大腸内腔常在菌が産生する遊離D-アミノ酸
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公開日：2018年12月17日
大腸内腔常在菌が産生する遊離D-アミノ酸
https://www.nature.com/articles/s41598-018-36244-z
松本光晴、國澤彰宏、...福崎英一郎 著者一覧を見る
サイエンティフィックリポーツ 8巻 記事番号：17915（2018） この記事を引用する
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メトリクス詳細
要旨
D-アミノ酸(D-AAs)は、D-SerによるN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体の活性化など、様々な生理活性を有する。 細菌を単培養したブロス中には遊離のD-AAsが数種類放出され、D-AAsは細菌のコミュニケーションに利用されていると考えられることから、腸内細菌叢からも遊離のD-AAsが数種類放出され、宿主の健康に関与している可能性が推測される。しかしながら、現在のところ、4種類の遊離D-AAsのみが腸管内腔で見つかっており、大腸内腔では見つかっていない。ここで我々は、高感度液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析計（LC-MS/MS）を用いたキラルAAsの同時分析により、12種の遊離D-AAs（D-Ala、D-Arg、D-Asp、D-Gln、D-Glu、D-allo-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-Phe、D-Ser、D-Trp）が腸内細菌叢によって産生されることを示し、関連する細菌候補としてファーミキューテス属に属する細菌群を同定した。
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はじめに
腸内細菌叢が食事由来および宿主由来化合物から産生する低分子代謝産物は、腸内細菌叢と宿主のクロストークを制御する1。腸内細菌叢によって多くの低分子代謝物が産生され2、その一部は大腸内腔から血流に輸送されると考えられる3。短鎖脂肪酸がGタンパク質共役タンパク質を介して腸管免疫系やホルモン分泌に寄与していることはよく知られているが4、その他の代謝産物の機能は未知のままであり、多くの代謝産物が同定・検出されていない。
以前は、D-アミノ酸（D-AAs）は哺乳類には存在しないと考えられていた。しかし、分析技術の進歩により、哺乳類には遊離のD-AAsが同定されるようになり、その一部は生物学的に活性がある。例えば、D-SerはN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体をそのコアゴニストとして活性化する5,6。したがって、腸管内腔に存在する遊離D-AAsは、上皮細胞の受容体や固有層の免疫細胞との結合を介して、腸内細菌と宿主との間のクロストークに関与している可能性がある。細菌を単培養したブロス中では数種類の遊離D-AAsが放出され7、D-AAsはおそらく細菌のコミュニケーションに利用されている8,9ことから、腸内細菌叢は数種類の遊離D-AAsを放出していると推定される。1965年にHoeprichが血清D-Alaの供給源として腸内細菌を初めて示唆し10、その後、いくつかのグループが血液中および尿中のD-Alaの供給源が腸内細菌であることを実証している11,12。しかし、腸管腔内の遊離D-AAを対象とした研究は限られている。BrucknerとSchieber12はラットの糞便中に11種類のD-AAsを検出したが、エタノール抽出による細菌の破裂がサンプル中の細胞内D-AAsの存在に関与している可能性があるため、彼らのデータは腸内環境と宿主のクロストークを理解するためには使用できない。現在、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と二次元高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて抽出した糞便サンプル中の遊離D-AAsを分析した研究は1件しかなく、既知のD-Ala以外に、D-Asp、D-Glu、D-Proの3種類のD-AAsが腸内細菌叢によって産生されていることが示されている13。しかし、この解析はわずか3匹のマウスを用いて行われたものであり、腸管内腔遊離型D-AAsのプロファイリングには不十分である。発酵食品中の微生物によって様々な種類の遊離D-AAsが産生されることを考慮すると11、様々な細菌が生息する腸管内腔には4種類以上の遊離D-AAsが存在する可能性がある。本研究では、無菌マウス（GF）とコロニー形成マウス（Ex-GF）を用意し、D-AAとL-AAを高分離能で分離し、二次元HPLCによる分析よりも微量のD-AAを検出できる高感度液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（LC-MS/MS）を用いて、キラルAAsの同時分析により腸管内腔の遊離D-AAsを調べた14。我々は、12種類の遊離D-AAが腸内細菌叢によって産生されることを確認し、関連する細菌候補を同定した。
結果
GFマウスとEx-GFマウスの大腸内腔遊離キラルアミノ酸の違い
高感度LC-MS/MSキラルAA分析により、マウスの大腸内容物から14種の遊離D-AA（D-Ala、D-Arg、D-ASn、D-Asp、D-Gln、D-Glu、D-His、D-allo-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-Phe、D-Ser、D-Trp）が検出された。階層的クラスタリングにより、GFマウスとEx-GFマウスの間で大腸内腔遊離D-AAに顕著な差が観察され、Ex-GFマウスではD-Asnを除くすべてのD-AA濃度がGFマウスよりも高かった（図1a）ことから、腸内細菌叢が大腸内腔D-AAに大きく影響していることが示された（図1b）。D-Ala、D-Leu、D-Lys、D-PheおよびD-Serは、すべてのEx-GFマウスで検出されたが、GFマウスでは検出されなかった（p < 0.001、Fisherの抽出物検定）。D-GlnおよびD-allo-Ileの発現率も、Ex-GFマウスではGFマウスよりも有意に高かった（p < 0.05、フィッシャー抽出物検定）。D-Arg（p＜0.001）、D-Asp（p＜0.001）、D-Glu（p＜0.001）、D-Met（p＜0.001）、D-Trp（p＜0.01）の濃度は、GFマウスよりもEx-GFマウスの方が有意に高かった。このように、これら12種類のD-AAsが腸内細菌によって産生されることが示され、大腸内腔において遊離のD-Arg、D-Gln、D-allo-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-Phe、D-Ser、D-Trpが同定された初めての報告である。一方、D-Asn濃度はGFマウスよりもEx-GFマウスの方が低かった（p < 0.05）。D-Cys、D-Ile、D-Thr、D-allo-Thr、D-Tyr、D-Valはどのマウスでも検出されなかった。一方、20種類のL-AAsのうち、L-allo-Thrを除く19種類が検出された。DL-Proは別に検出されなかったが、Glyは検出された。階層的クラスタリングにより、GFマウスとEx-GFマウスの間で大腸管腔内遊離L-AA含量に顕著な差があることが明らかになった（補足図S1a）。各L-AAに関するデータを補足図S1bに示す。L-Ala（p＜0.001）、L-Arg（p＜0.05）、L-Asp（p＜0.001）、L-Glu（p＜0.001）、L-His（p＜0.01）、L-Ile（p＜0.01）、L-Leu（p＜0.01）、L-Met（p＜0.01）、L-Lys（p＜0. 01）、L-Phe（p＜0.01）、L-Ser（p＜0.01）、L-Trp（p＜0.01）、L-Tyr（p＜0.01）、L-Val（p＜0.01）およびGly（p＜0.001）は、GFマウスに比べてEx-GFマウスで有意に高かった。L-allo-Ileは、GFマウスよりもEx-GFマウスの方が豊富であった（p < 0.01）。
図1
図1
GFマウスとEx-GFマウスの大腸内腔D-アミノ酸の違い。(a) D-アミノ酸のパターンを示す階層的クラスタリング。赤と緑はそれぞれ代謝物の高濃度と低濃度を示す。(b）D-アミノ酸の濃度。棒グラフ上の数字は発生率を示す。*Mann-Whitney U-testにより、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001で有意差あり。フィッシャー抽出物検定による有意差（†p < 0.05, ††p < 0.001）。#これらの代謝物のグラフは拡大されている。(c)GFマウスおよびEx-GFマウスにおける大腸内容物中の実際の濃度とペレットが大腸に到達したときの推定濃度とのD-アミノ酸の定量的比較（nmol/g of feces）。大腸内腔におけるペレット中のD-アミノ酸の推定値は以下のように計算した：D-アミノ酸の推定値（nmol/g）＝ペレット中の濃度測定値／［ペレットの固形分（％）／大腸内容物の固形分（％）］。
フルサイズ画像
ペレットが結腸に到達した際の結腸内腔における各遊離キラルアミノ酸濃度の推定値
ペレット中のキラルAA濃度、大腸内容物およびペレットの固形分含量をそれぞれSupplementary Table S1およびS2に示す。ペレットが結腸に到達したときの結腸内腔の各D-AA濃度の推定値を計算した。すなわち、D-AA濃度の推定値（nmol/g）＝ペレット中の濃度測定値／［ペレット固形分濃度（93.5%）／結腸内物質固形分濃度（15.9-41.5%）］である。GFマウスとEx-GFマウスの大腸内腔におけるD-AAsの実測濃度と推定濃度を比較したところ（図1c）、D-Gln、D-His、D-Serはペレットからは検出されなかったが、Ex-GFマウスの大腸内容物中には存在したことから、腸内細菌によって産生されていることが確認された。D-Ala、D-Arg、D-Asp、D-Glu、D-allo-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-PheおよびD-Valはペレット中に存在したが、GFマウス大腸内容物中の濃度が推定値よりはるかに低いことから、これらはGFマウスの大腸内容物からは検出されず、ペレット中のこれらのD-AAsは腸管内で宿主に吸収されることが示された。しかし、Ex-GFマウスの大腸内容物では、D-MetとD-Valを除く8種類のD-AAs濃度が推定値より有意に高く、これらのD-AAsが腸内細菌によって産生されていることが示された。D-Trp濃度は、Ex-GFマウス、GFマウス、推定値の間に差は認められず、D-Trpは宿主に吸収されず、腸内細菌の影響を受けないことが示された。GFマウスの大腸内腔におけるD-Asn濃度は推定値より低かったが、このレベルはGFマウスでゼロに近いものではなかった。また、GFマウスとEx-GFマウスの間に差は認められず、宿主によるD-Asnの吸収は困難であり、大腸内濃度は腸内細菌の影響を受けないことが示された。これらの結果を補足表S3にまとめた。
L-CysとL-allo-Thrを除くほとんどすべてのL-AAsがペレットから検出された（補足表S1）。GFマウスにおけるL-Asn、L-allo-IleおよびL-Trpの大腸内腔濃度は、GFマウスにおける推定値よりも低く（補足図S2）、これらのL-AAsが宿主に吸収されていることが示された。一方、10種類のL-AAs（L-Cys、L-Gln、L-His、L-Ile、L-Leu、L-Phe、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-Val）のGFマウスの大腸内濃度はGFマウスの推定値よりも高かったことから、これらは宿主の消化酵素によってペレット中のタンパク質から産生されると考えられた。Ex-GFマウスにおける14種類のL-AAs（L-Ala、L-Arg、L-Asp、L-Glu、L-His、L-Ile、L-allo-Ile、L-Leu、L-Met、L-Lys、L-Phe、L-Ser、L-Tyr、L-Val）の大腸内濃度はEx-GFマウスの推定値よりも高く、これらは腸内細菌によって産生され、ペレット由来ではないことが示された。
Ex-GFマウスにおける大腸内細菌と遊離D-アミノ酸の関係
16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて、Ex-GFマウスの大腸内容物から7門、15目、21綱、39科、71属を同定した（図2a、補足図S3）。D-AA産生に関与する大腸内細菌を推定するために、腸内細菌が産生する12種類のD-AAについて部分最小二乗（PLS）回帰を行った。その結果、すべてのD-AAsのPLS回帰直線は良好な直線性を示し（補足図S4）、各D-AAsについて1.0以上の投影影響度（VIP）値を持つ大腸内細菌が約20個検出された（補足表S4）。同時に、大腸内細菌の相対存在量とD-AAとの相関解析も行い、PLSのVIP値が高い各D-AAと有意な相関を示す主要細菌1〜4種を同定した（補足表S5）。未分類の細菌を除いたすべての細菌とその関連D-AAを図2bに示す。興味深いことに、リストアップされた細菌はすべてファーミキューテス門に属し、特にLachnospiraceae科に属する細菌の頻度が最も高く、Ruminococcaceae科とErysipelotrichaceae科に属する細菌がそれに続いた。すべての配列データは、DDBJ Sequence Read Archive (http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/)にアクセッション番号(DRA006827)で寄託された。
図2
図2
D-アミノ酸産生に対する腸内細菌叢の影響。(a) 16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスによるEx-GFマウスの大腸内細菌の相対量。存在量が0.1％未満の細菌はその他に含まれる。クラス、目、ファミリーレベルのデータを補足図S3に示す。(b）細菌の相対存在量（属レベル）とD-アミノ酸濃度の相関。赤線は有意な正の相関を、青線は負の相関を示す。有意な相関を示した未分類の細菌は示していない。
フルサイズ画像
考察
本研究では、12種類の遊離D-AA（D-Ala、D-Arg、D-Asp、D-Gln、D-Glu、D-allo-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-Phe、D-Ser、D-Trp）が腸内細菌叢に由来することを見出したが、大腸内腔の遊離D-AAの起源は不明である。多くの細菌がアミノ酸のラセマーゼ混合物8を持ち、L-AAとD-AAを含むペプチドグリカン、特にD-Ala15から遊離D-AAを生成するからである。しかし、死んだ細菌のペプチドグリカンが分解されて1分子のD-AAになるかどうかは不明である。一方、細菌を単培養したブロス中には遊離のD-AAが複数放出されており7、D-AAがバイオフィルムの分解に影響を与えていることから、D-AAが細菌のコミュニケーションに利用されていると考えられる8,9。したがって、大腸内腔の遊離D-AAsは、生きた細菌、特にファーミキューテス門に属する細菌の活動によって放出されると推測される。細菌のD-AAsの前駆体であるほとんどのL-AAsの濃度は、Ex-GFマウスではGFマウスやペレット到達推定値よりも高かったことから、腸内細菌がペレットや腸粘液由来のタンパク質を異化してL-AAを産生していることが示された。これらの観察結果は、腸内細菌がペレットや粘液からL-AAを産生し、アミノ酸のラセマーゼ混合物を用いてこれらのL-AAからD-AAを生合成していることを強く示唆している。
哺乳類では、内在性のD-SerとD-Aspはそれぞれ中枢神経系と内分泌機能の発達において重要な生物学的役割を担っている16。しかし、我々の知る限り、大腸内腔遊離型D-AAsの生物学的効果に関する研究は不足している。Sasabe13の研究は、腸管内腔におけるD-AAsの役割を報告した最初のものである。この研究は小腸腔内の遊離D-AAsに焦点を当てたものであるが、D-AAsがD-アミノ酸オキシダーゼ（DAO）の基質であり、この酵素反応によって産生されたH2O2が粘膜表面のコレラ菌や腸炎ビブリオなどの病原性細菌を死滅させることを示した13。我々は、大腸内腔に存在する遊離のD-AAsが、脳におけるD-Serと同様に、上皮細胞や粘膜固有層のリンパ球上のレセプターに結合することにより、アゴニストとして作用すると推測している。実際、遊離のD-PheとD-TrpはGタンパク質共役型受容体109B17を介してヒト白血球の化学誘引物質として作用する。Keeperら18は、プロバイオティクスによって産生されたD-Trpが、T細胞株におけるケモカイン・リガンド17の分泌を減少させ、IL-10を誘導し、ヒト単球由来樹状細胞におけるLPS誘発IFN-γ、IL-12、IL-5を減少させることを見出した。マウスにD-Trpを経口投与すると、肺と結腸の制御性T細胞数が増加し、肺のTh2反応が減少し、気道アレルギーが改善した。しかしながら、D-Trpの特異的な生物学的機能を解明するためには、さらなる研究が必要である。
D-AAs、特にD-Serは、NMDA受容体を介した神経伝達に重要な役割を果たし、いくつかの生理的および病態生理学的プロセスに関与している16,19。脳内D-SerはセリンラセマーゼによってL-Serから生合成されることが知られているが、セリンラセマーゼノックアウトマウスでは前頭皮質、海馬、線条体のD-Ser濃度が80〜90％低下しており、脳内D-Serの10〜20％はセリンラセマーゼに依存しないことが示されている20。我々は、腸内細菌叢によって産生されるD-Serが脳のD-Serの供給源であり、腸管内腔から脳に輸送されるのではないかと考えた。さらに、GFマウスはEx-GFマウスに比べて運動活性が亢進し、不安が軽減することがよく知られている21,22。GFマウスの異常行動は、腸内細菌によって供給されるD-Serの不足によって引き起こされている可能性がある。行動に関するD-AAsの役割を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
本研究では、高感度LC-MS/MSキラルAA分析により、腸管内腔遊離D-AAsの新規プロファイルとD-AAsに対する腸内細菌の役割を明らかにした。高感度LC-MS/MSは、感度が高いため、二次元HPLCよりも多くの種類のD-AAを検出することができる（以前の研究13では、D-Arg、D-Gln、D-allo-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-Phe、D-Ser、およびD-Trpは検出されなかった）。簡単に説明すると、MS/MSは標的化学物質（この場合はD-AAs）と非標的化学物質を区別できるので、この方法は二次元HPLCよりもD-AAsの定性/定量分析が可能である。これは、腸管内腔環境などの自然環境由来のメタボローム中の微量D-AAsの検出に適している。また、LC-MS/MS分析では誘導体化が不要なため、誘導体化時の前処理や副反応を大幅に削減でき、さらに再現性の高い精密なデータを得ることができます。この方法では、Proを除くすべての塩基性キラルAAを、1サンプルあたり約20分で検出することができる。一方、複数のアミノ酸を同時に分析できない二次元HPLCでは、対象となるアミノ酸の数に応じて測定を繰り返すため、分析時間が長くかかる。これらの利点は、特定の疾患群や健常者の糞便中D-AAプロファイリングなど、複数検体のハイスループット分析に適している。近い将来、腸内常在菌と宿主のクロストークに関連する低分子代謝産物としてのD-AAsの生物学的役割が、この方法を用いて研究されることが期待される。
研究方法
マウス
GF Jcl:MCH(ICR)マウスは、日本クレア株式会社（東京）から購入し、共同乳業株式会社研究所（東京）で飼育した。飼育は共同乳業株式会社研究所で行った。マウスはTrexler型フレキシブルフィルムプラスチックアイソレーター（滅菌チップ付き）（日本クレア株式会社、東京、日本）に寝かせた。マウスにはオートクレーブで滅菌した水（121℃、30分）および市販の滅菌CMFペレット（オリエンタル酵母工業株式会社、東京、日本）を自由摂取させた。糞便の細菌学的汚染は、岐阜嫌気性菌培地（GAM）寒天培地（ニッスイ、東京、日本）を用いて、培養手順を通して分析した。6週齢のGFマウスを用い、2群に分けた（n = 8/群）： GFマウス（コントロール）とEx-GFマウス（コロニー形成）に分けた。胃ろうチューブを用い、Ex-GFマウス（6週齢）の胃に従来のICRマウスから得た0.5mLの1:10希釈糞便を接種し、10週齢の検体採取まで4週間飼育した。動物実験は協同乳業動物使用委員会（許可番号2017-10）の承認を受け、米国アカデミー出版会発行の「実験動物の飼育と使用の手引き」に準拠した。
大腸内容物およびペレットからの遊離D-アミノ酸を含むメタボロームの調製
マウスを頸椎脱臼により犠牲とし、中腸内容物を採取して直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃で保存した。大腸内容物（約100mg）をGIBCO® Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)で10倍に希釈し、1分間激しく攪拌した後、アイスボックス上で攪拌せずに5分間インキュベートして2回抽出した。抽出の1分後、底部に沈殿のない上部の水性部分を集め、遠心分離（10,000×g、10分間、4℃）し、100μLの上清を5kDaカットオフフィルターUltrafree-MC（ミリポア社製）を用いて遠心ろ過した。ろ液はさらに使用するまで-80℃で保存した。
メタボローム解析用ペレットの調製
滅菌した市販のペレットを乳鉢で粉砕し、上記の大腸管腔メタボロームのセクションで説明したように調製した。
LC-MS/MS
LC-MS/MS 分析は、LC-30 AD ポンプ、DGU-20A5R 脱気装置、SIL-30 AC オートサンプラー、CTO-20 AC カラムオーブン、および CBM-20A 制御モジュールを備えた Nexera X2 システム（島津製作所、京都、日本）に LCMS-8060 トリプル四重極質量分析計（島津製作所）を接続して実施した。D,L-AAsの分離にはCROWNPAK CR-I (+)カラムおよびCROWNPAK CR-I (-)カラム (3 mm, 内径×150 mm, 幅, 5 μm, ダイセル株式会社製)を用いた。移動相は、アセトニトリル80%(v/v)、エタノール15%(v/v)、水5%(v/v)、トリフルオロ酢酸0.5%(v/v)の混合溶液とした。流速は0.6mL/min、カラム温度は25℃、注入量は1μLとした。質量分析計はエレクトロスプレーイオン化（ESI）源を装備し、ネブライジングガス流量3 L/min、加熱ガス流量5 L/min、界面温度250 °C、脱溶媒ライン温度250 °C、加熱ブロック温度300 °C、乾燥ガス流量15 L/min、ポジティブモードの界面電圧+ 4 kVの条件で行った。衝突誘起解離ガス圧力は270kPaに設定した。データ取得、ピーク選択、積分はLabSolutionsソフトウェア（島津製作所）を用いて行った。各化合物のピーク面積値は、内部標準物質（DL-アラニン-2,3,3,3-d4）のピーク面積値に対して正規化した。
以前、この方法は糞便検体中のキラルAAの分析に用いられた。簡単に説明すると、従来のマウス（n = 8）の糞便からの抽出物を混合してプールされた品質チェック試料を調製し、35種のキラルAAを検出したところ、すべてのキラルAAにおいて良好な再現性（13C6-L-Pheに対するAAのピーク面積比の相対標準偏差＜20％）が観察された（補足図S5）。この方法の回収率を測定するために、16種類の同位体標識L-AAsを抽出前に糞便に添加した。その結果、糞便から14種類のD-AAについて良好な回収率（80-100%）が得られた（補足表S6）。
大腸内物質およびペレットの固形分の測定
大腸内物質およびペレットの固形分含量は、乾燥減量試験により測定した。簡単に説明すると、試料を瓶の中に入れ、測定と同じ条件で乾燥させた。ボトルと試料を正確に秤量し、乾燥室（100℃、3 時間）で乾燥させた。完全乾燥後、乾燥室を開け、ボトルと内容物をデシケーター内で室温まで冷却し、重量を測定した。固形分含量は、乾燥前後のボトルとサンプルの入ったボトルの重量から算出した。
大腸内容物からの細菌 DNA 抽出
各サンプル約20 mgを、60 mM Tris-HCl、30 mM EDTA、および0.8%ドデシル硫酸ナトリウムを含む抽出バッファー600 μLに懸濁した。この懸濁液を500μLのTE飽和フェノールと混合し、ウォーターバス中で70℃で10分間インキュベートした後、マイクロスマッシュMS-100ホモジナイゼーションシステム（タカラトミー、東京、日本）を用いて、300mgのガラスビーズ（直径0.1mm）を用いて4,000rpmで60秒間激しくボルテックスした。その後、遠心分離（20,400×g、5分）により各上清350μLを回収し、エタチンメイト（ニッポンジーン、東京、日本）を用いてDNAを精製した。最後に、精製DNAをヌクレアーゼフリー水（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に溶解し、-80℃で保存した。
16S rRNA遺伝子アンプリコンライブラリーの構築と次世代シーケンシング
細菌16S rRNA遺伝子のV1-V2領域は、糞便DNAを鋳型として、融合プライマーを用いたPCRで増幅した。フォワードプライマーは、イオンAアダプター配列、キー、バーコード、アダプター（GT）、27Fmodプライマー配列（3′-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-5′）を含んでいた23。リバースプライマーは、イオン切断P1アダプターおよび338 Rプライマー配列（3′-TGCTGCCTCCCGTAGAGT-5′）を有していた23。PCR、DNA精製、エマルジョンPCR、および配列決定は、Ion PGMシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造元の指示に従って行った。
データ処理と配列アラインメント
配列データはFASTQフォーマットで取得し、QIIMEソフトウェア24を用いて解析した。生配列をそれぞれのバーコードに従ってソートし、品質（平均品質スコア≥20）およびプライマー配列の正確さについてスクリーニングした。トリミングされた配列は、UCLUST法25とfarthest neighbor アルゴリズムを用いて、類似度97%のレベルでoperational taxonomic units (OTUs)にクラスタリングされた。各OTUで最も豊富な配列を代表配列として選択した。代表配列は、Greengenesコアセット27に対して、QIIMEのデフォルトアラインメント法であるPyNAST (Python Nearest Alignment Space Termination)アルゴリズム26でアラインメントした。キメラの可能性のある配列を同定し、ChimeraSlayerアルゴリズムで除去した。キメラでない代表的な配列は、信頼度カットオフ値80%のRDP分類法を用いて分類した28。
統計解析
D,L-AA定量データの階層的クラスター解析（HCA）は、データ解析/可視化ソフトウェアPermutMatrix29を用いて行った。GFマウスとEx-GFマウスのキラルAAの差は、個々の代謝物についてMann-Whitney U-検定を用いて評価した。GFマウスとEx-GFマウスにおける個々のキラルAAの出現率は、Fisherの正確検定を用いて比較した。P値は、必要であれば偽発見率の概念30を用いて調整した。偏最小二乗（PLS）分析は、多変量解析ソフトウェアSIMCA 14（Umetrics）を用いて行った。検出された属の結果は説明変数として用い、D-AAsの定量結果は目的変数として用いた。スピアマンの順位相関検定は、D-AA濃度と細菌の相対存在量の相関を調べるために使用した。Mann-Whitney U検定およびFisherの正確検定は、Rバージョン3.3.2（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）を用いて行った。スピアマンの順位相関検定はSPSS ver.22 (IBM, Armonk, NY, USA)を用いて行った。
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謝辞
著者らは、大腸内容物からの細菌DNAの抽出と統計学の支援に熱心に取り組んでくれた山下綾乃氏に謝意を表する。また、本研究は協同乳業株式会社および株式会社島津製作所から研究助成を受けた。また、本研究は協同乳業株式会社および株式会社島津製作所から助成を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集および解析、発表の決定、原稿の作成には一切関与していない。
著者情報
著者および所属
協同乳業株式会社 酪農技術研究所 日本、東京
松本光晴、北田裕介、玉田葉月
島津製作所（日本、京都
國澤彰宏、服部隆成、川名修一、川野伸一、早川義弘、飯田順子
大阪大学島津分析イノベーション研究室、大阪、日本
國澤彰宏、服部隆成、川野伸一、飯田順子、福崎英一郎
大阪大学大学院工学研究科（日本、大阪
福崎英一郎
貢献度
M.M.、S.Kawana.、Y.H.、E.F.が実験の構想および設計を行った。Y.K.とH.T.はGFマウスとEx-GFマウスを繁殖させ、大腸内容物を得た。M.M.は大腸内容物およびペレットからメタボロームを抽出し、固形分を測定した。A.K.とT.H.はLC-MS/MSでキラルAAを分析した。M.M.、A.K.、T.H.はデータ解析を行った。S.Kawanaは科学的助言を行った。Y.K.は大腸内容微生物の分析を行った。S.KawanoとJ.I.は本研究を監督した。M.M.、A.K.、E.F.は原稿を執筆した。M.M.とH.T.は図表を作成した。
連絡先
松本光晴または福崎栄一郎まで。
倫理申告
利益相反
M.M.、Y.K.およびH.T.は協同乳業株式会社の従業員である。M.M.、Y.K.、H.T.は協同乳業株式会社の社員です。A.K.、T.H.、S.Kawana、S.Kawano、Y.H.およびJ.I.は、本論文の内容に関連するLC-MS/MSの市販製品を製造している株式会社島津製作所の従業員である。E.F.は利益相反がないことを表明している。
追加情報
発行者注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
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転載と許可
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この記事を引用する
大腸内腔常在菌が産生する遊離D-アミノ酸. Sci Rep 8, 17915 (2018). https://doi.org/10.1038/s41598-018-36244-z
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受領
2018年7月11日
受理済み
2018年11月09日
掲載
2018年12月17日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41598-018-36244-z
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微生物学
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サイエンティフィック・リポーツ (Sci Rep) ISSN 2045-2322 (online)
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