健康な乳児の腸内における既知のウイルスの多様性の拡大

2023年5月5日 09:59

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発行：2023年4月10日
健康な乳児の腸内における既知のウイルスの多様性の拡大

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01345-7

シラズ A. シャー
リン・デング
...
デニス・S・ニールセン
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Nature Microbiology 8巻 986-998ページ (2023年)この記事を引用しています。
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メトリックス詳細
アブストラクト
腸内細菌は乳幼児期を通じて形成され、免疫系の成熟に影響を与えるため、その後の慢性疾患から身を守ることができます。ファージ（細菌に感染するウイルス）は、溶菌と溶血によって細菌の増殖を調節し、特に乳児期の腸内では後者が顕著である。ウイルスのメタゲノム（ビローム）は、未知のウイルス多様性にまたがり、マーカー遺伝子や標準的な検出方法がないため、解析が困難である。本研究では、健康な母子ペアを対象としたデンマークの非選択コホートであるCopenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood 2010に属する1歳児647人の糞便ビロームのウイルス多様性を系統的に解明した。アセンブリとキュレーションにより、248のウイルスファミリーレベルクレード（VFC）から10,000種のウイルスが発見された。そのほとんど（232のVFC）は、これまで知られていなかったCaudoviricetesウイルス群に属していた。79%のファージは、同じ子供から採取した細菌メタゲノム内のclustered regularly interspaced short palindromic repeat spacersを利用して宿主を決定した。Bacteroidesに感染する典型的なcrAssphageは、ClostridialesとBifidobacteriumに感染する未記載のファージファミリーの数で上回った。ファージのライフスタイルはウイルスファミリーレベルで保存されており、33の強毒ファージファミリーと118の温和ファージファミリーが存在した。病原性ファージはより多く存在し、温和性ファージはより多く存在し、多様であった。本研究で発見されたウイルスファミリーは、既存のファージ分類法を拡張し、将来の乳児腸内細菌学的研究に役立つリソースを提供するものである。
主な内容
生後数年間の腸内細菌叢（GM）の確立は、乳児の免疫系の成熟に極めて重要な役割を果たします1,2。生後間もない頃の腸内細菌叢の異常は、その後の人生で起こる一連の慢性疾患と関連しており、免疫プログラミングに持続的な影響を与えることを示しています3,4,5,6。既存の研究のほとんどは、GMの細菌成分に焦点を当てたものでしたが、最近では、ウイルスがGMの有力なメンバーであることが明らかになってきています。最近の研究では、健康なドナーから腸内ウイルスを移植することで、再発性のClostridioides difficile感染症の治癒7、食事誘発性肥満の緩和8、早産新生児の壊死性腸炎の予防9が可能になることが示されている。そのメカニズムはまだ不明だが、おそらくウイルス感染によるGM組成の調節が関与していると考えられる。なぜなら、腸内ウイルスの多くは細菌にのみ感染するバクテリオファージ（ファージ）であるからだ10。
ファージは細菌と同様に、宿主特異的なパターンに従って生後数ヶ月の間に腸内に出現する11,12,13,14。病原性ファージは、容易に増殖し、溶菌によって宿主細胞を殺し、新しいビリオンを生態系に放出する溶菌サイクルを行う。温和なファージは、細菌の染色体に組み込まれ、プロファージとなることができます。このプロファージの状態は、特定の環境条件によってプロファージが溶解サイクルに入るまで、宿主の殺害を先送りする。また、ファージの中には、ウイルス粒子を継続的に排出する慢性感染症を引き起こすものもある15。細菌は複数の防御システムを用いてこれらのウイルスから身を守ります16。適応的免疫機構であるCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）-Casシステムは、過去のウイルス感染のDNA記録（スペーサー）を染色体のCRISPR配列に保存し、将来のファージ攻撃と戦うことができます17。
ファージはGMの組成や機能を変化させることができるが8,12、ヒトの宿主から直接免疫応答を引き出すこともできる18,19,20、宿主の健康を調節する三者間相互作用を示唆するものである。乳児の腸内におけるウイルスメタゲノム（ビローム）組成に関する最初の報告は10年以上前にさかのぼり21、乳児ビロームは最近、帝王切開や粉ミルクの影響を受けることが示されている22。しかし、乳児期のビロームの構成と構造を明らかにする大規模な研究はほとんどなく、一般にヒトのビローム研究は、未知のウイルス多様性の割合が大きいという課題を抱えている。この課題は、ウイルスの「暗黒物質」問題と呼ばれることもある23。
後者は、ビローム中の核酸配列のうち、既知のウイルスに関連づけられるものがごく一部であることを意味する。デノボ・ウイルス同定の試みは、普遍的なウイルスマーカー遺伝子の欠如によって制限され、新規ウイルスのデノボ分類は、標準的な方法の欠如によって妨げられてきた。しかし、近年24,25,26の進展により、いくつかのヒト腸管ウイルスデータベース27,28,29が構築されつつあるが、これらはまだ発展途上であり、含まれるすべての新規ウイルスに対するウイルス分類学がないのが現状である。包括的なウイルス分類法は、サンプルのメタデータに対して生物学的に意味のある統計解析を行うために重要である。
従来、新しいウイルス分類を定義するには、実験室でウイルスと宿主の両方を分離し、その後の特性解析を行う必要がありました30。しかし、国際ウイルス分類委員会（ICTV）は最近、配列情報のみに基づいて新しいウイルス分類群を定義することを可能にした。この重要な変更はすでに大きな意味を持ち、特に非常に多様な尾状ファージ（caudovirus）31の中で、いくつかの新しい分類が提案されている。特に、ICTVは新しいヘレルウイルス科の完全な分類学を確立し、この新しいパラダイムに従ったウイルス科、亜科、属の定義を実証した32。その後、ヒトの腸内メタゲノムデータから3つの新しいカウドウイルス科が同定された33。そして最近、著名な腸内ファージファミリーであるCrassviridae34がウイルス目Crassvirales35に昇格し、新しいウイルスクラスCaudoviricetesに属し、それ自体がボードウイルス36を全体として包含することが提案されています。
本リソースでは、Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood 2010（COPSAC2010）コホート37に登録された1歳の乳児647人の糞便ビロームの特徴を明らかにした。De novoアセンブリと慎重なキュレーションにより、未知のウイルス多様性をマッピングすることができ、数百のウイルスファミリーレベルクレード（VFC）が同定されました。成人の腸内は病原性の高いクラスウイルスに支配されているのとは対照的に、乳児の腸内は多様で大部分が温和なウイルス群であることが判明した。
結果
研究対象者
COPSAC2010は、大コペンハーゲン周辺の農村、郊外、都市に住むデンマークの子ども700人を対象とした人口ベースの母子コホート研究である（補足表1）。参加者は、慢性炎症性疾患の原因を前向きに研究することを目的として、妊娠中に募集されました37。糞便サンプルは正常に収集され、1歳時の647人の子供についてビロームの特徴が明らかにされました。メタゲノムも並行して配列決定された38。
ウイルスの同定と分類の決定
ウイルスの抽出には様々な量の細菌汚染DNAが含まれることが知られており39、未知のウイルスの多様性23により、新規ウイルスと汚染ウイルスを見分けることは困難である。この問題は、既存のツールや「circular contigs」33などの基準で、真に新規なウイルスクレードの同定を妨げる可能性のある選択バイアス（詳細については、補足情報および補足表2を参照）を避けるために、アセンブリ、クラスタリングおよび連続した手動キュレーション（方法）によって解決された。
つまり、抽出されたビロームは、乳児サンプルあたり平均3Gbpの配列決定が行われた。アセンブリと種レベルの重複排除を行った後、得られた運用分類単位（OTU）をタンパク質含有量でクラスタリングし（Extended Data Fig.1）、視覚化し（Extended Data Fig.2）、手動でキュレーションした。最終的に、10,021個のウイルスOTU（vOTU）が、この研究の最終的なウイルス種のセットを構成した（詳細については、補足情報およびオンラインメソッドを参照）。これらのvOTUは、全シーケンスリードの約半分を占め、残りの半分は主に細菌性汚染DNAの配列クラスターにマッピングされた（補足情報および拡張データ図3-5）、これは他の研究40と同等である。汚染配列クラスターはそれ以上分析されなかった。
どのvOTUが既存のウイルスファミリーの一部であるかを決定するために、7,705種レベルの重複排除された参照ファージ41とプーリングしました。遺伝子コールの後、タンパク質アラインメントは、ウイルスオーソログ遺伝子クラスター（VOGs）をde novoで定義し、集合タンパク質類似性（APS）ツリーを構築するために使用されました。このツリーは、Herelleviridae32ファージファミリーの最近の分類法を再現するレベルで根を張り、切断されたため、vOTUと参照ファージの両方を含むウイルスファミリー（VFC）、サブファミリー、属に対応するクラスタが得られた。また、新たに提案されたCrassvirales目35に基づくオーダーレベルのカットオフを追加した。
10,021の種レベルのボツリヌス菌は、2,497ボツリヌス菌を含む16の既知のファミリー（図1）と7524ボツリヌス菌を含む232の未記載のVFCを含む248のキュレーションVFCに含まれます。未記載のVFCは、糞便サンプルを提供した乳児の名前にちなんで命名されました。さらに、VFCは17のウイルスオーダーレベルクラスター（VOC、補足表3）に分類され、そのうち5つはすでに知られていたものであった（図1）。ファミリーレベルで典型的な完全ゲノムサイズを推定した結果（図1）、10,021個のvOTUの56 %が完全またはほぼ完全であることが判明した。特に、小さな一本鎖DNA（ssDNA）vOTU 2,629個の83%、大きな二本鎖DNA（dsDNA）vOTU 7,392個の46%がそうである。ボツリヌス菌のDNA配列と分類、およびボツリヌス菌の視覚化（拡張データ図2）は、インタラクティブな図1（http://copsac.com/earlyvir/f1y/fig1.svg）を通じて公開されています。
図1: 幼児の腸内DNAウイルス多様性のアトラス。
1歳の乳児647人の糞便ビロームの詳細な配列決定、アセンブル、キュレーションを行った結果、248のVFCに属する10,021種のウイルスが同定されました。各VFCの予測宿主範囲が示され、VFCは17のVOCに分類された。また、ヒートマップやヒストグラムでは、ゲノムサイズ、ライフスタイル、宿主範囲、存在量、コホート全体および公表されている腸内ウイルスデータベースにおける有病率を示している。既知の16のウイルスファミリーについては、名前を赤字で表記しています。この図のインタラクティブ版（拡張可能なファミリー）はオンラインでアクセスでき、各ウイルスの遺伝子内容の閲覧やゲノムのダウンロードが可能です：http://copsac.com/earlyvir/f1y/fig1.svg。
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乳児の腸管ウイルスデータベースには、ほとんど存在しない
10,021種のウイルスが、主に成人糞便のメタゲノムデータを基に構築された3つの腸内ウイルスデータベースで見つかったかどうかを確認した。Gut Virome Database (GVD)29には、私たちのvOTUのうち819種しか含まれていませんでしたが、より大規模で最新のGut Phage Database (GPD)28 とMetagenomic Gut Virus catalogue (MGV)27 は、それぞれ2,307と2,171vOTUをカバーしています。今回同定された乳児腸内細菌のうち7,046個（70%）は、3つの腸内細菌データベースのいずれにも見つからなかった。しかし、ファミリーレベルでは、248のVFCのほとんどがいずれかのデータベースで何らかの代表を持ち、特にCrassvirales VFCはGPDとMGVの両方でよく表現されていました。重要なのは、最も種数の多いVFC（例えば、候補の「アマンダウイルス科」）の大部分は、3つのデータベースのいずれにおいても表現が乏しく、一方、データベースが最もよくカバーするVFCは、我々のデータではしばしばマイナーだったことである（図1）。言い換えれば、データベースにある大型腸管ファージクレードのほとんどは、乳児腸管ビロームではたまにしか見られず、その逆もまた然りである。このパターンは、乳幼児期の腸が、成人の腸とは異なる特殊なウイルスを保有するユニークなニッチであることを示唆しています。このような重複の欠如の代替的な説明として、ライブラリ選択の違い（我々の場合はボナファイドビロミクスとバルクメタゲノミクス）、バイオインフォマティクス（キュレーションと自動検出）、乳児腸の配列多様性の制限（他では見られないファージの完全アセンブリが可能）、腸ビロームの性質として極めて個人差があること、が考えられる。
乳児腸内ビロームの大部分を占める未記載のウイルスファミリー
APSツリーをファミリー32とオーダーレベル35で切断したところ、248のVFCと17のVOCが得られた。ファミリーレベルのカットオフでは、最近定義されたcrAssphageファミリー35を再現した（図1）。オーダーレベルのカットオフでは、5つの既知のウイルスオーダー（すなわち、Petitvirales、Tubulavirales、anellovirus（CRESS）、Rowavirales、Crassvirales）と、さらに12種類の厳密にcaudoviral VOCを再現した（補足表3）。ファミリーレベルでも、248個のVFCのうち232個がcaudoviralであり、その多様性がさらに強調された。VFCの平均サイズと中央値はそれぞれ40と17の種レベルのvOTUであり、典型的なVFCはFlandersviridae33などの現在知られている腸内ファージファミリーと同様の豊かさを持っていることがわかった。
最も優勢なウイルス群を特定するために、3つの指標を計算した：総種の豊かさ、サンプル間の有病率、平均相対存在度（MRA）（図2）。ファミリーレベル、オーダーレベルのMRAと有病率は、まずサンプルのリードをvOTUにマッピングし、次に分類学的所属に基づいてそのカウントを集約することで求めた。3つの指標はすべて高い相関を示し（図2および拡張データ図6）、これは最も多様なVFCとVOCが、最も広く、豊富に存在することを意味している。これらの測定値の相関は、細菌群集構造にも適用される中立群集モデルによって予測される42,43。
図2：1歳児の腸内におけるウイルスクレードの豊富さ、有病率、濃厚さ。
ssDNAクレードは、増幅バイアスにより存在量が増加する可能性があるため、星印で示した。a: 17のVOCのサンプル間の有病率とMRA。主要なVFCは、データ中の最も豊富な10個のcaudoviral VFCとして定義され、色とラベルが付けられている。マイナーなVFCとssDNAファミリーはグレーで表示されています。10種類の主要なVFCの予測されるライフスタイルは、異なる形状で示されている。 c, VOCとVFCを種の豊かさでスケールし、MRAで並べた。VOC12とRowaviralesはサイズが小さいため、表示されていない。VFCは、所属するVOCの下に表示されている。クレードの有病率、存在量、種の豊富さは相互に関連しており、乳児の腸内では、いくつかの未記載のクレードがcrAssphageの数を上回っています。
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今回のデータでは、脊椎動物に感染するssDNAアネロウイルス（Anelloviridae）と細菌のssDNAマイクロウイルス（Petitvirales）が最も多いウイルス群に含まれていた（図2aおよび次の小節）。続いて、Caudoviricetesウイルス群に属する10種類の主要なdsDNA VFCが挙げられた（図2b）。これらのうち4つはICTVの承認待ちの既知のボードウイルス科、すなわちスクナウイルス科、サラスウイルス科、β-クラッスウイルス科、フランダースウイルス科であり、残りの6つは新しい候補科である。重要なのは、成人の糞便ビローム44に多く含まれるクラッスウイルス類が、乳児の腸内では他のVOCに追い抜かれたことである（図2a）。
スクナウィルス科は、ラクトコッカス乳製品培養液に感染する病原性ファージのファミリーである45。食事に由来する可能性があり、我々のデータでは、最も豊富なカウドウイルス科であった（2.7％MRA）。サラズマウイルス科は、ファージΦ2946を含む約12種のバチルス・ポドウイルス種を保有するウイルス科である。今回、我々は20以上のウイルスサブファミリーにまたがる200以上の多様なvOTUを持つSalasmaviridaeファミリーの範囲を広げることができ、様々な腸関連ファーミキューテスおよびアクチノバクテリアに感染することができました。β-Crassviridaeは、成人ではマイナーなCrassviralesファミリーであるが、乳児のほぼ3分の1（n = 210; 647）から見つかり、BacteroidesとClostridialesの両方の宿主に感染すると予測されるものであった。しかし、成人の主要なクラスウイルス科であるα-Crassviridae35,47は、乳児のわずか5％（n = 39）にしか存在しなかった。Flandersviridaeは、最近、公開メタゲノム集合体から得られた30個の完全なファージゲノム33に基づいて定義されたバクテロイデス感染性ファージファミリーである。小児のほぼ半数（n = 286）から発見され、4つのサブファミリーにまたがる80の完全な種レベルのvOTUでこのファミリーを著しく拡張した。
これら4つの既知のウイルス性ファミリーとは別に、6つの未記載の候補ファミリーが非常に豊富で、広く普及しており、多様であることが判明した。これらの候補ファミリーの有病率と豊かさの推定値から、これらのファミリーは、乳児の腸内生態系において、成人におけるcrAssphageと少なくとも同程度に優勢であることが示された44。候補ファミリーの「Sisseviridae」は、乳児にほぼ普遍的に存在し（80％）、非常に一般的なFaecalibacterium phage Oengus48を保有し、多様な固形菌と放線菌に感染する温和なvOTUと強毒vOTUを幅広く含んでいる。温帯の候補ファミリーである「Amandaviridae」、「Jeppeviridae」、「Alberteviridae」は、主要なVOC1に属し、関連しています。これらの候補ファミリーは乳児の70％に存在し、それぞれ200から300のウイルス種を含み、Ruminococcus、Blautia、Anaerostipes、HungatellaなどのClostridiales属に感染した。分類されていないClostridiumとBrevibacillusの参照ファージ種がその中に共クラスターとして存在する以外、これらの広範なクレードはほとんど未解明である。最後に、「Evaviridae」と「Hannahviridae」は、Bacteroides感染ファージの2つの関連候補ファミリーで、全部で約200種が含まれています。前者は厳格な強毒性を示し、後者は強毒性または温和なサブファミリーを有している。Hannahviridae」には、多様性を生み出すレトロエレメントで知られる最近報告されたBacteroidesファージ「Hankyphage」49が含まれており、同じサンプルで行われた並行プロビローム研究において広範囲に記述されている50。
乳児の腸内におけるssDNAウィルスのクレード
ssDNA vOTUはシーケンスリードの約3分の1を占めたが、短いゲノムサイズで正規化すると、MRAの60%を占めた（Extended Data Fig. 3）。ssDNAウイルスを検出するために使用された短い多重置換増幅（sMDA）プロトコルが、その数を増加させている可能性がある51。しかし、これらのファミリーは中立的なコミュニティモデルに沿って正規の位置づけを示したので（図2bと3f）、人為的なインフレーションは限定的であったと推測される。ssDNAファミリーは、Malgrandeviricetes、CRESSウイルス、Faserviricetesの3つのウイルスクラスに分類され、それぞれが単一のウイルスオーダーを保有していることがわかった。
図3: 幼児腸内の温和なウイルスファミリーと強毒なウイルスファミリー。
a-e,MRA(a)、有病率(b)、固有枝長で測定した遺伝的多様性(c)、メタゲノムCRISPRスペーサー一致数(d)、ホスト範囲（ホスト種の数）(e)に関するデータ中の温和なVFCと強毒なVFCの特徴。 f,図2bのVFCに対する中立コミュニティモデルの当てはめの結果。h, 中性コミュニティモデルの残差の比較。温帯性VFCは正の残差を持つ傾向があり、一方、病原性VFCは負の残差を持つ傾向があることを示し、病原性ファージと比較して、温帯性ファージは多くの子供で発見されているにもかかわらず、存在量が少ないことを示す。a-eとhについては、n = 151（温帯性118＋病原性33）。箱ひげ図要素：中央線は中央値、箱限界は上下4分位、ひげは1.5×IQR、点は外れ値。両側Wilcoxon検定のP値を報告。fとgについては、n = 248（温帯性118人＋病原性33人＋不明97人）。
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Petitviralesウイルス目（クラスMalgrandeviricetes）のマイクロウイルスは、どこにでもある小さな20面体のssDNAファージで、我々のビロームでは最も多く、豊富なウイルスグループで、MRAの52％を占めた。メタゲノムから得られた全CRISPRスペーサーマッチの21%はマイクロウイルス（http://copsac.com/earlyvir/f1y/taxtable.html）を対象としており、その重要性が強調されています。本データに含まれるゴクショビール科とアルパウイルス科（現在はゴクショビール亜科とアルパウイルス亜科）の2大家族からのvOTUは、それぞれClostridialesとBacteroidalesへの感染が予測されていますが、他のマイナーVFCも検出されました（図1）。
CRESSクラスのssDNAウイルスであるアネロウイルスは、トルクテノウイルスとも呼ばれ、脊椎動物の細胞に感染する3kbの小さなssDNAウイルスからなる一つのファミリー（Anelloviridae）を構成しています。健康な人では無症状の慢性感染症を引き起こしますが、免疫不全の患者さんでは抗体価が上昇することがあります52。乳児の免疫反応が未熟であることが、今回の検体におけるウイルスの多さ（MRAの7％）を説明しているのかもしれません。乳幼児は、970の種レベルのvOTUを持つ最も豊富なファミリーを構成しています。平均して、各幼児は10種のAnelloviridaeを保有しており、これは以前の知見と一致している13。当然のことながら、CRISPRスペーサーはAnelloviridaeのvOTUに一致するものはなかった。
Tubulavirales目（Faserviricetesクラス）のイノウイルスは、小さなssDNAゲノムを持つ糸状ファージのユビキタスで多様なグループである53。インテグラーゼを用いて宿主ゲノムに組み込むものもあれば、ウイルス粒子を継続的に排出することで慢性的な非致死性感染症を引き起こすものもある15。今回のデータでは、Petitviralesのような7つの科に分布し、多様であったが、種の豊富さは235vOTUと低く、存在量もそれに応じて低く、合計1%MRAだった。発見されたイノウイルスファミリーのほとんどは、クロストリジウム属に感染すると予測されていたが、VFC「Adamviridae」のメンバーは、ビフィドバクテリウムに特異的に感染するようである（図1）。
ウイルスのライフスタイルは、存在量と有病率の両方を決定する
10種類の主要なVFCのほとんどはインテグラーゼを欠いており、それ以外の場合は、あまり存在しないVFCによく見られる。インテグラーゼは温和な生活様式の指標であるため、強毒な生活様式がより高い存在量と関連しているかどうかを調査した。まず、228個のVFCについて、構成するvOTUのサイズ分布を調べることにより、VFCあたりの典型的な完全ゲノムサイズを決定した。VFCの完全ゲノムサイズの中央値（四分位範囲：IQR）は35kb（30-50kb）であった。ウイルスファミリーごとに決定された完全ゲノムサイズの最小限度（図1）を用いて、完全ゲノムおよびほぼ完全なゲノムを持つ5,608個のvOTUについてインテグラーゼのスクリーニングを行った（Methods）。ファージのライフスタイルはファミリーレベルでほぼ均質であり、合計118のVFCが温和と判断され、33のみが強毒であることが判明した。残りの97のVFCは、混合的なライフスタイルパターンを示すか、完全なゲノムの数が不十分であったため、不確実であった。
ファミリーレベルの存在量はファージのライフスタイルと有意な関係はなかったが（両側ウィルコクソン検定、P = 0.90、図3a）、温帯性VFCは強毒性VFCよりも有意に多かった（P = 0.048、図3b）。温帯ファージは、強毒ファージよりも遺伝的に多様であることが示されている54。そこで、強毒ファージと温帯ファージのファミリーレベルのAPSサブツリーにおいて、ユニークな枝長（全枝長に対する割合）の量を比較した。実際、温帯のボードウイルスVFCは、強毒VFCよりも遺伝的に多様であった（P = 0.021; 図3c）。クロストリジウム属の宿主は温帯性VFCに特に多く、一方、ほとんどの病原性VFCはバクテロイデス属に感染すると予測された（図1）。CRISPRスペーサーマッピングによると、他の研究28,55と同様に、いくつかのVOTUは複数の宿主種、属、あるいは細菌科に感染するようであった。我々は、スペーサーが温和なファージよりも強毒なファージをターゲットにしているか、あるいは強毒なライフスタイルがより広い宿主範囲と関連しているかどうかを確認した。しかし、温帯ファージと強毒ファージの宿主範囲はほぼ同じであり（P = 0.2、図3d）、標的となるスペーサーの数も同じであった（P = 0.097、図3e）ことから、このようなことはありませんでした。
最後に、病原性VFCと温和性VFCの存在量と有病率を互いにプロットすると（図3f）、病原性VFCは、より少ない子どもから発見されたにもかかわらず、高い力価を持つことが示唆されました。この仮説を、存在量と有病率の関係を記述する中立コミュニティモデル（図3g）を用いて系統的に検証した56。このモデルをすべてのVFCの存在量に当てはめた結果、病原性VFCは温帯性VFCよりも有意に低い残差を示し（両側ウィルコクソン検定、P = 2.1 × 10-5; 図3h）、温帯性VFCよりも流行が少なく存在量が多いことが確認された。
ファージホストの存在量は、ウイルスのライフスタイルにもかかわらず、連動している。
vOTUの宿主となる細菌は、メタゲノム集合ゲノム（MAGs）38の317,968個のCRISPRスペーサー、CRISPRスペーサーデータベース57の1100万スペーサー、WIsH58を用いて予測された。これらの予測は、最後の共通祖先によってマージされた。宿主となる細菌属は、vOTUの63%について予測され、77%は目レベル（図4a）、79%は宿主門レベルでカバーされていました。宿主属はBacteroidesが圧倒的に多く、Faecalibacterium、Bifidobacteriumと続く。一方、目レベルでは、注釈付きvOTUの約半数がClostridialesを宿主としており、Bacteroidalesはわずか4分の1であった（図4a）。これは、メタゲノムに含まれる細菌分類の対応するパターンを反映しており、バクテロイデス属が最も多く、クロストリジウム属がより多様である（図4b）。
図4: 1歳児の腸内におけるファージとその宿主細菌。
乳児腸内ビロームで見つかった10,021個のvOTUに対する細菌宿主の予測では、Bacteroides、Faecalibacterium、Bifidobacteriumの3つが最も目立つ宿主属である。 a, ウイルス宿主予測の分布を細菌の目および属レベルにそれぞれ折りたたんで示したもの。b,同じ乳児の糞便サンプルの腸内メタゲノムで見つかった上位100の腸内細菌属を分類学的ツリーで表現したもの。各細菌属のMRAを青いヒートマップで示し、その宿主属を保有する乳児647人の割合（つまり、その有病率）を茶色の棒グラフで示す。外側のリングは、細菌属ごとに、宿主がわかっている参照ファージ種41（紺色）に対する乳児の腸内vOTUの割合（黄色）を示しています。各属名の後ろの数字は、細菌宿主属ごとの参照ファージ種に対するvOTUの総数を示しています。c,各ドットはbの属を表し、メタゲノムにおけるそのMRAとビロームにおけるその全てのvOTUのMRAの総和を比較したものである。宿主の存在量は、スピアマンの順位検定（両側P値）により、対応するファージの存在量と強い相関があることが示された。
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メタゲノムにおける宿主細菌属のMRAは、ビロームにおける同種のファージのMRAと強い相関があり（スピアマンのρ = 0.76, P < 1.45 × 10-17; 図4c）、宿主予測およびウイルス量推定の精度を裏付けています。全体として、乳児の腸内では、強毒ファージと温和ファージの両方が宿主の存在量と正の相関を示した（拡張データ図7と8）。病原性ファージは宿主を溶かすが、断面的には宿主の存在を示す正のマーカーとして機能する。
考察
最近、いくつかの大規模な腸内ウイルスデータベースが公開され、ヒトの腸内ウイルス群集の多様性が明らかになりました27,28,29。しかし、この生態系ニッチの大部分は未解明である。腸内ウイルスの役割を理解するためには、腸内ウイルスを徹底的に解明することが必要であり、特に、慢性疾患の予防や治療のために腸内ウイルスを制御することを目的とする場合には、腸内ウイルスの解明が不可欠である。我々は、647個の乳児腸内ビロームの塩基配列を決定し、de novoアセンブリと分類によって、未知のウイルス多様性をマッピングした。その結果、248種類のVFCが発見され、そのうち232種類が未知であり、そのほとんどがCaudoviricetesウイルスクラスに属していることが判明した。温帯性ファージが1歳児の腸内ビロームの主流を占め、crAssphageはいくつかの未記載ウイルスクレードによって影が薄くなっています。ビロームデータのこのような包括的な分類学的解像度は、サンプルのメタデータに対して生物学的に意味のある統計解析を可能にし、トランスレーショナルビロミクスにおける将来の研究を支援するものである。
未知のウイルス多様性（「ダークマター」）を系統的に解決した結果、ビローム配列の7％しか未解明となり（拡張データ図3）、この過程で発見されたVFCは、現在のファージ分類学を大きく拡張するものとなった。ファージライフスタイルの解明により、乳児の腸内生態系に存在するファージの多くは温和であり、多様性の低い病原性ファージがより多く存在する可能性があることが示された。これは、同じく温和なファージが優勢な新生児腸に関する最近の知見12と同じであり、毒性ファージが優勢な成人とは対照的である29。
6つの主要な候補ファミリーに加えて、多数の優勢なボードウイルスVFCをオンラインで閲覧することができます（図1）。一般に、バクテロイデス属に感染するVFCは強毒で宿主特異的であることが多く、クロストリジウム属に感染するVFCは宿主範囲が広く、圧倒的に温和であることが特徴である。また、複数のVFCが一つの宿主属に特化していることが多く、例えば、アッカーマンシアに特化したVFCは7種類あった（図1）。また、例えば「アマンダウイルス科」のようなClostidialesに感染するVFCのように、複数の宿主属を持つ、より不可知論的なものもあった。また、同じ目に属する複数の細菌科に感染すると予測されるボツリヌス菌さえあった。このような特徴は、ウドウイルスが宿主間の水平的な種分化だけでなく、狭い宿主ニッチ内での垂直的な種分化の速度も速いことを強調している。BacteroidesやAkkermansia59のような系統的に異なる宿主は、おそらく宿主転換の障壁が高く、ヒトの腸内環境においてファージファミリーをより宿主特異的にしている。これは、Clostridiales属が数十種類共存し、宿主の柔軟性を促進するのとは対照的である。全体として、種や属のレベルでは、ボードウイルスの豊富さが宿主の豊富さを一桁上回っていることがわかった（例えば、メタゲノムでは、ボードウイルス2,858属に対して宿主203属が存在する）。
これまでのほとんどのビローム研究では、抽出したDNAをMDAで増幅してから塩基配列を決定しているため、塩基配列の構成がssDNAウイルスに偏る可能性があり、さらに全体的な定量分析に支障をきたすこともある60、61。しかし、ビローム研究の最大のメタアナリシス29では、非MDAと標準的な2時間MDAの腸内ビロームの間に違いは見つからなかった。さらに、バイアスなしでssDNAを検出できるとされる別のDNAライブラリーキットを用いた最近の腸内ビロームの研究では61、サンプルの3分の1でマイクロウイルスがボードウイルスを上回った62。ここでは、バイアスを抑えながらssDNAを検出するために、30分間のsMDAステップを使用しました。その結果、乳児の3分の2でマイクロウイルスがボードウイルスを上回るという逆の傾向が見られました。しかし、ファージとその宿主の間に強い共棲関係があることもわかりました。さらに、プラーク形成単位とウイルス量との関連性を徹底的に比較しました（Extended Data Fig.9）。少なくともdsDNAウイルスについては、sMDAを使用しているにもかかわらず、ウイルス量に関する我々の結果は定量的に妥当であると結論づけました。
スクナウィルス科は、最も豊富なボードウィルスファミリーですが、データセット中の完全なvOTUはわずか8個でした。これは、他の豊富なウイルスファミリーのほとんどが数百のvOTUを持つことを考えると、非典型的なものである。このファミリーに属するすべての参考ファージはラクトコッカスに感染するが、我々のvOTUはストレプトコッカスに感染すると予測されたが、これはラクトコッカスにCRISPR-Casシステムがないことによるアーティファクトである可能性がある63。溶連菌は子供たちに非常に多く生息していますが、病原性の高いスクナウィル科の数を支えるには十分な量ではなかったかもしれません。また、スクナウィル科とレンサ球菌やラクトコッカスとの間には、データ上、強い相関関係は見いだせなかった。したがって、これらの強毒性ファージは、以前提案されたように、自然に発生する発酵乳製品を介して摂取された可能性が残っている64。
同じサンプルから分離されたEscherichia coliファージに関する以前の研究65では、強毒性コリファージは温帯性コリファージよりも少ないがより多く存在し、より広い宿主範囲を持っていた。今回、我々は同じパターンをよりグローバルなスケールで発見した。多様な宿主に存在するウイルス性ファージファミリーは、温帯性ファージファミリーよりも豊富であったが、流行は少なかった。宿主範囲に違いは見られなかったが、温帯ファージファミリーは病原性ファージファミリーと比較して遺伝的に多様であった。温帯ファージがより多く、より少ないのは、マウスモデル66,67,68で示されたように、プロファージが頻繁に誘導され、誘導されたビリオンが容易に再感染して増殖しないことを反映していると思われる。ビロミクスでは、多様な温帯ファージの安定した背景の上に、ファージと宿主のランダムな出会いによって、確率的に病原性のブルームが出現すると考えることができる。私たちの幼児サンプルでは、この温和な背景は、病原性ファージの多様性を覆い隠すのに十分なほど強烈であった。おそらく、GMと宿主の免疫が安定した大人のビロームでは、細菌のストレスが少なく、温和なビロームが支配的でなくなっているのだろうと思われる。この考え方は、病原性ファージコアが成人の腸の健康とどのように関連しているか69、また乳児ビロームにはcrAssphageが少ないこと29と一致する。
方法
COPSAC2010のコホート
本研究は、慢性炎症性疾患37の基礎となるメカニズムを研究することを目的として、妊娠24週目から追跡された736人の女性とその子どもからなるデンマークの人口ベースCOPSAC2010前向き母子コホートに組み込まれました（補足表1）。本研究はヘルシンキ宣言の指導原則に従って実施され、The National Committee on Health Research Ethics（H-B-2008-093）およびDanish Data Protection Agency（2015-41-3696）によって承認された。登録前に、両親ともに書面によるインフォームドコンセントを行った。1歳時に660人の参加者について糞便サンプルを採取した。
ヴィローム抽出
各サンプルは10%vol/volのグリセロールと混合し、メタゲノム38用のDNA抽出とビローム抽出まで-80℃で保存した。ビロームの抽出と配列決定は、以前に記載されたプロトコルを用いて行った70。簡単に説明すると、ウイルス粒子に濃縮された糞便濾液からDNAを抽出し、短時間（30分）のMDA増幅にかけ、イルミナネクステラXTキット（FC-131-1096）の製造者の手順に従ってライブラリを作成した。エピフロレッセンスウイルス様粒子（VLP）の推定には、ビロームサンプル10 µlを100倍に希釈して固定し、0.02 µmフィルターに付着させ、乾燥させてSYBR-Goldで染色（200倍）し、475 nmレーザーによるエピフロレンス顕微鏡で可視化。VLPは8～10フィールドでカウントし、残りのフィルター表面積に掛け合わせた。
配列決定、組み立て、除染
ウイルスライブラリは、イルミナHiSeq Xプラットフォームで、ペアエンド2×150 bpリードを用いてサンプルあたり平均3 Gbの深さで配列決定した。660サンプル中647サンプルで満足のいくシーケンシング結果が得られた。Virome readはFastq Quality Trimmer/Filter v0.0.14 (options -Q 33 -t 13 -l 32 -p 90 -q 13)を用いて品質フィルターおよびトリミングし、cutadapt (v2.0) を用いて残存するイルミナアドプターを除去した。トリミングしたリードは、VSEARCH71（v2.4.3）のderep_prefixを使用して複製を解除し、Spades72（v3.10.1）でリードエラー補正を無効にしながらmetaフラグを使用してアセンブリした。除染クラスターは、既発表のパイプライン73を用いて、サイズが1kb以上の150万個のコンティグを267k個の90%ANI代表に重複除去し、Prodigal74 (v2.6.3) で遺伝子を呼び出し、FASTA75 (v36.3.6f) でタンパク質を全対全で揃え、カスタムコード (https://github.com/shiraz-shah/VFCs) によりAPS樹76を作成し、重複を減らすことにより生成した。ツリーは根元付近で切断し、除染クラスターを得た。同じサンプル38の細菌MAGをCRISPRDetect77（v2.2）を用いてCRISPRスペーサーを検索し、CRISPRターゲットの範囲とサンプルの普及率を掛け合わせてビロームの汚染除去クラスターをランク付けした。タンパク質アライメント結果をオーソロジーフィルター78 (https://github.com/shiraz-shah/VFCs) に通し、マルコフクラスタリング79 (v14-137) を用いてクラスタリングし、VOGs de novoを得た。VOG を用いて、各除染クラスター内のコンティグの遺伝子含有量を可視化した。上位400位までのクラスターを、2つのウイルスの特徴、すなわちコンティグのサイズと遺伝子内容の保存について視覚的に検査した。上位400位を超えると収穫が少なくなるため、残りの除染クラスターは汚染物質であると仮定した。
OTUの定義とタンパク質のアノテーション
BLAT80とクラスタリング用カスタムコード(https://github.com/shiraz-shah/VFCs)を用いて、コンティグのOTUへの種レベル（95% ANI）の重複排除を行った。リファレンスファージは、同じ戦略で種レベルまで重複排除された。また、VOTUとGVD、GPD、MGVの比較も同様に行った。汚染除去されたvOTUと参照ファージ種41をプールし、APSツリーとVOGを再計算した。VOG の複数配列アライメント (MSA) は MUSCLE81 v3.8.425 で構築した。VOGのMSAをPfam82、Conserved Domains Database83、Clusters of Orthologous Groups of proteins database84、TIGRFAMs85のMSAとHH-suite3 (ref. 86) v3.0-beta.3 でアラインし、機能注釈を得た。
ウイルス分類学の解明
まず、FigTree（v1.4.4）を使用して、木の幹から直接分岐するアウトグループを選択し、APSツリーをルート化しました。次に、phylotreelibとtreetool (https://github.com/agormp/phylotreelib)を使用して、以下のようにウイルス属、サブファミリー、VFC、VOCを生成した。まず、treetoolのcladeinfoオプションを使用して、既存のファージ属、サブファミリー、ファミリー、オーダーに対応するルートから分岐点までの距離を取得した32,35。次に、treetool.pyのclustcutオプションを使用して、上記の距離で根付きAPS木を切断し、vOTUと参照ファージの両方のウイルス属、亜科、科、目に対応するクレードを取得しました。ツリーカットに使用した距離は、それぞれ0.250、0.125、0.04、0.025で、各分類レベルの平均アミノ酸同一性（AAI）およびカバー率の閾値70%、50%、28%、22%に相当します。
VFCのキュレーション
上記のウイルスファミリーを可視化し（拡張データ図2）、(1)さらに個々のメンバーのvOTUをキュレーションし、構造的なVOGを持つ確認可能なウイルスと、典型的な構造タンパク質をコードする遺伝子を持たないサテライトのような様々なウイルス関連MGEを表すvOTUのサブクレードを分離しました。(2) 各ファミリー内のOTU長分布を検査し、5kbステップのヒストグラムにプロットして、最も右側のサイズのピークを特定した。このピークの直前の5kbステップを、完全またはそれに近いゲノムの下限サイズとして設定した。(3) ファミリーの可視化は、現在進行中の分類作業への干渉を避けるため、参照ファージが支配的なファミリーを手動で除去するために検査された。また、MGEやフラグメントを主成分とし、vOTUが5個未満、または完全なvOTUが2個未満の弱いファミリーも削除した。VOGのMSAは、Pfam、Conserved Domains Database、Clusters of Orthologous Groups of proteins database、TIGRAMsよりも情報量が多いPHROGs87のMSAに対して再調整され、最終版のファミリー可視化がオンラインで公開されている。
宿主予測
MAGスペーサーとCRISPRopenDB57およびWIsH57（v1.0）のスペーサーを使用して、各vOTUについて別々の宿主予測を作成した。3つの予測は、3つの方法すべてが時折予測を誤るため、エラー修正戦略として、最も密接に一致する2つの予測の最後の共通祖先を使用して統合された。メタゲノム中の細菌属の存在量は、各サンプルのリードに対して mOTUs88 (v2) を実行し、R (v4.0.2) で phyloseq89 (v1.41.1) を用いて属レベルで mOTU 存在量を集計することで求めた。
アバンダンスの推定
細菌汚染は、ViromeQC40（v1.0）と、各ビロームの同族であるメタゲノムを活用したカスタムアプローチにより、各ビロームサンプルについて推定しました：リードを16S rRNA遺伝子90とcpn60（文献91）に対して両分画からマッピングし、汚染の程度を両分画間の比率として算出した。各サンプルにおけるvOTUの存在量は、Burrows-Wheeler Aligner92 (v0.7.17-r1188) でmem -aオプションを付けてサンプルリードをサンプルコンティグにマッピングし、msamtools (v0.9.6) プロファイルを使用して、深さと長さで正規化した相対存在量を求め、一意にマッピングしたリードに比例して曖昧なマッピングリードを繰り返し再分配しました (https://github.com/arumugamlab/msamtools). 得られたコンティグの存在量をカスタムコード（https://github.com/shiraz-shah/VFCs）を用いてOTUレベルで集計し、サンプルごとのvOTU存在量を求めた。vOTU存在量をphyloseq89（v1.41.1）を用いてR（v4.0.2）でファミリーレベルおよびオーダーレベルで集約すると図2および3で用いた統計が得られた。
ファージライフスタイルの予測
インテグラーゼおよび大型セリンリコンビナーゼタンパク質ファミリーに一致するVOGのリストをまずキュレーションし、次にウイルスファミリー内の完全なvOTUが温和か強毒かを予測するために使用された。95%以上の完全なvOTUがインテグラーゼを持たないファミリーは強毒と判断され、温和なファミリーでは完全・不完全vOTUの少なくとも50%がインテグラーゼを持つことが要求された。
ベンチマーキング
ベンチマークに使用したウイルス発見ツールのバージョン（補足表2）は、DeepVirFinder（v1.0）、VIBRANT（v1.2.1）、VIRSorter（1.0.6）、VIRSorter2 （v2.0 commit 22f6a7d）, Seeker（commit 9ae1488）, PPR-Meta（v1.1） and CheckV（v.0.7.0). ランダム予測は、362,668個のOTUを12,500回、置換なしでランダムにサンプリングすることで作成されました。12,500という数字は、私たち自身の陽性セットとほとんどのツールで生成される陽性数に適度に近いので選ばれました。
図と統計解析
図1は、まずphyloseq89を用いてファミリーレベルのデータを照合し、Circos v0.69-8 (参考文献93)を用いてレンダリングした。図2-4、拡張データ図4-8、および対応する統計解析は、統計ソフトウェアRとtidyverseスイート（ggplot2（参考文献94）および関連アドオンパッケージggraph95、ggforce96、ggpubr97、ggrepel98、ggstance99およびpatchwork100を含む）を使用して作成した。固有枝長（図4）の導出には、caperパッケージ101のpd.calcという関数を使用しました。ファミリーレベルの存在量を中立的なコミュニティモデルに当てはめるには、MicEco R library (https://github.com/Russel88/MicEco) の neutral.fit 関数を使用しました。
ユニークな生物材料の入手
乳児の糞便サンプルの第三者への提供は、COPSAC2010コホートへの登録時に両親から付与された同意の一部ではありません。また、このようなアクセスは、未成年のヒト研究参加者の権利を保護するためのデンマークまたはEUの規制に準拠するものではない。ただし、COPSACとの科学的共同研究契約の一環として資料を入手することは可能であり、その場合の問い合わせは、COPSACデータ保護責任者のUlrik Ralkiaer, PhD (administration@dbac.dk)に送ることができる。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご確認いただけます。
データの入手方法
すべてのウイルスのゲノム配列、分類学、宿主予測、VOGは、FigShareリポジトリ（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21102805）だけでなく、図1のオンライン版（http://copsac.com/earlyvir/f1y/fig1.svg）からも入手できます。非ウイルス配列クラスターを含むベンチマークデータも、上記のほか、http://copsac.com/earlyvir/f1y/benchmark.tsv から入手できます。シーケンスFASTQファイルは、プロジェクト番号PRJEB46943を使用して、European Nucleotide Archive (ebi.ac.uk)からアクセスすることができます。参照ファージはmillardlab.orgのINPHAREDデータベースから入手しました。Reference Bacterial cpn60の配列はcpndb.caから入手した。
コードの入手方法
データ解析は、Online Methodsに明記されているように、フリーでオープンソースのソフトウェアを使用して実施しました。また、カスタムコードも使用し、GitHub (https://github.com/shiraz-shah/VFCs) で公開されています。
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謝辞
COPSAC2010コホート研究の子どもたちとご家族の皆様のご支援とご協力に深く感謝いたします。また、COPSAC研究チームのユニークな努力に感謝する。本研究は、Joint Programming Initiative 'Healthy Diet for a Healthy Life'、特にここでは、デンマーク科学高等教育庁、国立農業・栄養・環境研究所（INRAE）、カナダ保健研究所（腸内微生物学に関するチーム助成、栄養・代謝・糖尿病研究所、助成番号143924）により支援されています。M.B.D.は、Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (259257) とSentinel Northから大学院奨学金を受け、カナダアレルギー喘息免疫学財団からGoran-Enhorning Graduate Student Research Awardを受賞している。J.T.は、ノボノルディスク財団（助成番号：NNF18SA0034956）の助成を受け、コペンハーゲン大学保健医療科学部のBRIDGE Translational Excellence Program（bridge.ku.dk）により支援を受けています。S.M.は、Tier 1 Canada Research Chair in Bacteriophages (950-232136)を取得しています。S.A.S.はノボノルディスク財団の基礎生物科学におけるプロジェクト助成金（NNF18OC0052965）の受給者であり、M.A.R.、J.S.、D.S.N.とともにノボノルディスク財団助成金NNF20OC0061029の受給者となります。
著者情報
著者ノート
これらの著者は均等に貢献した： Shiraz A. Shah, Ling Deng.
故人：ハンス・ビスゴー（Hans Bisgaard）。
著者と所属
デンマーク、ヘレフ・ゲントフテ、コペンハーゲン大学病院、小児喘息に関するコペンハーゲン・プロスペクティブ・スタディーズ（Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood
Shiraz A. Shah, Jonathan Thorsen, Leon E. Jessen, Mathis Hjelmsø, Morten A. Rasmussen, Tamsin A. Redgwell, Cristina Leal Rodríguez, Bo Chawes, Klaus Bønnelykke, Hans Bisgaard & Jakob Stokholm
デンマーク、コペンハーゲン、コペンハーゲン大学、食品科学科
Ling Deng, Josué L. Castro-Mejía, Ronalds Silins, Fie O. Romme, Morten A. Rasmussen, Yichang Zhang, Jakob Stokholm & Dennis S. Nielsen.
ノボノルディスク財団基礎代謝研究センター、コペンハーゲン大学健康医学部、コペンハーゲン、デンマーク
ジョナサン・トールセン
デンマーク工科大学健康技術学部（デンマーク、リングビー
アンダース・G・ペデルセン、レオン・E・ジェセン、ギスル・ヴェステルゴール
カナダ、ケベック州、ケベックシティ、ラヴァル大学、生物化学・微生物学・バイオインフォマティク研究室
モイラ・B・ディオン＆シルヴァン・モイノー
カナダ、ケベック州、ケベックシティ、ラヴァル大学、歯科医学部、頬の生態学研究グループ
モイラ・B・ディオン＆シルヴァン・モイノー
パリ・サクレー大学、INRAE、アグロパリステック、ミカリス研究所、フランス、ジュイ＝アン＝ジョザス
ロマン・ソセ＆マリー・アグネス・プティ
微生物研究室フランス・クレルモンオーヴェルニュ大学ジェノーム・エ・エンバイロメント研究所
エリック・オロ・ンデラ＆フランソワ・エノー
デンマーク、コペンハーゲン、コペンハーゲン大学、生物学教室
セーレン・J・セーレンセン
カナダ、ケベック州、ケベックシティ、ラヴァル大学、フェリックス・デレル・レファレンス・センター（Félix d'Hérelle Reference Center for Bacterial Viruses
シルヴァン・モワノー（Sylvain Moineau
貢献度
S.A.S.はすべてのバイオインフォマティクス解析を行い、図1、オンラインリソースを準備し、原稿を執筆した。L.D.はビロームの抽出とシークエンスライブラリーの調製を行った。J.T.は、Fig.2-4の作成、統計処理、原稿執筆のアシストを行った。A.G.P.は、APSツリーを必要な分類レベルで切断するコードを作成した。M.B.D.とT.A.R.は細菌宿主の予測を行った。J.L.C.-M.とG.V.は、バイオインフォマティクスを支援した。R. Saussetはウイルスカウントを行った。R. SilinsとF.O.R.は、ビロームの抽出とシークエンスライブラリーの作成をサポートした。E.O.N.とF.E.は、マイクロウイルスの分類法を相互参照した。M.H., C.L.-R., M.A.R., Y.Z., B.C., K.B., S.J.S. および F.E. は執筆を手伝った。H.B.、J.S.、S.M.、M.-A.P.、D.S.N.は研究の構想、データの解釈、執筆を手伝った。すべての著者が原稿を読み、修正し、承認した。
対応する著者
Shiraz A. ShahまたはDennis S. Nielsenに対応する。
倫理に関する宣言
競合する利益
S.A.S.は、profluent.bioのコンサルタントとして、本研究とは関係のない事柄について活動しています。D.S.N.は、本研究とは関係のない科学的な事柄について、Pfizer社およびSniprbiome社のコンサルタントとして機能したことがある。残りのすべての著者は、利益相反がないことを宣言している。
査読
ピアレビュー情報
Nature Microbiologyは、本作品の査読に貢献した匿名査読者に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
拡張データ図1
除染とキュレーション手順の概要。
Extended Data 図2 Ingridviridaeファミリーに属するvOTUのクリック可能な遺伝子マップ。
残りの247科の同様のマップとともに、http://copsac.com/earlyvir/f1y/families/Ingridviridae.svg でオンライン公開されている（http://copsac.com/earlyvir/f1y/fig1.svg を参照）。ボツリヌス菌の間の小さな縦方向の隙間は属の境界を、大きな隙間は亜科の境界を表す。ボツリヌス菌の順序はAPSツリーの順序に従っており、したがって、関連するボツリヌス菌は互いに隣接している。ORFは鎖の長さに基づいて縦に並び、VOGの所属によって色分けされている。各ORFをクリックすると、PhROGsデータベース87に対するVOGの定義が検索できる。ORFの遺伝子産物（GP）番号は、マウスオーバーで表示される。各VOTUのGenBankファイルは、OTU名をクリックすると、ウイルスと宿主の分類とともに見ることができる。CaudoviralのマップはTerL遺伝子の座標に合わせて反転・ゼロ化されているが、GenBankファイルはそうなっていない。同じファミリーに属する参照ファージもマップに含まれ、GenBankアクセッション番号で表示されている。
Extended Data Fig. 3 アセンブリからキュレーションされたvOTUの数まで。
アセンブル、種レベルの重複排除、手作業による除染の結果、ほとんどの配列クラスターは非ウイルス性でサイズが小さいと推測された一方、ウイルス性OTUは非常に少ないが長い（A）。マッピング後、vOTUはリードの約半分を占めた（B）。97%のリードはもともと「ダークマター」であったが、解決後は7%しか残らなかった（C）。10,021個のvOTUは、5つのウイルスクラス（caudovirus [dsDNA], microviruses [ssDNA], anellovirus [ssDNA], inovirus [ssDNA] and adenovirus [dsDNA] ）に分類されていた。マップされたリード（D）、リード数をシーケンスの深さとゲノムサイズで正規化した後のMRA（E）、種の豊かさ、つまりvOTUの数（F）によるウイルスクラスの分布が示されている。G)Fと同じだが、ウイルスオーダーレベルで、オーダーの色分けは図2と同じ。
Extended Data 図4 データ内のvOTUs非ウイルス配列クラスターの特徴。
汚染された非ウイルス配列クラスターとキュレーションされたvOTUのサイズ、MRA、サンプル有病率の分布をそれぞれ示す。vOTUのサイズ分布は、データセットに含まれる3つの主要なウイルスクラス、すなわちアネロウイルス、マイクロウイルス、カウドウイルスのゲノム長（3 kb、5.5 kb、40 kb）に対応するピークを示す。汚染物質のサイズ分布は、コンティグ包含カットオフ（1 kb）をピークに、長い均一な尾を引き、汚染DNAに予想される非特異的な起源と一致する。キュレーションされたvOTUは、汚染された種よりも多く存在し、広まっていた。汚染された配列の大部分はサンプル固有であり、複数のサンプルで見つかったキュレーションされたvOTUの大部分とは対照的であった。後者は、細菌ゲノム空間の不特定多数のサブサンプリングではサンプル間の重複が生じにくいため、細菌の染色体由来と一致する。
Extended Data Fig. 5 細菌汚染の割合を推定するための3つのアプローチの比較。
各グラフには647個のドットがあり、各サンプルに1つずつ配置されている。軸は、指定された方法によって推定された細菌汚染の割合を示している。各グラフは、2つの異なる方法のペアワイズ比較である。A) 非ウイルス配列クラスターへのマッピング vs ViromeQC B) 非ウイルス配列クラスターへのマッピング vs メタゲノム中核遺伝子枯渇 C) メタゲノム中核遺伝子枯渇 vs ViromeQC. スピアマンの相関係数(ρ)は、3つの比較すべてについて示されている。
Extended Data 図6 ウイルスファミリーの種の豊富さは、有病率および存在量に関連している。
ファミリー内の種の豊富さは、その有病率（A）およびサンプル間のMRA（B）の両方と高い相関があり、ここではスピアマンの相関検定（両側P値）で示されています。MRAは、図3ですでに示したように、有病率と相関がある。3つの測定値の相関は、中立的なコミュニティモデルによる予測と一致する。MRA、平均相対存在度。
Extended Data Fig. 7 ビロームのファージとメタゲノムの宿主細菌のサンプル間共存在量（Sample-to-Sample coabundance）。
メタゲノムにおける宿主細菌の相対的な属の存在量と、ビロームにおいてそれらの宿主属に感染すると予測されるファージの相対的な存在量の総和の相関を、すべての子供で比較した。A) ファージ-宿主ペア間の有意な相関がすべて正であったことを示すボルケーノプロット（ρ > 0; n = 87属、スピアマンの相関検定、両側P値）。B) これらの相関値の分布はゼロより有意に高く（一標本ウィルコクソン検定、両側P = 2.4-10-12, n = 87, 右側）、一方、ランダムにマッチしないファージホストペアはゼロを中心とする（左側）。C)これらの相関はファージライフスタイルに関係なく正であり（両側P値による1標本ウィルコクソン検定）、D)テストしたすべての属の組み合わせの背景で際立っていた（パネルBに示した同じデータ、斜めはマッチしたファージホスト対、斜め外はマッチしなかった対）。ボックスプロットは、中央値、中央線、下限および上限四分位数、ボックスの上下にある四分位数1.5倍以内の最も極端なオブザベーション、ウィスカーを示す。個々のデータ点はすべて箱ひげ図に重ねて表示されている。
Extended Data Fig. 8 ウイルスライフスタイルに関係なく、ファージと宿主の平均的な共存在量。
メタゲノム中の宿主属の存在量と、ビローム中のそれらの属に感染する全ファージの存在量との対応（ウイルスのライフスタイル、すなわち温帯ファージ（A）と強毒ファージ（B）で層別した場合）。病原性ファージと温帯性ファージのMRAは、いずれも宿主のMRAと正の相関がある。MRAは、平均相対存在量（mean relative abundance）。相関関係は、スピアマンの順位検定（両側P値）を用いて検定した。
Extended Data Fig. 9 sMDA増幅ビロームはdsDNAファージに対して定量的である。
32のコリファージ65について実験的に決定されたPFU/gと、対応する32のサンプルからマッピングされたビロームおよびメタゲノムreads per kilobase per million (RPKM)との関係。2つのパネルは、それぞれ温帯性コリファージと強毒性コリファージのデータを示している。軸は、ダイナミックレンジを把握するために対数変換された。対数変換後に線形モデルをフィットさせた。温帯性コリファージは、おそらくリードマッピングが誘導されたファージDNAと細菌の染色体DNAの間で共有されていたため、関連する傾向が見られただけであったと思われる。しかし、病原性コリファージでは、PFU数の範囲（270から1.6Mまで）において定量的な関係が見られた。sMDAで増幅されたビロームは、同じサンプルの未増幅メタゲノムに劣らず定量的である。同一サンプルのペアビローム/メタゲノムが破線で結ばれている。回帰直線は線形モデルで描かれ、斜線部は回帰直線の95%信頼帯を表す。P値はスピアマンの順位相関検定に対応し、両側であり、多重比較のための調整はしていない。
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Shah, S.A., Deng, L., Thorsen, J. et al. Expanding known viral diversity in the healthy infant gut. Nat Microbiol 8, 986-998 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01345-7
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2022年6月10日受理
2023年2月17日受理
2023年4月10日発行
発行日2023年5月
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