細菌のc-di-GMPは宿主と微生物の共生を成立させる上で重要な役割を担っている

2023年9月4日 13:04

オープンアクセス
出版：2023年8月31日
細菌のc-di-GMPは宿主と微生物の共生を成立させる上で重要な役割を担っている

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01468-x

ナンシー・オベン、アンナ・ツェルヴィンスキー、...ヒンリッヒ・シュレンブルク著者一覧を見る
Nature Microbiology (2023)この記事を引用する

2843 アクセス

61 Altmetric

指標詳細

概要
ほとんどの微生物は宿主よりも早く進化するため、宿主-微生物相互作用の進化を促進するはずである。しかし、微生物が宿主との会合に適応する経路を規定する特性については、比較的ほとんど知られていない。我々は、線虫Caenorhabditis elegansを宿主とする自由生活細菌Pseudomonas luridaを実験的に進化させることにより、宿主への適応を媒介する微生物形質を同定した。10回の継代培養を行った結果、有益な宿主特異的細菌の進化が繰り返し観察され、線虫における持続性の向上はバイオフィルム形成の増加と関連していた。全ゲノム配列決定により、細菌のセカンドメッセンジャーである環状ジグアニル酸（c-di-GMP）を一様にアップレギュレートする変異が明らかになった。続いて、異なるシュードモナス菌株や種でc-di-GMPをアップレギュレートした変異体を作製したところ、宿主との会合が一貫して増加した。様々な環境から得られたシュードモナドのゲノムを比較した結果、c-di-GMPが植物からヒトまで様々な宿主への適応を支えていることが明らかになった。本研究は、c-di-GMPが宿主との結合を確立するための基盤であることを示している。

主な内容
宿主に関連する微生物は、動植物宿主の生理機能や体力に重要な影響を及ぼす1,2,3。このような宿主と微生物叢の相互作用は、微生物叢が介在する宿主機能に焦点を当てた、宿主中心の視点で研究されることが多い。このような見方では、ほとんどの微生物は宿主よりも世代交代が早く、突然変異率も高いため、宿主よりも早く進化するという重要な事実が無視され、微生物にとってのフィットネスの向上が相互作用を不釣り合いに促進している可能性がある4。宿主と微生物との会合が進化する上で重要なステップは、より特殊な相互作用が出現することである。この相互作用によって、自由生活する細菌が確実に宿主に侵入し、持続し、最終的には環境中に放出されて新たな宿主をコロニー形成することができるようになる（図1a）4。これまでのところ、細菌が宿主とのこのような会合にどのように適応するかを決定する形質や分子過程については、ほとんど知られていない。

図1：微生物叢の細菌は宿主特異的な表現型を進化させる。
図1
a,宿主に関連する微生物は、自由生活段階から宿主との会合へと移行する。6つのP. lurida個体群を、宿主C. elegans（EVOhost）または対照として宿主なし（EVOctrl）で、これらの段階にわたって10回継代した。 c,進化した細菌は宿主にとって有益なままであり、線虫の個体数の増加によって決定された（両側t検定およびFDR補正Tukeyポストホック比較、各処理につき6反復）。e,進化した宿主特異的細菌（赤色蛍光dTomatoでタグ付け）は、ワムシの腸にコロニーを形成した（線虫腸細胞内の自家蛍光小胞はシアン）。f,宿主関連ライフサイクルの主要形質（a）のPCAから、進化したシワシワ宿主スペシャリスト細菌は祖先細菌と比較して明確なプロフィールを持つことが明らかになった（個々の形質の測定値については補足表5を参照）。b-d,箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界）、四分位範囲（ひげ）を示す。

フルサイズ画像
結果
宿主特異性細菌の進化
シュードモナス・ルリダ（Pseudomonas lurida）という細菌と線虫の宿主である線虫（Caenorhabditis elegans）をモデルとして、自由生活から宿主との会合への進化的移行を、制御された実験的進化を通して研究した。この細菌は、線虫の自然微生物叢に時折見られる5,6。実験室条件下では、P. luridaの存在は線虫の個体数増加率と関連しており、病原体から身を守ってくれるが、宿主も細菌も互いに依存することなく増殖できる5,7,8。宿主に適応した細菌を選択するために、6つのP. lurida個体群を、宿主に関連した相を持つか持たないかのどちらかで連続継代した（図1a；それぞれEVOhostまたはEVOctrl）。すべての個体群は同じクローン祖先から接種された。宿主を10回通過した後、細菌は宿主において、その祖先よりも平均5-10倍高い細菌負荷量に達した。これは、宿主に暴露されずに進化したが、それ以外は同じ条件であった対照では観察されなかった有意な変化である（図1bおよび拡張データ図1）。線虫の個体数増加（線虫の体力の代用として使用5）は有意な変化を示さず、むしろ適応した細菌の存在下で増加した（図1c）。

継代培養の結果、細菌集団はコロニーの形態が多様化した。実験終了時には、宿主に関連したすべての実験複製集団で「しわくちゃ」形態型が優勢で、対照群では見られなかった。一方、「フサフサ」形態型と「つるつる」（先祖返り）形態型は、すべての処理で存在した（図1dと補足表1）。宿主での優位性が大きいにもかかわらず、寒天培地上での生育中に、しわのある形態型は減少し、一方、滑らかでファジーなタイプは増加した（Extended Data Fig.1および補足表2）。シワシワ型はワームに適応した細菌に特有であり、非常に高い存在量に達したことから、宿主のスペシャリストと考えられた。これらのスペシャリストは、線虫の腸管内、特に前部と後部に集団で見られる（図1eおよび拡張データ図2）。注目すべきは、進化したしわくちゃの形態型が、静的マイクロコズムの気液界面に出現するしわくちゃのP. fluorescens9や、様々な病原性細菌のしわくちゃ変異体10,11,12と類似していることである。我々の実験から、この形態変化は宿主との会合に適応する有益な細菌でも起こることが示唆される。これらの適応のさらなる特徴を明らかにするために、我々は進化実験の最終集団から分離された、遺伝的に安定した別個の形態型（補足表3）の47クローンに注目した。

宿主のスペシャリストは異なるライフスタイルを持つ
宿主との相互作用の各段階における形質変化の解析から、シワシワの形態型が線虫との相互作用に特異的に適応していることが明らかになった。詳細には、自由生活段階で重要な2つの形質と、宿主との会合で重要な4つの形質を特徴付けた（図1aに記載）。その結果、シワシワ分離株のプロフィールは祖先の形質プロフィールとは有意に異なることがわかった（図1fおよび補足表4）。これは主に、短期持続性、宿主からの遊離、in vitroでのバイオフィルム形成が有意に増加したためである（図1f、拡張データ図3、補足表4〜6）。宿主との相互作用が改善された全体的なパターンは、進化実験の最後に得られた遺伝的に多様な個体群を分析することによっても再現され、宿主と相互作用した個体群は、同様に持続性と放出性が増加した（拡張データ図4、補足表7と8）。詳細には、バイオフィルム形成は宿主との持続的な接触を可能にし、多くの病原体15で例証されているように、ストレス耐性を高め13,14、線虫の消化管内での生存率を向上させる。バイオフィルム形成が進むと、凝集した細胞は排出されやすくなる16。このような排出により、他の宿主に感染する可能性も高まる4。注目すべきことに、シワシワ分離株は初期のコロニー形成において先祖株と差はなかったが、コロニーの拡大とプレート上での群形成において有意な減少を示した（図1f、拡張データ図3、補足表4および5）。後者の結果は、カメムシの中で相互主義者になるように進化した大腸菌で報告されている運動性の低下17と一致するが、ゼブラフィッシュやヤリイカのコロニー形成開始には十分な群泳が必要であるという知見18,19とは対照的である。これらの対照はおそらく、ゼブラフィッシュとイカでは水生環境、線虫とカメムシでは陸上環境という宿主システムの違いによるものであろう。さらに、バイオフィルム形成の増大と運動性の低下という観察結果は、宿主との共生を定義する形質と自由生活段階との間に、進化的にトレードオフの関係が生じたことを示しているのかもしれない。我々は、線虫の宿主の存在下での実験的進化が、宿主特化型の出現と拡散をもたらすと結論づけた。次に、改善された宿主との会合に共通の遺伝的基盤があるかどうかを調べた。

c-di-GMPが宿主の特殊性を決定する
単離された形態型と祖先の全ゲノム配列決定により、シワシワの宿主スペシャリストにおいて、細菌のセカンドメッセンジャーである環状ジグアニル酸（c-di-GMP）に影響するいくつかの独立した変異が明らかになった。特に、非サイレントゲノム変異を比較した結果、シワシワ宿主スペシャリストに特異的な変異遺伝子が同定された（図2aおよび補足表9）。そのうちの2つの遺伝子、wspEとwspFは、それぞれシワジワ・スプレッダー（wsp）オペロン中のハイブリッドセンサー・ヒスチジン・キナーゼとメチルエステラーゼをコードしている20。これらの遺伝子は、偽性大腸菌を含むβ-およびγ-プロテオバクテリアにおいて、c-di-GMPレベル（図2g）とシワシワ形成を制御する2成分系の一部である20,21,22,23。私たちは、これまでc-di-GMPシグナル伝達には関連づけられなかったRNアーゼPHをコードするrph遺伝子に、宿主の専門家に特有の変異を追加発見した。蛍光ベースのc-di-GMPセンサーと液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）の両方を用いて、wspE、wspF、rphのいずれかに1つの変異を持つ3つのシワシワ分離株で、祖先と比較してc-di-GMPがおよそ2倍増加していることを発見した（図2b、拡張データ図5、補足表10）。このことは、wspFの機能喪失変異（c-di-GMPをダウンレギュレートする）と、WspEとRphの活性部位の変化が、すべてc-di-GMPをアップレギュレートする方向に収束していることを示している。進化したアミノ酸配列と祖先のアミノ酸配列のアラインメントを行い（Extended Data Fig.6）、WspFの機能ドメインの破壊を確認した。また、WspEのレシーバードメインの破壊も確認され、これはおそらく脱自己リン酸化を防ぎ、下流のWspR24を常に活性化する。Rphのエキソリボヌクレアーゼドメインのアミノ酸置換は、リボヌクレアーゼ活性とc-di-GMP代謝をさらに結びつけている。他のwrinkly変異体ではc-di-GMPレベルの同様の増加が観察されたが、smooth変異体やfuzzy変異体では観察されなかったので（Extended Data Fig.5）、我々は続いて、wrinkly特異的変異が本当に宿主との結合を改善するのかどうかを調べた。

図2：Wrinklyの宿主スペシャリストは、細菌のセカンドメッセンジャーc-di-GMPをアップレギュレーションし、宿主内競争力を高めることで線虫に適応する。
図2
a,進化した細菌単離株における非サイレントな変化を持つ遺伝子の概要。データポイントは、与えられた遺伝子に1つまたは複数の変異を持つ変異分離株を示す（括弧内は与えられた形態を持つ分離株の総数）。b,蛍光センサーとLC-MSは、祖先と比較して、進化したシワシワ変異体においてより高い細胞内c-di-GMP濃度を検出した（WelchのANOVAとGames-Howellのpost hoc比較、各処理につき5反復）。c、進化したwspF、wspE、rph変異体（左）、レスキューされた変異体（中）、および線虫MY316（3＜n＜5）における持続中の祖先のバックグラウンドで再構成された変異体（右）の競争力（祖先に対するワームあたりのc.f.u.s、破線）。e、ΔwspR変異を追加したwspF、wspE、rph変異体（5＜n＜6）の競合的フィットネスを祖先のPl_MYb11（破線）と比較。f、プラスミド（pJN2133）から異種ホスホジエステラーゼ（PDE）PA2133を発現するwspF、wspEおよびrphと、プラスミド（pJStrep-GCN4-WspR）から構成的に活性なジグアニル酸シクラーゼ（DGC）GCN4-WspRを発現する先祖代々のMYb11の競合適合性を、それぞれの空ベクター対照（n＝4、破線）と比較した。c-f,持続性競合実験は1処理あたり3反復以上行い、ANOVA (d)またはLMMとFDR補正Dunnettポストホック検定で解析した; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界）、四分位範囲（ひげ）を示す。 g, RphとWsp系を介した適応的c-di-GMP操作のグラフ仮説。実線はすでに確立された制御相互作用を示し、破線は新たな仮説を示す。赤は実験進化から推測される変異遺伝子の結果。

フルサイズ画像
wspE、wspF、rphの機能遺伝学的解析により、これらが宿主適応に直接関与していることが示された。この解析のために、宿主コロニー形成時の先祖に対する変異体の競争力を評価した。まず、選択した3つのwrinkly変異体を再評価したところ、それらは祖先よりも有意に競争力が高く（図2c、左パネル、補足表11）、in vitroでのバイオフィルム形成の増加と群れの減少が見られた（拡張データ図7、補足表12）。その後、これらの変異体を対応する祖先の対立遺伝子でレスキューしたところ、変異体のフィットネス上昇は確かに消失した（図2c、中パネル、および補足表11）。第3に、各変異を祖先のバックグラウンドに実験的に導入した結果、少なくともwspFとrph変異については、有意に高い競争力が得られた（図2c、右のパネル、および補足表11）。wspE変異体とwspF変異体のどちらか一方を、祖先と他の2つの形態型との四つ子競合にかけた場合にも、同様のフィットネス優位性が観察された（Extended Data Fig.8および補足表13）。注目すべきことに、進化した変異体のフィットネス優位性は、非ネイティブ宿主株（線虫実験室株N2）でも一貫して観察された（図2dおよび補足データ表14）。これらの遺伝子のうち2つはWspシステムの構成要素であり、他のシュードモナドでは表面センシングの際にc-di-GMPを制御している25,26が、Pl_MYb11では理論的には様々なc-di-GMP修飾酵素を持っている。これには、ジグアニル酸シクラーゼ（DGC）とc-di-GMP特異的ホスホジエステラーゼ（PDE）の機能を持つと推定されるGGDEFをコードする34の遺伝子とEALドメインをコードする22の遺伝子がそれぞれ含まれる。我々は、進化した宿主特異的変異体のwspRノックアウトを用いて、宿主適応におけるWspシステムの同族DGCの役割を検証した。この変化により、変異体の宿主における競争優位性が失われ（図2e）、コロニーの形態がしわくちゃから滑らかなものに変化した（Extended Data Fig. さらに、緑膿菌23,27由来のPDEとDGCを異種発現させることで、c-di-GMPレベルを直接操作したところ、予想通り、それぞれ線虫での持続性が低下または改善した（図2f、拡張データ図7、補足表16）。したがって、Wspシステムを介してc-di-GMPレベルを増加させることに収束するwspE、wspF、rphの変化は、宿主における細菌の体力を向上させると結論づけた（図2g）。このセカンドメッセンジャーのアップレギュレーションは、基本的な生活史スイッチ13を媒介することから、我々は次に、このセカンドメッセンジャーが、より一般的に、宿主との共生を媒介するかどうかを調べた。

c-di-GMPは一般的に共生を促進する
wspFの遺伝子操作とシュードモナスゲノムのバイオインフォマティクス解析から、wsp遺伝子が宿主との共生に一般的に関与していることが明らかになった。前者については、P. lurida MYb193株と遠縁のP. alkylphenolia MYb187株（ともに線虫と自然共生）のwspF欠失変異体を作製し、さらにシワシワ形成のモデルであるP. fluorescens SBW25株の変異体と野生型を得た21。その結果、変異株はそれぞれの野生株と比較して、線虫宿主における競争力が有意に高いことがわかった（図3aおよび補足表17）。さらに、NCBIの1,359の全シュードモナスゲノムにおけるwspおよびrph遺伝子の存在と、ライフスタイルの代理である分離元菌との相関を調べた（Extended Data Fig.） wsp遺伝子のいずれか、あるいは高度にシンテナイズされた完全なwspオペロン（補足表19）20を持つシュードモナス分離株は、これらの遺伝子を持たない分離株よりも宿主から分離される頻度が有意に高かった（図3bおよび補足表19）。これらの結果は、制御作用が正反対の遺伝子（例えばwspEとwspF）にとっては意外に思えるかもしれないが、おそらくオペロン全体と相互作用する遺伝子群がシンテニックに受け継がれることで説明できる（補足表19；文献20も参照）。さらに、健康な宿主／未診断の宿主から分離された株では、罹患宿主から分離された株よりもrphがより多く見られた。生活様式を問わず、さらにwspE、wspF、rphには負の選択の徴候が検出され、存在する場合には選択によって機能が安定化されることが示唆された（補足表20）。これらの遺伝子が存在することで、c-di-GMPのきめ細かな制御が可能になり、それによって宿主に付随した生活様式への適応が可能になると考えられる。

図3：C-di-GMP制御因子は、一般的に偽性細菌全体で宿主との共生を媒介する。
図3
a,WspF欠失は、野生型と比較して、異なるシュードモナス種の宿主内競争力を増加させる（ワームあたりのc.f.u.s.、野生型は破線で示す；LMMおよびFDR補正Dunnettポストホック検定、3＜n＜5,)。b,wsp遺伝子とrphの有無、およびwspオペロンの完全性（つまりwspA-FとwspRの存在）は、配列決定された仮種菌の分離元と共変動する（Χ2適合度検定）。

フルサイズ画像
考察
我々の研究は、細菌がその生活史を運動性から無柄性で持続性の生活様式に移行させることにより、宿主との関連を改善できることを示している。この生活様式の転換は、一連の生活史形質（図1f）の相関的な変化からもたらされ、これらが一体となって生活史戦略の転換を表している。この変遷を解釈するひとつの方法は、r-K型生活史の連続体に沿ったシフトであり、高い繁殖率を特徴とするr型戦略から、高密度条件下での持続性を特徴とするK型戦略へのシフトである28,29。このような移行が一般的に宿主との会合の増加につながるかどうかを実証するために、我々は以前に発表された宿主との会合に向けた微生物進化の数理モデルを拡張して使用した30。このモデルを用いて広範なパラメータ空間を探索した結果、宿主内での持続性を高めることが、微生物の宿主への適応にとって最適な戦略であることがしばしば確認された（Extended Data Fig.

我々の実験では、主に自由生活型から宿主関連型へのライフスタイルのシフトは、Wspシステムとそれに続く細菌のセカンドメッセンジャーc-di-GMPの活性によって媒介される。C-di-GMPは、細菌病原体における病原性の制御を含め、細菌の主要な生理学的機能を制御することがよく知られている22,31。私たちの研究は、この制御系が、植物からヒトまで多様な宿主系に対するシュードモナドの適応を促進し、病原体のみならず、有益な宿主と細菌の関係にも及んでいることを示している。宿主の機能における有益微生物の重要性を考えると、非病原性の連携を媒介するメカニズムを理解することは極めて重要である。我々の研究は、c-di-GMPがこのような関係の多くにおいて重要な役割を果たしていることを示唆している。

方法
宿主と細菌株
P. lurida MYb11株（Pl_MYb11）とその天然宿主C. elegans MY316株（Ce_MY316）を用いて進化実験を行った（文献5）。すべての実験の準備として、我々は凍結したワムシストックを解凍し（-80℃）、大腸菌OP50を播種した線虫増殖培地寒天培地（NGM32）上でワムシを飼育した。追加の持続コロニー形成実験では、進化した細菌の非ネイティブ宿主として標準的な実験室株C. elegans N2を用いた。無菌で同調したL1幼虫を集めるために標準的な白化プロトコルを用い、その後、特に断りのない限り、大腸菌OP50（20℃）でL4期まで飼育した。

P. lurida MYb11株およびMYb193株、P. alkylphenolia MYb187株はCe_MY316（文献5）から、P. fluorescens SBW25株はテンサイの葉から分離した9。細菌は、特に断りのない限り、トリプティック大豆寒天培地（20℃、48時間）およびトリプティック大豆ブロス（28℃、150 r.p.m.、一晩）で培養した。

進化実験
Pl_MYb11のクローンに由来する細菌集団を、Ce_MY316存在下（宿主処理、6反復）、またはワムシなし（陰性対照、6反復）でNGM上で連続継代した。各レプリケートについて、Pl_MYb11の芝生をNGM上に播種し、3.5日間培養した。宿主処理の各サイクルについて、プレートあたり10匹の線虫L4幼虫を加え、線虫がF1世代に達するまで培養した（3.5日間）。陰性対照では、細菌は虫なしでNGM上で維持した。各サイクルの終わりに、宿主に関連した処理とコントロール処理のそれぞれで、ワームまたはプレートのいずれかから細菌を集め、集団の10％（ボトルネック）を次のサイクルに移し、サンプルを凍結保存した（-80℃）。同様の数のコロニー形成単位（c.f.u.）を陰性対照のボトルネックに用いた。合計10サイクルを実施した。

10サイクル目の凍結菌は回収し、さらなる実験を行う前に、凍結・解凍による潜在的な選択的影響を最小化するために、進化実験をもう1サイクル行った。最近の宿主曝露に対する生理学的反応ではなく、宿主処理とネガティブコントロールの個体群間の進化的差異に焦点を当てるため、細菌は一般的なガーデン処理としてNGM上で2日間増殖させ、その後のアッセイに使用した。

個々のワムシの細菌コロニー形成
宿主との結合中の細菌のフィットネスは、ワムシ1匹あたりのc.f.u.s.として定量化した。準備として、細菌群（125 µl、光学密度(OD)600 = 2）をNGM上に播種し、同期化したL4 Ce_MY316を5匹加えた。20℃で3.5日後、0.025% Triton-100と25 mMの麻痺性駆虫薬テトラミソールを含むM9緩衝液でワムシを回収した。特注のフィルターチップ洗浄システム33 を用いてワムシをバッファーで洗浄し、Triton-100を含むM9で回収した。虫を含まない上清をバックグラウンドサンプルとして回収した。ビーズビートによるホモジナイズ後、c.f.u.s.の定量には連続希釈とプレーティングを用いた。多様な個体群については、コロニーの形態を平滑、フサフサ、シワシワとしてスコア化した。

ワムシ集団の成長
3.5日間にわたる5匹のL4幼虫によるワムシ集団の成長を、宿主適合性の代用として定量した。細菌とミミズはコロニー形成アッセイと同様に調製し、洗浄したミミズは48ウェルプレートで凍結保存した。ミミズの写真はImageJ2（参考文献34）で自動的にスコアリングされた。ミミズは楕円で近似された粒子として検出され、C. elegansのような寸法（長軸0.18-1.3 mm、短軸≦0.1 mm（参考文献35））に適合するものがカウントされた。自動カウントと2人の独立した実験者のカウントとの相関性により、検出の質を検証した（r(58) = 0.736, P = 2.106 × 10-11）。

ワムシの初期コロニー形成、持続性、放出
L4期ワムシの初期コロニー形成、持続性、放出を定量化するために、先祖代々のPl_MYb11と進化した集団（ポストコモンガーデン）またはクローン形態型（一晩培養）からバクテリアローンを調製した。初期のコロニー形成アッセイでは、コロニー形成しない大腸菌O50で飼育したL4 Ce_MY316に侵入した細菌を定量した。その後、コロニー形成レベルを上記のようにアッセイし、初期コロニー形成の指標としてワームあたりのc.f.u.s.を得た。

持続性アッセイと放出アッセイでは、ワムシをそれぞれのアッセイ細菌（L1からL4ステージまで）で飼育し、進化実験のF1世代のワムシの発育を模倣した。その後、ワムシを回収し、フィルターチップ洗浄システムを用いて洗浄し、サンプルを上清（上清1）とワムシサンプル（各100 µl）に分けた。その後、ワムシを200 µlのM9に懸濁し、1時間培養した後、放出されたバクテリアを含む100 µlの上清（上清2）を回収した。上清2と上清1のc.f.u.sの差から、ワーム1匹あたりに放出されたc.f.u.sを求めた。これとともに、このサンプルのワムシに維持されているc.f.u.sを定量し、持続性の指標とした。

細菌の増殖、コロニーの拡大、群発生
細菌の増殖を測定するため、細菌集団（一般的な園処理または一晩培養）をOD600 = 0.1に調整し、50 µlをNGM上にスポットした。培養（20℃で24時間または3日間）後、芝生を削り取り、ホモジナイズし、連続希釈によりc.f.u.s.を測定した。

0.5％または3.4％の寒天を含むNGM上で、コロニーの膨張と群をそれぞれ測定した。いずれの場合も、0.5 µlの細胞懸濁液（OD600 = 1）を表面乾燥した寒天プレートにスポットした。コロニー径は24時間後、3日後、7日後に測定した。

バイオフィルム形成
in vitroバイオフィルム形成は、前述の36. 特に、アッセイは表面処理したニュンクロンデルタプレートでランダムレイアウトで行った。染色は48時間培養後に行った（20℃、180 r.p.m.でオービタル振盪）。染色したバイオフィルム溶液の吸収は、Gen5マイクロプレートリーダーとImagerソフトウェア（Biotek, v.3.08.01）を用いて550 nmで測定した。液体中でのバイオフィルム形成を説明するため、ガラス試験管に2mlのトリプティック大豆ブロスを入れ、先祖代々のPl_MYb11または進化した宿主特異的変異体（wspE、wspF、rph）のシングルコロニーを接種し、20℃で48時間培養した後、写真撮影を行った。

形態型の単離
進化した10周期の個体群から、視覚的に明確な形態を持つ代表的なコロニーを単離した。進化した個体群を解凍し、連続希釈してプレーティングした（48時間、20℃）。すべての進化した個体群からユニークな形態型を再静置し、凍結ストックとして保存した（補足表3）。すべての形態型は一度解凍して再静置し、2日間の培養で安定したコロニー形態を示した。

マクロコロニーの増殖
Pl_MYb11の形態型と変異体のマクロコロニーは、既述の方法で調製した37。簡単に説明すると、一晩培養した5μlを、40μg ml-1 コンゴレッドを添加したトリプティック大豆寒天プレートにスポットし、20℃で培養した。24時間または48時間後、ライカの蛍光顕微鏡（LEICA M205 FA）を用いて写真を撮った。

皺状形態型MT12の蛍光標識とin vivo顕微鏡観察
wrinkly morphotype MT12は、既述のようにTn7トランスポゾンを用いた染色体挿入により、赤色蛍光dTomato（dT）で標識した38,39。標識の挿入は、コロニーの皺状形態に影響を与えなかった。

蛍光標識したMT12を用い、共焦点レーザー顕微鏡（ZEISS LSM 880）を用いてCe_MY316のコロニー形成を観察した。このために、同調させたL1期幼虫を標識細菌に72時間曝露し（20℃）、重力洗浄で回収し、既述のように顕微鏡用にマウントした39。25倍のLD LCI Plan-Apochromat多焦点対物レンズ（開口数(NA)=0.8）を用いて完全なワームの概観を作成し、40倍のC-Apochromat水浸対物レンズ（NA = 1.2）を用いて詳細を画像化した。バクテリアの蛍光とワームの自家蛍光を順次励起し（561 nmと488 nm）、Airyscan検出器（R-S感度モード；ロングパスフィルター≥570 nm；バンドパスフィルター495-550 nm）で検出した。データはZEISS Efficient Navigation 2のAiryscan自動処理機能で処理した。本研究で使用した遺伝子組み換え細菌のリストについては、補足表21を参照。連続した数週間の実験で、少なくとも3つの生物学的複製集団における10匹以上のワムシのコロニー形成を見た後、代表的なワムシをFig.

ゲノム配列決定と解析
セチル-トリメチルアンモニウム-ブロミドベースのプロトコルを用いて全DNAを単離した40。イルミナMiSeq（ペアエンド、300 bp）シーケンスでは、Nextera DNA Flexキットを用いてライブラリーを調製した。リード品質はFastQC（v.0.11.8）（ref.41）を用いて検査し、リードはTrimomatic（v.0.3.9）（ref.42）を用いてトリミングした。ペアリードをPl_MYb11参照ゲノム（RefSeq: GCF_002966835.1; Bowtie2 v.2.3.3 (ref.)）にアライメントし、Picardtools (v.2.22.2) (ref. 44)を用いて重複領域を除去した。BCFtools（v.1.10.2）（参考文献45）とVarScan（v.2.3.9）（参考文献46）を用いてバリアントをコールし、アノテーション（snpEff47,48）を行った。R49,50で祖先対照に存在しない非同義バリアントをフィルターした。遺伝子オントロジーはPseudomonas.com51を用いて推定した。推定DGCまたはPDE活性を持つ酵素をコードする遺伝子を推定するために、Pseudomonas.com51経由で保存ドメインデータベース(CDD)のInterProScanを用いてGGDEFおよびEALドメインを持つタンパク質を検索した。

アミノ酸配列のアラインメント
先祖WspE、変異WspF、RPHのアミノ酸配列アラインメントを作成するために、ヌクレオチド配列をEMBOSS Transeq52 (frame 1; bacterial codon table; forward for wspE and wspF, reverse for rph)を用いて翻訳し、得られたアミノ酸配列をClustal Omega52 (v.1.2.4; ClustalW with character counts and standard settings)を用いてアラインメントした。タンパク質のドメインのアノテーションと可視化のために、それぞれの配列のドメイン予測をPfam/InterPro（Pseudomonas.comから入手51）から収集し、DOG（v.2.0）で作成したタンパク質の可視化で視覚的に強調した53。

バイオセンサーを用いた相対的なc-di-GMP存在量の定量化
祖先のPl_MYb11と進化したwrinkly分離株（MT12: wspFEVO、MT14: wspEEVO、MT22: rphEVO）におけるc-di-GMPの細胞内濃度を定量するために、確立されたプラスミドベースのバイオセンサー54を用いた。プラスミドを持つ細菌株は、ゲンタマイシン選択プレート上で増殖させた（70時間、20℃）。顕微鏡観察では、単一コロニーを1×PBSに懸濁し、顕微鏡用スライド上の2％アガロースパッチにスポットし、密封した。

細菌の蛍光は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZEISS LSM 700、40倍のPlan-Apochromat油浸対物レンズ（NA = 1.4）、屈折率1.518のImmersol 518F）を用いて可視化した。センサーとノーマライザーの蛍光を順次励起し（555 nmと488 nm）、光電子増倍管検出器と波長≦630 nmと≦550 nmの可変二次ダイクロイック透過光でそれぞれ検出した。励起と検出の設定はすべての測定で同一に保たれた。

細胞あたりの蛍光強度は、Image J34で測定した：全細胞と5つの背景領域を関心領域として同定し、面積、積分密度、平均グレイ値を測定した。未変換画像のデータは、補正された全細胞蛍光の算出に用いられた55。

単一細胞の測定に加えて、c-di-GMPを集団レベルで定量した。このために、進化した皺状株（MT12、MT21、MT25、MT26）、平滑株（MT13、 MT33）、および曖昧株（MT11）のコロニーを上述のように増殖させ、1X PBSに再懸濁し、OD600 = 0.1に調整した。その後、細胞懸濁液（200 µl）を、底が透明な黒色平底96ウェルプレート（Greiner Bio-One CELLSTAR 96-well、細胞培養処理済み）に3連で移した。振盪後（10秒間、振幅1 mmで公転振盪）、蛍光を順次励起し（454 nmと460 nm、バンド幅9 nm、10回フラッシュ）、プレートリーダー（Tecan、Infinite M200Pro）で発光を検出した（585 nmと510 nm、バンド幅20 nm、最適ゲイン、20 µs積分）。

c-di-GMP濃度を推測するために、既述のように相対蛍光強度、すなわちTurboRFP蛍光強度とAmCyan蛍光強度の比を計算し54、先祖代々のPl_MYb11と進化したしわの多い形態型、滑らかな形態型、毛羽立った形態型の平均相対蛍光強度を比較した。図2で使用した画像では、フルレンジでリニアLUTを使用した。明るさとコントラストはすべての画像に等しく適用した。

並行反応モニタリングLC-MS/MSを用いたc-di-GMPの定量
並行反応モニタリングモードのLC-MSを用いて細胞内c-di-GMPを定量するため、祖先型および進化型Pl_MYb11（MT12、MT14、MT22）をLB培地でOD600が1.8になるまで増殖させ、遠心分離でペレット化した。塩を含まないLB培地で洗浄後、ペレット化した細胞をスナップ凍結保存した（-80℃）。細胞を10pmolの内部標準物質（cyclic-di-GMP-13C20,15N10, Toronto Research Chemicals）と60μlの水で混合した。c-di-GMPの抽出は、以前に記載された方法56に以下の変更を加えて行った：抽出液（240μlの1：1アセトニトリル（ACN）/メタノール（MeOH））を加え、サンプルを激しくボルテックスした。氷上でのインキュベーション（15分）および遠心分離（20,800×g、4℃、2分）の後、抽出液上清を回収し、溶媒抽出を2回繰り返した（200μlの2:2:1 ACN/MeOH/水）。プールした抽出液を乾燥させ、50μlの水に懸濁し、遠心分離して不溶性化合物を除去した。可溶化したタンパク質沈殿物の濃度は、Pierce BCA protein assay kit（Thermo Fisher）を用いて測定した。LC-MS/MSでは、1μlの抽出液をEASY-nLC 1000 UHPLC（Thermo Fisher）に注入し、15cmのReproSil-Pur C18-AQ nano LCカラム（内径0.1mm、1.9μm、120Å、Altmann Analytik）で400nl min-1で分離した。溶離液Aは0.1% HAcを含む10 mM NH4OAc、溶離液Bは100% MeOHであった。クロマトグラフィー条件は、5%溶離液B（5分）、5%から20%Bへの直線グラジエント（15分）、70%Bへの増加（1分）、70%B（5分）、5%B（5分）とした。m/z 691.1021およびm/z 721.0714前駆体の高エネルギー衝突解離は、Q Exactive HF Orbitrap MS（Thermo Fisher）で行った。Skyline（v.21.1.0.146.3、MacCoss Labソフトウェア）58で決定したqualifying57生成物イオンm/z 248.0778（light）およびm/z 263.0965（heavy）のピーク面積を用いて総c-di-GMP量を算出し、BCAアッセイで得られた総タンパク質量に対して正規化した。

変異体の作製
以前に記述されたプロトコール21,59に基づく2段階の対立遺伝子置換法を用いて、進化した突然変異対立遺伝子を祖先のバックグラウンドに導入し、また突然変異バックグラウンドに祖先の対立遺伝子を導入して突然変異を復帰させた。以下の変更を加えた： ~各変異を取り囲む700bpのPCRアンプリコンをpUISacBにクローニングし、スクロース選択を可能にした。この構築物をコンピテント大腸菌細胞に形質転換し、pRK2013（参考文献60）を含む大腸菌ヘルパー株との接合交配によってシュードモナス単離株に移植した。プライマー（補足表22参照）は、NCBIのBLASTツール61およびNCBI Primer-BLAST62、NEBuilder v.2.3.0（New England Biolabs）およびOligo Analyse Tool（Eurofins Genomics）を用いて設計した。BLASTnおよびClustal Omega63によるアラインメントはデフォルト設定で行った。

ホスホジエステラーゼとジグアニル酸シクラーゼの異種発現
細胞内のc-di-GMPレベルを操作し、宿主との会合やコロニー形態への影響を調べるため、進化した宿主特異的変異体（wspE、wspF、rph）に異種PDEと異種DGCを発現させた。緑膿菌由来のPDE PA2133をプラスミドpJN2133から発現させた（文献23）。構成的に活性なGCN4-WspR融合構築物27を合成し（Eurofins）、pJStrepにクローニングしてC末端StrepIIタグ付きGCN4-WspR構築物を作製した。空のpJStrep（StrepIIタグコード配列を含む改変pJN105（文献64）ベクター）および空のpJN105プラスミドを対照として用いた。すべてのプラスミドを、以前に記載されたエレクトロポレーションプロトコール65を用いてPl_MYb11と進化した変異体に導入した。

In vivo競合アッセイ
競合実験は、短期持続性アッセイについて記述したように行った。共接種した細菌をOD調整し、等量で混合してからNGM寒天培地に芝生として播種した。dTomato39で標識したPl_MYb11を用いたが、これは短期持続性に差が認められなかったため、祖先のPl_MYb11と同等である（分散分析（ANOVA）、F値＝0.99、d.f.＝1、P＝0.35）。ワムシあたりのC.f.u.s.は、ワムシサンプル中のC.f.u.s.から上清中のC.f.u.s.を差し引いて求めた。競合指数は、進化した変異体または構築した変異体のワームあたりのc.f.u.sと祖先のワームあたりのc.f.u.sの比として計算した。

wspおよびrph遺伝子の存在と分離元との擬似藻類全体での相関性
NCBIの全ゲノム配列から、シュードモナス属のメンバーの細菌生活様式とc-di-GMP調節遺伝子（焦点：wspオペロン、rph）を検索した。まず、候補ゲノムを入手した（NCBI Nucleotideのコマンドライン検索ツール；サイズ：500-800万bp）。これにより2,279配列が検索され、NCBIのBiosampleデータベースからサンプル情報が収集された。入手可能な場合、宿主、宿主疾患の状態、分離源およびサンプルタイプを用いて、ゲノムを、疾患の有無にかかわらず、自由生活または宿主に関連した分離株由来として手動で分類した（補足表18）。次に、pseudomonas.com51からrphおよびwsp遺伝子のすべての利用可能なPseudomonas参照配列をダウンロードした。これらを用いて、rph、wspA、wspB、wspC、wspD、wspE、wspFおよびwspRの候補配列を同定した。これらの標的遺伝子候補は、BLAST（Rパッケージ 'rBLAST'）を使用して選択されたゲノムから発見され、BLASTヒットの配列長と同一性パーセントに基づいてフィルタリングされた（Extended Data Fig.9）。同一性の割合と配列長は、遺伝子が正しく同定される確率が最大になるように選択した（Extended Data Fig.9の赤い四角）。参照遺伝子をクエリーとしてBLAST検索した結果、少なくとも1つの候補遺伝子が同定された場合、この遺伝子はそれぞれのゲノムに存在するとみなされた。次に、χ2適合度検定を用いて、標的遺伝子を持つ分離株と持たない分離株で、宿主に関連する生活様式の相対的な割合に違いがあるかどうかを推測した（補足表19）。

選択のシグネチャーの検出
宿主特異性遺伝子（wspE, wspF, rph）が、シュードモナス属においてポジティブ選択またはピュリファイング選択を経験しているかどうかを評価するために、MEGA11（文献66；デフォルト設定）を用いて、ヌクレオチド配列（前述のデータセットを参照）のMUSCLEコドンベースの多重配列アラインメントを行った。その後、コドンベースのz検定（デフォルト設定）を行い、中立選択からの有意な逸脱を検定した。さらに、3つのPseudomonasコア遺伝子（gyrB：PA0004、rpoD：PA0576、16S rRNAメチルトランスフェラーゼ：PA0419： PA0419；文献67も参照）。67）についても、多重配列アラインメントとコドンベースの中立性検定を用いて、wspとrphの有無について調査したゲノムのセットで行った。

統計解析
データ収集の前に、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、我々のサンプルサイズは過去の論文で報告されたものと同様である。すべての実験において、治療とサンプルは盲検化され、無作為化された。データ解析の前に、パラメトリック・モデルの仮定（正規性、分散の均質性）を目視検査（箱ひげ図/qqplot）およびShapiro-Wilk検定とLevene検定でチェックした。これらが満たされない場合は、ノンパラメトリック検定を適用した。箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界）、1.5×四分位範囲（ひげ）を示す。

進化した個体群が祖先の個体群とワムシあたりのc.f.u.s.が異なるかどうかを調べるために、進化した表現型（進化した個体群のワムシあたりのc.f.u.s.と祖先のPl_MYb11のワムシあたりのc.f.u.s.の比）と祖先の表現型のシフトを、多重検定のための偽発見率（FDR68）補正をかけた1標本のt検定（α = 0.05, mu = 1）を用いて比較した。このアプローチを、個体ワムシの細菌コロニー形成、ワムシ集団の成長、初期コロニー形成、持続と放出、コロニーの拡大と群れの解析に適用した。進化的処理による全体的な表現型のシフトを推測するために、アッセイした表現型を含む主成分分析（PCA）を行った。祖先グループと進化グループの表現型セットの違いを検定するために、並べ替え分散分析（PERMANOVA、1,000並べ替え）を行い、続いてグループの一対比較（FDR補正）を行い、信頼楕円（1標準偏差）をプロットした。使用したパッケージはggbiplot69、missMDA70、vegan71、pairwise.adonis72。

一般化線形モデル（GLM；準正規分布）とTukeyポストホック検定（lme4（ref.73）、lmtest74、multcomp75を使用）を用いて、ワムシ内の異なるコロニー形態（wrinkly、smooth、fuzzy）の割合の違いを同定した。

形態型の割合の経時変化はβ回帰を用いて検定した（gamlss76を使用）。

形態型の表現型間の差はANOVAまたはGLMを用いて検出し、TukeyまたはDunnettポストホック検定を行った。表現型間の機能分化を推測するために、PCAとPERMANOVAを用いた。

進化したシワシワ宿主のスペシャリスト（wspE、wspF、rph変異体）と祖先のPl_MYb11の間のバイオフィルム形成と運動性の差異を、ネステッドANOVAとTukeyポストホック検定を用いて解析した。バッチ効果（進化した起源集団）が検出されなかった場合、変異体は集団間で比較した。しかし、群発直径の場合、rph変異体はt検定を用いて、共同解析された祖先のPl_MYb11と比較された。

進化した単離株間のc-di-GMP濃度の差は、WelchのANOVA、入れ子のANOVA、またはGames-HowellまたはDunnettのポストホック比較を伴うANOVAを用いて推測した。

GLMおよび線形混合モデル（LMM）、およびDunnettまたはTukeyのポストホック比較を用いて、形態型または変異体間のワームあたりのc.f.u.sの差異を検定した。

すべての解析とプロットはR49,50,77,78で行った。

数理モデル
進化実験中に細菌が経験する選択勾配を評価するモデルを構築した（Extended Data Fig.10）。細菌がミミズと接触している段階に焦点を当て、均質な集団を考えた。(任意の)宿主会合に生息する細菌数n(t)の動態は、次式で記述できる。

frac{{dn}(t)}{{dt}}=f,Wleft(tright)+r,nleft(tright) \left(1-frac{nleft(tright)}{K,Wleft(tright)}} -delta n(t), $$
(1)
ここで、W(t)は時刻tにおけるプレート上のワムシのバイオマスを表す。飽和まで成長すると、プレート上のバクテリアは常に過剰となり、ワムシの数とワムシがバクテリアを捕食する速度fのみが、宿主への遊離バクテリアの移動を制限すると考える。最後に、宿主に付随する細菌集団の一部は、細菌の死と環境への排出を含む速度δで宿主から除去される。進化実験と同様に，宿主に付随する細菌のみが選択され，プレート上のダイナミクスを無視して次のサイクルに進むと仮定する．ワムシのバイオマスW(t) = g t + W0を線形成長と仮定し、繁殖と発育の両方を包含する。ミミズの成長に対する有益な効果の潜在的な進化を無視し、パラメータW0 = 10とg = 711 d-1を実験的に観測された値に固定した。

宿主に付随する細菌の最終的な数nfが、細菌のライフサイクルを記述するパラメータ（r、δ、f、K）の変化によってどのような影響を受けるかを調べた。これらの各パラメータ（すなわち形質空間）について、可能な限り実験データに基づいて生物学的に妥当な値の範囲を定義した：

10-1 d-1 < r < 101.25 d-1、すなわち、プレート上の最大成長速度（~7 d-1）のごく一部から2倍程度の間。

10-0.5 d-1 < δ < 104 d-1。（摂食と複製がない場合）ワームがマイクロバイオームの50％を失う典型的な時間は、数秒から数日の間である。

104 < K < 106.25。実験的に測定されたワーム1匹あたりの最大細菌数（~105）から桁を考慮する。

103 d-1 < f < 107.5 d-1。空のワームがその収容力の10%でコロニー形成される典型的な時間（K = 105）は、細菌の放出と宿主内複製を無視して、数秒から数日の間で変化するはずだからである。

形質空間の各点について、式(1)を数値的に解いて、tf = 3.5 dにおける予想最終細菌数nf = n(tf)を計算した。最後に、形質空間の各方向に沿ったnfの弾力性を評価した。この弾力性は、いずれかの形質における小さな相対的変化に対するnfの期待相対変化を測定するものである。この弾力性のベクトルを表現形質上の選択勾配79 と解釈し、このベクトルの支配的要素を用いて形質空間の各点に対する「最適進化戦略」30 を定義した。

報告概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
シーケンスデータはNCBIのBioproject PRJNA862108で入手可能。その他のデータは全てhttps://github.com/nobeng/c-di-GMP_host-association。

コードの利用可能性
カスタムコードと関連データはhttps://github.com/nobeng/c-di-GMP_host-association。

参考文献
McFall-Ngai, M. et al. 細菌世界の動物、生命科学の新たな命題。Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 3229-3236 (2013).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Toft、C. & Andersson、S. G. E. 進化微生物ゲノミクス：細菌の宿主適応に関する洞察。Nat. Rev. Genet. 11, 465-475 (2010).

論文

パブコメ

Google Scholar

Douglas, A. E. Fundamentals of Microbiome Science： How Microbes Shape Animal Biology (Princeton Univ. Press, 2018).

Obeng, N., Bansept, F., Sieber, M., Traulsen, A. & Schulenburg, H. Evolution of microbiota-host associations: the microbe's perspective. Trends Microbiol. 29, 779-787 (2021).

論文

PubMed

Google Scholar

線虫Caenorhabditis elegansのネイティブマイクロバイオーム：新しい宿主マイクロバイオームモデルへの入り口。BMC Biol.14, 38 (2016).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

C.エレガンス本来のマイクロバイオームの群集形成は、時間、基質、個々の細菌分類群に影響される。Environ. Microbiol. 22, 1265-1279 (2020).

論文

パブコメ

Google Scholar

Kissoyan, K. A. B. et al. 線虫の微生物叢は、ビスコシン環状リポペプチドの産生を介して感染から身を守る。Curr. Biol. 29, 1030-1037.e5 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Dirksen, P. et al. CeMbio-線虫マイクロバイオームリソース. G3 10, 3025-3039 (2020).

論文

PubMed

PubMedセントラル

Google Scholar

Rainey, P. B. & Travisano, M. 異種環境における適応的放射。Nature 394, 69-72 (1998).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

緑膿菌ラゴス小コロニー変異体は嚢胞性線維症肺での持続性を促進する適応を持つ可能性が高い。J. Bacteriol. 191, 3492-3503 (2009).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Salmonella Enterica serovar Typhimurium DT104は凸凹の表現型を示す。Appl. Environ. Microbiol. 67, 4048-4056 (2001).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Yildiz, F. H. & Schoolnik, G. K. Vibrio cholerae O1 El Tor: rugose colony type, exopolysaccharide production, chlorine resistance, and biofilm formationに必要な遺伝子クラスターの同定。Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 4028-4033 (1999).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Hengge, R. 細菌の増殖、生存、多細胞化をつなぐ-トリガーとドライバーとしてのシグナル伝達分子 Curr. Opin. Microbiol. 55, 57-66 (2020).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Pankey, M. S. et al. グローバルな制御因子に収束する宿主選択変異が、細菌の共生への適応的飛躍を促す eLife 6, e24414 (2017).

論文

グーグル・スカラー

細菌バイオフィルム：自然環境から感染症まで。Nat. Rev. Microbiol. 2, 95-108 (2004).

論文

パブコメ

Google Scholar

Schlomann,B.H.、Wiles,T.J.、Wall,E.S.、Guillemin,K.、Parthasarathy,R. 亜致死性抗生物質は凝集と排出を促進することにより腸内細菌集団を崩壊させる。Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 21392-21400 (2019).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

大腸菌を昆虫の相互扶助生物にする単一変異。Nat. Microbiol. https://doi.org/10.1038/s41564-022-01179-9 (2022).

宿主から放出されるアミノ酸が細菌のケモキネシスを制御し、コロニー形成を促進する。Cell Host Microbe 29, 1221-1234.e8 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

高濃度の環状ジグアニル酸は有益な細菌のコロニー形成を阻害する。

Google Scholar

Kessler、C., Mhatre、E., Cooper、V. & Kim、W. β-およびガンマプロテオバクテリアにおけるWspシグナル伝達系の進化的分岐。Appl. Environ. Microbiol. https://doi.org/10.1128/AEM.01306-21（2021）。

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Bantinaki, E. et al. Pseudomonas fluorescensの実験集団における適応的分岐。III. 皺状スプレッダー多様性の突然変異起源。Genetics 176, 441-453 (2007).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

環状ジGMP：セカンドメッセンジャー。Nat. Rev. Microbiol. 15, 271-284 (2017).

論文

PubMed

Google Scholar

環状ジグアニル酸レベルの調節を通じてバイオフィルム形成を制御する化学感覚システム。Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 14422-14427 (2005).

論文

PubMed

パブメッドセントラル

Google Scholar

応答制御タンパク質の受容体ドメイン構造と機能. Curr. Opin. Microbiol. 13, 142-149 (2010).

論文

CAS

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

細菌の表面感知と適応。Annu. Rev. Microbiol. 74, 735-760 (2020).

論文

パブコメ

Google Scholar

緑膿菌のWspシステムは表面感知と細胞外被ストレスを結びつけている。Proc. Natl Acad. Sci. USA 119, e2117633119 (2022).

論文

PubMed

パブメッドセントラル

Google Scholar

ジグアニル酸シクラーゼ応答制御因子WspRの活性化と自己阻害の決定因子。J. Mol. Biol. 393, 619-633 (2009).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Pianka, E. R. r-およびK-選択について。Am. Nat. 104, 592-597 (1970).

論文

Google Scholar

Andrews, J. H., Comparative Ecology of Microorganisms and Macroorganisms (Springer, 2017).

Bansept,F.、Obeng,N.、Schulenburg,H.&Traulsen,A. 選択下の宿主関連微生物のモデリング。ISME J. 15, 3648-3656 (2021).

論文

パブメドセントラル

Google Scholar

細菌病原におけるc-di-GMPシグナル伝達の複数の役割。Annu. Rev. Microbiol. 73, 387-406 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Stiernagle, T. 線虫の維持。WormBook https://doi.org/10.1895/wormbook.1.101.1 (2006).

Papkou,A.ら. 宿主と病原体の急速な共進化におけるレッドクイーンダイナミクスのゲノム基盤. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 923-928 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Rueden, C. T. et al. ImageJ2: 次世代の科学的画像データのためのImageJ. BMC Bioinformatics 18, 529 (2017).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

線虫摂食不全変異体は体長が短く、オートファジーが亢進している。BMC Dev. 6, 39 (2006).

論文

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

O'Toole, G. A. マイクロタイターディッシュバイオフィルム形成アッセイ。J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/2437 (2011).

論文

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

大腸菌バイオフィルムの空間的構造化における構造的要素としてのセルロース。J. Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Wiles, T. J. et al. mBio 9, e01877-18 (2018).

論文

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

Kissoyan, K. A. B. et al. 線虫保護天然微生物叢の宿主生理への影響を探る。Front. Cell. Infect. Microbiol. 12, 775728 (2022).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

(1)哺乳類（コクヌストモドキ科）の第1リボソーム内部転写スペーサーにおける極端な長さと長さの変異. Mol. Biol. Evol. 18, 648-660 (2001).

論文

PubMed

Google Scholar

Andrews, S. FastQC：配列データの品質管理ツール（Babraham Institute, 2010）。

Bolger, A. M., Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114-2120 (2014).

論文

パブコメ

PubMedセントラル

Google Scholar

Bowtie2による高速ギャップドリードアライメント。Nat. Methods 9, 357-359 (2012).

論文

パブコメ

パブメッドセントラル

Google Scholar

Picard Toolkit（Broad Institute、2019年）。

シーケンシングデータからのSNPコール、変異発見、関連マッピング、集団遺伝学的パラメータ推定のための統計的フレームワーク。Bioinformatics 27, 2987-2993 (2011).

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Koboldt、D. C. et al. VarScan 2：エクソームシーケンスによるがんの体細胞変異およびコピー数変化の発見。Genome Res. 22, 568-576 (2012).

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Cingolani, P. et al. 一塩基多型のアノテーションと影響予測のためのプログラム、SnpEff. Fly 6, 80-92 (2012).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Cingolani, P. et al. 新しいプログラムSnpSiftを用いた遺伝毒性化学物質突然変異研究のモデルとしてのショウジョウバエの利用。Front. Genet. 3, 35 (2012).

RStudio チーム. RStudio： Integrated Development for R (RStudio Inc., 2015).

R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing (R Foundation for Statistical Computing, 2016).

Winsor, G. L. et al. Pseudomonas genome databaseにおける数千のPseudomonasゲノムを比較するためのアノテーションと機能の強化。Nucleic Acids Res. 44, D646-D653 (2016).

論文

PubMed

Google Scholar

2022年におけるEMBL-EBIの検索および配列解析ツールサービス。Nucleic Acids Res. 50, W276-W279 (2022).

論文

パブコメ

PubMedセントラル

Google Scholar

DOG 1.0: タンパク質ドメイン構造のイラストレーター. Cell Res. 19, 271-273 (2009).

論文

PubMed

Google Scholar

Zamorano-Sánchez, D. et al. Vibrio choleraeのジグアニル酸シクラーゼの機能特化：運動抑制とc-di-GMP産生の異なる様式。

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

ImageJを用いた細胞蛍光の測定（The Open Lab Book, 2014）.

Bähre, H. & Kaever, V. in c-di-GMP Signaling： Methods and Protocols (ed. Sauer, K.) 45-58 (Springer, 2017)。

Gao, X. et al. 枯草菌cyclic-di-GMPシグナル伝達経路のコア成分の機能的特性解析。J. Bacteriol. 195, 4782-4792 (2013).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Adams, K. J. et al. Skyline for small molecules: a unifying software package for quantitative metabolomics. J. Proteome Res. 19, 1447-1458 (2020).

論文

PubMed

PubMedセントラル

Google Scholar

Hmelo, L. R. et al. 2段階の対立遺伝子交換による緑膿菌ゲノムの精密工学。Nat. Protoc. 10, 1820-1841 (2015).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Figurski、D. H. & Helinski、D. R. プラスミドRK2の起源を含む誘導体の複製はトランスで提供されるプラスミド機能に依存する。Proc. Natl Acad. Sci. USA 76, 1648-1652 (1979).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

遺伝子発現を解析するために必要な遺伝子発現解析ツール。J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990).

論文

PubMed

Google Scholar

Ye, J. et al. Primer-BLAST: ポリメラーゼ連鎖反応における標的特異的プライマー設計ツール. BMC Bioinformatics 13, 134 (2012).

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

タンパク質アラインメントを高速かつスケーラブルに生成するClustal Omega。Mol. Syst. 7, 539 (2011).

論文

パブメドセントラル

Google Scholar

L-アラビノース誘導性大腸菌araBADプロモーターとaraCレギュレーターを持つ広宿主域発現ベクター。Gene 227, 197-203 (1999).

論文

PubMed

Google Scholar

Choi, K.-H., Kumar, A. & Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. J. Microbiol. Methods 64, 391-397 (2006).

論文

PubMed

Google Scholar

MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11. Mol. Biol. Evol. 38, 3022-3027 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

シュードモナス属のゲノムに基づく進化史。Microbiol. 20, 2142-2159 (2018).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Benjamini, Y. & Hochberg, Y. 偽発見率の制御：多重検定への実用的で強力なアプローチ。J. R. Stat. Soc. B 57, 289-300 (1995).

Google Scholar

Vu, V. 他. vqv/ggbiplot： gplot2ベースのバイプロット。Github www.github.com/vqv/ggbiplot (2021).

Josse, J., & Husson, F. missMDA: a package for handling missing values in multivariate data analysis. J. Stat. Softw. https://doi.org/10.18637/jss.v070.i01 (2016).

Oksanen, J. et al：コミュニティ生態学パッケージ。Github https://github.com/vegandevs/vegan (2022).

Martinez Arbizu, P. pairwiseAdonis： adonisを用いた一対多値比較。R package version 0.4 Github https://github.com/pmartinezarbizu/pairwiseAdonis (2020).

Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. & Walker, S. Fitting linear mixed-effects models using lme4. J. Stat. Softw. 67, 1-48 (2015).

論文

グーグル・スカラー

Zeileis, A. & Hothorn, T. 回帰関係における診断チェック。R News 2, 7-10 (2002).

Hothorn, T., Bretz, F. & Westfall, P. 一般パラメトリックモデルにおける同時推論。Biom. J. 50, 346-363 (2008).

論文

PubMed

Google Scholar

Rigby, R. A. & Stasinopoulos, D. M. 位置、スケール、形状に関する一般化加法モデル。このような場合，どのようにすればよいのだろうか。Soc. C 54, 507-554 (2005).

論文

Google Scholar

Wikham, H. ggplot： Elegant Graphics for Data Analysis (Springer, 2016).

Kassambara, A. ggpubr: 'ggplot2' based publication ready plots. R package version 0.6.0. https://rpkgs.datanovia.com/ggpubr/ (2023).

Caswell, H. Matrix Population Models (Sinauer, 2001).

参考文献のダウンロード

謝辞
LSM 880を利用させていただいたE. Stukenbrock（ドイツ、キール大学）、K. Guillemin（アメリカ、オレゴン大学ユージーン校）、P. Rainey（ドイツ、プロエン、マックス・プランク進化生物学研究所）、H. Schweizer（アメリカ、ノーザン・アリゾナ大学）、F. Yildiz（University of California Santa Cruz、米国）、G. O'Toole（Dartmouth Medical School、米国）には菌株やプラスミドの提供を、D. Rogers、J. Summers（ともにMax-Planck Institute for Evolutionary Biology、Ploen、ドイツ）には対立遺伝子交換の指導を、J. Zimmermann (Schulenburg group, University of Kiel, Germany)のバイオインフォマティックサポート、B. Pees (Schulenburg group, University of Kiel, Germany)のイラストレーションサポート、S. Joel、J. Hofmann、J. Löwenstrom、J. Lorenzen、H. Griem-Krey、L. BluhmおよびL. Rheindorf (all Schulenburg group, University of Kiel, Germany) for lab support; the Kiel BiMo/LMB for access to their core facilities; the Schulenburg lab for project feedback; and B. Bohannan (University of Oregon, Eugene, United States), R. Knight (University of California San Diego, United States) and P. Engel (Université de Lausanne, Switzerland) for advice on the manuscript. 資金提供はDeutsche Forschungsgemeinschaft（DFG、ドイツ研究財団）、Project-ID 261376515 - SFB 1182、Project A4およびZ3（N.O.、A.C.、F.B.、J.L.、 A. Tholey, A. Traulsen, H. Schulenburg）、DFG Research Infrastructure NGS_CC project 407495230（J.F.) as part of the Next Generation Sequencing Competence Network project 423957469、International Max-Planck Research School for Evolutionary Biology（N.O., A.C.）、Max-Planck Society（Fellowship to H. Schulenburg）、NIH project R01AI168017（M.J.G.G., H. Sondermann）。

資金提供
Christian-Albrechts-Universität zu Kielよりオープンアクセス資金提供。

著者情報
著者メモ
テクラ・シュルトハイス

現住所キール大学毒物学・薬理学研究所、キール、ドイツ

著者および所属
ドイツ・キール大学進化生態学・遺伝学科

ナンシー・オベン、アンナ・ツェルヴィンスキー、ダニエル・シュッツ、ヤン・ミケルス、テクラ・シュルトハイス、メリンダ・ケムライン、ヒンリッヒ・シュレンブルク

キール大学システマティック・プロテオーム研究・バイオアナリティクス学科（ドイツ・キール

ヤン・ライパート & アンドレアス・トーレー

マックス・プランク進化生物学研究所／ドイツ・プレーン

フローレンス・バンセプト、アルネ・トラウルセン、ヒンリッヒ・シューレンブルク

構造システム生物学CSSBセンター、ドイツ電子シンクロトロンDESY、ドイツ・ハンブルグ

マリア・J・ガルシア・ガルシア＆ホルガー・ゾンダーマン

キール大学臨床分子生物学研究所（ドイツ・キール

ジャニーナ・フース

ドイツ・キール大学・生物学部門

ホルガー・ゾンダーマン

貢献
N.O.、A.C.、F.B.、A.Traulsen、H.Schulenburgがプロジェクトの構想を練った。N.O.、A.C.、M.J.G.G.、H.Sondermannが方法論を開発。N.O.、A.C.、J.M.、J.L.、T.S.、M.K.、J.F.が調査を実施。N.O.、A.C.、D.S.、F.B.がデータを分析。N.O.、A.C.、D.S.、J.M.、J.L.、F.B.、M.J.G.G.、T.S.、M.K.、J.F.、A.Tholey、A.Traulsen、H.Sondermann、H.Schulenburgは原稿執筆に貢献した。N.O.、A.Tholy、A.Traulsen、H.Sondermann、H.Schulenburgがプロジェクトを監督した。F.B.はモデリングを行った。

筆者
Hinrich Schulenburgまで。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、この論文の査読に貢献したHassan Salem氏と他の匿名の査読者に感謝する。

その他の情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

拡張データ
Extended Data 図1 実験的進化の過程とその結果における細菌の体力。
a, b, 進化実験中の細菌フィットネス。a, 3.5日間Ce_MY316に曝露した後、ワムシ集団あたりのコロニー形成単位（CFU）として測定した進化実験のサイクル全体での宿主における細菌フィットネス。各データポイントについて、細菌は指摘したサイクルのボトルネック時点で収集した。複製集団（n = 6）を別々の細い線で示し、平均値を太い線で示した。 c, 10サイクルの進化した細菌集団のワーム集団における個々の宿主あたりの平均CFU。5匹のL4線虫幼虫を3.5日間（F1世代に達する）、進化した細菌群または祖先の細菌群上で増殖させ、全ワムシ集団からCFUを抽出した。個体群あたりの CFU を個体群内のワムシ数で割った。全体的な結果は箱ひげ図で示しており、箱ひげ図は中央値（箱ひげ図内の太線）の上下25%を示している。d, e, 進化実験終了時点からの細菌集団について、宿主に付随したライフサイクルの自由生活段階における形態型組成の動的変化。箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界値）、四分位範囲（ひげ）。異なるコロニー形態型（グラフの凡例を参照）の割合を、宿主に関連したライフサイクルの時間経過とともに示す。時点0は宿主との関連期の終わりで、細菌が自由生活期に移行し、それ自体は168時間続く。Fdr補正ベータ回帰を用いて割合を予測し、時間の経過に伴う割合の変化を検定した（補足表2参照）。

Extended Data Fig. 2 線虫腸内におけるシワシワ宿主の専門家によるコロニー形成。
共焦点レーザー顕微鏡写真（上段：縦断光学切片、下段：縦断光学切片を示す最大強度投影）により、若齢成体Ce_MY316（シアン）の腸内に無傷の細菌細胞（赤色）が存在することが明らかになった。上の顕微鏡写真は完全なワームの概観を示し、下の顕微鏡写真は上の破線枠で示したワームの部分の詳細図を示す。これらには、ワームグラインダーと第一腸輪のある後咽頭（左）、中央腸（中央）、肛門領域（右）が含まれる。左下のパネルは本文（図1e）に示した顕微鏡写真と同じ。スケールバー＝50 µm（概観図）、10 µm（詳細図）。

Extended Data Fig. 3 宿主と共生するライフスタイルを進化させる、宿主と共生する進化処理の終盤に分離された皺状菌。
独立した宿主進化集団（左）と対照集団（右）から単離された形態クローンの表現型（スムース、ファジー、しわしわの各形態を含む）を示す。各形態の結果は箱ひげ図（1 < n < 4）としてまとめられている。箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界値）、四分位範囲（ひげ）を示す。破線は祖先形質の平均値、灰色の網掛け部分は標準誤差を示す。進化した形態と祖先の間の差は一般化線形モデルとfdr補正Tukeyポストホック検定で評価した。文字は形態間の統計的差異を、アスタリスクは祖先からの偏差を示す（補足表6参照）。

Extended Data 図4 宿主との相互作用による進化処理の終了時点からの個体群における宿主との相互作用による生活様式の進化。
a,祖先、宿主進化、対照進化した細菌集団の宿主との相互作用の特徴的な段階に関する主成分分析。b-f,進化した個体群における細菌祖先からの表現型の変化（(b)初期コロニー形成、細菌に1. 5時間、(c)M9緩衝液中で1時間飼育したL4幼虫の持続性（細菌で飼育）、(d)1時間以内にL4幼虫から緩衝液中に放出された細菌のCFU（以前はL1からL4まで細菌で飼育）、(e)24時間以内の0.5%寒天上での群発距離、(f)72時間以内の3.4%寒天上でのコロニー拡大。すべてのパネルは、個々のデータポイントとして示した5つの複製について、祖先集団に対する進化した集団の比率を示している。破線は祖先集団で得られた平均値を示す。進化した表現型と祖先の表現型の差は、片側t検定（fdr補正；補足表8）を用いて評価した。すべての箱ひげ図において、中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界値）、四分位範囲（ひげ）を示した。

Extended Data 図5 シワシワ分離株における細胞内c-di-GMP濃度の増加。
a, 蛍光センサーで測定した細胞内c-di-GMP量。生の蛍光強度（RFI）は、TurboRFP（c-di-GMP依存性）とAmCyan（プラスミドコピー数依存性）の比であり、従ってセンサープラスミドのコピー数で正規化されている。 b, 同位体希釈PRM分析により決定された総c-di-GMP。c, 同位体希釈PRM分析により決定され、総タンパク質量で正規化されたC-di-GMP。a,b,cにおいて、c-di-GMPsレベルは、祖先と、進化実験の最後からwspF,wspE,rphのいずれかに単一変異を持つ3つのシワシワ単離株について調べた。d,蛍光センサーで測定した、しわのあるコロニー、滑らかなコロニー、ファジーなコロニーの形態を持つ、進化実験終了時点からの分離株の細胞内c-di-GMPレベル（ネステッドANOVAとfdr補正Dunnettポストホック検定；n = 5）。e,複製依存性の影響を補正するために、祖先のRFIで正規化した異なる分離株のRFI（ANOVAとfdr補正Dunnettポストホックテスト；n = 5；補足表10）。それぞれの変異については補足表9を参照）。箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界）、四分位範囲（ひげ）を示す。

Extended Data 図6 祖先と進化したc-di-GMP制御酵素のアミノ酸配列アラインメント。
上図は、WspF、WspE、リボヌクレアーゼPHのタンパク質のドメイン構成図であり、Pl_MYb11変異によって影響を受けた部位は赤い矢印で強調されている。下には、祖先タンパク質と進化したタンパク質のタンパク質配列アラインメントを示し、ドメインは上と同じ色でハイライトされている。

Extended Data 図7 Pl_MYb11、進化した単離株、ΔwspR変異体、PDE/DGC発現誘導体のフォーカルしわ宿主専門家およびマクロコロニーのバイオフィルム形成と運動性。
a, 2日間振盪培養したマイクロタイタープレートでのwspF、wspE、rph変異体のバイオフィルム形成とPl_MYb11（祖先の中央値＝破線）の比較。48時間培養後の試験管からのバイオフィルムの写真によるバイオフィルムの図解。スケールバー＝4mm。 b, wspF、wspE、rph変異体の群遊運動性およびc, コロニー拡大を、それぞれ24時間後および72時間後にPl_MYb11（祖先の中央値＝破線）と比較した。3 replicates/treatmentで行い、ANOVAとfdr補正Dunnettポストホック検定、または片側t検定で解析した。箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界値）、四分位範囲（ひげ）を示す。 d, 祖先のPl_MYb11と進化実験の最後に得られた3つのシワシワ単離株（wspF、wspE、rphのいずれかに単一変異を持つ）のマクロコロニー。 e, Pl_MYb11のwspF、wspE、rphバックグラウンドにおけるΔwspR変異体のマクロコロニー。f,プラスミドからホスホジエステラーゼPA2133を発現させたwspF, wspE, rph単離株、プラスミドから構成的に活性なジグアニル酸シクラーゼGCN4-WspRを発現させたPl_MYb11単離株、および空ベクター対照株のマクロコロニー。 d-f,マクロコロニーはコンゴーレッドを添加したトリプシン大豆寒天培地で1日（d,e）から3日（f）培養した。スケールバー＝1mm。

Extended Data Fig. 8 4株の混合細菌（カルテット）におけるシワシワ単離株の競争力の増加。
宿主を進化させた複製集団T3から単離された3つの共進化形態型を祖先と対にした。1つのカルテットにはwrinkly wspF変異体（MT12）が、もう1つのカルテットにはwrinkly wspE変異体（MT14）が存在した。データポイントは独立した複製を表し、最小で1処理につき3複製。各処理につき3反復。形態型と祖先の間の差は、線形混合モデルとその後のfdr補正Dunnettポストホック比較を用いて評価した；補足表13参照。箱ひげ図は中央値（中央線）、上下四分位値（箱限界）、四分位範囲（ひげ）を示す。

Extended Data 図9 rphおよびwsp遺伝子候補の同定フィルター。
個々の遺伝子のBLAST結果の配列長と同一性の割合の分布。特定の配列長と同一性パーセントクラスに属するBLAST結果の割合を、強度を変化させた青色で示す（スケール参照）。赤い長方形は、考察した遺伝子の存在を仮定し、最大配列長と同一性パーセントの両方で最大のBLASTヒット値を含むように設定した領域を示す。

Extended Data 図10 宿主に関連したライフサイクルに従う細菌の選択勾配を評価するモデル。
b, 形質空間全体にわたる最適戦略の分布。 c, 形質空間を軸(r, δ)に投影したもの。マップの各点について、色は、fとKの値にわたって積分して、4つの可能な戦略のそれぞれが最適である回数の割合を表す。カラースキームはCMYKカラーコードを使用する：純粋なシアン（それぞれマゼンタ、イエロー）のピクセルは、考慮された値（r、δ）に対する唯一の最適戦略が↓δ（それぞれ↑f、↑K）であることを示す。より暗い色合いは、各エッジの追加カラースケールに示されているように、↑ rもその時点で小さな割合で最適であることを示す。

補足情報
報告概要
補足表
補足表1-22.

権利と許可
オープンアクセス本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にはその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

この記事について
アップデートの確認 CrossMarkを経由して通貨と真正性を確認する
この記事の引用
オベン、N.、ツェルウィンスキー、A.、シュッツ、D.ら、細菌のc-di-GMPは宿主と微生物の共生を確立する上で重要な役割を果たす。Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01468-x

引用文献のダウンロード

受領
2022年9月21日

受理
2023年8月10日

発行
2023年8月31日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-023-01468-x

この記事を共有する
以下のリンクをシェアすると、誰でもこのコンテンツを読むことができます：

共有可能なリンクを取得
コンテンツ共有イニシアチブSpringer Nature SharedItにより提供されています。

テーマ
細菌の進化
細菌ゲノム
実験的進化
共生
Nature Microbiology (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276 (オンライン)

サイトマップ
Natureポートフォリオについて
ネイチャーについて
プレスリリース
プレスオフィス
お問い合わせ
コンテンツを見る
ジャーナルA-Z
テーマ別記事
ナノ
プロトコル交換
ネイチャー・インデックス
出版ポリシー
Natureポートフォリオポリシー
オープンアクセス
著者・研究者サービス
別刷りと許可
研究データ
言語編集
科学編集
ネイチャー・マスタークラス
エキスパートトレーナーによるワークショップ
研究ソリューション
図書館・機関
図書館員サービス＆ツール
図書館ポータル
オープンリサーチ
図書館への推薦
広告とパートナーシップ
広告
パートナーシップとサービス
メディアキット
ブランドコンテンツ
キャリア開発
ネイチャー・キャリア
ネイチャーコンファレンス
ネイチャーイベント
地域ウェブサイト
ネイチャーアフリカ
ネイチャー・チャイナ
ネイチャーインド
ネイチャーイタリア
日本のネイチャー
ネイチャー韓国
ネイチャー中東
プライバシーポリシークッキーの使用お客様のプライバシーに関する選択/クッキーの管理法的通知アクセシビリティに関する声明利用規約お客様の米国におけるプライバシー権
シュプリンガー・ネイチャー
© 2023 シュプリンガー・ネイチャー

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？