大腸TRPV4過剰発現は便秘の重症度に関係する

2023年1月31日 17:46

公開日：2023年1月13日
大腸TRPV4過剰発現は便秘の重症度に関係する

https://bmcgastroenterol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12876-023-02647-0

三原浩, 内田邦敏, ...安田一郎執筆者表示
BMC Gastroenterology 23巻、記事番号：13（2023）この記事を引用する

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1 アルトメトリック

指標詳細

概要
背景
慢性便秘症は、大腸の過敏性と腸内細菌、特に粘膜関連細菌叢の様々な変化が関与していると言われている。ここでは、大腸上皮細胞株と腸内細菌およびその誘導体を共培養し、TRPV4発現の制御機構を検討した。また、便秘症患者の大腸上皮におけるTRPV4の発現を検討した。

方法
大腸上皮細胞株を各種腸内細菌（菌体成分および上清）、葉酸、LPS、または短鎖脂肪酸と共培養した。TRPV4の発現量とプロモーターDNAのメチル化をパイロシークエンスとマイクロアレイネットワーク解析で評価した。ヒト試料については、相関係数を算出し、重回帰分析を用いて、臨床背景、直腸TRPV4発現量、粘膜関連微生物叢との関連を検討した。

結果
CCD841細胞とP. acnes, C. perfringens, S. aureusとの共培養はTRPV4の発現を一過性に低下させたが、メチル化は誘導されなかった。K. oxytoca, E. faecalis, E. coliの臨床分離株や標準株との共培養によりCCD841細胞のTRPV4発現は増加し、TRPV4およびTNF-α発現は大腸菌培養上清により増加したが菌体成分により増加することはなかった。葉酸、LPS、IL-6、TNF-α、SCFAs単独ではTRPV4の発現に変化はなかったが、大腸菌培養上清に暴露した後のTRPV4の発現は酪酸またはTNF-αR1阻害剤で抑制され、p38阻害剤で上昇した。マイクロアレイ解析により、TNF-α、サイトカイン、NODシグナルの活性化が示された。TRPV4の発現は、回腸末端から大腸にかけての便秘患者で高く、重回帰分析により、低便回数、排便補助回数、持続時間がTRPV4発現と関連していることが示された。一方、不完全排便、排便に要する時間、24時間あたりの排便失敗回数は、E. faecalis頻度の増加と関連していた。

結論
大腸上皮細胞は、K. oxytoca、E. faecalis、または大腸菌上清と共培養するとTRPV4の発現が増加し、p38以外の経路でTNFα刺激によるTNFαR1発現も増加した。酪酸処理により、この増加が抑制された。便秘症患者では上皮性TRPV4の発現が増加しており、TRPV4とE. faecalisの頻度増加が便秘の諸症状の病態に関与している可能性が示唆された。

ピアレビュー報告
背景
慢性便秘症は、特に高齢者に多く、有病率5％と頻度の高い疾患である。直腸を刺激すると排便が誘発されるが[1]、便秘患者の23％、特に排便障害患者では直腸の感度が低く[2、3]、腸の感度の機能不全が慢性便秘の発症に関与することが示唆される。下部消化管の機能性疾患は、腸内細菌叢と関連している。先行研究では、高齢者ではActinobacteria（Bifidobacterium、acnesなど）やFirmicutes（Lactobacillus、Staphylococcaceae、Clostridiumなど）の有病率が低下し、Protozoa、Bacteroidetes、Proteobacteria（E. coliなど）が増加することがわかっています [4]．便秘における腸内細菌の変化については、遠位結腸の通過時間が腸内細菌叢の多様性と相関しています[5]。欧米の若年・中年女性における腸管通過時間の延長は、プレボテラ属菌の減少と関連している[6]。日本人の腸内細菌には性差があり、この多様性は便の形状尺度と関係がない。Oscillospira spp.は硬い便で増加し、Bifidobacteriumは便秘を経験する女性の便で有意に多くなる[7, 8]。便秘患者の粘膜関連細菌叢では、Bacteroidetesが増加し（Flavobacteriaceaeが増加、Odoribacteraceaeが減少）、BifidobacteriumとFaecalibacteriumは減少していた[9]。

TRPV4 (transient receptor potential channel vanilloid 4) は非選択的カチオンチャネルで、機械刺激、低浸透圧、熱、エポキシイソサトリエン酸によって活性化される。TRPV4 は，PAR-2，5-HT，ヒスタミンによっても感作される [10, 11]．TNFαで刺激された歯髄細胞はTNFR1およびp38 MAPKシグナル経路を介してTRPV4の増強を示し [12]、関節軟骨ではErkおよびp38 MAPKシグナル経路を介してTRPV4の増強が起こる [13, 14]。しかし、消化管上皮におけるTRPV4活性の制御機構は不明である。酪酸はTNFαの発現誘導を抑制することが知られている[15, 16]。我々は以前、TRPV4が大腸を含む消化管上皮全体に存在し[17]、生理的あるいは異常な消化管運動や知覚に関連していることを明らかにした。また、ピロリ菌感染患者の胃上皮では、TRPV4の発現がDNAメチル化によりサイレンシングされており、ピロリ菌除菌により発現が回復することを見いだしました[18]。大腸上皮細胞では、葉酸やLPSが様々な遺伝子のメチル化に関与していることが示されている[19,20,21,22]。本研究では、大腸上皮におけるTRPV4の発現に関与する細胞内シグナルを解明することを目的とした。胃のH. pyloriと同様に、TRPV4のメチル化は腸内細菌によって抑制され、TNFαの処理によって増加する。我々は、健常者と慢性便秘患者の大腸上皮におけるTRPV4発現の変化が、便秘の症状や粘膜付着性腸内細菌集団とどのように関連しているかを調べた。

方法
細胞株および培養条件
CCD 841 CoTr細胞（ATCC Cat# CRL-1807, RRID:CVCL_2872）は、製造元の説明書に従って培養した。この細胞は、33℃の加湿インキュベーターで維持した。CCD841 細胞が機能的に活性な TRPV4 を発現していることは既に報告した[23]。

共培養条件
本研究では、代表的な臨床分離腸内細菌12株、次いでTRPV4の発現を変化させることが知られている標準分離腸内細菌10株を評価した（追加ファイル2: 表S1）。便秘に関連する腸内細菌のリストは網羅的ではないが、本研究では可能な限り便秘との関連が示唆されている腸内細菌を選択した。臨床分離株は富山大学医学部附属病院臨床検査部より、標準株は理化学研究所微生物材料開発研究所または大阪大学微生物病研究所より入手した。好気性菌はBacto Tryptone（1〜7日）で，嫌気性菌はGAM Semisolid "Nissui "で微好気条件（5％O2，10％CO2，85％N2，37℃；三洋電機Multigas Incubator；Tokyo, Japan）で培養し，好気性，嫌気性，嫌気性の各菌種を得た．東京，日本），湿度100％，回転数160rpmのジャイロシェイカー（Thermo Shaker; Thermonix, Tokyo, 日本）内で行った。吸光度0.1＝108個/mLの式で、各培養液中の菌体濃度を推定した。CCD 841細胞と細菌株との共培養は、若干の修正を加えて、先に述べたように行った[24]。簡単に言うと、CCD 841細胞を6cmの培養皿に播種し、上記のように24時間培養した後、培養物をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄した。抗生物質やFBSを含まない新鮮な培地は、細菌を加える1時間前に加えた。細菌はまず上記の条件で培養し、PBSで2回洗浄した後、CCD 841細胞培養物に細菌／細胞の比率が50：1になるように直接添加した。共培養は指示された時間インキュベートされた。菌体上清および菌体成分の調製は、O.D.値が0.1（10^8）の菌体懸濁液を細胞培養液に添加し、1日培養した後に上清および菌体を回収した。菌体成分は、菌体懸濁液を100℃で20分間加熱することにより作製した。加熱後、再度菌を培養し、不活性化が完了していることを確認した。培養上清は0.22umのフィルターでろ過し、原液のままでは細胞に毒性があるため、新鮮な培養液で50％希釈した。

化学物質
特に断らない限り、以下の化合物はシグマ社（ミズーリ州セントルイス）のものであり、使用した濃度および処理時間を記載する：IL-6（日本、フナコシ、2. 5ng／mlで6時間または24時間）［25］、TNF-α（1〜100ng／mlで1時間〜24時間）、葉酸（100μM）、LPS（1pg／ml〜20g／ml）［26］、酪酸、酢酸、プロピオン酸（100μM）［27］；TNF-a受容体1（TNFR1）阻害剤R 7050（5μmol／ml）とp38阻害剤SB202190（10または100μM）であった。

逆転写PCR解析
実験は、以前に報告されたように行った[18]。RNeasy Mini Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を用いて、全RNA（1μg）を単離した。定量的 RT (qRT) -PCR は、QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) を用いて、7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) または iQ5 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) で実施した。サイクリング条件は、94 ℃ 5 分、94 ℃ 15 秒、60 ℃ 30 秒の 40 サイクルであった。プライマー情報は、Additional file 2: Table S2 に記載されている。

ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは、Additional file 2: Table S3にまとめた抗体を用いて、以前に記載したように行った[28]。CCD841細胞ライセートを7.5%SDS-ポリアクリルアミドゲルのSDS-PAGEによって分離し、ポリビニリデン膜に移した。膜を切断し、BlockAceでブロックし、一次抗体でプローブした。免疫陽性バンドは、ECLシステム（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）およびImageQuant LAS4000（GE Healthcare）装置で可視化した。TRPV4およびβ-Actinのバンド密度は、ImageJソフトウェア（https://imagej.nih.gov/ij/）を用いて測定した。

定量的DNAメチル化解析
DNAは、AllPrep DNA/RNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA)を用いて抽出した。DNAの重亜硫酸塩変換は、EpiTect bisulfite kit (QIAGEN, Valencia, CA)を用いて実施した。ビオチン化ポリメラーゼ連鎖反応は、TRPV4遺伝子配列を特異的に増幅するプライマーを用いて行った（Additional file 2: Table S4）。PCRアッセイには、95℃、30秒間の変性ステップ、様々な温度での30秒間のアニーリングステップ、72℃、30秒間の伸長ステップが含まれた。パイロシークエンスは、PSQ HS 96 Gold一塩基多型試薬とPyromark Q24 pyrosequencing machine (Biotage, Uppsala, Sweden) を使用して実施した。パイロシークエンシングのプロトコルは、以前に詳しく説明されている[29]。パイロシーケンスでは、あるプロモーターにおける複数のCpG部位のメチル化状態を定量的に測定する。これらの隣接する部位は、通常、非常に一致したメチル化状態を示します。したがって、検出された部位のメチル化率の平均値を、各遺伝子プロモーターの代表値として用いた。

遺伝子発現マイクロアレイとデータ解析・フィルター基準
cRNA を増幅し、標識し、製造元の説明書に従って 60K Agilent 60-mer オリゴマイクロアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションされたマイクロアレイスライドのスキャンには、Agilent スキャナーを使用した。相対的なハイブリダイゼーション強度とバックグラウンドハイブリダイゼーション値は、Agilent Feature Extraction Software (9.5.1.1) を用いて算出した。ハイブリダイゼーション強度（gProcessedSignal）、スポット情報（gIsSaturatedなど）から、Agilentが推奨する手順に従って、各プローブのRawシグナル強度とFlagsを算出した。(GeneSpring Softwareでのフラグ基準。GeneSpring Softwareのフラグ基準：Absent（A）：「Featureが陽性かつ有意でない」「Featureがバックグラウンド以上でない」、Marginal（M）：「Featureが一様でない」。Marginal (M): "Feature is not Uniform", "Feature is Saturated", "Feature is a population outlier"; Present (P): その他). さらに、2つのサンプルの生のシグナル強度をlog2変換し、Bioconductorソフトウェア[31]の「preprocessCore」ライブラリパッケージ[30]を用いて分位数アルゴリズムで正規化した。少なくとも1つのサンプルで'P'フラグを持つプローブを選択し、lincRNAプローブは除外した。発現が上昇または下降している遺伝子を特定するために、コントロールと実験サンプル間の比較のために、各プローブの正規化されたシグナル強度に基づくZスコア[32]と比率（非ログスケール倍率変化）を計算した。そして、Z-score ≧ 2.0 かつ ratio ≧ 1.5-fold が発現上昇を、Z-score ≦ -2.0 かつ ratio ≦ 0.66 が発現低下を示すことを制御対象遺伝子として基準を設けた。KEGGデータベースとのマイクロアレイネットワークの解析は、DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) を用いて行った[33]。本研究で作成・解析したデータセットは、GEOリポジトリ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE208164）で公開されている。

患者背景、直腸生検試料、粘膜付着菌について
便秘症患者（ROME IV基準）[34]と富山大学医学部附属病院で健康診断を受けた患者を本研究の対象とした。患者背景（年齢、性別）、Bristol stool shape scale（BS）、便秘重症度スコア（CSS）を記録した。大腸内視鏡検査時に粘膜生検（回腸末端、盲腸、S状結腸、直腸）検体と粘膜関連腸内細菌をブラシ（オルセレックス、医学生物学研究所、日本）で採取し、RNAlater（QIAGEN、ドイツ）にて保存した。CSSは，①排便回数，②排便痛，③排便不完全，④腹痛，⑤1回あたりの排便時間，⑥排便補助，⑦24時間以内の排便不成功，⑧便秘[35]と緩行性便秘・排便障害期間、の8項目からなり，ほとんどの症例でこれらの項目は合併症であった．

粘膜関連腸内細菌科比率
細菌特異的プライマーは、Additional file 2: Table S5 [36,37,38,39,40,41,42] に記載されている。P. acnes, E. coli, K. oxytoca, C. perfringens, E. faecalis, S. aureus の 16 srRNA に対する比率を算出し、因子間の相関係数を算出し、重回帰分析した。また、マルチミックスプライマーを用いた抗原特異的リアルタイムPCRにより、大腸菌のO抗原、H抗原の両者の比率との相関を検討した[43]。

データ解析と統計
qRT-PCR データは、3 回以上の独立した実験の平均値±SEM として示した。有意性の判定にはStudentのt-testを用い、p＜0.05とした。2群のデータが等しく分布していないため、t-検定にはWelchの方法を用いた。臨床検体の検査では、サンプルサイズは入力する独立変数の数の10倍として計算された。患者1人につき健常者3人の計40人を対象とした。各項目の相関係数はノンパラメトリックなスピアマン法で算出し、CSSサブスコア（CSS sub）に関連する項目はSPSS Statistics 24.0（IBM Corp.）を用いて重回帰分析（強制入力法）で検討した。

結果
CCD841細胞の共培養試験
P. acnes、C. perfringens、S. aureusの臨床分離株と1日間共培養したCCD841腸管上皮細胞では、TRPV4 mRNAの発現が有意に減少した。一方、K. oxytoca、E. faecalis、E. coliとの7日間の共培養では、TRPV4の発現の有意な増加が観察された。Lactobacillus, F. nucleatum, Bifidobacteria, C. butyricum, B. fragilis, Ruminococcusとの7日間の共培養では発現に変化は見られなかった（Fig. 1A）。発現が増加した菌は、3日間の共培養で発現が増加した。発現が低下したものについては、P. acneまたはC. perfringensとの共培養でまず発現が低下し、その後共培養3日後から増加し始め、この増加傾向は7日まで続いたが、S. aureusとの共培養では7日後から低下した（Fig. 1B）。次に、TRPV4の発現を変化させることが知られている腸内細菌の標準菌株を用いて同様の実験を行ったところ、同様の傾向が見られた（Fig.1C）。

Fig.
図1
CCD841細胞と細菌懸濁液の共培養がTRPV4発現に与える影響。A CCD841細胞をP. acnes、C. perfringensまたはS. aureus（臨床株；黒棒）と1日共培養した際のTRPV4 mRNA発現量の減少。K. oxytoca、E. faecalis、E. coli（白バー）と7日間共培養すると、TRPV4 mRNAの発現が増加した。他の種類の細菌（灰色のバー）との共培養はTRPV4発現に影響を与えなかった。アスタリスクは、未処理の対照細胞に対する発現の有意な変化を示す。エラーバーは5～6回の試行の平均±S.E.を表す。B 共培養1日後にTRPV4発現が減少した菌については、共培養3日後および7日後にTRPV4発現の抑制が戻った。C K. oxytoca、E. faecalisまたは大腸菌（標準株）と7日間共培養したCCD841細胞でTRPV4発現が増加した。

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パイロシークエンスによる細菌暴露後のTRPV4遺伝子のメチル化の検出
TRPV4の発現抑制を示すP. acnes、S. aureus、C. perfringensと1日共培養したCCD841細胞において、TRPV4遺伝子プロモーターメチル化の異常が生じるかどうかを検討したが、メチル化の変化はほとんど検出されなかった（Additional file 1: 図S1）。陽性対照として、高いメチル化レベルを有することが知られている2つの結腸癌細胞株、DLD1およびHCT116[44]のメチル化レベルは、それぞれ87%および92%であることが示された。

細菌上清はTRPV4とTNF-alphaの発現を増加させる
TRPV4の発現を増加させる成分が、細菌上清に関連しているのか、細菌成分そのものなのかを調べるために、K. oxytoca、大腸菌（O111）、E. faecalisの影響を検討した。CCD841細胞とK. oxytoca（1日共培養の場合）または大腸菌（3日共培養の場合）の菌体上清を共培養すると、いずれも菌体成分を処理した場合と比較してTRPV4発現が有意に増加した。E. faecalis（1日）については、菌体成分および菌体上清のいずれも、CCD841細胞におけるTRPV4の発現をわずかではあるが有意に増加させた（図2A）。一方、菌体代謝産物である葉酸、LPS（1 ng ~ 20 µg/ml）、SCFA（酪酸、酢酸、プロピオン酸）で3日間処理しても、どの濃度でもTRPV4発現に変化はなかった（図2B）。また、主要なサイトカイン（IL-6およびTNF-α）で6〜24時間処理したが、TRPV4の発現に変化は見られなかった（図2C）。しかし、CCD841細胞をK. oxytoca（1日）または大腸菌（3日）の培養上清で処理すると、TNF-αの発現レベルが著しく上昇したが、E. faecalisの上清では上昇しなかった（Fig. 2D）。

図2
図2
CCD184細胞におけるサイトカイン発現に及ぼす細菌上清または成分との共培養の影響。A CCD841細胞をK. oxytoca上清（SN）に1日暴露するとTRPV4発現が増加するが、K. oxytoca菌体成分（BC）と1日共培養するとTRPV4発現が増加しないことがわかった。E. coli (O111) SNに3日間暴露するとTRPV4の発現が増加したが、E. coli BCに3日間暴露してもTRPV4の発現は増加しなかった。E. faecalis SNまたはBCのいずれかに1日暴露するとTRPV4の発現が増加した。B 葉酸、LPS（1 ng ~ 20 µg/ml）、SCFA（酪酸、酢酸、プロピオン酸）を任意の濃度で3日間処理しても、CCD841細胞のTRPV4発現には影響がなかった。C ヒトIL-6またはTNF-αを任意の濃度、任意の時間（6、8または24時間）投与しても、CCD841のTRPV4発現に影響を与えなかった。D K. oxytocaまたは大腸菌SNを1日暴露するとCCD841細胞のTNF-α発現は増加したが、E. faecalis SNおよびBCを1日暴露すると増加しなかった。* は未処理対照との有意差を示す。エラーバーは5～6回の試行の平均±S.E.を表す。

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大腸菌上清曝露に応答したCCD841細胞におけるマイクロアレイネットワーク解析
CCD841細胞を低濃度（1 ml supernatant/3 ml medium）の大腸菌（O-111）上清で処理し、KEGG pathwayデータベースを用いたマイクロアレイネットワーク解析を実施した。この解析により、TNF-αシグナル、サイトカイン、NODの活性化が確認された。有意な変化を示したそれらのパスウェイをAdditional file 1に示す。qRT-PCRによる発現上昇遺伝子の追跡は、TNFαR1量が増加し、TNFαR2発現の増加はわずかであったが、マイクロアレイの結果を確認した（図3）。また、ウェスタンブロッティングの結果、タンパク質レベルではTRPV4の発現が有意に増加し、TNFαR2タンパク質の明確な増加は認められなかった（図4）。

図3
図3
細菌上清はTNFαシグナル伝達経路の遺伝子発現に影響を与える。CCD841細胞を大腸菌（O111）上清（SN）に暴露すると、TRPV4、TNFα、TNFR1、TNFR2、IL-1、IL-6、NOD2、およびMMP mRNAの相対量が増加した。# は、処理した細胞と未処理の対照細胞との間の有意差（p < 0.05）を示す。エラーバーは5～6回の試験の平均±S.E.を示す。

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図4
図4
大腸菌E. O111上清がCCD841細胞におけるTRPV4タンパク質発現に及ぼす影響。大腸菌（O111）上清（SN）と3日間共培養したCCD841細胞のウェスタンブロットは、未処理の対照細胞に対してTRPV4タンパク質の発現が有意に増加することを示している（*p < 0.05）。エラーバーは5〜6回の試行の平均±S.E.を表す。ブロットの右端のレーンにはラダーが表示されている

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TRPV4の発現調節機構をさらに検討するために、CCD841細胞を大腸菌培養上清に3日間暴露した後のTRPV4発現の増加に、葉酸、SFCA、TNFαR1阻害剤、p38阻害剤がどのように影響するかを検討した。酪酸またはTNFαR1阻害剤で処理すると発現の増加は抑制されたが、p38阻害剤で処理するとさらに増加した（図5）。

図5
図5
細菌上清と共培養したCCD841細胞におけるTRPV4発現に対するTNFα阻害剤の効果。CCD841細胞を大腸菌（O111）上清（SN）に3日間複合暴露した。酪酸またはTNFaR1阻害剤（TNFaR1I）は、SN曝露により誘導されるTRPV4の発現を抑制したが、10μM（P38I）または100μM（P38*10）のp38阻害剤SB202190は、その効果を認めなかった。# は未処理対照との有意差を示す。エラーバーは5〜6回の試行の平均±S.E.を示す。

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便秘患者におけるTRPV4過剰発現の検討
便秘患者（n = 5）と健常者（n = 9）の回腸末端、盲腸、S状結腸、直腸におけるTRPV4の発現を比較したところ、便秘患者の直腸においてTRPV4の発現が有意に増加していたが、回腸末端においても差が認められた（図6）。そのため、直腸のみから検体を追加採取し、40名の被験者について解析を行った。表1に、ROME IV基準による健常者と便秘患者のTRPV4発現量、男性率、年齢、Bristol scale（BS）、便秘重症度スコア（CSS）（トータルスコアとサブスコア）、直腸付着菌比率（％）を示す。女性の多くは50代後半までに閉経を迎えるため、ホルモンの影響を最小限に抑えるため、56〜86歳（平均69.9歳）の女性のデータを使用した。この研究では、68％が男性で、残りの32％が閉経後の女性であると仮定しています。健康群では、67.8％が男性で、平均年齢は68.7歳、平均総CSS値は1.64、平均BS値は3.9であった。便秘群では、77.8％が男性で、平均年齢75.4歳、平均総CSS9.56、平均BS3.1（総CSS平均3.6、BS平均3.5）であった。スピアマン相関係数（表2）により、BSと総CSSは逆相関し、TRPV4発現はCSS sub8（便秘の期間）と相関していることが示された。また、いくつかの因子がCSSサブスコアと相関していることがわかった（表3）。重回帰分析における各CSSサブスコアのB値と統計的有意性（p＜0.05）を示すp値から、CSS sub1（稀発便回数）、CSS sub6（排便補助）、CSS sub8（便秘の期間）はTRPV4発現と、CSS sub3（排便不完全）、CSS sub5（1回あたりの排便時間）、CSS7（24時間あたりの排便不成功回）はE. faecalisと相関があることが示唆された。大腸菌O抗原によるTRPV4発現と便秘症状に差は認められなかった（データ未提示）。

図6
図6
慢性便秘患者の腸管組織におけるTRPV4発現は、健常対照者と比較して増加している。慢性便秘患者（CC、n = 5）は、健常者（n = 9）と比較して、末端回腸（TI）、盲腸（Cec）、S状結腸（Sig）、直腸（Rec）においてTRPV4発現が増加しており、直腸における増加は有意であった（#p < 0.05; n = 40）。エラーバーは平均値±S.E.を示す。

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表1 研究参加者の背景情報 (n = 40)
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表2 各因子間の相関係数
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表3 CSSサブスコア、TRPV4発現量、腸内細菌比率の重回帰分析結果
全角の表
考察
胃上皮でTRPV4メチル化を誘導したH. pylori [18, 45]とは異なり、ここでは調べた腸内細菌および代謝産物は大腸上皮でTRPV4メチル化を誘導しなかった。そこで、便秘患者と健常者の全便材料を用いてTRPV4発現の変化を調べたが、便上清中の濃度の定量化（N = 6）が確立されていないため、サンプル間の比較はできなかった。そこで、便秘患者の大腸上皮におけるTRPV4が増加していることを確認し、TRPV4の発現増加を誘導する腸内細菌、およびそのメカニズムや臨床症状との関連について検討した。E. faecalis、K. oxytoca、E. coli（O127、O111）の臨床株、標準株ともにTRPV4発現が増加し（図1）、K. oxytocaとE. coliでは菌体成分ではなく培養上清がTRPV4発現の増加と関連していた。一方、E. faecalisについては、菌体成分および菌体上清のいずれもTRPV4の発現をわずかに増加させた。本研究では、TNFα単独ではTRPV4の発現を増強しなかったが、大腸菌上清では、マイクロアレイネットワーク解析および定量PCRの結果、TNFαシグナルとTRPV4の発現が増強された（図2、3、追加ファイル1：図S2）。TNFαシグナルは、TNFα依存的なTRPV4発現への影響の変化がTNFR1およびp38 MAPKシグナル伝達経路を介して現れる歯髄細胞などの他の細胞型においてTRPV4の発現を誘導する[12]。関節軟骨では、Erkとp38 MAPKのシグナル伝達経路を介した変化が見られる[13, 14]。本研究では、TNFαR1阻害剤で変化が抑制され、p38阻害剤では抑制されなかったことから、p38経路以外のErkまたはJNK経路がTRPV4レベルに影響を与えている可能性がある（図5）。TNFαの発現は酪酸によって抑制されることが知られており[15, 16]、本研究の結果から、大腸菌培養上清共培養に伴うTRPV4の発現亢進を抑制する酪酸の作用にはTNFα発現の抑制が関わっている可能性が示唆された。

また、TRPV4の発現は培養上清中の未知の成分によって上昇することから、酪酸はTRPV4の増減には直接影響しないが、これら他の成分によって誘導されるTRPV4の発現上昇を抑制している可能性が示唆された。次に、便秘患者と健常者の臨床情報およびヒト検体を用いて、便秘症状とTRPV4発現および直腸粘膜付着細菌との関係を検討したところ、直腸粘膜付着細菌はE. faecalisとTRPV4の2種類であった。E. faecalisの頻度およびTRPV4の発現は，いくつかのCSSサブスコアと関連していた．高齢者で頻度の減少を示すFirmicutes（Lactobacillus）に属するE. faecalisは酪酸を生産せず、Lactobacillusが相対的に増加するとTRPV4発現が増加し腸管知覚異常を引き起こすと考えられるが、この因果関係については今後の検討が必要と思われる。

本研究の結果は、便秘症状とTRPV4発現の抑制ではなく、亢進との関係を支持するものと思われる。全身TRPV4欠損マウスに見られる胃排出の遅延 [45]、およびIBS-Dにおける下痢症状と相関するヒト大腸組織における内因性TRPV4リガンドの増加 [46] に基づき、大腸上皮におけるTRPV4発現増加は、大腸移動を促進すると思われる。したがって、TRPV4発現の増加は、他の疾患による大腸移動の遅延の代償機構である可能性がある。一方、大腸上皮のTRPV4発現増加は、便秘の病態生理の一部である可能性がある。大腸上皮は前進刺激を慢性的に受容しているため、便塊からの圧力刺激を追加で受容できず、低感度となるためである。今後、同じ患者の便秘症状との関連でTRPV4発現の変化を前向きに検討する必要がある。

この探索的研究には、被験者数が少ないこと、調べた菌種が少ないこと、腸管感受性試験がないこと、更年期の情報がないことなど、いくつかの限界がある。この研究では、多くの女性が閉経年齢に達していたため、ほとんどが閉経していると推定された。今後の研究では、より大規模な患者コホートにおいて、腸管感受性試験とともに細菌種のパネルを拡大することを検討すべきである。

結論
腸内細菌の培養上清を投与することにより、大腸上皮におけるTRPV4の発現を増加させることができる。TRPV4発現の増加およびE. faecalisの頻度は便秘症状と関連しており、酪酸またはTNFαR1阻害がTRPV4発現の増加を抑制する可能性があることが示唆された。

データおよび資料の利用可能性
データセットはGEOリポジトリ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE208164）で公開されています。

略語
TRPV4:
一過性受容体電位バニロイド4

LPS:
リポポリサッカライド

SCFA:
短鎖脂肪酸

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論文

キャス

グーグルスカラー

参考文献のダウンロード

謝辞
技術的な支援をいただいた小沢利彦氏（富山大学）、萩原宏氏（Cell Innovator、マイクロアレイ）に感謝します。

資金提供
本研究は、日本学術振興会科研費番号JP19K08366の助成を受けた。

著者情報
著者および所属
富山大学大学院医学薬学研究部医学教育・キャリア開発センター

三原浩

富山大学大学院医学薬学研究部消化器病態学講座

三原浩、南條荘八、作村美穂、本尾伊織、安藤隆行、峯村正巳、安田一郎

福岡歯科大学・生理科学・分子生物学教室

内田邦敏

川崎臨港総合病院内科

渡辺義幸

シャルジャ大学医学部基礎医学科（アラブ首長国連邦、シャルジャ市

ジブラン・スアレ・ムハンマド

聖マリアンナ医科大学内科学講座消化器・肝臓内科

渡辺義幸・伊藤文男

聖マリアンナ医科大学大学院バイオインフォマティクス研究科

山本博之

分担
実験の構想および設計。HM、KU、WY、SN、IM、TA、IY；データ収集。データ収集：HM、KU、WY、JSM、HY、FI；データ解析と解釈：HM、KU、WY、JSM、HY、FI。データ解析と解釈：HM, KU, WY, MS, MM; 原稿ドラフト。HM, WY, JSM; 全著者が最終版を読み、承認した。

著者名
三原宏に連絡すること。

倫理に関する宣言
倫理承認と参加への同意
本研究は富山大学倫理委員会により承認され（R2021182）、すべての研究参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。すべての方法は、関連するガイドラインや規則に従って実施された。

論文発表の同意
該当なし。

競合する利益
著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。

追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。

補足情報
追加ファイル1. 図S1.
P. acnes、S. aureus、またはC. perfringensに1日間暴露したCCD841細胞におけるTRPV4遺伝子のパイロシークエンス。各ポイントは、各菌と共培養したCCD841のTRPV4遺伝子のメチル化率を表し、線は平均値と範囲を示す。メチル化の異常は検出されなかった。図S2. A. KEGGパスウェイデータベースを用いたCCD841細胞のマイクロアレイネットワーク解析。ヒト遺伝子名は緑色の文字で示した。アレイで発現が増加している遺伝子は赤色、減少している遺伝子は青色で表示されている。大腸菌（O111）SNで処理すると、TNFR2シグナル、サイトカイン、NODシグナルが活性化されることがわかった。TNFシグナル経路は、TNFR2の発現と白血球のリクルートを誘導する。TNFファミリーメンバーの発現は、サイトカイン受容体会合で誘導される。炎症性サイトカインはNOD様受容体シグナル伝達経路でも誘導された。金久研究室のご好意により、KEGGパスウェイマップの引用を許可していただきました。

追加ファイル2. 表S1.
本研究で使用した腸内細菌科の臨床分離株と標準株。表S2. qPCR用プライマー配列。

追加ファイル3.
TRPV4、TNFαR2、βactinのオリジナル未処理全長ブロットを分子サイズマーカーで示したものである。TRPV4が特異的に検出されることを確認するために、GES-1を陽性対照として使用した。

権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可しています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。

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Mihara, H., Uchida, K., Watanabe, Y. et al. Colonic TRPV4 overexpression is related to constipation severity.大腸TRPV4過剰発現は便秘の重症度と関係がある。BMC Gastroenterol 23, 13 (2023). https://doi.org/10.1186/s12876-023-02647-0

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受付終了
2022年7月8日

受理済み
2023年1月10日

公開
2023年1月13日発行

DOI
https://doi.org/10.1186/s12876-023-02647-0

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キーワード
大腸
TRPV4
フェカリス菌
大腸菌
慢性便秘
BMC Gastroenterology
ISSN: 1471-230X

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