サッカロミセス・セレビシエ発酵産物はストレスによる馬の腸内細菌叢の頑健性を改善する

哉百名


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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Vet. Sci.、2023年2月24日
Sec. Animal Nutrition and Metabolism（動物栄養学と代謝学
第10巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fvets.2023.1134092
この記事は、Research Topicの一部です。
腸内細菌叢。家畜の栄養、健康、福祉との関連性

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サッカロミセス・セレビシエ発酵産物はストレスによる馬の腸内細菌叢の頑健性を改善する
Erika Ganda1,2*†, Anirikh Chakrabarti3†, Maria I. Sardi4†, Melissa Tench5, Briana K. Kozlowicz6, Sharon A. Norton6, Lori K. Warren5 and Ehsan Khafipour6*.
1ペンシルバニア州立大学農学部動物科学科（米国ペンシルバニア州ユニバーシティパーク
2ペンシルバニア州立大学マイクロバイオームセンター、ペンシルバニア州ユニバーシティパーク、アメリカ合衆国
3カーギルR&Dセンター・ヨーロッパ（ベルギー、ヴィルヴォールデ
4カーギルバイオテクノロジーR&D、ミネソタ州ミネアポリス、米国
5フロリダ大学動物科学部、フロリダ州ゲインズビル、米国
6カーギルアニマルニュートリション、ミネアポリス、アメリカ合衆国
はじめに 栄養および環境ストレス要因は、馬の腸内細菌叢を乱し、最終的に馬の健康およびパフォーマンスを低下させる可能性がある。我々は、酵母由来のポストバイオティクス（Saccharomyces cerevisiae fermentation product-SCFP）の補給が、長期の輸送によるストレスモデルが確立された馬に有益であると仮定している。

方法 クォーターホース（n = 20）を性別、年齢（22 ± 3ヵ月）および体重（439 ± 3 kg）でブロックし、乾草60％および濃厚飼料40％の基礎飼料（CON）または21 g/d Diamond V TruEquine C（SCFP; Diamond V, Cedar Rapids, IA）添加の基礎飼料に60日間ランダム化して投与した。57日目に、軽度の上気道炎を誘発するために、馬の頭をウィザーの高さより35cm高くして12時間繋留した。糞便サンプルは、ストレス導入前の0、28、56日目、ストレス導入後の0、12、24、72時間目に採取し、DNA抽出とNanoporeショットガンメタゲノミクスに供した。サンプル内（α）多様性は線形モデルで、サンプル間（β）多様性は並べ替え分散分析で検定した。

結果 SCFPはすべての時点においてα多様性を安定化させたが，CONはd 56と比較して，チャレンジ後12，24，72時間でより変動が大きかった（P < 0.05）．また，βダイバーシティはd56でCONとSCFPの間に差はなかった．

考察 これらの観察結果を総合すると、SCFPによる処理によって、ストレス負荷後の馬の微生物プロファイルはより強固で安定したものになると結論づけられる。

はじめに
マイクロバイオームの役割とその重要性は、環境（1, 2）、生物医学（3-5）、農業（6-8）など、過去 20 年間にいくつかのシステムで十分に確立されてきた。草食動物は特に消化管マイクロバイオームの影響を受けやすく、馬の日常食の代表である飼料に含まれる複雑な炭水化物の消化に必要な微生物のみが存在する代謝経路と相互依存関係にあるため、消化管マイクロバイオームの影響は大きい。

馬の場合、マイクロバイオームを調査する研究は比較的少ないが、その数は急速に増加している (8, 9)。馬のマイクロバイオームに影響を与える要因は数多くあるが、その中でもストレスは最も重要な要因の一つである。食事によるストレス（10）と運動によるストレス（11、12）の両方が、馬のマイクロバイオームの変化と関連している。不安定なマイクロバイオームは、日和見病原体の定着に適したオープンニッチであり、健康状態の悪化と関連している。実際、コロニー形成抵抗性は、宿主の健康維持においてマイクロバイオームが果たす最大の役割の1つである（13-15）。したがって、ストレスのかかる事象が発生した際に、頑健なマイクロバイオームを維持することは、馬の健康にとって有益であると考えられる。

最適な微生物群集を維持するために、腸内細菌叢の多様性と構成を意図的に操作するいくつかの手法を適用することが可能です。食生活の改善、プレバイオティクス、プロバイオティクス、ポストバイオティクスの投与、そして抗生物質療法や糞便微生物叢移植といったより抜本的な治療法も、マイクロバイオームの調節に用いられています（16）。ポストバイオティクスは、「宿主に健康上の利益を与える無生物微生物および/またはその成分の製剤」と定義されています（17, 18）。これらの製剤は、必ずしもプロバイオティクス微生物に由来するものではなく、無生物生物およびその代謝物の未精製混合物を含む必要があります。ポストバイオティクスの作用様式は、最終製品における生きた微生物の存在に依存しないため、飼料加工中の安定性が高いことから、飼料添加物としての魅力的な選択肢となる (19)。ウシ (20, 21)、鳥類 (22) およびウマ (23) の種で、Saccharomyces cerevisiae 発酵製品 (SCFP) によるポストバイオティクス補給の有効性を評価する研究がいくつか行われてきた。ポストバイオティクスが宿主に利益をもたらすメカニズムはまだ完全に解明されていないが、多くの文献は、ポストバイオティクス補給がマイクロバイオームの最適化（24）および免疫機能の改善（20、22、25）に関連していることを示している。しかし、馬に対するSCFPの効果についてはあまり知られていない。最近のいくつかの研究では、ワクチンチャレンジ・モデルにおいて免疫パラメータの改善が見られたが（23、26）、酵母サプリメントを与えた競走馬の微生物叢には差が見られなかった（27）。多くの動物種でポストバイオティクス投与が有益であるという証拠が豊富にあることから、ポストバイオティクス投与がストレス下にある馬に有益であるという仮説を立てるのは妥当であろう。

馬は、輸送、運動、食餌の変化など、日々ストレスのかかる状況にさらされている。いくつかの研究により、ストレスのかかる事象が馬の糞便マイクロバイオームに影響を及ぼすことが示されているが（10、28）、ポストバイオティクス投与がストレス下の馬のマイクロバイオームの堅牢性にどのように影響を及ぼすかについてのエビデンスはほとんど得られていない。そこで本研究では、長期の輸送によるストレスを模擬した確立されたウマモデルにおいて、SCFPの補充によりマイクロバイオームがより強固になるかどうかを明らかにすることを目的とした。我々は、SCFPの補給により、実験的ストレスの影響を受けにくい、より頑健なマイクロバイオームが得られると仮定した。

材料および方法
実験デザイン、動物およびサンプル収集
本マイクロバイオーム研究のための動物実験は、Tenchら（29）により記述された。実験動物の使用に関するプロトコルは、フロリダ州ゲインズビルのフロリダ大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（#201810324）により、Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Research and Teaching（30）の下で承認されている。

簡潔に述べると、20頭の若くて臨床的に健康な調教馬（平均±SEM；初期年齢22±0.3ヶ月、BW439±3kg）を年齢と性別で対にし、60日間2つの実験処理のうちの1つにランダムに割り付けた。処理には、0 g/d (コントロール；無処理コントロール) または 21 g/d の Diamond V TruEquine C (SCFP; Diamond V, Cedar Rapids, IA) の補給が含まれていた。適度な成長速度の馬の栄養要求量（31）を満たすように配合された 60% Coastal bermudagrass hay と 40% concentrate の基本飼料をすべての馬に提供した。投与は濃厚飼料に SCFP をトップドレッシングすることで行った。馬は週4日、30～45分／日の軽～中程度の強度で運動させた。57日目に、長距離輸送ストレスを模倣するために以前に確立されたプロトコルに従って、軽度の上気道炎を誘発するために、馬を個々のストールに入れ、頭をウィザー高より35cm高くして12時間繋いだ（32、33）。炎症の誘発は、ストレス誘発後に行った血清コルチゾールと血中白血球の測定値がストレス前と比較して有意に上昇したことで確認された (34, 35)。ストレス期間は、12時間のタイムポイントの後、馬の頭の綱を解くことによって緩和された。糞便サンプルは、ストレス導入前の0、28、56日目、ストレス導入後の0、12、24、72時間の7時点で滅菌容器に採取した（0時間は馬の綱を解いた時点）。サンプルは直ちに氷上に置かれ、実験室に運ばれ、DNA抽出まで-80℃の冷凍庫に保管された。実験デザインとサンプル収集の概略をFigure 1に示す。

図1
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図1. 研究の概要。若齢で臨床的に健康な馬を年齢および性別で組み合わせ、対照群（n = 10）または Saccharomyces cerevisiae 発酵物群（SCFP、n = 10）に無作為に割り付けた。馬は60日間、飼料を摂取した。57日目に、長距離輸送を模倣した軽度の上気道炎を誘発するために、以前に確立されたストレスプロトコルを馬に適用した。サンプルは、ストレス前の0、28、56日目、ストレス後の0、12、24、72時間目に採取された。

DNA抽出とショットガン・メタゲノム配列決定
DNA抽出
糞便サンプルは、DNA抽出の1日前に-80℃の冷凍庫から取り出し、4℃の冷蔵庫で一晩解凍した。ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) を Biomek i7 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) ワークステーションで使用し、製造者の指示に従ってDNA抽出を行った。クロスコンタミネーションが起こらないことを確認するために、各96ウェルプレートに4つの抽出ブランクが含まれていた。

ナノポアシーケンス
SQK-RPB004 Rapid PCR Barcoding kit (ONT, Oxford, UK)を用いてライブラリーを構築した。ライブラリーの調製には、品質管理のためのDNA抽出ブランクが含まれています。ショットガンメタゲノムシーケンスは、GridIONプラットフォーム（ONT, Oxford, UK）のR9.4.1 FLO-MIN 106フローセルを用いて、各フローセルに12サンプルをマルチプレックスして実施した。配列決定にはGuppyベースコーラを搭載したMinKNOW ONTソフトウェア（v 3.6.5）を使用し、高精度ベースコーリング設定、デマルチプレックス、アダプタートリミング、品質管理をデフォルト設定にて実施した。

バイオインフォマティクスと統計解析
分類学的割り当てと微生物多様性
MinKNOW ONTワークフローから得られたFastqファイルは、微生物の分類学的分類に使用された。まず、Minimap2（36）を用いてFastqファイルをウマゲノム（アセンブリEquCab3.0）にマッピングし、SAMtools（37）を用いてウマゲノムに一致するリードを除去することにより、宿主DNAを除去した。残りのリードは微生物由来と仮定し、分類学的な割り当てに使用した。微生物分類を改善するために、RefSeqデータベース(38)とメタゲノム集合ゲノム(38-40)から高品質のゲノムを含むカスタムデータベースを作製した。種の同定にはKraken2パイプライン(41)を、種の存在量の推定にはBrackenを使用した(42)。多様性メトリクスは、Brackenからの希少種数テーブルを入力として、Phyloseqパッケージ(44, 45)を用いてR (43) で計算された。種表は、zCompositions パッケージ (47) のベイズ乗法置換法を用いてゼロをインピュテーションした後、microbiome パッケージ (46) を用いて中心対数変換を行った。75%以上のサンプルにゼロでない種が存在し、相対量が0.001%以上の種をストレス前とストレス後で別々に同定し、すべての種を含むスーパーセットを存在量の差解析に使用した。

機能的ポテンシャル
マイクロバイオームの機能的ポテンシャルをより深く理解するために、各サンプルのマイクロバイオームコミュニティに存在するCarbohydrate-Active enZymes (CAZy) (48) を同定した。まず、Kraken2で同定した微生物種のゲノムをPROKKA（45）でアノテーションし、さらにEggNOG-mapper v2（49）を用いて遺伝子機能を評価した。アノテーションプロセスが完了した後、カスタムPythonスクリプトを使用して各ゲノムのCAZyをコンパイルし、各サンプルについて同定されたすべての微生物の累積CAZyポテンシャルを含むテーブルを生成しました。結果は、各サンプルのアノテーションされたフィーチャーの数を含む最終的なテーブルにまとめられました。

統計解析
多様性メトリクス
サンプル内（α）の多様性は、Rのlme4パッケージ（50）のlmer関数で線形モデルを適合させて評価した。モデルは、従属変数としてShannon diversity index、ランダム効果として馬、独立変数として処理、タイムポイント、およびそれらの相互作用を含んでいた。ストレスはタイムポイントに入れ子になっているため、ストレスの影響のみを別のモデルで評価した。サンプル間（β）多様性は、Rのveganパッケージ（51）のadonis関数を用いた順列型ANOVAで検定した。モデルには、従属変数としてCLR変換値に基づいて計算したAitchison距離（52）、独立変数として治療、タイムポイント、それらの相互作用が含まれていた。データはPhyloseqパッケージ(44, 45)を用いたPCAにより可視化した。

存在量の差
LinDAパッケージの線形判別分析の改良版 (53) を用いて、従属変数として相対現存量、独立変数として処理、タイムポイント、およびそれらの相互作用、そしてランダム効果として馬を含む線形モデルを適合させた。次に、各モデルの出力をemmeansパッケージ（54）で解析し、各動物について、0日目に採取した最初のサンプルに対する各測定（種）の中心化対数比（CLR）変換データの変化量を算出した。False discovery rate（FDR）補正（55、56）を使用して、処置とControlの間で有意に異なる各タイムポイント内の種を同定した。

相関ネットワーク
CLR変換されたデータを用いて、相関の多様な尺度（ピアソンの相関係数、スピアマンの相関係数、ケンドールの相関係数を含む）の組み合わせを生成するCoNetフレームワーク（57）の適応が、相関ネットワーク分析に使用された。ノード間のすべてのペアワイズスコアの分布は、各タイムポイントについて計算された。FDR補正（55、56）後のp値＜0.05のエッジ（相関）のみがさらに考慮され、少なくとも2つの指標でサポートされていないエッジは破棄された。

クラスタリング
最適なクラスタ数の同定とクラスタリングは，MATLAB R2019bのギャップ統計（58）を用いて，種とCAZy識別子についてはスペアマン相関，サンプルについてはAitchison距離を用いて計算・実行した（59）．任意の時点のCLR変換値とそれに対応する0日目の値の差を入力として使用した。データは実験変数またはクラスターに基づいてソートされ、可視化された。

結果
配列決定パラメータ
合計140個のサンプルを配列決定した。1サンプルあたり平均389,680リードが得られた（平均389,680、中央値377,834、SD 118,596）。リードのN50長は平均4,043 bp（平均4,043、中央値4,052、SD318）。リードの品質スコアは平均12（平均12、中央値12、SD 0.6）であった。平均で1サンプルあたり1,429,212,272塩基が得られ、標準偏差は413,891,226塩基であった。4つのサンプルはシーケンスのスループットが低く、さらなる解析から除外された。

分類学的割り当て
平均して67%のリードが種レベルで割り当てられました（平均66.9%、中央値67.4%、SD 4.4%）。合計119の分類群が同定されました（補足表5）。このうち、27の分類群はストレス前の期間に少なくとも75%のサンプルに存在し、相対的な存在量が0.001%以上という基準に適合し、18の分類群はストレス後の期間にこの基準に適合した。最終的に、存在量の差の解析に使用されたスーパーセットには27の分類群が含まれていました。

ストレスは微生物の多様性に有意な影響を与え、SCFP処理によりストレス後のマイクロバイオームがより強固になることがわかった
ストレス前の期間では、対照群とSCFP群の間でα多様性は同程度であり（図2）、SCFPによる処理がシャノン微生物多様性指数値を有意に変化させないことが示された。ストレスは、Control群とSCFP群の両方で、多様性レベルに影響を与えた（P < 0.0001）。しかし、ストレスによるSCFP群の多様性レベルの変化は、Controls群と比較して小さかった。全体として、SCFP を投与した馬は、Control 群と比較して、ストレス後の微生物多様性の変動が小さく、ストレスによる多様性の低下も全体的に小さかった（補足表 1）。グループ内比較を行ったところ、Control群ではいくつかのタイムポイント間で統計的な差が認められた（図2、灰色の点線、補足表2）。一方、SCFP群ではグループ内比較を行ったところ、有意な差が認められたタイムポイントが少なく（図2、青点線、補足表3）、SCFP処理がストレス後の多様性レベルをより安定させることに寄与している可能性が示唆された。

図2
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図2. アルファ多様性の比較。シャノン多様性指標は、馬をランダム効果として、処理、タイムポイント、およびそれらの相互作用を含む線形モデルで解析された。生平均と標準偏差をプロットで示した。青い菱形はSCFPを、灰色の円はControlを表す。透明な線は多様性の仮想的な軌跡を表す。破線の水平線は、ボンフェローニ多重比較調整後の0.05水準でのグループ内一対の有意差を示す。アスタリスクは、SCFPがControlと有意に異なる時間帯を示す **P < 0.01, *P < 0.05.

ベータ値の多様性は、ストレスのかかる前の期間では変化していた（図3）。時間0 h（馬の綱を解いた時間）では、SCFP処理に割り当てられた馬は2つのサブクラスターを形成したが、Control処理に割り当てられた馬は同じ全体領域に集まっていた（図3、パネル1）。28日目には、処理馬と未処理馬は重複する2つのグループにクラスター化し（図3、パネル2）、時間の経過とともに均質化し、56日目にはControlとSCFP処理馬の間に明確な差は見られなかった（図3、パネル3）。しかし、ControlとSCFP処理馬は、ストレス後、2つの全く異なるクラスタリングの軌跡を示し、SCFPとControl馬はストレス後0時間と12時間で別々にクラスタリングし（図3、パネル4および5）、ストレス後72時間で再び均質なグループに頂点に達することがわかった（図3、パネル7）。

図3
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図3. ベータ多様性の比較。アイチソン距離は、処理、タイムポイント、およびそれらの交互作用を含む並べ替え分散分析（PERMANOVA）モデルで分析された。プロットはAitchison距離の主成分分析で、CLR変換したデータ。

ストレスの影響はコントロールの馬でより大きかった
ストレス負荷と SCFP 処理は、種レベルでの微生物組成に有意な影響を及ぼした（Aitchison distances の PERMANOVA。治療、P = 0.01; タイムポイント、P = 0.01; 治療×タイムポイント、P = 0.01）。2つの種クラスターが同定された（図4A、垂直クラスターAおよびB）。大きい方のクラスター（クラスターA-18種）は、主にストレス負荷後に存在量が増加した種で構成されていた。一方、小さい方のクラスター（クラスターB-9種）は、ストレス負荷後に存在量が減少する種で構成されていた（図4A、垂直クラスターAおよびB、補足表5）。注目すべきは、SCFPで処理した馬と比較して、コントロールの馬では、ストレス後にクラスタBに属する種がより顕著に減少していることである。総微生物組成をサンプルのクラスタリング解析の基礎として使用した場合、5つの主要なサンプルクラスタが同定された（図4A、クラスタI、II、III、IV、およびV）。ストレス後のSCFP処理とControl処理の間で非常に異なる軌跡が観察され（図4B）、Control処理馬の微生物組成はほとんどがクラスタVに属していたが、SCFP処理馬はすべてのクラスタを代表する微生物組成を示した。

図4
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図4. ストレス負荷の結果、Control馬とSCFP処理馬で異なる微生物プロファイルが得られた。(A）馬の糞便サンプルで検出された細菌種の中心対数比の相対存在度のヒートマップ。(B）円グラフは、Control群とSCFP群の異なるクラスタにわたるサンプルの存在を経時的に表したものである。種クラスターAは、ストレス負荷により相対存在量が急激に増加する種を含み、種クラスターBは、ストレス負荷後に減少する種で構成されている。

ストレス負荷により、時間依存的に存在量に有意差が生じた。
SCFP処理により、ストレス負荷前のErysipelotrichaceaeの現存量が有意に増加した。実際、これはチャレンジ前の期間においてControlとSCFPの間で有意に異なる唯一の分類群であり（図5A、パネル1および2）、SCFP処理動物は研究全体を通じて全体的に正の対数比を示した（補足図）。

図5
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図5. 差異のある存在量。効果の大きさ（log2-fold change）は各生物種について示されており、有意に異なる生物種のみが対応する信頼区間とともに各プロットに示されている。統計モデルは、従属変数として相対的存在量、ランダム効果として馬、独立変数として処理、タイムポイント、およびそれらの交互作用を含む。多重仮説検定の補正はBenjamini Hochberg False Discovery Rate 法で行った。負の倍数変化は、Controlと比較してSCFPの相対的存在量が増加することを示し、正の倍数変化は、Controlと比較してSCFPの相対的存在量が減少することを示す。(A)ストレス前の差次的存在種。(B)ストレス後における差分化された生物種。

ストレス負荷後、特にストレス負荷後0時間と12時間において、より多くの生物種が有意に異なる濃度で存在した（図5B）。0時間後では、SCFP群ではControl群に比べ8種が有意に増加し、3種が有意に減少した（図5B、パネル1）。ストレス後24時間までは群間で統計的に異なる種が観察され（図5B、パネル2および3）、ストレス後72時間では有意な差のある種は観察されなかった（図5B、パネル4）。

SCFP処理馬は、対照馬と比較して、ストレス後により強固な微生物機能を示した
CAZyファミリーによって測定されたサンプルの機能的潜在能力のクラスタリング解析により、2つの主要な機能的サンプルクラスタが同定された（図6A、クラスタIおよびII）。CAZyファミリーは、Auxiliary Activity Family (AA), Carbohydrate-Binding Module Family (CBM), Carbohydrate Esterase Family (CE), Glycoside Hydrolase Family (GH), Glycosyl Transferase Family (GT), and Polysaccharide Lyase Family (PL) であることが確認されている。SCFP馬と比較して、Control馬ではストレス後にCAZyファミリーがより顕著に増加することが観察された（図6A）。組成クラスタリングの結果と同様に、Control群とSCFP群は、ストレス負荷後に著しく異なる機能プロファイルを示した（図6B）。Control馬は、ストレス負荷直後にクラスタIへの切り替えを示し、ストレス後12〜72時間には再び完全にクラスタIIに切り替わった。一方、SCFP処理馬は、試験期間全体を通じて、両方のクラスターを代表する微生物群の機能的ポテンシャルを示した。

図6
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図6. SCFP処理馬と対照馬では、機能的潜在能力が処理とストレスによって異なる影響を受けている。(A) 馬の糞便サンプルから検出された糖質活性酵素（CAZy）ファミリーの中心対数比相対存在度のヒートマップ。(B）円グラフは、Control群とSCFP群の異なるクラスターにまたがるサンプルの存在を経時的に表したものである。AA, Auxiliary Activity Family; CBM, Carbohydrate-Binding Module Family; CE, Carbohydrate Esterase Family; GH, Glycoside Hydrolase Family; GT, Glycosyl Transferase Family; PL, Polysaccharide Lyase Family.

相関ネットワークから、ストレス後の微生物群集は SCFP 処理馬でより安定であることが明らかになった。
全体として、SCFP群では対照群と比較して、特にストレス後に有意な相互作用の数が少なかった（SCFP＝198の正の相互作用と30の負の相互作用。対照群＝304の正の相互作用と210の負の相互作用、補足表4）。SCFP投与群では、全体として有意な種間相互作用の数が少なかった（チャレンジ前の最大相互作用数は310）のに対し、Control群ではチャレンジ前に合計520の相互作用があった。SCFPを投与された馬は、ストレスの前後で、Controlと比較して全体的に相互作用の数が少なかった。ストレス前の正の相互作用の割合には差が認められなかったが、ストレス後の正の相互作用の数は、SCFP投与馬が無処置のControl馬よりも大幅に多かった（87 vs. 59％）。

考察
ストレス条件下で馬にポストバイオティクスを補給することの潜在的効果を評価するため、我々は、長期の輸送を模倣する以前に確立されたストレスモデルを受けた20頭の馬の糞便メタゲノムを配列決定した。SCFPの補充がマイクロバイオームの安定性改善につながるという根拠は、ストレス条件下にある他の種においてSCFPがプラスの影響を与えるという最近の報告に基づいている（22、24、60-62）。ここで、我々は、サンプル内およびサンプル間の多様性測定において、無処置の対照馬と処置した（SCFP）馬がストレス時に非常に異なるマイクロバイオームの軌跡を示すことを観察した。さらに、SCFP馬の機能的ポテンシャルと微生物プロファイルの変化の大きさは、Control馬よりも小さいことが観察された。これらの観察結果を総合すると、SCFPによる処理によって、ストレス負荷後の馬の微生物プロファイルがより強固で安定したものになると結論づけられる。

SCFP を投与した馬では、対照群と比較して、微生物および機能プロファイルのばらつきが少ないことが観察された。これは、Shannon diversity index、微生物ネットワーク相互作用の総数、正のネットワーク相互作用の割合、および微生物と機能のクラスタリングプロファイルを含むいくつかの分析で認められたもので、SCFP投与馬よりも対照馬の方が変化の度合いが大きいことがヒートマップで示された。これらのデータから、食餌性SCFPの補給は、ストレスの影響を受けにくい、より安定した堅牢なコミュニティをもたらすと結論付けられた。我々の知見は、不顕性アシドーシスに曝された牛の微生物叢がポストバイオティクス処理により安定化する傾向があることを観察した Tun ら (24) と一致するものであった。この研究では、SCFP の補給により、亜急性ルーメンアシドーシスがルーメン微生物群の組成と機能に及ぼす影響が軽減されると結論付けている。私たちの結果と他の研究者の結果を総合すると、SCFP を投与すると、ストレスに対応するための堅牢性（変化に対する耐性と定義）がより高い微生物群になるという仮説が導き出されます。この仮説は、相関ネットワーク解析の結果からも裏付けられる。相関ネットワーク解析では、SCFP処理によって接続数が概して減少する一方で、正の相互作用の割合が増加しており、SCFP処理馬の微生物コミュニティーはよりスリム（メンバー間の接続数が少ないが正の接続数が多いコミュニティーとして定義）かつ接続数が多いことが示された。

この結果は、ポストバイオティクスの補給がマイクロバイオームバランスの改善と関連することを示した他の研究とも一致しており、多くの種で宿主の健康に反映されている（23、60、62、63）。馬では、ポストバイオティクスを補給すると、線維分解菌の相対量が増加し（64）、運動誘発性ストレスマーカーが減少した（28）。さらに、Lucassenらは、ポストバイオティクスを投与された馬はワクチン接種に対してより効率的に反応することを示した（23）。一方、同じグループが最近行った SCFP 補給に関する研究では、サラブレッド競走馬の糞便微生物叢に有意な変化は認められなかった (27)。この相違の説明として考えられるのは、20頭の馬の糞便マイクロバイオームを解析するためにショットガン・メタゲノミクスを使用した我々の研究と比較して、低解像度技術（16S rRNA遺伝子配列決定）の使用とそのデータセット（11頭）の少なさである。さらに、それらの著者らは、治療の馬依存的な効果が高いことを報告しており、これは馬ごとのばらつきが大きいことに起因している可能性がある。

馬の健康と福祉にとって、腸内マイクロバイオームによる飼料の構造的炭水化物の分解が重要かつ依存的であることから、ストレスおよびSCFP処理がCAZyファミリーに及ぼす潜在的影響について評価した。その結果、SCFPは後腸の微生物群集の組成と機能を安定化させることが確認された。これは特にストレス解消直後（0時間）に観察され、Control馬ではCAZyの存在量の低下（ほとんどの場合、薄緑色）が観察されたのに対し、SCFPでは存在量が比較的横ばいか増加した（1頭を除く）。ストレス後12時間で、Control馬は機能プロファイルの劇的な変化を示し、図6のヒートマップに示されるように、ほとんどの馬が相対的な存在量の増加を示した。この研究のサンプルサイズが小さいため、機能的な可能性についてこれ以上述べることはできないが、この研究から明らかなことは、CAZyファミリーの相対存在量の大きな変動が、ストレス後の全期間を通して処理馬と比較してControl馬に関連していたことである。さらに、強い馬対馬効果が観察され、治療効果が動物に大きく依存することが示された。これらの知見は、ポストバイオティクスを与えた馬の馬体マイクロバイオームの研究において、高い馬体間変動を観察したLucassenら（27）の知見と同様である。

本研究で同定された細菌は、健康なウマの腸内細菌叢に関するこれまでの報告と一致しており、その構成は主に繊維素細菌に支配されている (8, 9, 65)。治療群間の統計的比較のために、分類群の選択に非常に厳しい閾値を選んだことを強調することが重要である。具体的には、統計解析に含めるためには、ある微生物種が全サンプルの少なくとも75%に存在しなければならなかった。これは、多重仮説検定による偽の発見の可能性を減らすための意図的な選択であった。

ここで、我々は SCFP 処理がストレス前の Erysipelotrichaceae の相対存在量に有意な影響を与え、SCFP 処理馬は対照馬に比べてわずかではあるが有意に増加することを確認した。Biddleらも肥満馬においてErysipelotrichaceaeの有意な時間変化を観察しており（66）、このファミリーは以前に馬糞の中核微生物群集の一部であることが確認されていた（67）。しかし、ウマ腸内におけるこの種の役割についてはほとんど知られておらず、他の生物におけるErysipelotrichaceaeの役割については、マウスおよびヒトの疾患研究において様々なレベルのErysipelotrichaceaeが報告されており、多様な証拠が提示されている (12, 68)。

ストレス直後には、11種類の細菌が、非常に小さな効果量ではあるが、有意に異なることが確認された。このうち、SCFP群では8種、Control群では3種が増加し、SCFP馬で増加した種と比較すると、相対的に高い効果量であった。対照群で有意に増加した微生物は、未培養のButyrivibrio 1種、Pseudobutirivibrio ruminis、Ryzophagus irregularisであった。Ryzophagus irregularisは、植物によく見られるアーバスキュラー菌根菌で、ウマの消化管ではこれまで報告されていない（69）。この菌は多くの植物種に存在し、馬の食事が植物性であることを考えると、この発見は完全に驚くべきことではない。

ストレス後12時間では、より多くの有意差のある種が観察された。18種の有意差のうち、6種は比較的高い効果量を持ち、SCFP馬で増加した。これらの種には、Blautia、Acetivibrio、Methanobrevibacterに加え、3種のButyrivibrioが含まれており、これらの種はストレスの12時間後にSCFP処理馬で相対存在量が有意に高いことが判明している。Butyrivibrioは非常に汎用性の高い細菌で、複雑な糖質を加水分解する様々な酵素をコードしている(70, 71)。また、糖質発酵や酪酸生産に関与するグリコシドヒドロラーゼ（GH）をコードする遺伝子を多数保有していることが報告されている。同様に、BlautiaとAcetivibrioも繊維発酵菌である(8)。また、Butyrivibrio属での増加と一致し、機能アノテーション解析では、本研究で有意差が認められた62酵素のうち36酵素がグリコシドヒドロラーゼをコードしていることが判明した。最後に、Methanobrevibacterもストレス後12時間および24時間において、SCFP群で増加していることが確認された。ウマ腸内のメタン生成アーキアの存在は以前から報告されており、ウマ腸内のメタン生成菌の多様性は高いと考えられている（8, 72）。

このプロジェクトの一環として収集された豊富なデータにもかかわらず、20頭のウマというサンプルサイズは比較的小さいと認識している。さらに、ストレスや治療に対する反応に馬の内因性因子が影響することは、ある時点で一頭の動物が他のグループと異なる行動をとることで観察されたので、立証された。実際、このストレスモデルにさらされた馬の免疫パラメータには、馬ごとのばらつきがあることがよく知られている（33）。Raidal らは、長時間の頭部挙上を行った 6 頭の馬で、白血球数、好中球数、総細菌数の変化の程度が異なることを観察した (33)。このような変動が加わることで、我々の分析は混乱し、強いシグナルを特定することができなくなったかもしれない。とはいえ、動物はそれぞれ異なるため、今後の研究では、動物間の変化を考慮し、おそらく動物内のマイクロバイオームの変化という観点から効果を定量化する必要があります。このデータセットの不均一性が比較的高いにもかかわらず、我々は、αおよびβ多様性の測定、細菌および機能プロファイル、および細菌相互作用の動態で観察されたように、SCFPによる処理がストレス後のマイクロバイオームの堅牢性と安定性を促進する傾向があるという明確な全体的シグナルを特定することができた。

本研究は、ストレス下にある馬へのポストバイオティクス投与がもたらす有益な影響に関する一連の知見を追加するものである。ポストバイオティクス投与により馬の腸内細菌叢に堅牢性と安定性が付与される具体的なメカニズムは完全には解明されていないが、他の種における研究では、ポストバイオティクス補給による健康増進の潜在的な基礎メカニズムとして、免疫調節経路における効果（73）およびマイクロバイオームの構成と機能の改善（24）が示唆されている。免疫の観点からは、SCFPを投与された動物は、脅威が検出されたときにサイトカイン産生が増加（反応の大きさ）および加速（反応の速さ）して反応するようにプライミングされているようだ（61、62）。さらに、SCFPを投与された動物では、チャレンジ部位において、白血球の食作用および殺傷能力が高まり、炎症系の活性化が抑制されるため、局所的な炎症が減少し、免疫病理の可能性が低下する（62, 74）。マイクロバイオームの観点からは、反芻胃動物に関する研究により、SCFP 補給によりマイクロバイオームの有力なメンバーの存在量が増加し、マイクロバイオームの豊かさと多様性が促進され、その結果、VFA 産生の増加およびルーメン発酵のエネルギー効率の改善が見られることが示されている (24, 75)。したがって、免疫調節経路を介したSCFPポストバイオティクスの二重作用とマイクロバイオームの機能最適化により、広範な感染性および代謝性ストレス要因に対する動物の頑健性が高まることが推測される。

この結果は、ストレスにさらされる前に酵母由来のポストバイオティクスを予防的に補給することが、馬にとって有益な戦略である可能性を示している。この探索的研究は、ストレスモデルにさらされた馬におけるSCFPの効果について、メカニズム的な結論を導き出すという点では限界がある。SCFP を給与した馬の微生物多様性および機能プロファイルの変化の程度は、対照群と比較して低いことが観察された。メカニズム的には、マイクロバイオームがより強固で安定していれば、病原体のコロニー形成の機会が減少し、健康維持が向上する可能性が高い。ポストバイオティクスは、いくつかの動物種でポジティブな影響を与えることが実証されており、これらの有益な効果が生じるメカニズムについてさらなる研究が必要である。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表されたデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, bioproject PRJNA788958で確認できる。

倫理に関する声明
この動物実験は、フロリダ州ゲインズビルのフロリダ大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（#201810324）により審査・承認されたものである。

著者による貢献
LWは動物実験の設計を行った。EKとBKはマイクロバイオーム研究の設計を行った。MTは動物実験の実施とサンプル収集を行った。MSは配列決定とバイオインフォマティクスを行った。ACは統計解析を行った。EG、EK、SNはデータを解釈した。EGとEKは最初の原稿を作成した。最終原稿は全著者が読み、承認した。

資金提供
著者らは、本研究がカーギル社のブランドであるDiamond V（Cedar Rapids, IA）から資金提供を受けていることを表明する。この資金提供者は、研究デザイン（EKとBK）、分析（ACとMS）、データ解釈（EK、AC、MS、SN、BK）、初稿作成（EK）において、本研究に関与している。EGは、USDA National Institute of Food and AgricultureおよびHatch AppropriationsのAward Nos.

利益相反
AC, MS, BK, SN, EKはCargill Inc.に雇用されていた。

残りの著者は、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1134092/full#supplementary-material でオンライン公開されています。

略語
CAZy, Carbohydrate Active enZyme; CLR, Centralized Log-Ratio; FDR, False Discovery Rate; SCFP, Saccharomyces cerevisiae発酵生産物.

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キーワード：ウマ、馬、サッカロミセス・セレビシエ発酵産物（SCFP）、ポストバイオティクス、ストレス、マイクロバイオーム

引用元 Ganda E, Chakrabarti A, Sardi MI, Tench M, Kozlowicz BK, Norton SA, Warren LK and Khafipour E (2023) Saccharomyces cerevisiae fermentation product improves robustness of equine gut microbiome upon stress. Front. Vet. Sci. 10:1134092. doi: 10.3389/fvets.2023.1134092

Received: 2022年12月29日; Accepted: 2023年2月01日
掲載：2023年2月24日

編集者

中国・広東海洋大学 劉文晁
査読者

ハノーバー獣医科大学（ドイツ） Hans-Joachim Schuberth 氏
Muhammad Akbar Shahid, Bahauddin Zakariya University, パキスタン
Copyright © 2023 Ganda, Chakrabarti, Sardi, Tench, Kozlowicz, Norton, Warren and Khafipour. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用，配布，複製は認めない．

*通信欄 Ehsan Khafipour, yes ehsan_khafipour@cargill.com; Erika Ganda, yes ganda@psu.edu.

これらの著者は、この研究に等しく貢献し、筆頭著者を共有しています。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしもその関連組織のもの、あるいは出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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