoA合成酵素のフラックスは、in vitroの結果とGencicら35が提唱した代謝機構に従って、酪酸の分泌にロックされていた。最後に、システインやグリシンの発酵、Wood-Ljungdahl経路など、非グルコース炭素源からの酢酸生成反応を考慮し、グルコース由来の酢酸の13C NMR曲線に、天然由来の酢酸フラックスの1H-NMR曲線を追加しています。
ATP加水分解は、対数期、定常期、胞子形成期に共通する代謝ドライバーとして生物学的目的に選択されました（補足情報）。定常状態のFBA溶液は、36時間のタイムスケールをシミュレートし、1時間あたり5溶液の分解能で計算しました。FVA解は、同じシミュレートされたタイムスケールに沿って、99.5%の目的フラックス閾値で計算された。選択した反応の代謝フラックス軌跡は、カスタムMATLABスクリプトを使用して可視化した（図3）。細胞質L-アラニン、L-グルタミン酸、ATP、ピルビン酸、アンモニアの生成と消費に寄与するフラックスは、各タイムポイントで記録した（補足表6、C-AL列）。
フラックス比率の算出
ATP流入への寄与は、補足表6に記録された反応フラックスを、ATPフラックス全体に対する割合として計算したものである。
1.
初期段階のATP産生酸化的スティックランドフラックスは、0時間から9.8時間までのATP産生酸化的スティックランドフラックス（深緑色の網掛け）と0時間から9.8時間までのATP流入量の合計（明暗の網掛け）の比としてとらえた。
2.
後期ATP産生酪酸フラックスは、24時間から36時間までの酪酸キナーゼフラックス（暗橙色シェーディング）と24時間から36時間までの全ATP流入量（明橙色シェーディング）の比としてとらえた。
3.
ATP産生に対する総解糖系寄与度は、0時間から36時間までの総ATP流入量に対する赤枠領域の比率として算出した。
4.
各区間の解糖系フラックス（赤枠と各陰影領域の交点）を各陰影領域のフラックス（0～9.8、10～23.8、24～36時間はそれぞれ緑、紫、オレンジ）で割った値を各区間のATP産生への解糖系寄与度とする。
5.
各時間間隔におけるATP生成の割合は、各陰影領域のフラックス（0-9.8、10-23.8、24-36時間それぞれ緑、紫、オレンジ）の総ATP流入量に対する比とした。
L-ロイシンからL-アラニンへの予測アミノ窒素フローは、以下のスキームで推定した。アンモニア代謝の2つのフェーズを定義する：アンモニアの純分泌がある1〜9時間の脱アミノフェーズと、アンモニアの純吸収がある10〜21時間の同化フェーズである。各時点におけるL-ロイシンからのL-アラニンアミノ基の寄与を正確に捉えるために、ロイシンからグルタミン酸を介してアラニンに直接移行するアミノ基と、脱アミノ段階で放出され同化段階でグルタミン酸を介してアラニンにリサイクルされるロイシンに由来するアンモニアを考慮しました。
ロイシン-アラニンのアミノ基転移の最終段階は、アラニントランスアミナーゼによるグルタミン酸とピルビン酸のトランスアミノ化であると仮定しています。したがって、各タイムポイントにおいて、ロイシン由来のアラニンのシェアは、グルタミン酸上のロイシン由来の窒素の割合にアラニントランスアミナーゼの総フラックスを掛けたものになる。このロイシン由来のグルタミン酸のシェアは、脱アミノ化段階でロイシントランスアミナーゼによって生成されたグルタミン酸のみからなる。同化期には、脱アミノ化期に放出されたロイシン由来のアンモニアからグルタミン酸デヒドロゲナーゼの逆反応によって合成されるグルタミン酸の成分が追加される。この第2の成分は、プールされたアンモニアのうち、ロイシンアミノ窒素として起源を持つものの割合に、グルタミン酸脱水素酵素フラックスを乗じたものとして推定される。
ロイシン由来のアンモニアは、ロイシントランスアミナーゼの作用とグルタミン酸脱水素酵素の前進反応の組み合わせによって脱アミノ化されたロイシンアミノ窒素の累積値として推定されます。各タイムポイントにおいて、これはグルタミン酸デヒドロゲナーゼフラックスにロイシントランスアミナーゼフラックスを掛け合わせたもので、全グルタミン酸流入量に対する割合である。脱アミノ相の終了時にロイシンアミノ窒素として発生したプールされたアンモニアの割合は、ロイシン由来のアンモニアの累積和を脱アミノ相中の総アンモニア生成量で割ることで推定される。
これらの計算はすべて、補足表6のロイシン-アラニンの計算の見出しに記録されている。
13Cアラニンの13C NMRスペクトル解析における15N-13Cピーク分割の解析
13Cスペクトルにおける15Nの検出のために、C. difficile ATCC 43255 ΔPaLocの3連培養物を、[U-13C]グルコースと天然ロイシンまたは[15N]ロイシンを含むMMM中で嫌気的に培養した。接種から48時間後に培養液を遠心分離し、上清を回収してフィルター滅菌し、凍結乾燥してD2Oに再添加した。Bruker BioSpin（Bruker Corporation）で測定したNMRデータを、NUTS, 2D Pro（Acorn NMR Inc.）で解析した。.fidファイルは0.2Hzの線幅で処理され、フーリエ変換の前にゼロフィルされた。フーリエ変換後、ローレンツ線形状を用いたカーブフィッティングにより共鳴ピークを定量化した。カーブフィッティングは、まずグローバルに行い、フィットしたすべてのピークの平均ピーク幅を決定した。その後、幅の平均とローレンツ関数を用いて曲線を再フィットした（Extended Data Fig.5）。
U-13C]グルコースと[15N]ロイシンを含む培地におけるアラニンのα-炭素の13C NMR分析
13C NMRスペクトル領域におけるアラニンのα-炭素からの複雑なピークは、（1）考えられる13Cラベルパターン（拡張データ図8a）に基づいて分解することができる。8a）。（a）13Cはアラニンの3つの炭素すべてに現れる可能性があり、その結果、α炭素に4つのピークが発生する。（b）炭素13はアラニンの2つの炭素だけに現れることもある。[1,2-13C]アラニンと[2,3-13C]アラニンは検出可能なα-炭素13C NMR信号を生成せず、アラニンの2つの13C標識アイソトポログはいずれもα-炭素に対して二重項ピークを生成し、（c）炭素13はアラニンとしてα-炭素上にのみ出現して一重項ピークを生成します。(2) 15N-13CのJ-カップリングにより、15Nがα-13Cに結合するとα-炭素-13C NMRピークが2つのピークに分かれる（Extended Data Fig. 8b）。(3) 同位体効果により、測定された共鳴に小さなシフトが生じる33 (拡張データ図8d)。
報告書のまとめ
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご確認いただけます。
データの入手方法
本研究で生成されたすべてのNMR自由誘導減衰ファイルは、Metabolomics Workbench47でST002433研究として公開されています（https://doi.org/10.21228/M88M5G）。更新されたC. difficile代謝モデルicdf843は、GitHub（https://github.com/Massachusetts-Host-Microbiome-Center/nmr-cdiff）で入手可能です。本研究で生成された残りのデータは、本論文およびその補足情報ファイルに含まれています。本研究でNMRスペクトルの分子同定に使用した参照スペクトルは、HMDB（https://hmdb.ca/）とBMRB（https://bmrb）からアクセスした。 io）のL-プロリン（HMDB, HMDB0000162; BMRB, bmse000047）、5-アミノバレレート（HMDB, HMDB0003355; BMRB, bmse000419）、L-ロイシン（HMDB, HMDB0000687; BMRB、bmse000042）、イソバレレート（HMDB、HMDB0000718；BMRB、bmse000373）、イソカプロン酸（HMDB、HMDB0000689）、D-グルコース（HMDB、HMDB0000122。BMRB、bmse000015）、アセテート（HMDB、HMDB0000042；BMRB、bmse000191）、エタノール（HMDB、HMDB0000108；BMRB、bmse000297）、L-アラニン（HMDB、HMDB0000161; BMRB、bmse000994）、L-乳酸（HMDB、HMDB0000190；BMRB、bmse000269）、酪酸（HMDB、HMDB0000039；BMRB、bmse000402）およびn-ブタノール（HMDB、HMDB0004327；BMRB、bmse000447）です。
コードの入手方法
本研究のために開発したすべてのカスタムコードは、GitHub（https://github.com/Massachusetts-Host-Microbiome-Center/nmr-cdiff）で公開しています。
参考文献
Schonheit, P., Buckel, W. & Martin, W. F. On the origin of heterotrophy. Trends Microbiol 24, 12-25 (2016).
記事 PubMed Google Scholar
Cheng、C., Bao、T. & Yang、S. T. Engineering Clostridium for improved solvent production: recent progress and perspective. Appl. Microbiol. バイオテクノロジー（Biotechnol. 103, 5549-5566 (2019).
記事CAS PubMed Google Scholar
Guh, A. Y. et al. U.S. burden of Clostridioides difficile infection and outcomes（米国におけるクロストリジウム・ディフィシル感染症の負担と転帰の傾向）. N. Engl. J. Med. 382, 1320-1330 (2020).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
プロリン依存的なClostridium difficile Stickland代謝の制御。J. Bacteriol. 195, 844-854 (2013).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
クロストリジウム・ディフィシルによるL-ロイシンのイソカプロン酸への還元に関与する（R）-2-hydroxyisocaproate dehydrogenaseおよびファミリーIIIコエンザイムAトランスフェラーゼの特性評価。Appl. Environ. Microbiol. 72, 6062-6069 (2006).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Pavao, A. et al. Clostridial Stickland アミノ酸発酵の生体内機能を再考察する。Anaerobe https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2022.102600 (2022).
Fletcher, J. R. et al. Clostridioides difficileは、毒素を介した炎症を利用して宿主の栄養状態を変化させ、腸内細菌叢から競合を排除する。Nat. Commun. 12, 462 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Bouillaut, L., Dubois, T., Sonenshein, A. L. & Dupuy, B. Clostridium difficileにおける代謝と毒性との統合. Res. Microbiol. 166, 375-383 (2015).
記事CAS PubMed Google Scholar
Girinathan, B. P. et al. In vivo commensal control of Clostridioides difficile virulence. Cell Host Microbe 29, 1693-1708.e1697 (2021).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Cheng, L. L. et al. 高分解能マジックアングルスピニングプロトン磁気共鳴分光法による定量的な神経病理学。Proc. Natl Acad. Sci.USA 94, 6408-6413 (1997).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Tilgner, M., Vater, T. S., Habbel, P. & Cheng, L. L. メタボロミクスにおける高分解能マジックアングルスピニング（HRMAS）NMRメソッド。Methods Mol. Biol. 2037, 49-67 (2019).
記事CAS PubMed Google Scholar
Judge, M. T. et al. NMRによるin vivo代謝の連続性。Front Mol. Biosci. 6, 26 (2019).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Cheng, L. L. et al. Magic-angle spinning を用いた悪性リンパ節のプロトン NMR スペクトルの解像度の向上. Magn. Reson. Med. 36, 653-658 (1996).
論文CAS PubMed Google Scholar
Henry, P. G. et al. In vivo 13C NMR spectroscopy and metabolic modeling in the brain: a practical perspective. Magn. Reson. Imaging 24, 527-539 (2006).
論文CAS PubMed Google Scholar
Rados, D. et al. 13C核磁気共鳴法による炭素フラックス分析で、Corynebacterium glutamicumによる嫌気性コハク酸生産に対するCO2の影響を明らかにした。Appl. Environ. Microbiol. 80, 3015-3024 (2014).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M. & Sauer, U. 13Cベースの代謝フラックス解析。Nat. Protoc. 4, 878-892 (2009).
論文 CAS PubMed Google Scholar
Borah Slater, K. et al. ワンショット13C15N-メタボリックフラックス解析による炭素・窒素フラックスの同時定量化。Mol. Syst. Biol. https://doi.org/10.15252/msb.202211099 (2023).
マハデバン、R.、エドワーズ、J.S.&ドイル、F.J.III. 大腸菌の二重成長における動的フラックスバランス解析。Biophys. J. 83, 1331-1340 (2002).
Henson, M. A. & Hanly, T. J. 合成微生物群集の動的フラックスバランス解析. IET Syst. Biol. 8, 214-229 (2014).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Dannheim, H., Will, S. E., Schomburg, D. & Neumann-Schaal, M. Clostridioides difficile 630Deltaerm in silico and in vivo-quantitative growth and extensive polysaccharide secretion. FEBS Open Bio. 7, 602-615 (2017).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Becker, E. D., Shoup, R. R. & Farrar, T. C. 13C NMR spectroscopy: relaxation times of 13C and methods for sensitivity enhance. Pure Appl. Chem. 32, 51-66 (2009).
論文 Google Scholar
高分解能魔法角回転NMRによる無傷の生体試料解析。最初の発見、最近の開発、および将来の方向性。NMR Biomed. https://doi.org/10.1002/nbm.4684 (2021).
Neumann-Schaal, M., Hofmann, J. D., Will, S. E. & Schomburg, D. Clostridium difficile 630Deltaermの時間分解アミノ酸取り込みとそれに伴う発酵産物と毒素形成. BMC Microbiol. 15, 281 (2015).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Britz, M. L. & Wilkinson, R. G. アミノ酸発酵嫌気性菌の細胞懸濁液によるロイシンのイソ吉草酸およびイソカプロン酸への異化：Stickland反応の再検討. Can. J. Microbiol. 28, 291-300 (1982).
記事CAS PubMed Google Scholar
Jackson, S., Calos, M., Myers, A. & Self, W. T. 院内病原体Clostridium difficileにおけるプロリン減少の解析。J. Bacteriol. 188, 8487-8495 (2006).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Lovitt, R. W., Kell, D. B. & Morris, J. G. Clostridium sporogenesによるプロリン還元はベクトル型プロトン排出と連動している。FEMS Microbiol. Lett. 36, 269-273 (1986).
記事CAS Google Scholar
Rennhack, K. E. Clostridioides difficileの呼吸エネルギー生成に必要なRnf-Proline Reductase複合体の蛋白質ネットワーク. 博士論文、ブラウンシュヴァイク工科大学（2021年）。
Neumann-Schaal, M., Jahn, D. & Schmidt-Hohagen, K. Metabolism the difficile way: the key to the success of the pathogen Clostridioides difficile. Front Microbiol 10, 219 (2019).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Kabisch, U. C. et al. Clostridium sticklandii 由来の D-proline reductase をセレン酵素として同定し、プロタンパク質の切断によりシステイン残基由来の触媒活性ピルボイル基を示唆する. J. Biol. Chem. 274, 8445-8454 (1999).
論文CAS PubMed Google Scholar
パッチング、S.G.生物学的および生物医学的応用のためのNMR-活性核。J. Diagnostic Imaging Ther. 3, 7-48 (2016).
記事 グーグル スカラー
Nieto, R., Cruz, F., Tejedor, J. M., Barroso, G. & Cerdan, S. ミトコンドリアのシトルリン合成に用いられるアンモニアの起源を13C NMRで観察した13C-15Nスピン結合パターンで明らかにした。Biochimie 74, 903-911 (1992).
記事CAS PubMed Google Scholar
Lapidot, A. & Gopher, A. 13C-15Nカップリングパターンと同位体シフトの自然存在量13C-NMR検出による高アンモニア血症脳における代謝コンパートメントの定量化. Eur. J. Biochem. 243, 597-604 (1997).
論文CAS PubMed Google Scholar
Lambert, J. B. & Greifenstein, L. G. 化学シフトの同位体効果の起源. 立体化学的証拠。J. Am. Chem. Soc. 96, 5120-5124 (1974).
記事CAS Google Scholar
Ragsdale、S.W.酢酸生成のWood-Ljungdahlパスウェイの酵素学。Ann. N. Y. Acad. Sci. 1125, 129-136 (2008).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Gencic, S. & Grahame, D. A. Clostridium difficileにおける多様なエネルギー保存経路：アミノ酸スティックランド受容体非存在下での増殖とWood-Ljungdahl経路の役割. J. Bacteriol. https://doi.org/10.1128/JB.00233-20 (2020).
Peltier, J. et al. Clostridium difficileのvanG様遺伝子群のゲノム解析と発現解析. Microbiol. 159, 1510-1520 (2013).
記事CAS Googleスカラー
Hofmann, J. D. et al. Metabolic reprogramming of Clostridioides difficile during the stationary phase with induction of toxin production. Front. Microbiol. 9, 1970 (2018).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Philips, J., Rabaey, K., Lovley, D. R. & Vargas, M. Clostridium ljungdahliiによるバイオフィルム形成は塩化ナトリウムストレスによって誘導される：実験評価とトランスクリプトーム分析。PLoS ONE 12, e0170406 (2017).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
大腸菌によるd-アラニンの分泌. Microbiol. 162, 1243-1252 (2016).
記事CAS Googleスカラー
Peltier, J. et al. Type I toxin-antitoxin systems contribute to maintenance of mobile genetic elements in Clostridioides difficile. Commun. Biol. 3, 718 (2020).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
唐沢貴洋、生駒聡、山川浩一、中村修一：Clostridium difficileの確定増殖培地．微生物学 141, 371-375 (1995).
論文CAS PubMed Google Scholar
Delaglio, F. et al. NMRPipe: UNIXパイプに基づく多次元スペクトル処理システム. J. Biomol. nmr 6, 277-293 (1995).
記事CAS PubMed Google Scholar
Helmus, J. J. & Jaroniec, C. P. Nmrglue: an open source Python package for analysis of multidimensional NMR data. J. Biomol. nmr 55, 355-367 (2013).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Virtanen, P. et al. SciPy 1.0: Pythonによる科学計算のための基本アルゴリズム。Nat. Methods 17, 261-272 (2020).
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kashaf, S. S., Angione, C. & Lio, P. Making life difficult for Clostridium difficile: augmenting the pathogen's metabolic model with transcriptomic and codon usage data for better therapeutic target characterization. BMC Syst. Biol. 11, 25 (2017).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Ebrahim, A., Lerman, J. A., Palsson, B. O. & Hyduke, D. R. COBRApy: constraints-based reconstruction and analysis for Python. BMC Syst. Biol. 7, 74 (2013).
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Sud, M. et al. Metabolomics Workbench: メタボロミクスデータとメタデータ、代謝物標準、プロトコル、チュートリアルとトレーニング、解析ツールのための国際リポジトリ。Nucleic Acids Res. 44, D463-D470 (2016).
記事CAS PubMed Google Scholar
リファレンスのダウンロード
謝辞
M. Delaney（微生物学サポート）、M. Judge、A. Edison（有用なコメント、密閉型HRMAS NMRローターの嫌気性条件維持能力を確認）に感謝する。このプロジェクトは、米国国立衛生研究所（L.B., grant nos. R01AI153653, R03AI174158 and P30DK056338; L.L.C., grant nos. S10OD023406, R21CA243255 and R01AG070257), Brigham and Women's Hospital Precision Medicine Institute and Presidential Scholar's Award (L.B.), the MGH A. A. Martinos Center for Biomedical Imaging (L.B. and L.L.C.) and the Massachusetts Life Sciences Center (L.B. and L.L.C.),.
著者情報
著者ノート
Brintha Girinathan（ブリンタ・ギリナサン
現在の住所 米国マサチューセッツ州ボストンのGinkgo Bioworks, The Innovation and Design Building, USA
著者と所属
マサチューセッツ宿主マイクロバイオームセンター、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院、ハーバード・メディカル・スクール、ボストン、マサチューセッツ州、米国
エイダン・パヴァオ、ブリンタ・ギリナサン、リン・ブライ
パリシテ大学パスツール研究所F-75015、UMR-CNRS 6047、フランス・パリ、嫌気性細菌の病原性研究室
ヨハン・ペルティエ＆ブルーノ・デュピュイ
細胞統合生物学研究所（I2BC）、91198、パリサクレー大学、CEA、CNRS、ジフ・シュル・イヴェット、フランス
ヨハン・ペルティエ
コスタリカ大学微生物学部熱帯病研究センター（コスタリカ、サンホセ
パメラ・アルタミラノ・シルバ
マサチューセッツ総合病院、ハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン、放射線学・病理学部門
イザベラ・H・ムーティ＆レオ・L・チェン
テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンター放射線科（米国テキサス州ダラス市
クレイグ・マロイ
ハーバード大学医学部ブリガム・アンド・ウィメンズ病院病理部臨床微生物学研究室（米国マサチューセッツ州ボストン市
リン・ブライ
貢献度
L.B.とL.L.C.は本研究を考案した。J.P.、P.A.S.、B.D.はPaLoc-negative strainを構築した。A.P.、B.G.、L.B.は嫌気性微生物学的手法を開発し、HRMAS実験の微生物学的要素を実行した。L.L.C.は、NMR法を開発し、HRMAS実験の磁気共鳴スペクトルの構成要素を実行した。A.P.、I.H.M.、L.L.C.は、NMRデータの処理と解析を行った。C.M.は、15N-13C増幅の技術についてモデル化し、助言を行った。A.P.は、カスタムコードを開発し、計算および代謝モデリング解析を実施した。A.P.とL.B.は原案執筆を行った。L.L.C.、J.P.、P.A.S.、B.D.、I.H.M.、C.M.が編集と内容を提供し、オリジナルドラフトを作成した。
対応する著者
Leo L. Cheng または Lynn Bry に通信してください。
倫理に関する宣言
競合する利益
L.B.は、C. difficileに対する生きた細菌治療薬の発明者であり、ParetoBio, Inc.の科学的創設者、SAB議長、株主である。他の著者は、競合する利害関係はないことを宣言している。
査読
ピアレビュー情報
Nature Chemical Biologyは、William T. Self、Alexander Shekhtman、およびその他の匿名の査読者の方々に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 Kel-Fローターインサート内の標準的な嫌気性培養とHRMAS取得の代謝的整合性。
密閉したKel-Fローターインサート内でMMMで培養したC. difficileを、回転させずに37℃で36時間インキュベートするか（「非回転」）、HRMAS高周波パルスと回転プログラムを36時間適用した（「HRMAS」）場合の分析結果。(a-b) (a)非回転条件または(b)回転条件で培養したグラム染色培養物の光学顕微鏡画像；各顕微鏡画像は、同様の結果が得られた3生物学的複製を示す。色の付いた矢印は、植物細胞（黒い矢印）、溶解した細胞および破片（青い矢印）、および胞子形成細胞（赤い矢印）を示す。(c-d) MMMで[U-13C]プロリンを添加し、(c)非紡糸条件または(d)HRMAS条件で培養した培養物の1H-NMRスペクトルを示す。軸：単位なしNMR信号（y軸）対化学シフト（ppm）（x軸）。ラベルは、選択した代謝物に起因する1Hピークを示す。(e-f)MMMで[U-13C]ロイシンを添加し、(e)非紡糸または(f)HRMAS条件で培養した培養物；軸とラベルは(c-d)と同じ。(g-h) MMMで[U-13C]グルコースを添加し、(g)非回転または(h)HRMAS条件で培養した培養物；軸およびラベルは(c-d)と同じ。
Extended Data Fig. 2 L-[U-13C]プロリンを用いて増殖したC. difficileのHRMAS 13C NMR。
(a) プロリン（濃青）と5-アミノバレレート（濃赤）に起因するピークの軌跡を示す実験複製1の13C-NMR時系列のサーフェースプロット。軸：単位なしNMR信号（z軸）対化学シフト（ppm）（x軸）対時間（y軸）。(b) ロジスティックカーブフィットを用いた推定代謝物濃度(mM)の実験レプリケート1の散布図(時間単位の時間に対して)。(c) 実験試料2の13C-NMR時系列のサーフェスプロット。線と軸は(a)と同様である。(d) 推定代謝物濃度の実験用レプリカ2に対する散布図、軸は(b)と同じ。(e) 実験試料3の13C-NMR時系列のサーフェスプロット。線と軸は(a)と同じ。(f) 推定代謝物濃度の散布図、軸は(b)と同じ。
Extended Data 図3 L-[U-13C]ロイシンで増殖したC. difficileのHRMAS 13C NMR。
(a) ロイシン（水色）とその発酵生成物に起因するピークの軌跡を示す、実験複製1の13C-NMR時系列の表面プロット。軸：単位なしNMR信号（z軸）、化学シフト（ppm）（x軸）、時間（y軸）。(b) ロジスティックカーブフィットを用いた推定代謝物濃度(mM)の実験レプリケート1の時間単位の時間に対する散布図。(c) 実験試料2の13C-NMR時系列のサーフェスプロット。線と軸は(a)と同様である。(d)推定代謝物濃度の散布図（軸は(b)と同じ）。[U-13C]Isovalerateは、この実験では信頼できる軌跡を推測するのに十分なシグナルを欠いていた。(e) 実験試料3の13C-NMR時系列のサーフェスプロット。線と軸は(a)と同じ。(f) 推定代謝物濃度の散布図、軸は(b)と同じ。
Extended Data 図4 [U-13C]グルコースで増殖したC. difficileのHRMAS 13C NMR。
(a) グルコース（青）とその発酵生成物に起因するピークの軌跡を示す、実験複製1の13C-NMR時系列の表面プロット。軸：単位なしNMR信号（z軸）、化学シフト（ppm）（x軸）、時間（y軸）。(b) ロジスティック曲線フィットによる推定代謝物濃度(mM)の実験レプリケート1の散布図と時間単位の時間。(c) 実験試料2の13C-NMR時系列のサーフェスプロット。線と軸は(a)と同様である。(d) 推定代謝物濃度の実験用レプリカ2に対する散布図、軸は(b)と同じ。(e) 実験試料3の13C-NMR時系列のサーフェスプロット。線と軸は(a)と同じ。(f) 推定代謝物濃度の散布図（軸は(b)と同じ）。
Extended Data 図5 [U-13C]グルコース中でC. difficileを生育させ、天然量のロイシンまたは[15N]ロイシンを加えた後のアラニンのα-炭素の13C NMRスペクトル領域を曲線でフィットさせた。
(a) 天然のロイシンを含む培地で培養した場合のスペクトル。(b) [15N]ロイシンを含む培地で培養した培養物のスペクトル。各共鳴スペクトルにおいて、青は実験生データの曲線、赤は全体的なフィット曲線、緑は個々のフィットピークを示し、灰色の線は実験曲線とフィット曲線の間の差を示す。
Extended Data 図6 生細胞の13C NMRスペクトルと代謝物の同定。
(a) [U-13C]グルコース、L-[U-13C]プロリン、L-[U-13C]ロイシンとそれぞれ反応させた生細胞のプロトン脱離13C NMR スペクトル。(b) [U-13C]グルコースから生成した13C2-アセテートの1Hおよびプロトン脱離13C NMRスペクトル（それぞれ45.5時間および45.0時間に測定したもの）。1H（S/N=1.000）および13C（S/N=0.033）について測定した単位時間に正規化した相対的な信号対雑音比（S/N）。1Hスペクトルに見られるダブルダブレットピークは、メチルおよびカルボキシル13C核との1H J-カップリングによるものである。中央のピークは12Cへのメチル-1H結合を表している。13Cスペクトルに見られるダブレットピークは、メチルおよびカルボキシル13C核の間の13C-13C J-カップリングの結果である。(c) [U-13C]グルコースで培養した生細胞について、HMDBから報告された13Cおよび1H化学シフト値に従って、2D 13C COSY、13C-1H HSQC、および1H COSYによる代謝物同定の説明図である。この図では、1H 1Dスペクトルは45.5時間、1H 2D COSYは32.6時間、1H-13C HSQCは27.9時間、13C COSYは37.2時間、13C 1Dスペクトルは24.8～45.0時間に測定したすべてのプロトン脱離13Cスペクトル（N = 11）の複合スペクトルであることを示しています。
Extended Data 図7 グルコースに対するU-13C代謝物の13C-シグナル増強標準曲線。
(a) 補足表9に示した溶液のHRMAS 13C-NMR取得から求めた[U-13C]酢酸対[U-13C]グルコースの濃度-信号比の散布図。100ppm以下のピークのみが解析に含まれる。化合物の炭素あたりの平均ピーク面積が18未満である取得は、黒い十字でマークし、線形回帰から除外した。ベストフィットの直線は、式とR二乗統計値で示される。(b) [U-13C]アラニン対[U-13C]グルコースの濃度-信号比の散布図、パネル (a) と同様に決定した。(c) パネル(a)と同様に決定された[U-13C]酪酸と[U-13C]グルコースの濃度-信号比の散布図(c)。(d) パネル(a)と同様に決定された[U-13C]エタノールと[U-13C]グルコースの濃度-信号比の散布図.
Extended Data 図8 13C NMRスペクトル領域におけるアラニンのα-炭素のデコンボリューション。
(a) [U-13C]グルコースから生成したアラニンのα-炭素のすべての可能な13Cパターンをグレーで示す（Q：[U-13C]アラニンからの4重ピーク、D12とD23：それぞれ[1，2-13C]アラニンと [2，3-13C]alanine からの2重ピーク、S：[2-13C]アラニンのシングルレット。(b) 黄色で示した15N-13C J-カップリングにより、すべてのピークが2つの等しい強度のピークに分かれる。(c) AとBのピークの合計。 (d) 同位体効果による15Nと13Cの共鳴のシフトを含む計算による、すべての可能なアラニン種のピークプロファイルの予測。
補足情報
補足情報
補足表1-3、9、11-13および図。1-4.
報告書の概要
補足表4-8、10
補足表4：C. difficile28の既発表モデルであるicdf834を修正した。得られたモデルはicdf843と命名された。修正点については、Methods (Metabolic modeling)で詳しく説明しています。補足表5：NMRで測定された代謝物の交換反応境界を評価した。各シミュレーションのタイムポイントで評価された取り込み（プロリン、バリン、イソロイシン、グルコース）または分泌（その他の代謝物）の反応上限と下限を、mM h-1で表示した。補足表6：dFBAで予測された代謝フラックスの一部。L-アラニン（alaL_c、生成：C列、消費：D列）、L-グルタミン酸（gluL_c、生成：E-H列、消費：I-K列）、ATP（atp_c：L-S列、消費：T-Y列）、ピルビン酸（pyr_c：Z-AB列、消費：AC-AE列）およびアンモニア（nh3_c：AF-AJ列、消費：AK-AL列）についての生成および消費のフラックスを予測した．モデル目的フラックスはU列に、ロイシンからアラニンへの推定アミノ基フラックスの計算はAM-BA列に記載されている。補足表7：icdf843の全反応に対するFVAシミュレーション反応下限値。ATP加水分解目的フラックスが最適値の0.5%以内に収まる反応の下限値。フラックス単位は mM h-1、表ヘッダーは反応 ID。補足表 8：icdf843 の全反応の FVA シミュレーション反応上限値．ATP 加水分解目的フラックスが最適値の 0.5%以内である反応の上限値。フラックスの単位は mM h-1、テーブルヘッダーは反応 ID である。補足表10：C. difficileにおけるグルコース、ロイシン、プロリンの代謝に関与する経路と酵素系。列のラベルは以下の情報を示す。番号：図2および図3に示した反応番号に対応する。システムまたは酵素、対応する細胞システムまたは酵素触媒による経路。Gene-association, CD630: C. difficile参照株CD630における関連遺伝子ID。Gene-association(遺伝子関連)。ATCC43255：本研究で使用したC. difficileのATCC43255株における関連遺伝子ID。
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Pavao, A., Girinathan, B., Peltier, J. et al. HRMAS 13C NMRとゲノムスケールモデリングによる動的嫌気性菌代謝の解明。Nat Chem Biol (2023). https://doi.org/10.1038/s41589-023-01275-9
引用元：ダウンロード
2022年8月24日受領
2023年1月30日受理
2023年3月09日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41589-023-01275-9
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ネイチャー・ケミカル・バイオロジー（Nat Chem Biol） ISSN 1552-4469（オンライン） ISSN 1552-4450（プリント版）
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