抗生物質投与後の腸粘膜マイクロバイオーム再構成はプロバイオティクスによって損なわれ、自家FMTによって改善される

2022年11月21日 15:25

抗生物質投与後の腸粘膜マイクロバイオーム再構成はプロバイオティクスによって損なわれ、自家FMTによって改善される
ジョサム・スエズ 11
ニブ・ズモラ 11
ギリ・ジルベルマン＝シャピラ 11
ザミール・ハルパーン 12
Eran Segal 12
Eran Elinav 12, 13
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脚注を表示するオープンアーカイブDOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.08.047
PlumX メトリクス

ハイライト

マウス腸管粘膜のプロバイオティクスコロニー化は、抗生物質によって軽度に促進されるのみである

ヒトの腸管粘膜のプロバイオティクスのコロニー形成は、抗生物質によって著しく促進される。

抗生物質投与後、プロバイオティクスは腸内細菌叢とトランスクリプトームの再構成を遅らせる。

一方、aFMTは粘膜のマイクロバイオームと腸内トランスクリプトームの再構成を回復させる
まとめ
プロバイオティクスは、抗生物質投与に伴う腸内細菌叢の異常とそれに伴う副作用を予防するために広く処方されている。しかし、抗生物質投与後の腸管粘膜の宿主マイクロバイオームニッチの再構成に対するプロバイオティクスの影響については、まだ不明である。我々は、多系統プロバイオティクスまたは自家糞便マイクロバイオーム移植（aFMT）が、マウスおよびヒトの粘膜マイクロバイオームニッチの抗生物質投与後の再構成に及ぼす影響を侵襲的に検討した。ホメオスタシスとは逆に、抗生物質による撹乱は、ヒト粘膜におけるプロバイオティクスのコロニー形成を促進したが、マウスではコロニー形成をわずかに改善しただけであった。抗生物質投与後の自然回復と比較して、プロバイオティクスは顕著に遅延し、持続的に不完全な常在便/粘膜マイクロバイオームの再構成と恒常性構成への宿主転写産物の回復を誘導したが、aFMTは投与後数日で迅速かつほぼ完全な回復を誘導した。In vitroでは、乳酸菌が分泌する可溶性因子がプロバイオティクスによるマイクロバイオームの抑制に寄与していた。抗生物質投与後のプロバイオティクスの効果は、腸管粘膜の回復の阻害によって相殺される可能性があり、抗生物質投与後の宿主におけるマイクロバイオームの再コロニー化を阻害せずに粘膜保護を達成するaFMTまたは個別化プロバイオティクス法の開発の必要性が浮き彫りにされた。
図表の説明
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キーワード
プロバイオティクス
抗生物質
マイクロバイオーム
はじめに
抗生物質は、医学と生命を脅かす一般的な細菌感染症との闘いを一変させた（Van Boeckel et al.）しかし、抗生物質の広範な曝露は、耐性株の出現と、様々な消化管（GI）効果、過敏症、および薬剤特異的な副作用と関連しており、最も顕著なのは、治療したヒトの5％〜35％における抗生物質関連下痢（AAD）である（Wiströmら、2001年、McFarland、1998年）。非選択的抗生物質が誘発する常在微生物群集構造の破壊（「ディスバイオーシス」）は、全AAD症例の最大20％を占める（Bartlett, 2002）。このようなディスバイオーシスは数日以内に急速に発生し、マウスおよびヒトにおいて細菌代謝の変化および宿主プロテオームの障害をもたらす（Ferrer et al.、2014、Lichtman et al.、2016）。抗生物質治療からのヒトのマイクロバイオーム再構成は、しばしば遅く、不完全であり（Dethlefsenら、2008、Dethlefsen and Relman、2011、Jernbergら、2007）、場合によっては、ナイーブ構成に戻るのに数年かかることもある（Lankelmaら、2017）。注目すべきは、齧歯類モデル及びヒトにおける研究が、特に人生の初期段階における抗生物質曝露と、肥満（Shao et al., 2017）、アレルギー（Risnes et al., 2011, Hoskin-Parr et al., 2013）、自己免疫のリスク増加（Arvonen et al., 2015）及び炎症性腸疾患（Virta et al., 2012, Kronman et al., 2012）などの様々な長期障害（Vangay et al.）
プロバイオティクスは、マウス（Ekmekciuら、2017）およびすべてではないが一部の（Hempelら、2012）ヒト研究（Olekら、2017、Allenら、2013）において、抗生物質誘発性ディスバイオシスおよび関連副作用に対する有効な予防治療法を構成すると提案されてきた。重要なのは、プロバイオティクス摂取に伴う副作用が臨床試験で十分に報告されていない可能性があり（Bafeta et al.、2018）、有効性の議論をさらに複雑にしていることである。抗生物質使用後のプロバイオティクス腸粘膜コロニー化の程度とパターン、および常在腸内細菌叢への影響も依然として不明である。小規模な培養ベースの研究では、抗生物質で乱されたGI粘膜における補充されたプロバイオティクスの定量化を試みたものは少ないが（Klarinら、2005）、大半の研究は、便サンプルから結論を推定しており、その結果、抗生物質使用前のマイクロバイオーム構成を復元するプロバイオティクス能力に関する結論は出ていない（McFarland、2014年）。重要なことは、抗生物質治療後のヒト粘膜のプロバイオティクスコロニー化のグローバルな範囲と、常在粘膜マイクロバイオームや宿主の腸内トランスクリプトームの再構成への影響を直接調べたin vivo研究はないことである。
ここでは、抗生物質曝露後のプロバイオティクス摂取が、マウスとヒトの腸管内腔、粘膜、糞便のマイクロバイオーム組成と機能、およびGIトランスクリプトームに与える影響について検討した。この目的のために、マウスとヒトボランティアのコホートは、広域スペクトル抗生物質で処理された後、プロバイオティクスを補充するか、自家糞便マイクロバイオーム移植（aFMT）を受けるか、時間の経過とともに自然回復させるかのいずれかとした。その結果、抗生物質投与後のプロバイオティクスによる腸管粘膜のコロニー形成に関して、マウスとヒトの間に大きな違いがあることが判明した。マウスは、「ヒト適合性」プロバイオティクスレジメンを抗生物質で処理した場合、恒常性条件と比較してコロニー形成がわずかに改善されただけであったが、ヒトはこの設定でコロニー形成が顕著に改善されることが示された。重要なことは、抗生物質投与後のプロバイオティクス補給は、自然回復またはaFMTと比較して、糞便および粘膜常在菌の再構成の程度（マウスおよびヒト）および腸内トランスクリプトームの恒常的構成への復帰（ヒト）を有意に遅らせることであった。一方、マウスとヒトの抗生物質投与後のaFMTでは、迅速かつほぼ完全な腸粘膜マイクロバイオームの再コロニー化が達成され、ヒトの腸内トランスクリプトームも抗生物質投与前の状態に戻された。
実験結果
マウスの実験セットアップ
恒常的な条件下（Zmoraら、2018）で、多菌種プロバイオティクス製剤の投与は、マウスでは限られたコロニー化、ヒトでは人特異的な腸粘膜コロニー化抵抗性と関連した。aFMTやwatchful waitingと比較して、プロバイオティクスの抗生物質投与後の粘膜コロニー形成能と粘膜常在微生物への影響を調べるために、マウスとヒトでMUcosal Search for Probiotic Impact and Colonization 3（MUSPIC3）試験を実施しました。マウスでは、野生型（WT）C57BL/6成熟雄マウスの飲料水に、ciprofloxacinとメトロニダゾールの広域抗生物質レジメンを2週間補充した。腸粘膜マイクロバイオーム構成に対する抗生物質治療の直接的な影響は、2週間の抗生物質曝露後に犠牲にしたマウスの1つのグループで評価した（図1A、「抗生物質」）。残りの動物（n = 30）は、3つの抗生物質介入後の群に分けられた。第1の群（「Probiotics」）では、抗生物質処置の後に、複数の方法によって組成および生存率が検証された11株を含む市販のプロバイオティクス製品を経口ガベージによって毎日4週間投与した（Zmoraら、2018年）。ラクトバチルス・アシドフィルス（LAC）、L. カゼイ（LCA）、L. カゼイ・スブスプ・パラカゼイ（LPA）、L. プランタラム（LPL）、L. ラムノサス（LRH）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（BLO）、B. bifidum（BBI）、B. breve（BBR）、B. longum sbsp. infantis（BIN）、Lactococcus lactis（LLA）、及びStreptococcus thermophilus（STH）である。第2グループ（「aFMT」）の各マウスは、抗生物質投与中止の翌日に、抗生物質投与前の便のマイクロバイオームを経口投与された。第3のグループ（「Spontaneous」）は、抗生物質治療後も無処置のままとし、この環境における腸内常在菌の自然回復を評価した。もう1つのマウス群（「Control」）は、抗生物質やその他の治療を受けず、研究期間中ずっと追跡調査を行った。
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図1 抗生物質投与後のマウス消化管におけるプロバイオティクスのコロニー形成
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抗生物質投与はマウスのプロバイオティクス腸管粘膜コロニー形成をマイルドに促進する
我々はまず、マウスに広域抗生物質を投与した後のプロバイオティクスの糞便および粘膜コロニー形成を評価した。16S rDNAにより、プロバイオティクスミックスを構成する4属のうち3属（Lactobacillus、Bifidobacterium、Streptococcus）が抗生物質投与前でも便サンプルに存在していることがわかった（図S1A-S1C）。プロバイオティクス投与1日後、Lactobacillus属（図S1A）、Bifidobacterium属（図S1B）、Lactococcus属（図S1D）の相対存在量（RA）は増加した。4日目にはBifidobacteriumのRAだけが上昇したままとなり、その後はどの属のRAも処理群で有意に上昇しなかった（図S1A-S1D）。16S rDNA分析が種レベルでの絶対的な存在量変化を区別できないことを考慮し、試験した11種のプロバイオティクスをそれぞれ標的とする高感度種特異的qPCR（Zmoraら、2018）を利用した。便中のすべての種のプールされたqPCR分析は、プロバイオティクス補給の1日目および4日目にプロバイオティクス種の10,000倍を超える糞便濃縮を示し（図1B）、それは次の日に急速に減少し、それによって統計的有意性が失われたが、その傾向は実験を通して持続した（曲線下の増分面積［iAUC］p < 0.0001 対各群）。種ごとの分析では、11種のうち9種（BBIとLACを除く）が、プロバイオティクス補給中の便で有意に濃縮されることが示された（図1C）。
図1サムネイル図
図S1図1に関連する、マウス消化管における抗生物質投与後のプロバイオティクスコロニー化の動力学
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便と同様に、腸管粘膜表面の16S rDNA評価では、どの領域でもプロバイオティクス属のRAの有意な上昇は検出されなかった（図S1E-S1H）。すべての投与プロバイオティクス種のプールqPCR解析は、下部消化管（LGI）の内腔で有意に高い存在度を示したが、LGI粘膜（図1D）または上部消化管（UGI；図1E）ではなかった。LGI組織および胃の内腔で有意に上昇した菌種は、便中に排出された菌種と一致したが、LGI粘膜ではBBR、LRH、STHのみが有意に上昇した（図1F）。一方、同じ実験デザインで抗生物質を前処理せずにプロバイオティクスを投与したマウスでは、GI内腔のすべての標的のプロバイオティクス負荷量が有意に低下したが、粘膜には認められなかった（図S2A）。これらの結果は、マウスGI内腔におけるプロバイオティクス種の存在に対する耐性は、常在細菌群によってもたらされることを示すものである。この抵抗性は抗生物質によって部分的に緩和されるが、抗生物質の前処理後でさえ、試験したプロバイオティクスは軽度かつ散発的な粘膜の存在を示し、潜在的にマウス腸粘膜におけるこれらのヒト適合性プロバイオティクス種の低いコロニー形成能力を反映していた。
図サムネイル Figs2
図S2 プロバイオティクスの遅延とaFMTによる抗生物質投与後の糞便および消化管マイクロバイオームの再構成（図2関連
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プロバイオティクスの遅延とaFMTによる抗生物質投与後のマウス常在微生物相の再構成の改善
次に、抗生物質投与後のマウス糞便および粘膜の腸内常在微生物群集の再構成に対するプロバイオティクス製剤の影響を明らかにした。予想通り、抗生物質投与により、便のアルファ多様性が劇的に減少し（66%以上減少；図2A）、ベースラインとの非加重UniFrac距離によって明らかなように、便中細菌群集構造の全般的な崩壊が生じた（図2B）。抗生物質投与後の3つの介入のうち、aFMTは糞便中の細菌の豊富さを対照区で観察されるように回復させるのに最も効率的であり、α多様性はaFMT後8日以内に対照区と区別がつかなくなった（p＝0.11）。一方、プロバイオティクスと自然回復の両方は、抗生物質投与停止から4週間後に糞便のα多様性をベースラインレベルまで回復させることはできなかった。重要なことは、プロバイオティクスは、自然回復と比較して、ベースラインのマイクロバイオームの豊かさへの復帰を著しく遅らせることが、試験したすべての時点において明らかであった（図2A）。
図のサムネイル gr2
図2プロバイオティクスによる遅延とaFMTによる抗生物質投与後のマウス腸内細菌叢の再構築の促進
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プロバイオティクスによるマイクロバイオームの再構成の遅れは、UniFrac距離で表される抗生物質投与前のベースライン糞便組成への回帰の速度にも反映されていた。予想通り、すべての治療群は、抗生物質投与によりベースラインの便組成から劇的に変化した。aFMTは抗生物質投与後28日目までにベースラインに戻ったが（p = 0.83、図2B）、プロバイオティクス投与群と自然回復群はいずれも抗生物質投与停止後4週間以内にベースラインに完全に戻ることができず、プロバイオティクス投与群のマイクロバイオームが最も遅い回復速度であった（p = 0.0001）。プロバイオティクス投与群でベースラインまでの距離が長いのは、単にマイクロバイオームに新たに外来菌が導入された結果かもしれない。そこで、プロバイオティクス4属を解析から外し、RAを1に正規化してから測定を繰り返したところ、プロバイオティクス投与群でベースラインまでの距離が長く、この群では粘膜固有マイクロバイオームの再構築が損なわれたことが確認できた（図S2B）。フォローアップ最終日とベースラインの糞便微生物組成を一対一で比較したところ、プロバイオティクス群では28の分類群の発現が有意に異なり（図S2C）、Blautia属の発現が10倍以上増加し、プロバイオティクス属はいずれも有意な増加がなかった。自然回復（16分類群；図S2D）およびaFMT（6分類群；図S2E）群では、有意差はほとんど見られなかった。抗生物質によって有意に減少したすべての分類群のうち、4つの系統に属する13の分類群は、aFMT群と自然回復群の両方でベースラインレベルに戻ったが、プロバイオティクス群では変わらなかった（図2C）。一方、プロバイオティクス群の便サンプルでは、5つの分類群が過剰発現し、α多様性と有意な逆相関を示した。Akkermansia、Vagococcus、Enterococcus、Blautia、Lactococcusである。これらのうち、Blautiaだけは、抗生物質投与中止後、プロバイオティクス群のみで開花した（図2D）。興味深いことに、プロバイオティクス投与マウスと自然回復マウスのケーカには巨視的な違いが認められ、前者は大きく（図S2Fの代表）、有意に重く（図S2G）、無菌マウスや広域抗生物質を投与したマウスを彷彿とさせるものだった。
便中の所見と一致して、プロバイオティクス群の観察種数は、LGI（図2E）およびUGI（図2F）の内腔および粘膜の両方で、抗生物質2週間投与直後に解剖した群と同等で、対照群、aFMT群、自然回復群と比較して有意に少なかった。aFMT群とコントロール群ではいずれの領域でも有意差は認められなかったが、自然回復群ではaFMTとプロバイオティクス群の中間の豊かさを示した（図2E、図2F）。プロバイオティクス群のLGIにおけるα多様性の減少は、少なくとも部分的にはLGI細菌量の総量減少に起因していた（図2G）。これと一致して、粘膜および管腔内のaFMTマイクロバイオーム構成の制御に対するUniFrac距離は、自然回復群のそれよりも低く、制御に対する最大の距離はプロバイオティクス投与群によって特徴付けられた（図2H-2IおよびS2H）。便の場合と同様に、プロバイオティクス投与マウスにおけるこれらのコロニー形成の違いは、プロバイオティクス属を解析から除外しても結果が変わらないことから、プロバイオティクス属の存在だけでは説明できない（図S2IおよびS2J）。興味深いことに、aFMT投与マウスのマイクロバイオーム組成は、LGIおよびUGIの両方でコントロールと区別がつかず、糞便マイクロバイオームが明確なUGIマイクロバイオームを再現するのに十分であることが示唆された（図S2H）。抗生物質投与群のLGI粘膜で対照群と比較して有意に減少した分類群のうち、16種がaFMT群と自然回復群の両方で対照レベルに戻ったが、プロバイオティクス群では戻らなかった。そのうち11種がClostridiales目に属し、2属（BlautiaとStreptococcus）はプロバイオティクス群でのみ有意に開花した（図2J）。プロバイオティクス群に優占する4つの分類群は、LGI粘膜のα多様性と高い（Spearman r < -0.6）かつ有意な（p < 0.0001）逆相関を示した： Vagococcus, Akkermansia muciniphila, Blautia producta, Enterococcus casseliflavus (Figure S2K)．これらのブルーミング分類群は、プロバイオティクスによって誘発されるマイクロバイオーム再構成の阻害に関与している可能性がある。
プロバイオティクス投与後の恒常的な常在細菌群構成への復帰の遅れは、研究対象の動物飼育室に限ったことではないことを確認するため、ベースラインの糞便微生物群（26分類群）が異なる別の特定病原体フリー（SPF）動物飼育施設で、同じ一連の介入を行った（図S3A）。この動物園でも、aFMTは、注意深く待つことと比較して、抗生物質による再構成後に迅速な常在微生物群を誘導したが、11株のプロバイオティクス処理は、再コロニー化プロセスの速度と規模を遅らせた（図S3B〜S3K）。
図サムネイルfigs3
図S3図2に関連する、別の生体実験室における検証用マウスコホート
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広範な抗生物質による4週間の自然回復により、腸管粘膜の形態と細菌の豊富さおよび量がベースラインに部分的に回復した。プロバイオティクスの摂取は、抗生物質投与後のマイクロバイオーム構成をほとんど改善せず、抗生物質投与前の腸粘膜マイクロバイオームの恒常的な構成と豊富さの回復を遅らせることが示されたが、静観は、固有マイクロバイオームの再構成を誘導する割合において優れていた。その結果、aFMTは、抗生物質投与後の上部および下部腸管粘膜マイクロバイオームを速やかに恒常的な状態に回復させることができ、静観およびプロバイオティクス投与と比較して、最も効率的な治療方法であることがわかった。
ヒトの実験デザイン
次に、11株プロバイオティクスまたはaFMTが、抗生物質投与後のヒトの管腔および粘膜関連マイクロバイオームの再構成にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることを目的とした。この目的のために、我々は、プロバイオティクスを摂取していない21人の健康なヒトボランティア（表S1およびSTAR Methods）を対象に、7日間、シプロフロキサシンとメトロニダゾールを標準用量で経口広域抗生物質治療を行った前向き縦断介入試験を実施した（図3A）。抗生物質治療後、7名の参加者は自然なマイクロバイオーム再構成を見守る経過観察、6名の参加者はaFMT（STAR Methods）、8名の参加者は前述の11株プロバイオティクス製剤を4週間にわたり隔日投与された（図3A）。内視鏡検査は、21名の参加者にそれぞれ2回ずつ実施した。1回目の大腸内視鏡検査と深部内視鏡検査は、1週間の抗生物質投与終了後に実施され、これにより、抗生物質投与後の消化管全体のディスバイオーシスを特徴付けることができた。3週間後（21日目）に2回目の大腸内視鏡検査と深部内視鏡検査を行い、3つの治療群それぞれの腸管粘膜と管腔の回復の程度を評価した（図3A）。図3Aに示した間隔で、抗生物質中止から6ヶ月まで、複数の便サンプルを採取した。合計で、337の管腔サンプル、702の粘膜サンプル、および557の便サンプル、ならびに362の局所生検が採取された。
図サムネイルgr3
図3抗生物質治療後のヒト消化管におけるプロバイオティクスのコロニー形成
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抗生物質投与後のヒトのプロバイオティクスは便中に継続的に排出され、LGI粘膜に定着する。
予想通り、ヒトの抗生物質投与は、便（図S4CおよびS4D）、LGI粘膜（図S4EおよびS4F）、UGI粘膜（図S4G）で観察されるように、糞便微生物の枯渇（図S4A）および微生物群集組成の崩壊（図S4B）を引き起こしたが、後者は最も抗生物質の影響を受けていない（図S4H）。組成の変化は、ショットガン・メタゲノム配列決定によって評価された便およびLGIにおけるマイクロバイオーム機能の変化を伴っていた（図S4I〜S4K）。
図サムネイル Figs4
図S4抗生物質が媒介するヒト腸内細菌叢の組成および機能の変化（図3関連
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糞便16S rDNA解析により、プロバイオティクス補給前の便にはすべてのプロバイオティクス関連属が存在し、抗生物質投与後のRAではラクトバチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスが有意に拡大していることが示された。4種のプロバイオティクス属はすべて、プロバイオティクス補給中もベースラインと比較して有意に上昇したが、いずれも抗生物質投与後のレベルまで上昇することはなかった。プロバイオティクス治療の中止後は、どの属もベースラインと比較して有意な上昇を示さなかった（図S5A-S5D）。
サムネイル図5
図S5図3に関連する、抗生物質治療を受けたヒトにおけるプロバイオティクスコロニー化の時空間的解析
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糞便の種レベルのメタゲノム解析（MetaPhlAn2）でも、11種のうち6種（BBI、BBR、BLO、LAC、LLA、STH；図S5E）のRAでベースラインと比較して抗生物質による拡大を示した。一方プロバイオティクス治療中は、すべての種がベースラインと比較して拡大したが、この方法ではBBIとBLOのみが統計的有意性を示した（図S5E）。ショットガン・メタゲノムシークエンス株特異的手法（Sharon et al., 2013）により、ベースライン1日の便でプロバイオティクス株1種、抗生物質投与中にプロバイオティクス株2種（ベースラインで現れた株とは異なる）、プロバイオティクス曝露中に複数日で錠剤特異的株6種（BBI、BBR、BLO、LLA、LPL、LRH）が同定された。BBI、BLO、BBRは、同じ参加者が中止した後にも排出された（図3B）。
最も感度の高い方法である糞便種特異的qPCRにより、プロバイオティクス投与中の糞便は、11種のプロバイオティクス種を合わせて考えると有意に拡大し、摂取中に個別に分析すると11種のうち7種がベースラインから有意に上昇した（BBR、BIN、LAC、LCA、LLA、LPL、LRH；図3C）。このプロバイオティクス種の拡大は、aFMTと自然回復の両方と比較して有意であった（図3DおよびS5F）。プロバイオティクス中止から5ヶ月後でも、プロバイオティクス補給群の便には、ベースラインと比較して、いくつかのプロバイオティクス種が増加したままであった（図3DおよびS5F）。
上記の便中の継続的な脱落を考慮すると、恒常性維持時に観察されるものと比較して、プロバイオティクス投与後の腸粘膜コロニー形成も促進されると推測した（Zmoraら、2018）。プロバイオティクス投与前および3週間後に採取したGI内腔および粘膜サンプルの16S rDNA分析では、GI内腔（図S5G）または粘膜（図S5H）におけるプロバイオティクス属のRAの有意な増加は見られなかった。MetaPhlAn2解析では、LPAを除くすべてのプロバイオティクス属のRAがベースラインから管腔方向に拡大する傾向を示したが、統計的有意差に達したものはなかった（図S5I）。一方、直腸を除くTIとすべてのLGI領域の粘膜では、プロバイオティクス種のレベルが有意に上昇し、その大部分はBBIとBLOの上昇に起因していた（図S5J）。その結果、抗生物質投与後のプロバイオティクスコロニー化は、プロバイオティクス未投与のグループと比較して改善されていた（p < 0.0001; Figure 3E）。粘膜種特異的qPCRは、胃底部、回腸末端部、上行結腸、横行結腸、S状結腸、および直腸のプロバイオティクスコロニー化が有意であることを示した（図3F）。プロバイオティクス種は、抗生物質自然回復後の上行結腸と横行結腸でも有意に増加したが、aFMT群では有意な増加は観察されなかった（図3F）。平均して、プロバイオティクス添加群では自然回復群に比べて8.7倍（p = 0.0001）、aFMT群に比べて53.9倍（p < 0.0001; 図3G）プロバイオティクス種が拡大していた。
抗生物質を投与された個体が、恒常的な条件下における我々の観察（Zmoraら、2018）と同様に、プロバイオティクスに対する人特有のコロニー形成許容性／耐性を特徴とするかどうかを判断するために、プロバイオティクス補給の初日と最終日の間の、qPCRベースの個人別プロバイオティクス負荷の倍率変化を算出した（図S6A）。4人の参加者において、粘膜プロバイオティクス負荷の有意な100倍超の増加（すべてのターゲットについて集計）が観察された（Wilcoxon p < 0.02）。5人目の参加者は、より軽度ではあるが有意な上昇を示した。さらに3人の参加者は、プロバイオティクスによる粘膜拡張の有意でない傾向を経験した。プロバイオティクス株特異的ショットガンベースの検証解析は、qPCRで観察されたこの個別パターンを反映し、コロニー形成株は補充した錠剤に由来することを示唆した（図S6B）。抗生物質投与後のプロバイオティクスによるコロニー形成におけるこのような明らかな個人差の原因および影響については、より大規模なコホートでのさらなる研究が必要であると思われる。
サムネイル図6
図S6プロバイオティクスの遅延とaFMTによる抗生物質投与後のヒト糞便微生物群のナイーブへの再構成（図3および図4に関連するもの
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抗生物質を投与されたヒトの腸内では、プロバイオティクスに対するコロニー形成抵抗性が逆転し、主に大腸において、試験した外因性投与プロバイオティクス菌株による腸内コロニー形成が増加し、安定したコロニー形成と活発な増殖を示すプロバイオティクス糞便の長期排出につながった。ビフィドバクテリウムに属するプロバイオティクス種は、試験した他のプロバイオティクス種と比較して、より高いレベルでコロニー形成された。
プロバイオティクスは、aFMTが抗生物質投与後のヒト糞便常在菌の再構成を改善する一方で、遅延させる。
次に、抗生物質投与後の3つの治療法が、ヒトの糞便常在菌の再構成にどのように寄与するかを評価した。まず、糞便MetaPhlAn2種を用いた解析により、抗生物質投与中または再構成期間中に採取した便とベースライン便のマイクロバイオーム構成との間のBray-Curtis非類似度指数を算出した（図4Aおよび4B )。特に、ベースラインとの非類似度は、全群で抗生物質治療中に3倍以上となり、抗生物質が便のマイクロバイオーム構成に劇的な影響を与えることを反映していた。aFMT治療者は、ベースライン構成に最も早く戻り、早ければaFMT後1日でベースラインとの便の構成の差は消滅した（図4B）。自然回復群では、ベースラインと比較した便組成の有意差は、抗生物質中止後21日以内に消失した（図4B）。一方、プロバイオティクス摂取者は、介入期間の終了時（28日目）までにベースラインの便のマイクロバイオーム構成に戻らず、プロバイオティクス中止から5か月後でも、180日目まで採取したすべての便サンプルがベースラインと有意に異なるままであり、ディスバイオシスが維持されていた（二元配置分散分析とダンネットp＜0.01；図4Aおよび図4B）。ベースラインからの差に加え、プロバイオティクス摂取者は、再構成の7～28日目まで、自然回復群とも有意に差があった。その結果、プロバイオティクス投与群の再構成曲線下面積は、aFMTおよび自然回復群よりも有意に高かった（図4B）。マウスと同様に、プロバイオティクス種を解析から除外し、RAを再正規化しても結果は変わらず、プロバイオティクス消費者における明確なマイクロバイオーム組成は、プロバイオティクス種の単なる存在では説明できなかった（図S6CおよびS6D）。プロバイオティクス摂取個体における再構成の遅れは、プロバイオティクス属を解析から除外した場合でも、16S-rDNAベースの非加重UniFrac距離（図4Cと4D）でも観察された（図S6EとS6F）。
図サムネイルgr4
図4プロバイオティクスが遅延する一方で、aFMTは抗生物質治療後のヒト糞便マイクロバイオームのベースラインへの再構成を促進させる
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次に、3つのアームにおいて、ベースライン（抗生物質投与前）と再構成終了時で糞便中の存在量が2倍以上異なる種および機能的KEGGオルソログ（KO）を定量した。aFMTではベースラインと終了時で異なる糞便中の種が最も少なく（29種、図S6G）、一方、プロバイオティクスではベースラインと終了時で最も異なる種（96種、図S6H）、自然回復時（51種、図S6I）と比較してほぼ2倍の種が観察された。3つの分類群は、aFMTによって未使用時のレベルに有意に戻ったが、自然回復では戻らなかった（Alistipes shahii、Roseburia intestinalis、およびCoprococcus）。糞便中のKOによって決定されるマイクロバイオーム機能も同じパターンを示した（aFMTで9個、プロバイオティクスで123個、自然回復で17個、それぞれ図S6J〜S6L）。重要なことは、抗生物質投与後、糞便中の観察種の数は半減したが、aFMT群と自然回復群の両方で、それぞれ1日と2日以内に回復したことである（図4E）。一方、プロバイオティクス群では介入期間中、α多様性は有意に低いままベースラインに戻らず（二元配置分散分析、Dunnett p < 0.05; 図4E）、α多様性の再構成曲線はプロバイオティクス停止後5カ月まで、aFMTまたは自然回復と同様に自身のベースラインに比べ低いままであった（図4E）。同様に、糞便細菌量は、aFMTと自然回復の両方と比較して、プロバイオティクス補給の3週間後にベースラインに戻ることができず（図4F）、プロバイオティクス補給を停止してから1カ月後もベースラインより低いままであった。
抗生物質によって糞便中のRAが変化した種のうち、aFMTと自然回復群ではベースラインレベルに戻ったが、プロバイオティクス群では戻らなかった20種が確認された（図4G）。マウスと同様に、プロバイオティクスによって抑制された種の大部分はClostridiales目に属していた。ヒトとマウスのプロバイオティクスによる分類学的変化を比較すると、4つの分類群（Enterococcus、Akkermansia、Bifidobacterium、Blautia）が、両種ともプロバイオティクス補給後に開花した（図4H）。ブルームした分類群のどれがマイクロバイオーム抑制に関与しているかを評価するために、16SおよびMetaPhlAn2ベースの存在量とアルファ多様性の相関を調べた。14属107種がα多様性と有意に逆相関しており、これにはプロバイオティクス種の大部分（LPAとSTHを除く）、さらにマウスLGI粘膜のα多様性と有意に逆相関していたE. casseliflavusとB. productaが含まれていた（図4I、S2Kおよび表S2）。同様に、aFMTと自然回復では抗生物質投与前の状態に戻るが、プロバイオティクスでは戻らない複数のパスウェイを同定した（図4J）。37のKOと60のパスウェイは、その大部分が代謝に関連しており、便中のα多様性と有意な逆相関があった（表S2）。最も高い逆相関があったのはガラクトース代謝で、これは追加のパスウェイとともに、糞便サンプルに咲くプロバイオティクス種による乳酸生成と結果的にマイクロバイオーム阻害に関連している可能性がある（図4K）。
プロバイオティクス種は、抗生物質を投与されたヒトの腸の粘膜に定着する一方で、抗生物質投与前の構成に向けた便のマイクロバイオーム構成、機能、多様性に関連する再構成を遅らせた。この便の再構成の遅れは、プロバイオティクスを中止して5カ月後でも持続した。一方、aFMTは、経過観察群やプロバイオティクス投与群と比較して、迅速かつほぼ完全な糞便微生物群の再構成を誘導した。
プロバイオティクスは、抗生物質投与後のヒト粘膜常在微生物群の再構成を遅らせる
次に、プロバイオティクスとaFMTが便のマイクロバイオーム再構成に及ぼす上記の逆影響が、腸粘膜レベルで証明されるかどうかを評価した。我々は、LGIに注目した。この領域では、プロバイオティクス後、抗生物質が優先的にコロニー形成されるからである（図3G、S5I、S5J）。16S-rDNA (Figures 5A and 5B ) と MetaPhlAn2 (Figures 5C and 5D) に基づく解析の結果、aFMT と自然回復LGIの内腔および粘膜構成は、抗生物質を投与されたナイーブな非抗生物質の構成と比較して有意により似ていることが明らかにされた。一方、プロバイオティクスを投与したLGIは、抗生物質を投与したLGIに近い形状であった（図5A〜5D）。プロバイオティクス群のナイーブ配置からの距離が長いのは、単にプロバイオティクス種の存在を反映しているわけではなく、距離分析からプロバイオティクス属（図S7AおよびS7B）または種（図S7CおよびS7D）を除去しても、前述のパターンが維持されたためであった。KOにおけるマイクロバイオームの機能（図5Eおよび5F）および経路（図S7EおよびS7F）も、プロバイオティクスに関連した粘膜固有LGIマイクロバイオームの回復の遅延を反映した。便と同様に、プロバイオティクス群のLGI粘膜は低いα多様性を示し、これは抗生物質投与直後に観察されたものと同程度であり（図5G）、LGI粘膜細菌量にも反映されていた（図5H）。便と同様に、複数の種（図5I）と微生物経路（図5J）が抗生物質によって変化し、aFMTと自然回復によって恒常的なレベルに戻されたが、プロバイオティクスでは戻されず、阻害された種はすべてClostridialesに属した（図5I）。8属、62種、80KO、26パスウェイはLGI粘膜のα多様性と有意に反相関し、便と粘膜の間で種（69％）、パスウェイ（84％）の高い類似性を示した（表S2）。
図サムネイルgr5
図5プロバイオティクスによる遅延とaFMTによるヒト腸管粘膜および管腔内微生物群の抗生物質投与後のベースラインへの再構成の促進
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図サムネイル Figs7
図S7プロバイオティクスを遅らせながらaFMTを行うと、抗生物質治療後のヒト腸管粘膜および管腔マイクロバイオームのナイーブネスへの再構成が促進される（図5と関連あり
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LGI粘膜における抗生物質投与後のプロバイオティクスのコロニー形成は、便とLGI内腔・粘膜の両方に反映される抗生物質投与後のディスバイオシスの組成的・機能的持続と関連している。このように腸内常在菌が抗生物質投与前の組成と機能に戻るのが遅いことは、マウスでの観察結果（図2、S2、S3）と一致し、宿主種を超えて常在菌と外来プロバイオティクスが相互作用するグローバルなメカニズムが示唆された。
プロバイオティクスによる抗生物質関連GIトランスクリプトーム景観の逆転は、プロバイオティクスによって遅れる
プロバイオティクスとaFMTが粘膜腸内細菌叢の組成と機能の回復に与える影響は、経過観察と比較して差があることから、次に、抗生物質投与後の3つの介入が宿主に与える影響の特徴を明らかにした。この目的のために、抗生物質投与直後と3週間後に胃、十二指腸、空腸、回腸末端、盲腸、下行結腸の生検から採取した転写産物のRNA配列決定によるグローバル遺伝子発現解析を行い、3つの抗生物質投与後の介入を行った（Figure 3A）。注目すべきは、抗生物質がGI管全体の転写ランドスケープに影響を及ぼし、ナイーブな状態と抗生物質の状態との差の大部分が下行結腸で観察されたことである（図6A）。重要なことは、抗生物質投与後の3つの介入群によって抗生物質未投与の宿主の転写ランドスケープが回復したことであり、マイクロバイオームにおける我々の知見を反映していた。すなわち、抗生物質によって顕著な影響を受けたGI管全体の複数の遺伝子が、自然回復とaFMTによって恒常的発現レベルに回復し、プロバイオティクスでは回復しなかった（図6B）。ナイーブな状態（抗生物質に触れていない状態）の転写産物と比較すると、aFMT後の十二指腸のトランスクリプトームは、有意に差のある発現遺伝子が最も少なく（図6C）、次いで自然回復群（図6D）、十二指腸の転写産物はプロバイオティクス群でナイーブ状態とは最も異なる（図6E）ことがわかりました。プロバイオティクス群のジェジュナは、aFMT群または自然回復群のトランスクリプトームと比較して、抗生物質投与後の転写状態との類似性が最も高かった（図6F-6H）。プロバイオティクス群と自然回復群の間で最も多くの有意差が観察されたのは十二指腸で、プロバイオティクス摂取者で発現が低下したインターフェロン誘導タンパク質（IFI）に属する複数の遺伝子が含まれていた（図6I）。興味深いことに、プロバイオティクスは、IL1Bなどの炎症性メディエーターや抗菌ペプチド分泌の調節因子（図6J）、REG3Gなどのいくつかの抗菌ペプチド（図6K）の転写レベルの上昇をもたらし、クロストリジウム属などの常在菌の抑制に寄与する可能性があることが示された。
図サムネイルgr6
図6プロバイオティクスによる遅延とaFMTによるヒト腸管トランスクリプトームの抗生物質投与後の再構成の促進
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プロバイオティクスが分泌する分子は、ヒト微生物群の試験管内増殖を抑制する
最後に、プロバイオティクスを介した直接のメカニズムが、常在細菌の復元を抑制する可能性について検討した。この目的のために、我々は、宿主と接触しない、プロバイオティクスとヒトマイクロバイオームの培養系を利用した。まず、プロバイオティクス錠剤を、プロバイオティクスコンソーシアムを構成する4つの属のそれぞれの増殖を選択的にサポートする5つの濃縮増殖培地で培養した（図7A）。24時間の嫌気培養の後、5つの増殖条件のそれぞれから得た上清を、嫌気条件下で新鮮なナイーブヒト糞便マイクロバイオームのラグフェーズ培養に加えた。8時間後に測定したマイクロバイオーム培養液の光学密度（OD）から、デ・マン、ロゴサ、シャープ培地（MRS）-プロバイオティクス培養上清（主に乳酸菌の増殖をサポートする）中の可溶性因子が、未経験のヒトのマイクロバイオームの増殖を阻害することがわかった（図7B）。この阻害効果は、単にプロバイオティクス細菌による酸生成によるものではなく、プロバイオティクス濾液は、比較的に酸性化した非細菌暴露培地（pH 4；図7C）と相加的な阻害効果を有していたためである。ラクトバチルスが本当にマイクロバイオーム抑制プロバイオティクスであることを裏付けるために、（1）プロバイオティクス錠剤の内容物のMRS嫌気性培養上清、（2）錠剤に含まれる5種のラクトバチルスを混合したMRS嫌気性培養上清、（3）他の二つの培養物で測定したレベルまで酸性化した非培養MRS培地から上清を集めた（pH 4；図 7D）。次に、この3つの上清を、嫌気条件下で未経験のヒト微生物群とともに培養した。重要なことは、酸性化したMRSと比較して、プロバイオティクスと乳酸菌上清の両方で有意な増殖阻害が引き起こされたことであり、分泌された乳酸菌因子が阻害効果を促進していることが示唆された（図7D）。11時間培養後の濾液添加ヒトマイクロバイオーム培養物の16S rDNA解析により、これらの可溶性因子は、観察された種の数を著しく減少させ（図7E）、群集構造を調節した（図7Fおよび7G）ことが示唆された。この結果、PrevotellaおよびClostridialesに属するいくつかの分類群のレベルが低下し（図7H）、in vivoプロバイオティクス投与による我々の観察結果と一致することが示された。
図サムネイル gr7
図7プロバイオティクスに関連する可溶性因子はヒトの糞便微生物相を抑制する
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考察
本研究では、11種類のプロバイオティクス製剤またはaFMTの抗生物質投与後における腸粘膜マイクロバイオーム群集構造への影響をマウスとヒトの両方で検討した。抗生物質投与後の腸粘膜を侵襲的に内視鏡で観察し、投与したプロバイオティクスに対する恒常的な微生物群のコロニー形成抵抗性が、抗生物質投与により少なくとも部分的に克服され、枯渇した腸粘膜層全体へのプロバイオティクスのコロニー形成が、マウスよりもヒトにおいてより向上することを明らかにした。重要なことは、マウスでもヒトでも、抗生物質投与後のプロバイオティクスのコロニー形成が促進される代わりに、常在微生物や宿主粘膜の転写産物の恒常的な構成への再構成が、様子見やaFMTと比較して遅れるというトレードオフがあることを示したことである。一方、aFMTでは、腸粘膜マイクロバイオーム構成と宿主の腸内トランスクリプトームが迅速かつほぼ完全に再構成される。
本研究は、いくつかの重要なポイントを強調している。まず、マウスにおける投与したプロバイオティクスに対するコロニー形成抵抗性、およびヒトにおける投与したプロバイオティクスに対する人特異的コロニー形成抵抗性（Zmoraら、2018）が、土着の腸内マイクロバイオームによって寄与されていることを示す直接的な証拠を示している。比較的均一なマイクロバイオーム構成を特徴とする近交系マウスでは、極端な無菌状態（Zmora et al., 2018）でのマイクロバイオームの欠如により、優先的かつ持続的なプロバイオティクスコロニー化がもたらされ、マウスの腸内環境におけるこれらの投与株に対するコロニー形成抵抗性の主要なドライバーとして、土着マイクロバイオームが指し示されました。マウスの広域スペクトル抗生物質処理によるそれほど極端でないマイクロバイオーム枯渇は、プロバイオティクスのコロニー形成を軽度しか改善しなかったことから、以前の報告（Grazul et al, 2016）と同様に、調べたプロバイオティクス株のヒト適合性、または他の根絶できない微生物要因が、この設定におけるマウスのコロニー形成抵抗性に寄与している可能性が示唆された。対照的に、ヒトは、非常に多様なマイクロバイオーム構成を特徴とし（Yatsunenkoら、2012、Zeeviら、2015）、11のプロバイオティクス株の恒常的コロニー形成の個別化能力を駆動する（Maldonado-Gómezら、2016、Goosensら、2006、Zmoraら、2018）。ヒトに抗生物質を投与した後、ヒトに適合する11種類のプロバイオティクス株を投与すると、顕著な粘膜コロニー形成の促進が見られた。それでも、一部の個体では、プロバイオティクスを中止した後もビフィドバクテリウム株のみが残存し、この観察は、同属のヒト腸管への適応に由来することが以前に示唆されている（Maldonado-Gómezら、2016年）。恒常性維持時に存在し、抗生物質治療中に失われる外来菌に対するコロニー形成耐性を組織化する微生物因子と関連する分子メカニズムを解読することにより、異なる臨床状況においてプロバイオティクス治療の長期的コロニー形成効果を高めるためにこれらのメカニズムを利用することができるかもしれません。
第二に、本研究では、抗生物質による破壊的な条件下でプロバイオティクスによる腸粘膜のコロニー形成を改善すると、組成、機能、細菌量の点で常在の腸粘膜の再構成が著しく遅延し、プロバイオティクス曝露停止後少なくとも5カ月間続くディスバイオシスが生じるという、これまで認識されていなかった重要なトレードオフが浮き彫りになった。本研究は、抗生物質投与後の臨床症状の改善におけるプロバイオティクスの有効性、またはその欠如を評価する目的や検出力はないが、その「代替」効果は、ディスバイオシスの大幅な延長と常在細菌群の再コロニー化の遅れという代償を払い、結果として宿主の腸内転写産物が恒常的な構成へと変化する可能性があることを実証している。このプロバイオティクスによる「副作用」は、抗生物質に関連するディスバイオシスと微生物多様性の低下を、無数の慢性および感染性疾患に対する感受性の増加と関連付ける複数の観察結果に照らして重要かもしれない（Vangayら、2015）。プロバイオティクスによる内因性マイクロバイオームおよび宿主トランスクリプトームの再構成の遅延の期間、範囲、および長期的な健康への影響、そして本研究でテストしなかった他のプロバイオティクスで発生するかどうかについては、さらなる研究が必要である。
このようなプロバイオティクスの効果を考慮すると、プロバイオティクスによって誘発される内在性マイクロバイオームの再構成阻害の要因をさらに解明することが極めて重要であると考えられる。我々のヒト、マウス、およびin vitroのデータを総合すると、いくつかのプロバイオティクス種と、EnterococcusおよびVagococcus、ならびにB. productaおよびActinomyces odontolyticusなどの関連するブルーミング乳酸菌の、常在細菌群に対する拮抗活性、潜在的にそれらの以前に確立した抗菌活性によって媒介されていることを指摘している（Caballeroら、.com、.com、.com、.com、.com）。2017, Franz et al., 2007, Cotter et al., 2013, Franker et al., 1977）が、常在菌の文脈では見落とされていた。そのような因子の遺伝的または薬理学的阻害は、プロバイオティクス後のマイクロバイオームのより良い回復を促進し、それによってプロバイオティクスの使用を補完することができるかもしれません。
第三に、本研究は、抗生物質投与後の腸粘膜マイクロバイオームの「停滞期」を最小限に抑える効果的な手段として、aFMTの潜在的優位性を浮き彫りにした。実際、aFMTは、本来適合するパーソナライズされた便のマイクロバイオーム構成を構成しており、試験したプロバイオティクス製剤や経過観察と比較して、常在細菌のコロニー形成率および宿主腸内転写産物の恒常的構成への復帰が顕著に改善されることと関連していた。このように、aFMTは、抗生物質投与後の重要かつ脆弱な時期に、病原体や病原菌の関与から宿主を迅速に保護することができ、宿主を常在細菌叢の再コロニー化の遅れやその長期的な影響の可能性にさらすことがないと考えられる。注目すべきは、aFMTが様々な臨床コンテキストでますます研究され（Kootteら、2017）、非医療チャンネルおよびバイオバンキング事業体（Smithら、2014、Terveerら、2017）を通じて促進されている一方で、「抗生物質のアジュバント」として広く使用することは、便の長期保存、大規模な錠剤の生産、および患者への迅速な配達が必要となるため、技術的に困難であると予想されることである。科学的に健全なaFMT代替手段は、抗生物質投与後の粘膜保護とコアマイクロバイオーム機能を提供する個別化された生物活性常在プロバイオティクスコンソーシアムの生成を可能にする、人特有の「コア腸粘膜マイクロバイオーム機能」の特性化が必要であるだろう。このような高度に定義され、個人に合わせた方法によって、プロバイオティクス使用の臨床効果と再現性が向上し、無差別なプロバイオティクスのコロニー形成がもたらす潜在的な影響を最小限に抑えることができると期待しています。この「パーソナライズド・プロバイオティクス」アプローチは、さらなる研究の価値がある。
我々の研究には、いくつかの重要な限界がある。我々は、マウスとヒトにおいて、広域スペクトル抗生物質と経口投与されたプロバイオティクス混合物（多様ではあるが）の単一の組み合わせをテストした。他の抗生物質、プロバイオティクスの組み合わせ、治療経路や時期については、さらに研究を進める価値がある。さらに、我々の研究は、この試験の一環として自発的に抗生物質を摂取している健康な成人を対象に行われたものであり、プロバイオティクスに対する臨床反応を評価する目的も検出力も持っていない。結果は、疾患との関連や、マイクロバイオーム構成がまだ安定的に成熟していない小児集団や、他の明確なマイクロバイオームの変化を特徴とする老人集団などの極端な年齢集団では異なる可能性があります。
これらの限界にもかかわらず、我々の研究は、経験的な多菌種プロバイオティクス製剤において、抗生物質に関連する副作用からのプロバイオティクスによる保護がリスクフリーではない可能性があることを実証している。他の治療法と同様に、潜在的に有益な病原体撃退活性（これはまだ証明も反論もされていない）は、常在細菌群の再コロニー化の速度と程度に悪影響を及ぼし、宿主の腸内転写産物がナイーブな構成へと回帰するトレードオフのリスクを伴う可能性がある。これに対して、aFMTや人特異的微生物コンソーシアム（後者は本研究では検証していない）などの新しい戦略は、個々人のマイクロバイオームの独自性を活用し、常在細菌の再構成に悪影響を与えることなく、微生物のコロニー形成を最適化できる可能性があります。このような新しい個別化介入により、抗生物質治療時や他の様々なマイクロバイオーム関連疾患において、より持続的な生菌治療効果を達成できる可能性がある。
STAR★メソッド
主要リソース一覧
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
細菌およびウイルス株
Lactobacillus acidophilus N/A Cat # ATCC 4356
Lactobacillus rhamnosus 臨床分離株 N/A
ラクトバチルス・カゼイ N/A Cat # ATCC 393
ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ N/A Cat # ATCC BAA-52
ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum） N/A Cat # ATCC 8014
ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス N/A Cat # ATCC 15697
ビフィドバクテリウムビフィダム N/A Cat # ATCC 29521
ビフィドバクテリウム・ブレーベ N/A Cat # ATCC 15700
ビフィドバクテリウム・ロンガムサブスピーシーズロングム N/A Cat # ATCC 15707
Lactococcus lactis Bio 25 Supherbから単離された乳酸菌 N/A
Streotococcus thermophilus N/A Cat # ATCC BAA-491
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
Bio 25 Supherb Supherb, Nazareth Ilit, Israel N/A
クリティカルコマーシャルアッセイ
NextSeq 500/550 High Output v2 kit (150 cycles) for Metagenome shotgun sequencing illumina Cat# FC-404-2002
RNA-Seq用NextSeq 500/550 High Output v2 キット（75サイクル） illumina Cat# FC-404-2005
MiSeq Reagent Kit v2 (500サイクル) illumina Cat# MS-102-2003
RNeasy ミニキット QIAGEN Cat# 74104
DNeasy PowerLyzer PowerSoil キット QIAGEN Cat# 12855-100
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs Cat# E7420S
NEBNext Multiplex Oligos（イルミナ用）New England Biolabs Cat# E7600S
実験モデル生物／株
C57BL/6JOlaHsd オス 8～9 週齢 Envigo, Israel N/A
無菌スイスウェブスター雄8-9週齢ワイツマン科学研究所 N/A
オリゴヌクレオチド
Miseq Illumina シーケンスプライマー

リード1 - TATGGTAATTGTGCCAGCMGCCGCGTAA N/A N/A
Miseq Illumina シーケンスプライマー

リード2 - AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGTWTCTAAT N/A N/A
Miseq Illumina シーケンスプライマー

インデックスプライマー - ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACT N/A N/A
16S qPCR 111-967F-PP:CNACGCGAAGAACCTTANC (Huber et al., 2007) N/A
16S qPCR 112-967F-UC3:ATACGCGARGAACCTTACC (Huber et al., 2007) N/A
16S qPCR 113-967F-AQ:CTAACCGANGAACCTYACC (Huber et al., 2007) N/A
16S qPCR 114-967F-S:CAACGCGMARAACCTTACC (Huber et al., 2007) N/A
16S qPCR 115-1046R-S:CGACRRCCATGCANCACCT (Huber et al., 2007) N/A
寄託データ
配列データ European Nucleotide Archive ENA: PRJEB28097
ソフトウェアとアルゴリズム
QIIME 1.9.1 Caporaso et al., 2010 N/A
Trimmomatic Bolger et al., 2014 N/A
MetaPhlAn2 Truong et al., 2015 N/A
Bowtie2 Langmead and Salzberg, 2012 N/A
EMPANADA Manor and Borenstein, 2017 N/A
GOrilla (Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool) Eden et al., 2009 N/A
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試薬・リソース共有に関するお問い合わせ先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、Lead ContactであるEran Elinav ( eran.elinav@weizmann.ac.il ) に直接連絡し、対応してもらうことができます。
実験モデルおよび被験者の詳細
臨床試験
ヒトMUSPIC試験は、Tel Aviv Sourasky Medical Center施設審査委員会（IRB承認番号 TLV-0553-12, TLV-0658-12 and TLV-0196-13) およびWeizmann Institute of Science生命倫理・胚性幹細胞研究監督委員会（IRB承認番号 421-1, 430-1 and 444-1) によって承認されており、 https://clinicaltrials.gov/ (Identifiers: NCT03218579 and NCT01922830) に報告されていた。すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
除外基準および組み入れ基準（ヒトのコホート）
すべての被験者は以下の包含基準を満たした：18～70歳の男性および女性で、現在、食事療法や栄養士による診察を受けておらず、インフォームドコンセントを提供できる人である。除外基準は以下の通り。(i) 妊娠または不妊治療 (ii) 参加前3ヶ月以内の抗生物質または抗真菌剤の使用 (iii) 参加前1ヶ月以内のあらゆる形態のプロバイオティクスの消費 (iv) 登録前3年間の慢性的に活動性の炎症性または腫瘍性疾患 (v) 炎症性腸疾患およびセリアック病を含む慢性胃腸障害。(vi) 活動性の精神神経疾患 (vii) 参加前6ヶ月間の心筋梗塞または脳血管障害 (viii) 凝固障害 (ix) 免疫抑制剤の慢性使用 (x) I型またはII型糖尿病の予備診断または抗糖尿病剤による治療。なお、対象者および除外項目は、医師により確認された。
ヒト試験デザイン
46人の健康なボランティアが、2014年から2018年の間にこの研究のために募集された（表S1参照）。登録時に、参加者は医療、ライフスタイル、および食物頻度アンケートに記入する必要があり、研究への参加を受け入れる前に医師によって確認された。ナイーブコホート（n＝25）と抗生物質治療コホート（n＝21）の2つのコホートを募集し、プロバイオティクス（n＝8）、自家糞便マイクロバイオーム移植（aFMT、n＝6）、自然再構築（n＝7）の3つの介入に細分化された。抗生物質投与群については、ベースライン（7日間）、抗生物質（7日間）、介入（28日間）、フォローアップ（28日間）の4相からなる試験デザインを採用した。4週間の介入期（1日目から28日目）には、プロバイオティクス群の参加者は市販のプロバイオティクスサプリメント（Bio-25）を隔日で摂取するよう指示され、aFMT群の参加者は、抗生物質治療前に参加者から採取した加工・液化便150ml（0日目）を空腸内で注入され、自然再構成群の参加者はいかなる治療も受けなかった。便サンプルは、ベースラインおよび抗生物質投与期間中は毎日、介入開始1週間は毎日、その後は介入期間中は毎週、フォローアップ期間中は隔月および毎月採取された。抗生物質投与群の参加者は、抗生物質投与期間の終了時（0日目）と介入期間の3週間後（21日目）の2回、内視鏡検査を受けた。ナイーブコホートの参加者は1回の内視鏡検査を受け、そのうち10人は内視鏡検査前の7日間、毎日便を採取した。
46名の被験者全員が予定通り試験を完了し、脱落や退学はなかった。本試験では、10件の軽度の有害事象が報告され、完全に解決されました。すべての参加者は、最後の内視鏡検査セッションの退院時に、本試験への参加に対する支払いを受けた。
方法詳細
薬物および生物学的製剤
抗生物質
抗生物質投与期間中、参加者はciprofloxacin 500 mg（Ciprodex, Dexcel Pharma）を隔日で、metronidazole 500 mg（Flagyl, Sanofi）を3日で7日間経口摂取することが要求された。
プロバイオティクス
プロバイオティクスの段階では、参加者はSupherb Bio-25を隔日で摂取した。製造元は、次の種の活性細菌を少なくとも250億個含むと説明している。ビフィダム菌、ラムノサス菌、ラクティス菌、カゼイ菌、ブレーベ菌、サーモフィラス菌、ロンガム菌、パラカゼイ菌、プランタル菌、インファンティス菌が含まれている。この錠剤は、胃酸の下で生存し、腸内で増殖することを確実にするために、二重コーティングが施されています。前述の種の量と生存率の検証は、研究の一環として行われました（Zmora et al.、2018）。
自家糞便マイクロバイオーム移植試験
aFMT試験群に割り当てられた参加者は、Tel Aviv Sourasky Medical Centerの細菌治療室に出席し、少なくとも350 grの新鮮な便サンプルを預けるよう要請され、サンプルは速やかにグリセロールへの包埋、ホモジナイズ、ろ過を受け、-80℃の保管場所に移された。サンプルは内視鏡手術の30分前に解凍され、シリンジに入れられた。初回（抗生物質投与後）の内視鏡検査終了時に、調製液150mlを空腸内注入した。平均糞便量は150 ml懸濁液あたり70.02 ± 22.28grであった。
腸内細菌叢のサンプリング
便のサンプリング
参加者は、印刷された詳細な説明書に従って、あらかじめ決められた間隔で（前述のように）スワブを使用して便を自己採取するよう求められた。採取したサンプルは、直ちに家庭用冷凍庫（-20℃）で7日以内に保存し、備え付けの冷却装置で当社の施設に移送し、-80℃で保存した。
内視鏡検査
内視鏡検査の48時間前に、参加者は内視鏡検査前の食事に従うように指示された。検査20時間前の食事は、透明な液体に制限された。参加者全員にピコスルファートナトリウム（Pico Salax）ベースの腸内洗浄を実施した。参加者は2つのフリート浣腸を装備し、不明瞭な便が出た場合に使用するよう指示された。検査はプロポフォール・ミダゾラムによる軽い鎮静下でPentax 90i内視鏡（Pentax Medical社製）を用いて行った。
内視鏡吸引装置により、胃、十二指腸、空腸、回腸末端、盲腸、下行結腸から15mlのチューブに管腔内容物を吸引し、直ちに液体窒素中に置いた。ブラシ細胞診（US Endoscopy）は、胃底部、胃前庭部、十二指腸球部、空腸、回盲部、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸、直腸から腸粘膜を掻き取って粘膜内容を得るために使用された。ブラシはスクリューキャップマイクロチューブに入れ、液体窒素で急速凍結した。胃、十二指腸、空腸、回腸末端、盲腸、下行結腸から腸管上皮の生検を行い、液体窒素でスナップ冷凍した。各セッション終了時までに、すべてのサンプルをWeizmann Institute of Scienceに移し、-80℃で保存した。
マウス試験デザイン
8週齢の雄C57BL/6マウス（平均初期体重20gr）をHarlan Envigoから購入し、実験前に2週間、動物施設の環境に馴化させた。すべての実験において、年齢と性別を一致させたマウスを使用した。すべてのマウスは24時間の厳密な明暗サイクルで飼育され、午前6時から午後6時まで照明が点灯していた。各実験グループは、ケージ効果をコントロールするために、1グループあたり2ケージで構成された（1ケージあたりn = 5）。抗生物質処置のために、マウスは、以前に記載されたように、シプロフロキサシン（0.2g/l、Sigma-Aldrich）およびメトロニダゾール（1g/l、LKT laboratories）の組み合わせを飲料水中で2週間与えた（Suez et al.、2014）。プロバイオティクス補充については、1錠（Supherb Bio-25）を10mlの滅菌PBSに溶解し、暗期に直ちに経口ガベージでマウスに与えた（4X109 CFU kg-1 day-1）。aFMTについては、抗生物質投与前に糞便ペレットを採取し、液体窒素中でスナップ冷凍した。aFMTの当日、各マウスのペレットを別々に嫌気条件下（Coy Laboratory Products、75% N2、20% CO2, 5% H2）滅菌PBSに再懸濁し、3分間ボルテックスしたのち2分間重力で沈降させた。サンプルはハンゲート嫌気培養管で直ちに動物施設に移し、上清を経口ガベージでマウスに投与した。便はあらかじめ決められた日に暗期開始時に採取し、直ちにスナップ冷凍して移送し、さらなる処理まで-80℃で保存した。各時点において、交差汚染を最小限に抑えるため、各グループは1つの生物学的フード内で異なる研究者によって取り扱われた。実験終了後、マウスは二酸化炭素による窒息死で犠牲にし、正中線垂直切開で開腹した。消化管の露出と摘出後、胃、幽門から始まる小腸の近位4cmを十二指腸、小腸の次の1/3を近位および遠位の空腸、小腸の遠位1/3を回盲部、最後に結腸をその近位と遠位に分割して8分割し、各分割部内の内容物は、それぞれ、胃、幽門、小腸、回盲部、結腸に分けられた。各セクションについて、空洞内の内容物を抽出して内腔マイクロバイオーム単離用に収集し、残りの組織は滅菌PBSで3回洗浄し、粘膜マイクロバイオーム単離用に収集した。合計710個の糞便サンプル、680個の管腔サンプル、680個の粘膜サンプルが分析された。すべての動物実験は、Weizmann Institute of Science Institutional Animal Care and Use committee（IACUC）、申請番号29530816-2によって承認された。
細菌培養
本研究で使用した細菌株は、Key Resource Tableに記載されている。プロバイオティクス錠剤の菌の培養には、以下の液体培地を使用した。De Man, Rogosa and Sharpe (MRS), modified reinforced clostridial (RC), M17, Brain-Heart Infusion (BHI), または chopped meat carbohydrate medium (CM). すべての増殖培地はBDから購入した。培養は、嫌気条件下（Coy Laboratory Products, 75% N2, 20% CO2, 5% H2）、37℃で振盪せずに培養した。糞便マイクロバイオーム培養のために、約200 mgの冷凍ヒト糞便を5 mlのBHI中で嫌気条件下でボルテックスした。上清200μlを新しい5mlのBHIに移し、培養を開始した。定常期のプロバイオティクス培養物を0.22μMのフィルターを用いてろ過し、糞便培養物に添加した。純粋な乳酸菌培養物については、各菌株を液体MRS中で嫌気条件下で培養した。
核酸抽出
DNA精製
DNAは、DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit（QIAGEN）を用いて、内視鏡サンプル（内腔内容物と粘膜ブラシの両方）から単離された。自動化プラットフォーム用に最適化されたPowerMag Soil DNA Isolation Kit（QIAGEN）を用いて、便スワブからDNAを単離した。
RNA精製
参加者から得た消化管生検は、RNAeasy kit (QIAGEN, 74104)を用いて、メーカーの説明書に従って精製した。ほとんどの生検はRNAlater solution (ThermoFisher, AM7020)で保存し、液体窒素でスナップ冷凍した。
核酸処理とライブラリー調製
細菌DNAの定量用qPCRプロトコル
Fast Sybr Green Master Mix（ThermoFisher）を用いてプライマーセット（表S3に示す）を用いて増幅する前に、DNAテンプレートを1反応あたり1 ngに希釈し、二重測定した。増幅条件は、変性95℃、3分、変性95℃、3秒、アニーリング64℃、30秒、メーティングカーブの40サイクルである。2サイクル以上の差のある重複は解析から除外した。40サイクル後に増幅されなかったサンプルのCT値を40（検出の閾値）と定義した。
16S rDNAの塩基配列決定
16Sアンプリコンパイロシークエンスでは、16S rRNA遺伝子のプライマー515F/806Rを用いてV4領域にわたるPCR増幅を行い、その後2X250 bpペアエンドシーケンス（Illumina MiSeq）を用いて塩基配列を決定した。Illumina MiSeq Kitにカスタムプライマーを追加し、ペアエンド結合後に253 bpフラグメントを配列決定したところ、110,998 ± 66,946 リード（平均±SD）の深さとなった。
リード1 TATGTAATGTGGCCAGcmGCCGCGTAA
Read2: AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGTWTCTAAT
インデックス配列プライマー：ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACTATTAGAA
全ゲノムショットガンシーケンス
精製した100 ngのDNAをCovaris E220Xソニケーターでせん断した。Illumina互換ライブラリーを記載されたように調製し（Suezら、2014）、Illumina NextSeqプラットフォームで、リード長80bpで6294093±5732308（便）または3366309±4950053（ルーメンおよび粘膜）リードの深さに配列決定した（平均±SD）。
RNA-Seq
リボソームRNAを、公表された方法（Adiconisら、2013）の修正版に従って、RnaseH（New England Biolabs、M0297）により選択的に枯渇させた。具体的には、マウスrRNA18S及び28Sに相補的な50bp DNAオリゴ（25nM、IDT、表S4に示す）のプールを、75μlの10mMトリスpH8.0中に再懸濁した。全RNA（10μl H2O中100〜1000ng）を等量のrRNAオリゴプールと混合し、2μlに希釈し、3μl 5x rRNAハイブリダイゼーション緩衝液（0.5Mトリス-塩酸、1M NaCl、HClでpH7.4まで滴定）を添加した。サンプルは95℃で2分間インキュベートした後、37℃までゆっくりと温度を下げた（-0.1℃/秒）。RNaseH酵素ミックス（2 μl of 10 U RNaseH, 2 μL 10x RNaseH buffer, 1 μL H2O, total 5 μl mix）をハイブリダイゼーション終了の5分前に準備し、37℃に予熱しておいた。サンプルが37℃に達した時点で酵素ミックスを添加し、この温度で30分間インキュベートした。サンプルは、メーカーの指示に従い、2.2x SPRIビーズ（Ampure XP, Beckmann Coulter）を用いて精製した。37℃で30分間インキュベートした5μl DNase反応ミックス（1μl Trubo DNase, 2.5μl Turbo DNase 10x buffer, 1.5μl H2O）とインキュベートすることにより、残留オリゴをDNase処理（ThermoFisher Scientific, AM2238）により除去した。サンプルを再び2.2x SPRIビーズで精製し、3.6μlプライミングミックス（0.3μl New England Biolab, E7420のランダムプライマー、3.3μl H2O）中に懸濁させた。続いて、サンプルを65℃で5分間プライミングした。次にサンプルを氷に移し、2μlの第一鎖ミックスを加えた（1μl 5x 第一鎖緩衝液、NEB E7420；0.125μl RNase阻害剤、NEB E7420；0.25μl ProtoScript II逆転写酵素、NEB E7420；および0.2μg/μlアクチノマイシンD、Sigma、A1410を0.625μlとした）。第一鎖合成およびその後のすべてのライブラリー調製工程は、NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB, E7420）を用いて、製造者の指示に従って行った（すべての反応量は1/4に減量）。
16S rDNA解析
2X250 bpのリードは、QIIME (Caporaso et al., 2010) (Quantitative Insights Into Microbial Ecology, http://www.qiime.org) 分析パイプラインを使用して処理した。FASTA quality ファイルと、各サンプルに対応するバーコード配列を示すマッピングファイルを入力として使用した。ペアリードは、まず配列の類似性に基づいて長いリードにアセンブルされ、次にバーコードに従ってサンプルに分割された。16S rRNA領域で97%以上の塩基配列同一性を持つ配列は、オペレーション分類単位（97%ID OTU）にビン分けされた。各OTUは、Greengenesデータベースに対してUclustアルゴリズムを適用して分類し、OTUテーブルを作成した。
メタゲノム解析
シーケンサーからのデータをbcl2fastqでfastqファイルに変換した。その後、リードは、パラメータPE -threads 10 -phred33 -validatePairs ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:50 でTrimomatic (Bolger et al., 2014) を使用してQCトリミングされました。分類学的解析にはMetaPhlAn2 (Truong et al., 2015)を使用し、パラメータは: -ignore_viruses -ignore_archaea -ignore_eukaryotes としました。
ホスト配列は、bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012) を用いて、ヒトゲノムリファレンス hg19 に対して、-D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 のパラメータでリードを整列させて除去した。得られた non-host リードは、bowtie2 を用いて、パラメータ:-local -D 25 -R 3 -N 1 -L 19 -i S,1,0.25 -k 5 で統合遺伝子カタログ (Qin et al., 2010) にマッピングし、1 つのリードで最大 5 つの異なるエントリーにマッチするようにしました。
さらに、最小塩基品質が26のレコードのみを保持することで、バクテリアリードのフィルタリングを行った。内視鏡サンプルと便サンプルについて、それぞれ1X105と5X105の細菌ヒットにサブサンプリングし、細菌品質でフィルタリングしたbamファイルを作成した。エントリーのスコアは、その長さを遺伝子長で割った値で定義された。エントリーのスコアは、KOアノテーション（Kanehisa and Goto, 2000）に従って要約された。各サンプルは1Mにスケーリングされた。KEGGパスウェイ解析はEMPANADA (Manor and Borenstein, 2017)を用いて行った。
ユニークなゲノム配列によるプロバイオティクス菌株の同定
メタゲノミクスデータを使用してプロバイオティクス株の存在を評価するために、株の種がサンプルに存在するかどうか、次にサンプル中の種のための株の1つがプロバイオティクス株であるかどうかを決定することを目的としたパイプラインを適用した。
準備段階：プロバイオティクス株のゲノムの回収プロバイオティクス株のゲノムは、本研究で使用したプロバイオティクス錠剤のメタゲノミクスサンプルから再構築した。アセンブリは idba-ud (Peng et al., 2012) を用いて行い、その後、ペアエンドリードデータとミニアセンブリ (Sharon et al., 2013) を用いてスキャフォールドの連結に依存するゲノムクロージング手順を行った。このとき、データの一部を用いて、最も豊富な株のゲノムを最初に回収した。次に、豊富なゲノムのリードをサンプルから除去し、残りのデータを全て使用して、少ないゲノムを回収した。各ゲノムに対して、prodigal (Hyatt et al., 2010)を用いて遺伝子とタンパク質を予測した。MetaPhlAn2 (Truong et al., 2015)により、異なる株の豊富さを評価し、各ゲノムに必要なデータ量を推定した。回収されたゲノムと最も近い公開株の統計情報を表S5に示す。B. longumを除くすべてのゲノムは、94%以上の完全性と4%未満のコンタミネーションと推定される状態でアセンブルされた。B. longumはおそらく2つの株で構成されており、そのうちの共通領域（ゲノムサイズの約半分）をアセンブルし、同定することができた。L. lactisとL. paracaseiを除くすべてのプロバイオティクス株は、ほぼ同一の参照ゲノムを公開していた。
メタゲノミクスサンプル中のプロバイオティクス菌株の存在評価
1.
サンプルからのヒトリードの除去メタゲノミックリードをヒトゲノム（GRCh38.p7、NCBIからダウンロード）に対して、bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012) を用いて、パラメータ：-very_sensitiveでマッピングした。ゲノムと一致するリードのペアはすべて削除した。
2.
2. プロバイオティクス菌株に属する可能性のあるリードの同定 bowtie2 の -very_sensitive パラメータで、回収したプロバイオティクスゲノムに対してメタゲノムリードのマッピングを行った。2.プロバイオティクスに属する可能性のあるリードを特定する。
3.
3. プロバイオティクスゲノムへのリードの割り当て Bifidobacteriales目とLactobacillales目に属するプロバイオティクスゲノムとRefSeqからダウンロードしたゲノムのデータベース（各生物種最大10ゲノム）に対して、前工程で回収したすべてのリードをアライメントした。アライメントは bowtie2 を用い、パラメータ:-very_sensitive で行った。プロバイオティクス菌株のいずれかに最もよく一致するリードは、ペアエンドとともにその菌株に割り当てられた。
4.
4. 各サンプルにおける生物種の存在判定各プロバイオティクス菌株について、少なくとも1つのリードでカバーされると予想される遺伝子の割合を、観測されたゲノムカバレッジの関数として推定した。これは、プロバイオティクス錠剤のメタゲノム試料の1つから得られた異なる数のリードを、各プロバイオティクスゲノムに対してアライメントするシミュレーションによって行われた。これらのシミュレーションに基づき、R関数loess.SD（パッケージmsir）と approxfunを用いて、シミュレーションサンプルの95％を拘束する関数を設計した。閾値は、各カバレッジについて、得られた関数値の半分に設定した。
5.
5. 各プロバイオティクスゲノムに含まれる菌株特異的遺伝子を同定する。本ステップは、サンプル中のプロバイオティクス菌株を同定するために必要であり（次のステップ参照）、 NCBI の RefSeq から同種の他の菌株のゲノムをダウンロードし、各参照ゲノムとプロバイオティクス菌株ゲノムを compare-sets.pl (https://github.com/CK7/compare-sets) で類似度 96% の閾値を設けて比較した。長さが70%以上で揃ったゲノムは "類似"、98%以上で揃ったゲノムは "ほぼ同一 "のラベルを付けた。次に、プロバイオティクス株の遺伝子を、blastnを使用して、すべての類似／ほぼ同一のゲノムに対してアラインメントした。少なくとも1つの他のゲノムと60%以上の同一性で整列し、類似（ほぼ同一ではない）ゲノムの10%以上と整列しない場合、その遺伝子は株特異的遺伝子と同定された。表S6に、各プロバイオティクス菌株の遺伝子数および菌株特異的遺伝子をまとめた。
6.
各サンプルにおけるプロバイオティクス菌株の存在判定シミュレーションを用いて、1つ以上のリードでカバーされる全遺伝子の割合ごとに、少なくとも1つのリードでカバーされると予想される菌株遺伝子の存在を特徴づけた。シミュレーションに基づき、R関数loess.SDと approxfunを用いて、シミュレーション結果の95%と99%にバインドする関数を設計した。プロバイオティクス株の種への割り当ては、以下のキーに従って行われた：「不明」、全遺伝子の20%未満が少なくとも1つのリードでカバーされている；「プロバイオティクス株を含まない」、株特有の遺伝子の割合が99%関数以下である；「プロバイオティクス株を含む可能性がある」、株遺伝子の割合が95%から99%関数の間にある試料；「プロバイオティクス株を含む」、株遺伝子の割合が95%関数以上であった。
RNA-seq 解析
リードはcutadapt (Martin, 2011)を用いてトリミングし、STAR (Dobin et al., 2013) v2.4.2a (default parameters) を用いてhg38 Homo sapiens genomeにマップした。遺伝子は RefSeq を用いてアノテーションした。少なくとも1つのサンプルで5リード以上を持つ遺伝子をさらなる解析の対象として考慮した。カウントの正規化および差次的発現解析は、DESeq2（Loveら、2014）を使用して、パラメータ：betaPrior = True、cooksCutoff = FALSE、independentFiltering = FALSEで行った。Benjamini and Hochbergの手順を用いて、生のP値を多重検定用に調整した。(A) パイプラインで計算された p 値が [0.25,0.5], [0.5,0.75], [0.75,1] のビンで [0.25,1] の範囲にあり，いずれかのビンでの p 値の割合が 0.28 から 0.38 でない場合，fdrtool (Strimmer, 2008) で修正された．(B) 範囲 [0,0.25] の p 値の割合は、範囲 [0.25,1] の p 値の割合より 0.05 だけ低い。パイプラインはSnakemake (Köster and Rahmann, 2012)を用いて構築された。
定量化・統計解析
16Sデータについては、希少なOTU（相対量0.1%未満）をフィルタリングし、10,000リードの深さに希釈したサンプルを用いた。メタゲノム解析では、1X105未満（内視鏡サンプル）または5X105未満（便サンプル）の細菌リードを持つサンプル（宿主除去後）は、さらなる解析から除外された。残りのサンプルでは、希少なKEGGオーソログ（KO）遺伝子（< 0.1%）を削除した。ベータ多様性は、OTU（16S）または種（メタゲノム）の相対的存在量について、それぞれUniFrac距離またはBray-Curtis非類似度（R Veganパッケージ、https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html）を用いて計算された。KOと機能性細菌パスウェイのβ多様性は、スピアマンの順位相関係数を用いて算出した。アルファ多様性は、OTU（16S）について、観察された種指数を用いて計算した。16Sデータについては、QIIME tools v 1.9.1を用いてα多様性とβ多様性の測定値を算出した。微生物相の分類学的組成と機能的能力に対する処理の影響を調べるために、ダンの検定による繰り返し測定クラスカル・ウォリスを使用した。2群間またはそれ以上での経時的な治療効果を比較するために、Dunnetの検定付き二元配置分散分析、または参加者間でラベルを切り替えて行う並べ替え検定（適切な場合はペアで）が、割り当てられたすべてのサンプルを含めて使用された。Mann-Whitney検定およびWilcoxon検定は、2つの治療群間または参加者の2群間の一対比較を行うために使用されました。サンプル距離に基づく並べ替え多変量ANOVA（Adonis PERMANOVA、並べ替え数10,000）を、群集組成と機能の変化を検定するために使用した。qPCRデータの解析には、SidakまたはDunnett検定による2元配置のANOVAが使用された。有意性の閾値はp値、q値ともに0.05とした。統計的に有意な所見は、以下のカットオフに従ってマークされた。∗はp＜0.05、＊＊はp＜0.01、＊＊はp＜0.001、＊＊はp＜0.0001。データはGraphPad Prism version 7.0cでプロットした。サンプルサイズ、使用した統計検定、分散と精度の測定、統計的有意性など、すべての実験の統計的詳細は、結果のセクションに明記し、図の説明文に記した。
データおよびソフトウェアの利用可能性
配列データはEuropean Nucleotide Archiveにアクセッション番号ENA: PRJEB28097で寄託されている。
謝辞
ElinavとSegalの研究室の方々に感謝します。また、スペースの関係で掲載できなかった著者の方々にはお詫び申し上げます。DNA/RNAシーケンス解析にご協力いただいたWeizmann Institute of ScienceバイオインフォマティクスユニットのRefael Kohen氏、Elinav研究室のNadin Jbara氏、Amit研究室のPierre Bost氏に感謝の意を表します。Carmit Bar-Natanの献身的な動物飼育に感謝する。N.Z.はGilead Sciences International Research Scholars Program in Liver Disease .の支援を受けている。J.S.はStrauss Instituteの研究奨学生である。E.S.はクラウン・ヒトゲノム・センター、エルゼ・クローナー・フレゼニウス財団、ドナルド・L・シュワルツ（カリフォルニア州シャーマンオークス）、ジャック・N・ハルパーン（ニューヨーク州）、リーサ・スタインバーグ（カナダ）、欧州研究評議会とイスラエル科学財団による助成金によって支援されている。E.E.は、Y. and R. Ungar、Abisch Frenkel Foundation for the Promotion of Life Sciences、Gurwin Family Fund for Scientific Research、Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust、The Crown Endowment Fund for Immunological Research、J. Gitlitzの財産から支援を受けています。ギトリッツの遺産、L. ハーシュコビッチの遺産、科学振興のためのベノジヨ基金、アデリス財団、J.L. と V. シュワルツ、A. と G. マルコビッツ、A. と C. Adelson , フランス国立科学研究センター (CNRS) , D.L. Schwarz , V.R. Schwartz Research Fellow Chair , L. Steinberg , J.N. Halpern , A. Edelheit , 欧州研究会議からの助成 , マリー・キュリー統合助成 , ドイツ・イスラエル科学研究開発財団 , イスラエル科学財団 , Minerva Foundation , Rising Tide Foundation , Helmholtz Foundation , ヨーロッパ糖尿病研究財団. E.E.はカナダ先進研究所（CIFAR）のシニアフェローであり、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とハワード・ヒューズ医学研究所（HHMI）の国際研究者である。
著者協力
J.S.、N.Z.、G.Z.-S.、U.M.は実験の設計、実施、解釈、原稿執筆を行い、本研究に等しく貢献した。M.D.-B., S.B., S.F., H.S., M.P.-F. は実験およびサンプル処理を行い、アシストした。E.K., M.H. Y.C., D.Z., T.K., I.S.は計算機による解析を行った。A.E.M.とS.I.はRNA配列決定をサポートした。M.Z.、D.R.-L.、R.B.-Z.B.、N.M.、O.Sは患者の割り当て、フォローアップ、処置について協力した。A.H.は動物実験の監督を行った。Z.H.、E.S.、E.E.は研究の構想、被験者の監督、実験の解釈、原稿執筆を行った。
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。本研究の成果は、特許提案として提出されている。
補足情報
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表S1. 参加者の詳細、STAR手法関連
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表S2. アルファ多様性と有意に相関する特徴量、図4、図5関連
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表S3. qPCR解析に使用したプライマー、STAR Methods関連
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表S4. rRNA欠失に使用したDNAオリゴ、STARメソッドに関連するもの
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表S5. 本研究で回収されたゲノムの統計量のまとめ、STARメソッド関連
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表S6. STARメソッドに関連する系統遺伝子の統計情報
参考文献
以下の文献が補足情報に掲載されています。Furet et al., 2004, Haarman and Knol, 2005, Herbel et al., 2013, Ruggirello et al., 2014, and Schwendimann et al., 2015.です。
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記事情報
出版年譜
掲載されました。2018年9月6日（木
受理されました。2018年8月20日（木
改訂版として受理された。2018年6月5日（金
受理されました。2017年11月13日（木
識別情報
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.08.047

著作権について
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図
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図のサムネイル gr1
図1 抗生物質処理後のマウス消化管におけるプロバイオティクスのコロニー形成
図1 プロバイオティクス処理後のマウス消化管のコロニー形成
図S1図1に関連する抗生物質投与後のマウス消化管におけるプロバイオティクスのコロニー形成の動態
図1.図2.図3.図4.図5.図6.図7
図S2aFMT中のプロバイオティクス遅延は、抗生物質投与後の糞便および消化管マイクロバイオームの再構成を促進する（図2関連
図サムネイル gr2
図2プロバイオティクスの遅延とaFMTによる抗生物質投与後のマウス腸内細菌叢の再構成の促進
図サムネイル figs3
図S3図2に関連した、異なる生体実験室での検証マウスコホート
図サムネイル gr3
図3抗生物質治療後のヒト消化管におけるプロバイオティクスのコロニー形成
図サムネイル figs4
図S4抗生物質が介在するヒト腸内細菌叢の組成と機能の変化（図3関連
図サムネイルフィギュア5
図S5図3に関連する抗生物質投与ヒトにおけるプロバイオティクスコロニー化の空間的および時間的解析
図3.サムネイル図6
図S6プロバイオティクスの遅延とaFMTによる抗生物質投与後のヒト糞便微生物群のナイーブへの再構成（図3および図4関連
図サムネイルgr4
図4抗生物質投与後、aFMTがヒト糞便マイクロバイオームのベースラインへの再構成を促進する間に、プロバイオティクスが遅延した場合
図3.サムネイルgr5
図5抗生物質投与後、aFMTによりヒト腸管粘膜および管腔マイクロバイオームがベースラインまで回復するまでのプロバイオティクス遅延時間
図のサムネイル figs7
図S7Probiotics Delay while aFMT Enhancing Human Gut Mucosal and Luminal Microbiome Reconstitution to Naivety following Antibiotics Treatment, Related to Figure 5
図サムネイルgr6
図6プロバイオティクスを遅らせながらaFMTを行うと、ヒト腸管トランスクリプトームの抗生物質投与後の再構成が促進される
図サムネイルgr7
図7プロバイオティクスに関連する可溶性因子はヒトの糞便微生物相を阻害する
リンク記事
経験的プロバイオティクスに対する腸管粘膜コロニー形成抵抗性は、宿主およびマイクロバイオームのユニークな特徴と関連する
Zmora et al.
セル2018年09月06日
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