自動化と機械学習を用いた微生物培養のハイスループット化
オープンアクセス
掲載：2023年2月20日
自動化と機械学習を用いた微生物培養のハイスループット化
https://www.nature.com/articles/s41587-023-01674-2
黄義明、ラヴィ・U・シェス、...ハリス・H・ワン 著者一覧を見る
Nature Biotechnology (2023)この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
マイクロバイオーム研究における詳細な実験やメカニズムの研究には、純粋な細菌培養が依然として不可欠であり、複雑な微生物生態系から個々の細菌を分離する従来の方法は、労力がかかり、スケールアップが難しく、表現型と遺伝子型の統合が欠けています。ここでは、オンデマンドで迅速に分離株を生成するための、オープンソースの高スループットロボット株分離プラットフォームについて説明します。コロニー形態とゲノムデータを活用した機械学習アプローチを開発し、分離される微生物の多様性を最大化し、特定の属に的を絞ったピッキングを可能にする。このプラットフォームを20人のヒトの糞便サンプルに適用した結果、全豊富な分類群の80%以上を占める26,997の分離株を含むパーソナライズされた腸内細菌叢バイオバンクを得ることができました。100,000以上のコロニーを視覚的に捉えた空間解析により、Ruminococcaceae, Bacteroidaceae, Coriobacteriaceae, Bifidobacteriaceaeの間の共成長パターンが明らかになり、重要な微生物相互作用を示唆しています。これらのバイオバンクから得られた1,197の高品質ゲノムを比較解析した結果、興味深い菌株内および菌株間の進化、選択、水平遺伝子移動が明らかになりました。このカルチュロミクスの枠組みは、多くの新しいマイクロバイオーム研究において、イメージングに基づく表現型の収集と定量分析を、高解像度ゲノミクスデータとともに体系化する新しい研究努力を後押しするものと期待されます。
主な内容
メタゲノム解析は、土壌から腸内細菌まで、多様な微生物生態系の構成を幅広く調査することが可能です。しかし、生息環境における微生物の機能的役割や、発生する無数の種間プロセスを機構的に解明するためには、微生物を分離・培養する必要がある。ランダムなコロニーピッキングに依存する従来の培養法は、面倒で手間がかかる1,2,3,4。96ウェルや384ウェルを使用した連続希釈ベースの分離方法は、資源を大量に消費し、集団から同じ優勢株を繰り返し分離する結果となる5。マイクロ流体システムでは、ナノリットルリアクターでの増殖が可能ですが、クローン性分離株の抽出が困難です6,7。典型的なマイクロバイオームには、ロングテールの存在量分布8を示す数百から数千のユニークな種が含まれることがあり、系統的なカルチュロミクスによって包括的な菌株コレクションを作成することは、依然として重要かつ未知の課題である。
微生物は、特定の培地で増殖する能力や生産する代謝物など、多様な表現型に基づいて区別することができる9,10,11,12. 例えば、異なる栄養素や抗生物質を含む培地を用いて、増殖に基づく選択を行うことで、希少種の分離を促進することができます1,2,13. 質量分析スペクトルは、生物種の区別に使用することができますが14,15、このアプローチは低スループットであり、手作業で処理する必要があります。多次元画像に基づいて真核細胞を分離するImaging-activated cell sortingが開発されているが、この方法は高度な装置を必要とし、細菌に対しては実施されていない16。近年、人工知能（AI）が発達し、多次元画像や生体データの微妙な特徴を見分けるように訓練された深層学習モデル17により、表現型とゲノムデータを組み合わせた機械学習（ML）が次世代微生物培養学を変革する態勢が整ってきている。
ここでは、オンデマンドで迅速かつハイスループットな培養バイオバンクの生成を可能にする、ML誘導型ロボット株分離およびジェノタイピングプラットフォームについて説明する。このシステムは、インテリジェントな画像ベースのアルゴリズムを使用し、ランダムピック法に比べてカルトロミクスの分類学的多様性を高めることができる。我々は、20人のヒト被験者のために個人化された分離バイオバンクを嫌気的に生成し、394の16Sアンプリコン配列変異（ASV）にまたがる1,197の高品質ドラフトゲノムと合計26,997の分離株を得て、このシステムの有用性を実証した。各分離株のゲノムと形態のペア情報を用いて、コロニーの形態のみから分類学的同一性を予測できるMLモデルを訓練した。このMLモデルを適用することで、目的の微生物の標的分離が改善されました。また、寒天培地上で生育した全コロニーの大規模画像解析により、種特異的な生育パターンや種間相互作用の興味深い実態を明らかにした。また、個人化されたバイオバンクの全ゲノム解析により、腸内主要植物群における個人特異的な株レベルの変異と水平遺伝子移動（HGT）の徴候が明らかにされた。さらに、マイクロバイオーム分野のユニークかつ拡張的なコミュニティリソースとして、自動培養で得られたすべての分離株の遺伝子型、形態学的、表現型データを検索できるオープンアクセス型のウェブベースデータベース（http://microbial-culturomics.com/）を開発しました。
研究成果
表現型と自動化によるデータ駆動型カルチュロミクス
コロニーピッキングは、細菌株をクローン的に分離するための古典的な微生物学的手法である。プレート上のコロニーの成長は、培地の組成（例えば、利用可能な栄養素）、大気条件（例えば、酸素濃度）、阻害分子（例えば、抗生物質）の存在、pH、湿度、近くのコロニーから得られる他の拡散性代謝産物の影響などの多くの要因に依存します18,19,20。コロニーの形態は、細胞の形状、剛性、運動性、成長速度、色素分子や細胞外マトリックス、界面活性剤の産生などの影響を受けた株特有の生理的差異に基づいて観察される9,10,11,12. これらのコロニー形質は容易に定量化できるが、コロニー分離時に記録されることはほとんどない。そのため、視覚的特徴を用いた選択的コロニーピッキングは一般に定性的で標準化されておらず、実験や実験者により結果が大きく異なることがある。このような欠点に対処するため、我々は、コロニー分離と機能解析のために、形態学的データと遺伝子型データの両方を用いてカルチュロミクスを体系化するプラットフォーム（Culturomics by Automated Microbiome Imaging and Isolation, CAMII）を考案した。
CAMIIプラットフォームは、以下の4つの主要要素（図1a）で構成されています。(1）コロニーの形態データを収集するイメージングシステムとAIガイドによるコロニー選択アルゴリズム、（2）分離株のハイスループット分離・配列のための自動コロニーピッキングロボット、（3）ピックした分離株のゲノムデータを迅速に生成するコスト効率の良いパイプライン、（4）コロニーの形態、表現型、遺伝子型情報を検索できる物理分離株バイオバンクとデジタルデータベースです。このように、このエンドツーエンドのカルチュロミクスプラットフォームは、多様なインプットマイクロバイオームから分離株コレクションを最小限の手作業で作成することができます。イメージングと分離システム全体は、温度、湿度、酸素レベルをリアルタイムで制御できる嫌気性チャンバー内に、市販の部品を使用して構築されています（図1bおよび補足表1）。CAMIIロボットは1時間あたり2,000コロニーの分離スループットを持ち、1回あたり12,000コロニーを処理できる。これは、人が手でコロニーを分離するよりも20倍以上高い能力で、より速く分離できる。ゲノム解析能力をロボットの分離スループットに見合うようにするため、液体処理の自動化を活用して16S rRNAシーケンスまたは全ゲノムシーケンス（WGS; Methods）用のバーコード付きライブラリーを生成する低コスト・高スループットのシーケンスパイプラインも開発した。このパイプラインの分離株あたりのコストは、コロニー分離とゲノムDNA（gDNA）調製に0.45ドル、16S rRNAシーケンスに0.46ドル、Illumina HiSeqプラットフォームで60×以上のカバレッジでWGSに6.37ドルと、商業サービスよりも大幅に安い（補足表2）。
図1：表現型と形態学的特徴を利用したデータ駆動型の微生物分離戦略。
図1
a, ヒト腸内細菌叢の表現型および形態学的特徴に基づく菌株分離とデータ収集の枠組み。ヒトの糞便サンプルをプレーティングし、異なる抗生物質選択下で培養し、形態学的に多様なコロニーを分離し、バイオバンク化し、ダウンストリームシーケンスで解析した。 b, 自動嫌気性微生物分離・培養システムCAMIIのセットアップ。プレート上で増殖したコロニーを透過照明および落射照明下で撮像し、輪郭分割と形態学的特徴の抽出を行う。d. プレート上の多様なコロニー形態を示す図。e, 糞便サンプルH1t1を7種類の抗生物質で培養し、ファミリーレベルの16S分析により、最もユニークで多様な細菌を得る能力を評価した。f, 3つのヒト糞便サンプルH1t4, H5t1, H6t1をランダムに分離した場合と比較して、表現型ガイドによる分離から得られたユニークなASVの数。分離はCAMIIで行い、ランダム分離はプレート上で検出された全コロニーのランダムサブセットに対して行い、表現型ガイド分離はアルゴリズムにより形態学的に選択されたコロニーに対して行った（補足図1b）。P値は、曲線下の面積に関する両側ペアt検定により算出。曲線上のリボンは、アルゴリズムによって得られたユニークなASVの数の標準偏差を表している。
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CAMIIプラットフォームの主な独自機能は、細菌コロニーの形態データを収集し、そこから学習するイメージングシステムである（図1c）。具体的には、コロニーの高さ、半径、円形度を示す透過照明画像と、色やしわなどの複雑な形態的特徴を示す落射照明画像をCAMIIで撮影し、多次元かつ定量的な形態データセットを得ることができます。我々は、多様な形態的特徴に沿ってコロニーをセグメント化するカスタムコロニー解析パイプラインを開発した（方法；補足表3、補足図1）。面積、周囲長、平均半径はコロニーの大きさを、円形度、凹凸度、慣性度はコロニーの形状を反映している。また、赤・緑・青（RGB）チャンネルの画素強度とその分散から、コロニー全体の密度勾配と色彩が明らかになりました（図1d）。次に、形態的に異なるコロニーは系統的に多様である可能性が高く、これを利用してコロニーの分離を向上させることができると考えました。そこで、撮影した特徴量から多次元ユークリッド空間にコロニーを埋め込み、この空間で最も形態学的に異なるコロニーを表す最大距離の点を選択することにより、より多様な分離株を分離する画像誘導型「スマートピッキング」戦略を開発した（補足図1；Methods）。また、CAMIIでは、培養・検査可能な細菌の多様性をさらに高めるため、さまざまな抗生物質を補充して、最もユニークで多様な微生物のサブセットを濃縮しています1,13（補足図2a,b）。例えば、健康なヒト腸内細菌サンプル（H1t1）では、作用機序の異なる3種類の抗生物質（シプロフロキサシン、Cip；トリメトプリム、Tmp；バンコマイシン、Van）により、最も異なる濃縮培養を行いました（図1eおよび補図2c）。
画像誘導型コロニー分離の能力と忠実性を系統的に評価するために，3人のヒトボランティア（H1t4，H5t1，H6t1；補足表4）の腸内細菌叢サンプルにCAMIIを適用した．主成分分析（PCA）により、プレーティングしたコロニーの形態データを解析し、最も有益な視覚的特徴を評価した（図1cおよび補足図1c；Methods）。興味深いことに、コロニー密度とサイズが最も支配的な特徴であり（それぞれ主成分1、2）、合わせて形態学的分散の72.0%を占めた（補足図3）。このうち約半数はmGAMプレートから無作為に採取し、残りの半数は画像誘導による「スマートピッキング」戦略と抗生物質の選択により採取したものである。分離株は384ウェルで培養され、16S rRNAの配列決定により分類学的に同定された。ユニークな16S V4配列は、ASV（100%同一性カットオフ）にクラスタリングされ、おおよその種レベルの同一性が示された21。驚くべきことに、表現型データに基づいてコロニーを分離すると、3つのマイクロバイオームサンプルすべてにおいて、ランダム分離と比較して、より多様なASVのセットが得られた（図1f）。例えば、30個のユニークなASVを得るために必要なコロニーは、ランダム選択では410 ± 218コロニーであるのに対し、イメージング選択戦略ではわずか85 ± 11コロニーです。また、生成された分離株は、入力された微生物の多様性をよりよく反映し、シャノンの等質性によって測定される組成が実質的により均等であることを示唆している（補足図4a）。また、分離株の系統解析から、CAMII に最適化したコロニーピッキングにより、得られた微生物の多様性が大幅に改善されることが分かりました（補足図 5）。このことは，分離株数の増加に伴い，ユニークな ASV を見つけることが漸近的に困難になることを考慮すると，特に顕著である．これらの結果から、CAMIIプラットフォームにおけるAIガイド付きデータ駆動型分離フレームワークは、カルチュロミクスの効率を大幅に向上させ、特に希少種の分離にかかる労力を軽減できることが示されました。
パーソナライズされた腸内細菌分離のバイオバンクの迅速な生成
異なる人々のマイクロバイオームが同じような細菌種を共有していても、これらの細菌種に属する菌株は個人に非常に固有であり、何年も同じ宿主に共培養されることがあります22,23。我々は、CAMIIの有用性を示すために、健康な20人の個人化された腸内分離株コレクションを作成しようとした（補足表4、補足図6a,b）。合計102,071コロニーを目視で分析し、26,997コロニーを採取して16S rRNAシーケンスで分類学的に同定した結果（図2a）、健康な常在腸菌の幅広い多様性をカバーする394種類の固有のASVを得た（図2b、c、補足表5）。
図2：20人分のパーソナライズド腸内分離株バイオバンクの作成。
図2
a, 20人のパーソナライズド腸内細菌分離株バイオバンクの統計。 b, 本研究で26,997個の腸内細菌分離株がカバーする394個のASVの系統樹。16S V4配列に基づいて系統樹の近傍結合木を構築した。c, ファミリーレベルの分類で上位 20 位までの分離株数。 d, 糞便サンプル中の個人別バイオバンクからの分離株で表される ASV の累積相対存在量。棒グラフはコレクション全体の任意の個人からの分離株、赤線は同一人物からの分離株を示す。 e, オリジナルの糞便サンプル中の豊富なASVの相対存在量とバイオバンクでの存在・非存在のヒートマップ。平均相対量が0.1%を超えるASVを示し、左側のサイドバーはそのファミリーレベルの分類を表している。右側のヒートマップでは、パーソナライズドバイオバンクで見つかったASVを黒いバーで示し、どのバイオバンクでも見つからなかった未培養のASVをハイライトで示しています。 f, ASVの元の糞サンプルにおける平均相対存在量とコレクション全体における分離株数の相関。培養が困難な、つまり分離株数が少ない高濃度ASVは強調表示されている。 g, 高濃度ASVの平均相対量だが、コレクション全体では分離株が2つ以下。バーの色はファミリーレベルの分類を表す。
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この分離株コレクションの包括性を評価するため、16S rRNAのバルクシークエンスによって、対応する糞便サンプル中の分離ASVの存在量を計算しました（図2d）。驚くべきことに、各個人について、存在量によるASVの80.9±9.4%が、分離株コレクション全体で少なくとも一度は表されていることがわかった。また、各個人に由来する分離株は、その個人内の全細菌ASV量の平均45.6±21.6%を構成していた（図2d）。さらに、分離コレクションとバルク糞サンプルを比較すると、高濃度で流行しているASVのほとんどが、コレクション内で少なくとも1回は分離されていることがわかった（補足図6c-e）。さらに、各個人用分離株コレクションは、同等のマイクロバイオームプロファイルとシャノンの多様性指数を持つバルク糞便サンプルを模倣している（補足図6f,g）。
このように、我々はCAMIIを用いて、394のASVにまたがる26,997の分離株と、豊富な形態学的、表現型、分類学的、WGSデータのセットを含むヒト腸内細菌コレクションを構築することを実証した。研究コミュニティへの有用性を高めるため、ゲノム、表現型、画像を含むCAMII対応バイオバンクの全データを収容する検索可能なオンラインリソース（http://microbial-culturomics.com）をさらに開発しました。このポータルサイトによって、さらに遺伝子型から表現型への解析が容易になり、他の環境からの分離株コレクションをより多く共有できるようになると考えています。
培養不足の「ダークマター」腸内細菌群の同定
これまでの研究で、異なる環境に生息する多くの微生物は、実験室での培養が困難であることが分かっている24,25。そこで我々は、系統的に作成した分離株バイオバンクを活用して、ヒト腸内細菌叢の培養性を評価し、我々の実験環境では分離が困難な細菌ASVを特定した。20の個人用分離株コレクションすべてについて、糞便バルク物質中の豊富なASV（平均相対存在度 > 0.1%）をバイオバンクで検出できるかどうかを判断しました。注目すべきは、未培養の腸内細菌のかなりの割合がRuminococcaceaeおよびLachnospiraceaeファミリーに属していたことである（図2eおよび補足表6）。これは、「培養不可能」24として以前に記録されたものでもある。各ASVについて、全分離株コレクションから得られた分離株数と、バルク糞便中の平均存在量を比較したところ（図2f）、正の相関があるように見えた。それでも、Faecalibacterium ASV-58, Prevatella ASV-470 と ASV-324, Oscillibacter ASV-215, Clostridium XlVa ASV-287 など、豊富だが培養が困難な細菌群を確認した（図2g）。興味深いことに、我々が1株入手しWGSを実施したFaecalibacterium ASV-58は、Candidatus cibiobacter qucibialisのメタゲノム集合ゲノム（MAG）とゲノム全体の平均塩基同一性（ANI）98%以上で一致した。この菌株は、ヒトの腸内で最も豊富な未培養種であると以前に報告されており25、他のFaecalibacterium株と同様に、炎症性腸疾患（IBD）患者では非常に枯渇している26。
さらに、WGSによって我々のバイオバンクの分離株を既存のデータベース1,3,22,25と比較したところ、どの参照コレクション（BIO-ML、CGR、HMP）でも培養されておらず、SGBコレクションにおいてのみMAGと関連している11種を追加で同定した（補足図7、補足表7）。例えば、Faecalibacterium ASV-58の他に、糞便中の相対存在量が平均で3%を超えるFaecalibacterium sp. ASV-76を分離し、培養可能な腸内細菌群のコレクションをさらに拡大することができた。これらの結果は、培養された単離株と、現在の培地や増殖条件に基づく失われた多様性を明らかにし、これらの「ダークマター」腸内細菌に焦点を当てた今後のカルチュロミクス研究の方向性を示している（補足表6）。
形態学から分類を予測することで、ターゲットを絞った分離が可能になる
マイクロバイオームサンプルから目的の細菌を集中的に培養することは、機構解明研究にとって極めて重要である。しかし、残念ながら、私たちはほとんどの細菌種を特定の方法で選択的に培養する能力を持ち合わせていません。そのため、多数のコロニーを選んで統計的な確率に頼ることが、目的の細菌を得るための唯一の現実的な解決策となっています。しかし、この戦略は、何千ものコロニーを手動でピッキングする必要があるため、多くの場合、リソースを消費しすぎています。CAMII は，分類学的同一性とコロニー形態との関連性に基づく ML ガイドによる自動コロニー選択法を提供しており，理論的には標的分離を強化することが可能である．そこで，腸管深部病原体の分離株を系統的に調査し，形態学的データと遺伝子型データの関連性を解析した．興味深いことに、異なる属のコロニーは多様な形態学的パターンを示した（図3a,b）。例えば、Dorea属、Bacteroides属、Collinsella属のコロニーは全体的に大きく密だが、円形度は異なり（Collinsella属＞Bacteroides属＞Dorea属）、その成長特性の違いを反映している。一方、Faecalibacteriumのコロニーは小さく微小であり、我々が以前示した培養性の低さと一致している。さらに、コロニーの形態は系統によって有意にクラスタリングされていた（図3cのPERMANOVA検定でP = 0.008）。例えば、Clostridia属のほとんどは、形態に基づく順序付けによって互いに接近している（図3c）。したがって、コロニーの形態には、分類学的な同一性に結びつく相当量の情報が含まれている可能性がある。
図3: コロニーの形態を利用して分類学的同一性を予測することで、標的分離を強化できる。
図3
a, 異なる細菌属間の形態的特徴の平均zスコアのヒートマップ。多様な形態パターンを示す細菌属は、階層的クラスタリングによって異なるグループに分類され、右側の色付きの点はそのクラスレベルの分類を表す。c, コロニーの形態的特徴に基づく属の PCA 順序付け。d, 形態的特徴に基づくランダムフォレスト分類器による細菌属予測の性能。括弧内の数字は各属の分離株数を表す。モデルの学習と評価は20回ブートストラップし、箱ひげ図は性能の分散を示す（n = 20）。青線はヌルモデルの性能を表す。箱ひげ図要素の定義-中央の線は中央値、箱の限界は上下25分の1、ひげは1.5×四分位範囲 e, モデルベースの標的分離の性能。棒グラフは20回ブートストラップした個体別モデルによる予測精度の平均値を表し、エラーバーは標準偏差を表す。P値は、ランダムに初期化されたn=20のモデルブートストラップからの予測値に対する両側スチューデントのt検定によって計算された。
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コロニーの分類学的同一性が、プレート上の形態的情報のみを取り込むことで一意に予測できるかどうかを評価した。ランダムに選んだ分離株のサブセット（全体の70％；Methods）から得た形態学と分類学のデータを用いて、ランダムフォレスト分類モデルを学習させた。残りの30%の分離株について、モデル性能を評価した。その結果、学習用データセットに100個以上の分離株が含まれるほとんどの属で、70％以上の精度を達成した（図3d）。属レベルでの再現率にはさらに大きなばらつきがあり、より洗練されたモデルを用いてコロニー固有の特徴をさらに学習する機会があることが浮き彫りになった27,28,29。Eggerthellaのような一部の属は、高い精度と再現率を示し、高度に保存されたユニークなコロニー形態が分類学的予測に特に活用できることが示された。同じASVからの分離株を分析したところ、コロニー形態は同一人物内の分離株では高度に保存されているが、異なる人からの分離株ではより多様であることがわかった（補足図8）。このことから、コロニー形態は株レベルで大きく変化していることが示唆された。
次に、AIで情報化されたコロニー特徴が標的微生物の分離を改善できるかどうかを評価するために、3人の異なる人（H12、H13、H14）からのバイオバンク分離株データを別々にランダムフォレストモデルを学習させた。このモデルを用いて、同じ糞便サンプル由来の新しいプレートからBifidobacterium、Parabacteroides、Eggerthellaのコロニーを予測し、そのコロニーをCAMIIで分離し、16S rRNAの塩基配列を決定して分類学的同一性を確認した（Methods）。この結果、ピッキングの精度が向上し、目的の微生物を見つけるために多くのコロニーをスクリーニングする必要性が軽減されました。これらの結果は、表現型と遺伝子型を結びつけ、視覚的なコロニーの特徴のみから分類学的な予測を実証し、標的微生物の分離を大幅に強化できるバイオバンク・データセットの価値を強調するものである。
腸内細菌叢の菌間増殖の関連性
細菌コロニーは、栄養素の競合や必須代謝物の相互供給などの種の相互作用を通じて、隣接する細胞の成長に影響を与えることがあります。これまでの研究から、近隣の細胞は予測可能な方法でコロニーのサイズに決定的な影響を与えることが示唆されています19。CAMII はコロニーの動態的な成長を連続的に追跡できるため，寒天培地上で腸内細菌の共進化の関連性を系統的にプ ロバシーした．糞便サンプル（H1t5；補足表4）を毎日プレーティングして画像化し，その後6日目にすべてのコロニーを分離して，16S配列決定で分類学的同定を行った（図4a）．各ASVについて、寒天培地上のコロニーの累積面積は、元の糞便サンプル中の存在量と相関しており（補足図9）、我々の試験管内条件は、概して腸内と同程度に増殖を促進することが示された。興味深いことに、Faecalibacterium属のコロニーは初期増殖が遅く、近くに増殖中の他のコロニーがある場合にのみ出現し始めた（図4b；Methods）。この結果は、Faecalibacteriumと他の生物種との間で、共生的あるいは相互依存的な相互作用が起こっている可能性を示唆している。
図4: コロニー形態解析による腸内細菌叢間の相互作用のマッピング。
図4
a, 6日間生育したプレートの画像と16S配列決定によるプレート上のコロニーの同定。 b, 各属の6日目と比較した異なる時点での検出可能なコロニーの割合。c, 代表的な2つのASVについて、コロニーサイズと近傍コロニー数の相関を示す。相関の全リストは補足表8に示す。P値は近接コロニーが1つ以下、または4つ以下のコロニーの面積について片側Mann-Whitney U検定により算出した（ASV-6ではn = 101 vs 82、ASV-39では17 vs 9）。箱ひげ図要素の定義：中心線：中央値、箱の限界線：上下25分位値、ひげ線：1.5×四分位値。d, 属間における一対の成長促進・抑制ネットワーク。方向性のある成長促進効果は赤の鋭い矢印で、方向性のある成長抑制効果は青の鈍い矢印で示す。ノードは細菌属を表し、ファミリーで色分けされている。ノードの大きさはこの解析で使用した分離株の数に比例し、エッジの幅は相互作用の有意性に比例する。
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CAMIIによって可能となった種の相互作用をより系統的に研究するために，コロニー形態，分類学的同一性，コロニー近傍のデータを一緒に分析した．目視で捕獲した102,071個体（26,997個体）のコロニーの形態データと物理座標を集約し、コロニーの成長が近傍細胞の影響を受けるかどうかを評価した。意外なことに、種間相互作用を反映していると思われる興味深い共成長パターンが多数観察された（補足表8）。例えば、Phocaeicola vulgatus ASV-6のコロニーサイズは近傍細胞の数と負の相関があり、P. vulgatusと腸内の他の細菌との間に競争や拮抗を介した一般的な負の相互作用があるというシナリオと一致している30 (Fig. 4c)。一方、Faecalibacterium prausnitzii ASV-39は、コロニー動態（図4b）において初期増殖が遅いとされる種の一つであるが、より多くの近隣細菌とより大きなコロニーを形成し、正の種の相互作用を反映することがわかった（図4c）。
次に、近傍のコロニーの分類学的情報を組み込み、特定の属のコロニーサイズが他の属からどのように影響を受けるかを調べた。簡単に説明すると、属のペアごとに、一方の属のコロニーサイズを、近傍に存在する他方の属と、コロニーが存在しない状態で比較した（Methods）。驚くべきことに、Bifidobacterium、Phocaeicola、Bacteroidesに近接していると、FaecalibacteriumとClostridium IVの2属の分離体がより大きなサイズに成長することが確認された（図4d）。FaecalibacteriumとClostridium IVは腸内の主要な酪酸産生菌であり、BifidobacteriumやBacteroides類との共培養増殖が有効であると報告されており31,32,33、今回の結果と整合的であった。一方、Phocaeicola分離株はFaecalibacterium分離株を隣接させると小さくなることが観察され（図4d）、共培養の相互作用が一方にのみ利益をもたらす可能性があることが示された。また、PhocaeicolaとBacteroidesの増殖が、他の複数の属によって抑制されていることがわかった。この結果は、CAMII が種間相互作用に支配されたコロニー共生のパターンを明らかにし、潔癖な種の in vitro 繁殖を刺激する増殖促進微生物とその拡散性代謝産物の同定に役立つ可能性を示している。
腸内細菌の株内・株間ゲノム多様性
腸内細菌の株レベルのゲノムワイドな多様性をマッピングすることは、腸内コロニー形成のダイナミクスや、各ヒト宿主に特有の細菌の選択と適応のドライバーを理解するために重要である1,2,34。CAMIIシステムの主な利点は、個人間および個人内のゲノム変異を調査するために、多数の分離株を分離してWGSを実施できることです。そこで、20人規模のマイクロバイオーム・バイオバンクから最もユニークで一般的なASVをカバーする分離株を選び、WGSを実施したところ、1,197の高品質ドラフトゲノムを得た（補足図10および補足表9）。さらにゲノムアセンブリを解析し、分離株の正確な種レベルの分類を決定した（Methods）。
まず、私たちの分離株コレクションに存在する対人系統レベルのゲノム変異を調べた(Methods)。これまでの報告1,35と同様に、同一人物内の分離株の多くはゲノム変異が非常に少なく（つまり、102SNPs以下）、一方、人と人との分離株は103-105のゲノムワイドSNPsで異なっていた（図5a）。興味深いことに、同一人物の中に、系統学的に異なる（つまり、104以上のSNPsを持つ）同一種の分離株が共存していることが観察された（図5a）。例えば、H4個体からはP. vulgatusの2つの異なる株が、H2個体からはB. uniformisの2つの異なる株が分離されていた（補足図11）。
図5: 個人内および個人間における腸内細菌叢の菌株レベルのゲノム多様性。
図5
a, 分離菌の多い14種について、同一個体または異なる個体からの分離菌間のゲノムワイドSNPsの数。種名の後の数字は、個体間（赤）と個体内（青）のペアの数を表している。箱ひげ図要素の定義：中央線：中央値、箱限界線：上下25分位値、ひげ線：上下25分位値。b, 個体H1の分離頻度の高い種について、ゲノムワイドSNPs数と糞便サンプル中の相対的存在量との相関。ドットの大きさはこの解析で使用した分離株の数、色は1つの遺伝子型にのみ存在するSNPの割合を表す。 c, H1からの409分離株に基づく2kb＋HGT頻度のネットワーク。ノードは細菌種を表し、ファミリーで色分けされている。ノードのサイズはH1コレクションにおける分離株の数に比例し、エッジの不透明度は接続された2つの種間のHGT頻度に比例する。エッジの色は、異なるタイプのHGT、すなわち、interphyla、intraphyla、interfamily、またはintrafamily HGTを表し、ノードの輪郭色は、その種のグラム染色を表している。
フルサイズ画像
次に、H1個人から得られた408株のゲノムを解析することで、一人の人間における株レベルの多様性を評価しようとした（補足図10；方法）。腸内に多く存在する菌種は、より多くの細胞分裂を行うことが予想されるため、腸内のコロニー形成期間がほぼ同じと仮定すると、ゲノムにより多くのSNPが蓄積される可能性があると仮定した。実際、各分類群におけるゲノムワイドSNPsの数は、元のマイクロバイオームにおける存在量と概して相関している（図5b）。B. fragilisは葉のSNP（つまり、1つの遺伝子型にのみ存在する）の割合が高い（56.0%）一方で、P. goldsteinii（20.5%）、B. stercoris（22.4%）、B. xylanisolvens（25.6%）など他の種ではかなり低く、種レベルでの集団ボトルネックや選択掃射に差があると示唆されます。また、遺伝子レベルでは、収斂的な適応進化を示す証拠も観察された。例えば、異なるP. dorei分離株の系統間で、細菌のトルエン代謝を制御する2成分キナーゼセンサーをコードする遺伝子TodS (Supplementary Fig. 12) の2つのコーディングバリアントが確認された36。トルエンをはじめとする芳香族炭化水素は食品中に含まれ、また工業用原料として使用されているため、食品を汚染する可能性があり、その結果、腸内での進化を促すことになる37。
個人内の腸内細菌群の進化を促すもう一つの大きな要因は、HGTである。そこで、全ゲノム配列が決定されたH1分離株すべてを用いて、長さ2 kbを超える共有DNA要素のHGTネットワークを再構築した（Methods）。つまり、ほとんどのHGT事象は同じ系統内で起こっていたが、異なる科や異なる種間でもかなり広く起こっていた（図5cおよび補足表10）。興味深いことに、HGTは同じグラム染色を持つ分離株間で優勢になり、グラム陰性種はグラム陽性種よりもHGTが優勢であることが観察された（ピアソンのカイ二乗検定によるP = 0.0005 ）。この結果は、最近の知見39と一致し、異なる細胞壁構造がHGTに重要な役割を果たす可能性を示唆している。また、今回のデータセットでは、グラム陽性菌と陰性菌の間のHGTも観察されたことから、今後、細胞壁構造のHGTへの影響を研究し、これらのHGT要素をマイクロバイオーム編集ツールに組み込んでいくことが期待されます。次に、これらのHGTが最近発生したかどうかを調べるために、すべての種ペア間の平均HGT頻度を算出した（Methods）。もしHGTが2つの種の間で最近発生したのであれば、それらはごく一部の分離株としか関連せず、結果として種間の頻度は低くなる。一方、もしHGTが早く発生し、成長の利益をもたらすのであれば、それらは濃縮されて後の世代に垂直継承され、結果として高い頻度となるだろうと我々は仮定している。興味深いことに、ほとんどのHGT要素は分離株間に頻繁に存在し（50%以上の頻度で71.5%のHGT）、特にバクテロイデス属内のものについては（図5c）、遠い過去に起こり、腸内環境における強い選択下で濃縮されたことが示唆された。
個体内遺伝子の頻度が高いことから、次に、最も広く分布する遺伝子のタンパク質コード配列をアノテーションし、その潜在的な機能を探った（Methods）。その結果、分泌系遺伝子だけでなく、作用機序の異なる複数の抗生物質耐性遺伝子（ARG）が同定された（補足図13）。例えば、最も広く分布する上位4つのHGT配列は、Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae, Odoribacteraceae, Rikenellaceaeの少なくとも13種で驚くほど発見され、リボソーム保護因子や抗生物質排出ポンプ、さらにIII型およびIV型分泌システムなど複数のARGを含んでいた。HGTによって共有されたARGや分泌系は進化的に明らかに有利であると考えられるが40,41、異なる種間で機能不明な遺伝子を持つ要素が多数存在し（補足図13）、腸内で長期保存されるメカニズムが未解明であることが示唆される。これらの結果は、CAMIIを用いたディープストレイン・バイオバンキングとゲノム解析により、人により異なる腸内細菌群のコロニー形成、適応、生態を研究するための系統的な特性評価が可能であることを示唆しています。
考察
腸内細菌叢からの菌株分離は、歴史的にアドホックな方法で行われており、重要な表現型の特徴を十分に捉えることができず、ゲノムデータと共に記録することも不十分であった。ここでは、自動化、マシンビジョン、教師あり学習、ゲノミクスを活用し、分離バイオバンクの生成を工業化するCAMIIプラットフォームについて説明した。低コストの16Sおよび全ゲノム配列決定と組み合わせることで、パイプラインから生成される系統的な表現型およびゲノムデータは、微生物のコロニー形態、多様性、進化を研究するための豊富なリソースを形成します。腸内細菌を例にとると、CAMIIによる分離により、20人の健康な人から、存在量によって全微生物種の80％以上を網羅する広範な分離バイオバンクを得ることができました。この分離コレクションは、健康な腸内の微生物多様性の大部分をカバーしており、これまでに報告された最も広範な個人用分離バイオバンクの1つである。このリソースを用いて、コロニー形態の定量的解析により分類を予測し、対象となる属の分離を促進し、微生物間の潜在的な相互作用を明らかにすることができることを実証しました。また、人により異なる分離株間のゲノムの違いを系統的に解析した結果、集団選択、適応、HGTの興味深いパターンが明らかになりました。
ここで紹介したデータの大部分は、ヒトの腸内細菌叢の文脈で菌株の分離と特性評価を行うために、一般的なMGAMリッチ培地に依存したものである。今後、別の培地処方、他の微量栄養素や多量栄養素、宿主や環境に関連した生化学的擾乱（例えば、胆汁酸や異種化合物）の探索により、形態学的および増殖プロファイルの変化が得られ、未解明の生理機能や腸内細菌の特徴に情報が提供される可能性があります。CAMIIデータセットから得られる種間相互作用は、さらにマイクロバイオーム動態のドライバーを系統的にマッピングするために利用される可能性があります。これらの相互作用は、本研究や他の研究で観察された協調的な増殖を促進する未知の微生物由来分子の同定に役立つことで、不応性の「暗黒物質」マイクロバイオームの培養を促進できると想定している。
CAMIIシステムは、市販の部品とオープンソースのコードを使用しており、他の研究者が容易に複製することができる（部品一覧は補足表1を参照）。また，検索可能なオンラインポータルにより，標準化された表現型やゲノムデータの共有が促進されることを想定しており，これは時間の経過とともに拡大することが予想される．CAMII のハードウェアをさらに拡張し、質量分析測定を統合することで、コロニーの特性プロファイルを追加し、種や代謝物の同定を向上させることができます。さらに、搭載された自動顕微鏡により、直交するデータストリームを導入し、異なるスペクトルチャンネルにわたって微生物細胞をマイクロメートルの分解能で可視化できる可能性があります。マシンビジョンとMLアルゴリズムの改善により、さらに優れた菌株予測が可能になり、分離性能も向上する可能性があります。
個々の菌株は複雑なコミュニティ内の活動単位であるため、より完全な菌株コレクションが必要である。このような包括的なバイオバンクを利用することで、コミュニティ全体の構成、種間相互作用、代謝能力を考慮したより全体的な状況を再現でき、マイクロバイオームの機能、動態、安定性に関する研究を向上させることが可能である。CAMIIは、ヒトの腸内だけでなく、土壌、水域、農業環境など、他のマイクロバイオームにも有用で、ファージ、真菌、原虫の分離・分析をさらに進めることができます。また、ロボットによる自動化システムは、アレイ化トランスポゾン挿入ノックアウトコレクション42や機能ゲノミクス発現ライブラリ43などの系統的な菌株ライブラリの生成や、遺伝子操作のための扱いやすい微生物シャーシのスクリーニングを向上させることができます44。
方法
倫理的審査
本研究は、コロンビア大学医療センター施設審査委員会プロトコールAAAR0753に基づき、承認され実施された。本研究では、参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
糞便サンプルの採取と保管
20人の健康なヒトドナーから新鮮な糞便サンプルを採取し、排便後3時間以内に処理した。糞便は、Commode Specimen Collection System (Fisher, 02-544-208)を用いて収集された。逆さにした滅菌済み200μlピペットチップ（Rainin, RT-L200F）を用いて便検体から小さなサンプルを芯出しし、それを直ちに滅菌済みクライオバイア（Fisher, NC9347001）内に入れた。次に、採取した糞便サンプルを嫌気性チャンバー（Coy Laboratory）に移し、5mlの前処理済みPBS中で十分にボルテックスすることによりホモジナイズした。ホモジナイズしたサンプルをさらに40μフィルター（Fisher、22363547）に通して食物の残骸を除去し、グリセロール（最終濃度20%）とともに複数のクライオバイアルに分注し、-80℃のフリーザーに移して長期保管した。
プレート調製および細菌培養
すべての腸内細菌はGifu Anaerobic Medium Broth, Modified (mGAM; HyServe, 05433)を用いて、嫌気性チャンバー内で嫌気条件（5% H2、10% CO2 および 85% N2）下で培養された。簡単に言うと、mGAM培地を入れた1.5%寒天プレート（Thermo Fisher Scientific, 242811）を蠕動ポンプ（New Era Pump Systems NE-9000）を使って作り、固有のバーコードで標識した。シプロフロキサシン（10 µg ml-1）、トリメトプリム（50 µg ml-1）またはバンコマイシン（50 µg ml-1）を添加したプレートでは、プレート調製時に抗生物質を添加した。その後、すべてのプレートを嫌気性チャンバーに移し、プレーティングの前に24時間前まで予備減菌した。凍結した糞便サンプルは嫌気性チャンバーで解凍し、各培養条件に対して1mlあたり103CFUに希釈した。最適な希釈倍率は、サンプルごとの連続希釈実験によって決定された。希釈した糞便サンプル200マイクロリットルをプレート上に分注し、滅菌ガラスビーズを用いて広げた。プレートは乾燥を防ぐためジップロックバッグで密封し、37℃で5日間培養してコロニーを増殖させた。
菌株のイメージングと分離
菌株のイメージングと分離は、カスタム自動イメージング＆コロニーピッキングシステム（CAMII）を用いて行った。5日間の増殖後、寒天培地プレートをCAMIIシステムで自動的に画像化した（Fig.1c）。まず、プレートをカルーセルスタッカーに設置した。ロボットアームのグリッパーがバーコードスキャナーを通過してコロニーピッカー上の照明付きイメージングプラットフォームに個々のプレートを運び、Hudson RapidPick制御ソフトウェアによって2つの照明条件（落射照明と透過照明）でイメージングを行った。プレートラベルは撮影された画像とリンクしており、画像化されたプレートはロボットアームによって自動的に再スタックされました。イメージングプロセスの終了後、プレートは乾燥を防ぐためにジップロックバッグに密封され、カスタムスクリプトを使用して異なるコロニーをセグメント化し、その後のピッキングのために形態学的にユニークなコロニーを識別した（補足図1a）。形態学的特徴には、グレーチャネル（透過照明画像）およびRGBチャネル（落射照明画像）に沿った面積、周囲長、平均半径、円形度、凸度、慣性、平均および分散が含まれる。また、プレート上の全コロニーの生画像も収集する。
本研究で行ったランダムピッキングでは、スクリプトによって検出された全コロニーから所定数のランダムなサブセットを生成し、これらのコロニーに対して自動分離を行った。表現型誘導ピッキングでは、まず検出された全コロニーを形態に基づく最適化セレクションを行い、形態的多様性が最大となる所定数のコロニーのサブセットをCAMIIによって単離した。最適化されたコロニー選別の詳細なアルゴリズムは補足図1bに、プレート画像とコロニー形態の解析に使用したスクリプトはhttps://github.com/hym0405/CAMII でアクセスできる。
プレート画像を解析し、ピックするコロニーのリストを作成した後、これらのコロニーを単離するために、同様のロボットプロトコルを実行した。まず、プレートをピッキング用に再スタックし、マルチチャンネルメディアディスペンサーを使用して、50μlのmGAM液体培地を2枚のバーコード付き滅菌384ウェル光学プレート（Thermo Fisher Scientific、12-566-2；複製「A」「B」）の各ウェルに分注し、コロニーピッカーに移動させた。次に、寒天培地をコロニーピッカーに移し、熱滅菌した針で個々のコロニーを光学プレートに摘出した。コロニーピッキングが終了すると（寒天培地プレート）、自動的にプレートが交換され、すべてのウェルに接種された（光学プレート）。コロニーピッキング後、接種した光学プレートをプレートシーラー（Brandel、9795）に移し、密封して再スタックした。その後、光学プレートを37℃で5日間培養し、バクテリアの培養を行った。菌の増殖後、'A'プレートは下流のgDNA抽出を行い、'B'プレートの各ウェルに40%グリセロールを30μlずつ加え、-80℃に移し長期保管した。
コロニー形態学的解析
形態ガイドによるコロニー選択を実現するため、生画像処理で抽出したコロニー形態特徴を一元化し、単位分散にスケーリングした後、PCAにより埋め込んだ。さらに、埋め込んだ特徴量に最適化したコロニー選択アルゴリズムを適用し、形態的多様性が最も高いコロニー群を探索した（補足図1b）。
近接コロニーに対するASVの応答を評価するために（図4c）、プレート上の分離株について近接コロニー数を計算し、それらのX-Y座標間の距離が30ピクセルより短く、それらの半径の和を加えたものを「近接コロニー」のペアと定義した。抗生物質がコロニーの形態に及ぼす影響を避けるため、mGAM専用プレートで増殖したコロニーのみを形態解析に使用した。
特定の属の生育が他の属からどのような影響を受けるかを評価するために（Fig. 4d）。まず、上記のように「近傍コロニー」ペアを同定し、近傍コロニーとして属Aが存在する属Bのコロニーサイズと、近傍コロニーが存在しない属Bのコロニーサイズを比較することで、属Aの属Bへの増殖影響を定量化した。効果量は，近傍にA属が存在する場合の平均コロニーサイズと，近傍にA属が存在しない場合の平均コロニーサイズのfold-changeと定義し，近傍にA属が存在する場合と存在しない場合のサイズ分布についてMann-Whitney U検定によりP値を算出し，Bonferroni-Holm法によりFDR（偽発見率）補正を行った。また、抗生物質がコロニーの形態に及ぼす影響を避けるため、mGAM専用プレートで培養したコロニーのみを形態解析に使用した。
分類学的予測および標的分離
プレート上のコロニー形態が分類学的同一性の予測に役立つかを検証するため、データの豊富な属のコロニー（20個体すべてで100株以上分離）をモデルの学習とテストに供した。抗生物質の擾乱や近傍コロニーの影響を考慮し、14のコロニー形態学的特徴、抗生物質の状態、近傍コロニー数を用いてランダムにサンプリングした70%の分離株についてマルチラベルランダムフォレストモデルを学習し、残りの30%の分離株についてモデルの性能（精度と再現率）を評価した。モデルの学習と評価の手順は、バイアスを最小化するためにランダム化の設定を変えて20回ブートストラップし、ヌルモデル（分離株数に基づく予測）によりモデルのバックグラウンド性能を計算した。標的微生物の分離を行うために、H12、H13、H14の個体から別々にデータ豊富な属のコロニー（同じ個体から15個以上分離）に対してマルチラベルランダムフォレストモデルを上記のように学習させた。その後、同じ糞便サンプルをプレートアウトし、細菌増殖後の新しいプレートにモデルを適用してプレート上の全コロニーをスクリーニングし、対象となる属レベルの分類のコロニーを予測した。その後、プレートの全コロニーをCAMII上で分離し、16S V4配列決定を行って分類を特定し、標的分離の性能を評価した。
プレート上のコロニーの日次カイネティクス成長解析
日次で増殖動態をモニターするため、糞便サンプルH1t5をmGAM専用プレートにプレートアウトし、6日間の増殖期間中、毎日プレートを画像化した。画像上でコロニーの検出とセグメンテーションを行い、異なる日のコロニー形態の特徴をそのX-Y座標に基づいて照合した（Fig.4a）。その後，6日目にプレート上の全コロニーをCAMIIで分離し，16S rRNA配列決定による分類学的同定を行った．各属の初期増殖の違いを定量化するため、各日の検出コロニー数（X-Y座標で追跡）を6日目のコロニー総数で正規化し、各日における検出コロニーの割合を算出した（図4b）。
gDNA抽出
摘出した分離株のgDNAを、先行研究45から引用したシリカビーズビートベースのプロトコルを用いて、384ウェルフォーマットで抽出した。まず、40 µl の 0.1 mm ジルコニアシリカビーズ (Biospec, 11079101Z) と 120 µl の溶解液 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 and 0.2 mM EDTA) を 384 ウェル深穴プレート (Thermo Fisher Scientific, 07-202-505) の各ウェルに入れておく。次に、各ウェルに分離株の培養液40 µlを加え、プレートを4,500gで1分間遠心し、シールマット（Axygen、AM-384-DW-SQ）を貼付した。ビーズビート時の過熱を避けるため、ビーズビート前にプレートを5秒間ボルテックスし、-20℃で10分間インキュベートした。その後、プレートをビーズビーター（Biospec, 1001）に固定し、5分間ビーズビートを行い、その後10分間の冷却を行った。ビーズビートのサイクルを1回繰り返した後、プレートを4,500gで5分間遠心分離して細胞破片をスピンダウンさせた。次に、10 µl の細胞溶解液を 384-well PCR plate (Bio-Rad, HSP3801) に移し、Formulatrix Mantis を用いて 2 µl の proteinase K solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 and 1 µg µl-1 proteinase K (Lucigen, MPRK092)) を添加した。最後に、細胞溶解液をサーマルサイクラーでプロテイナーゼK消化し（65℃30分、95℃30分、4℃無限）、-20℃に移して長期保存した。糞便バルクサンプルのgDNA抽出は、96ウェルフォーマットの反応量をスケールアップして、同じプロトコルで行った。
16S rRNAアンプリコンシークエンス
分離株の分類学的同定のためのV4領域の16S配列決定は、デュアルインデキシング配列決定プライマーのセットを用いて384ウェルフォーマットで行われた。簡単に説明すると、バーコード付きの16S V4アンプリコンプライマーは、ユニバーサル16S V4プライマーを基に設計され、Integrated DNA Technologies社によって合成された。次に、バーコード付きフォワードプライマー16SV4f_5xxとリバースプライマー16SV4r_7xxのそれぞれ固有の組み合わせ1 µlを、Labcyte Echoを用いて384ウェルPCRプレートに移し、固有のデュアルインデックスプライマープレートを作製した。次に、384-well pin replicator (Scinomix, SCI-6010.OS) によりプライマープレートに〜130 nlのgDNAを移し、Formulatrix Mantisを用いて各ウェルに2 µl NEBNext Q5 PCR master mix (NEB, M0543L)を添加した。その後、サンプルをサーマルサイクラーで16S V4増幅（98 ℃ 30秒、40サイクル。98℃30秒、55℃20秒、65℃60秒、65℃5分、4℃無限大）。得られたアンプリコンライブラリーを手動でプールし、E-Gel EX Agarose Gels, 2% (Thermo Fisher Scientific, G402002)でゲル電気泳動した。予想されるDNAバンド(~390 bp)をゲルから切り出し、Wizard SV Gel and PCR Cleanup System (Promega, A9282)により製造者の指示に従って抽出し、PCRプライマーとアダプター二量体を除去した。ゲル精製したライブラリーをQubit dsDNA HS assay (Thermo Fisher Scientific, Q32851)で定量し、Illumina MiSeqプラットフォームでシーケンスした（試薬キット: v2 300-cycles、ペアエンドモード）で、20% PhiXスパイクイン（Illumina、FC-110-3001）と共に、Miseq試薬カートリッジ（100 µMストックの6 µl、ウェル12： 16SV4_read1, ウェル13： 16SV4_index1, ウェル14： 16SV4_read2) にスパイクしたカスタムシーケンス用プライマーで製造者の説明に従ってロード濃度8pMでシーケンスを行った。ライブラリー調製と配列決定に用いた全てのプライマーの塩基配列を補足表11に示す。バルクサンプルの16S V4配列決定は、96ウェルフォーマットで反応量をスケールアップして同様のプロトコルで実施した。さらに、SYBR Green I (最終濃度: 0.2×; Thermo Fisher Scientific, S7563)をPCR反応に加え、定量的16S V4増幅を行い、指数期(通常13-17サイクル)で停止し、最終伸長ステップまで反応を進めた。
16S rRNAアンプリコン解析とASVクラスタリング
16S V4アンプリコンの生シーケンスリードは、USEARCH v11.0.667 (ref. 46)で解析しました。具体的には、ペアエンドリードをデフォルト設定の「-fastq_mergepairs」モードでマージした。マージされたリードは、「-fastq_maxee 1.0 -fastq_minlen 240」オプション付きの「-fastq_filter」モードで品質フィルタリングを行い、予想エラー塩基数が1未満で240 bp以上のリードのみを保持するようにしました。残ったリードは重複排除（-fastx_uniques）し、100%同一性のASVにクラスタリング（-unoise3）し、マージしたリードをASV配列と検索（-otutab）してASV数表を作成しました。ASVの分類は、Ribosomal Database Project classifier v2.13 with 16S rRNA training set 18 (ref. 47)で学習させたものを使用しました。バルクサンプル中のASVの相対的存在量は、ASVのリード数をマッピングされたリードの総数で正規化したものとして定義されます。
分離菌株の分類と 16S 系統解析
ASVクラスタリング後、ASVカウントテーブルを解析し、各単離株について、総リード数、リード数が最も多いASV、そのASVの純度を算出しました。リード数が足りない、あるいは純度が悪い（リード数<5、純度<0.5）分離株はフィルタリングし、残った分離株の分類をリード数の最も多いASVとした。分離株の系統を構築するために、MUSCLE v5 (ref. 48) を用いて分離株のASV配列に対してマルチシーケンスアライメントを行い、その後、アライメントしたASV配列をMEGA v11.0.11 (ref. 49) で解析し、系統構築のデフォルト設定で近隣結合樹を算出した。
単離株の全ゲノム配列決定とリードの処理
16S V4アンプリコンシーケンスに用いたのと同じgDNAを、分離株の全ゲノムシーケンスに供した。少量Nexteraライブラリー調製の公開プロトコル50に従ってペアエンドライブラリーを構築し、Illumina Nextseq 500/550プラットフォーム（2×75 bp）およびHiSeqプラットフォーム（2×150 bp）で配列決定しました。その後、Cutadapt v2.1を用いて、'-minimum-length 25:25 -u 10 -u 5 -U 10 -U 5 -q 15 --max-n 0 --pair-filter=any' というパラメータで生リードを処理し、低質塩基とNexteraアダプタを除去しました。カバレッジは1株あたり142±286万ペアエンドリードで、一部の株ではSNPsaurusによりPacBioロングリードシーケンスを行い、de novoゲノムアセンブリの性能を向上させた。
De novoゲノムアセンブルとSNP変異解析
イルミナリードとPacBioロングリードをUnicycler v0.4.4 (ref. 51)で初期設定のままアセンブルし、ドラフトゲノムを作成し、QUAST v4.6.3 (ref. 52), CheckM v1.0.13 (ref. 53) and GTDB-Tk v0.2.2 (ref. 54) で品質と種レベルの分類を評価しました。3,271株のアセンブリのうち、1,197株が高品質ドラフトゲノム（カバレッジ>20×、N50 > 5,000 bp、完全性>80%、汚染<5%）と定義され、下流のゲノム変異およびHGT解析に使用されました。腸内細菌叢分離株の個人内および個人間の株レベルのゲノム変異を同定するために、各生物種の完全性とN50が最も高いドラフトアセンブリをリードアライメントの基準ゲノムとして選択し、分離株の処理済みイルミナリードをBowtie2 v2.3.4 (ref. 55) でペアエンドモード、「--非常に敏感」設定で同じ種の基準ゲノムにアライメントを行った。その結果得られたリードのアラインメントをSAMtools v1.9 and BCFtools v1.9 (ref. 56) で処理し、'--ploidy 1' 設定でゲノム変異 (SNPs and Indels) を検出しました。得られた変異は、「信頼できる」遺伝子型（≥5リードでカバーされ、≥0.9ハプロイドを持つ）を識別するための品質フィルタリングにかけられ、すべての分離株で90%以上の「信頼できる」遺伝子型を持つSNP変異のみが下流解析に使用された。SNPに基づく系統樹を構築するために、SNP部位における分離株の塩基プロファイルを連結し、UPGMA樹をMEGA v11.0.11でデフォルト設定で計算した。
ゲノムワイドANI計算
バイオバンクから分離された未培養種を同定するため、本研究で得られたドラフトゲノムと公開データベースから得られたMAGsまたは分離株のゲノム間の平均塩基同一性をFastANI v1.0 (ref. 57) で計算し、ANIが95%以上のゲノムを同一種とみなした。
HGTの同定とアノテーション
H1株内の種間で生じたHGTを同定するために、BLASTN v2.7.1 (ref. 58) を用いて、異なる種の全ゲノムペアを「-evalue 0.1 -perc_identity 99」設定で比較し、配列同一性の高いゲノム領域ブロックを系統的にスクリーニングしました。HGT候補のP値は、分離株間のゲノムワイドANIに基づいて計算され、さらにBenjamini-Hochberg手順で調整された。P値＜1×10-5、長さ2,000bp以上のブラストヒットは、異なる種の分離株間のHGTイベントとみなされた。種間のHGTの頻度は、以前に発表された方法39,59を用いて定量化し、少なくとも1つのHGTを共有する種間ゲノムペアの数を種間ゲノムペアの総数で割ったものと定義した。HGTエレメントのARGと分泌システムをアノテーションするために、メタゲノムモードのProkka v1.12 (ref. 60)でHGTエレメントの配列をアノテーションし、得られたCDSをBLASTP v2.7.1 でCARD database v3.1.4 (ref. 61) に対して検索し、e値<1 × 10-5、同一性>20、クエリカバレッジ>50でARGヒットを特定しました。また、EffectiveDB62により、HGT要素のCDS上で分泌系をデフォルト設定で予測した。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。
データの入手方法
本研究で作成した配列データは、NCBI BioProjectデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/）にアクセッション番号PRJNA745993で提出されている（ref.63）。形態学的特徴や生画像を含む分離株コレクションの他の関連データは、http://microbial-culturomics.com でアクセスできる。ASVの分類は、Ribosomal Database Projectから提供された16S rRNAトレーニングセット18に基づいて割り当てられた。ARG遺伝子のアノテーションはCARDデータベースv3.1.4、HGT要素の分泌システムのアノテーションはEffectiveDBデータベースをそれぞれ使用した。
コードの入手方法
本研究でプレート画像の解析に使用したスクリプトは、https://github.com/hym0405/CAMII 参考文献にアクセスできる。64.
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参考文献のダウンロード
謝辞
原稿へのアドバイスとコメントをいただいたWang研究室のメンバーに感謝します。H.H.W.は、NSF (MCB-2025515), NIH (1R01AI132403, 1R01DK118044 and 1R21AI146817), ONR (N00014-18-1-2237 and N00014-17-1-2353), Burroughs Wellcome Fund (1016691), Irma T. Hirschl Trust and Schaefer Research Awardからの関連資金援助に謝意を表する。R.U.S.はFannie and John Hertz Foundation FellowshipとNSF Graduate Research Fellowship（DGE-1644869）の支援を受けている。T.M.はNIH Medical Scientist Training Program (T32GM007367)の支援を受けている。M.R.とF.V.-C.はNSF Graduate Research Fellowship (DGE-1644869)による支援を受けている。C.R.はSimons Society of FellowsからJunior Fellows Scholarshipの支援を受けている。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Yiming Huang, Ravi U. Sheth.
著者と所属
コロンビア大学システム生物学教室（米国ニューヨーク州ニューヨーク市
Yiming Huang, Ravi U. Sheth, Shijie Zhao, Lucas A. Cohen, Kendall Dabaghi, Thomas Moody, Deirdre Ricaurte, Miles Richardson, Florencia Velez-Cortes, Tomasz Blazejewski, Andrew Kaufman, Carlotta Ronda & Harris H. Wang.
コロンビア大学生物医学情報学科、ニューヨーク、米国
孫 毅偉
コロンビア大学・病理学・細胞生物学教室（米国ニューヨーク州ニューヨーク市
Harris H. Wang
寄稿
Y.H., R.U.S. and H.H.W. developed the initial concept; Y.H., K.D. and T.B. developed morphology-based colony selection software; Y.H., R.U.S. and L.A.C. performed experiments and analyzed data with input from H.H.W.; T.M, D.R., Y.S., M.R., F.V.-C., A.K. and C.R. はコロニーの分離を、Y.S. と S.Z. は分離株のWGSをサポートし、 Y.H., R.U.S., S.Z. and H.H.W. wrote the manuscriptを担当した。他のすべての著者は、結果について議論し、原稿を承認した。
共著者
Harris H. Wangに連絡する。
倫理的宣言
競合する利益
H.H.W.は、SNIPR Biome, Kingdom Supercultures, Fitbiomics, Arranta Bio, VecX Biomedicines, Genus PLCの科学顧問、Aclidの科学共同創設者ですが、これらはすべてこの研究には関係ありません。R.U.S.とK.D.はKingdom Superculturesの共同設立者である。その他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言している。
査読情報
査読情報
Nature Biotechnologyは、Peter Turnbaugh氏とその他の匿名の査読者の方々に感謝します。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。
補足情報
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補足図1-13
報告書の概要
補足表
補足表1-11.
権利と許可
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Huang, Y., Sheth, R.U., Zhao, S. et al. 自動化と機械学習を用いたハイスループットな微生物培養学（High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol (2023)。https://doi.org/10.1038/s41587-023-01674-2。
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受領日
2021年8月12日
受理済
2023年1月11日
掲載
2023年2月20日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41587-023-01674-2
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