妊娠中期から後期および糖尿病妊娠中の胎児代謝のアトラス

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リソース|第187巻第1号、p204-215.e14、2024年01月04日

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妊娠中期から後期および糖尿病妊娠中の胎児代謝のアトラス

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)01228-X

セサル・A・ペレス-ラミレス 8
中野晴子 8
リチャード・C・ロー
パク・ジュニョン 9
中野 敦 9
ヘザー・クリストフク 9, 10
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脚注を表示するオープンアクセス掲載:2023年12月08日DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.011
PlumXメトリクス

ハイライト

メタボロームプロファイリングにより母親の高血糖が胎児の代謝に影響を与えることが明らかになった

ソルビトールは高血糖ダムの胎児組織に蓄積する

13C-グルコース・トレーシングにより、母親の高血糖が胎児の栄養源を変化させることが明らかになった。

ヒスチジン由来の代謝物は後期胎児組織に蓄積する。
まとめ
代謝が幹細胞の運命決定を指示することを示唆する証拠が増えている。しかし、胎児の代謝が発生過程でどのように変化するのか、また母体の代謝の変化が胎児の代謝をどのように形成するのかについては未解明である。我々は、正常妊娠と糖尿病妊娠における妊娠中期から後期のin vivoマウス胎児代謝の記述的アトラスを発表する。13C-グルコースと液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）を用いて、胎生日（E）10.5から18.5までの間に妊娠したダムから採取した胎児の脳、心臓、肝臓、胎盤の代謝をプロファイリングした。その結果、高血糖環境に特異的な代謝の特徴と、低血糖環境下での発育遷移を示すシグネチャーが明らかになった。胎児組織におけるソルビトールの蓄積と、高血糖のダムから単離された胎児の脳における神経伝達物質レベルの変化が観察された。13C-グルコースを追跡したところ、母親の血糖状態によって胎児の栄養源が異なることが明らかになった。血糖状態にかかわらず、ヒスチジン由来の代謝物は後期胎児組織に蓄積した。我々の豊富なデータセットは、in vivoの胎児組織代謝と母親の高血糖による変化の包括的な概要を示している。
グラフィカル抄録
図サムネイルfx1
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キーワード
代謝
糖尿病
アイソトープトレーシング
発育
妊娠
胎児代謝
メタボロミクス
はじめに
母体の栄養と胎児の発育は切っても切れない関係にある。妊娠中の食事介入は母体の健康を促進し、胎児の発育不全の発生率を低下させる。例えば、鉄の補給は妊娠中の子宮内発育制限を予防し、葉酸の補給は胎児の神経管欠損症の発生率を低下させる。1,2 しかし、胎児の代謝が発育中にどのように形成されるのか、また母体の代謝に影響を及ぼす有病率が発育中の胎児にどのような影響を及ぼすのかについてはあまり知られていない。最近の研究では、マウスの着床前胚における代謝可塑性3や、胚発生日数（E）9.5-13.5におけるコンパートメント化の特徴が明らかにされ始めている4。しかし、胎児が独立した循環系を完成させる時期である妊娠中期から後期にかけての胎児代謝については、未解明のままである。
母体糖尿病は、米国をはじめ世界的に臨床的な問題が増大している。米国では、出生1,000人当たりの妊娠中の糖尿病罹患率は、2011年の47.6から2019年には63.5に上昇した5。この不利な傾向は、妊娠前の若年者における妊娠糖尿病および2型糖尿病の罹患率の増加によるものである。母体の高血糖は、先天性心欠損のリスクを4倍増加させ、神経発達欠損のリスクを増加させることに関連している6,7,8。以前、我々は、高グルコースレベルが過剰なヌクレオチド代謝を介してin vitroで心臓の成熟を損なうことを見出した9。しかし、母体の高血糖が発育中の胎児の代謝に及ぼすin vivoでの影響は依然として不明であり、糖尿病妊娠における先天性欠損の原因についてメカニズム的に光を当てる可能性がある。
10,11,12。ここでは、発達中の胎児の代謝状況を多組織レベルで定量化し、母体の高血糖がこの状況をどのように形成しているかを調べることにより、哺乳類の発達の理解に新たな層を提供する。液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）と[U-13C]グルコース追跡法を用いて、妊娠中期から後期にかけて妊娠マウスから解剖した胎児組織（胎盤、心臓、肝臓、脳）の代謝プロファイルを測定した。胎児組織の広範なメタボロームアトラスを提示することで、低血糖および高血糖下における代謝物レベルの動態と経路利用についての知見を得ることができた。私たちの豊富なデータセットは、子宮内での高グルコース曝露が胎児組織代謝に与える影響を反映する代謝シグネチャーを明らかにし、胎児の栄養ニーズを満たすための改善戦略の設計に向けて活用することができる。
研究結果
低血糖および高血糖における胎児メタボロミクス
糖尿病妊娠をモデル化するために、我々は高血糖秋田マウスを使用した。このマウスは、軽度の欠陥はあるが、妊娠中期および後期まで生存する子孫を産む。このマウスはIns2遺伝子のヘテロ接合体変異を有し、成人発症の糖尿病を発症する13。C57BL/6バックグラウンドで、秋田産のダムを野生型のオスと交配し、胎児が高血糖環境にさらされる糖尿病妊娠状態を作り出した9。秋田産のダムの子孫には心臓や神経管の欠損が見られたが、ほとんどの欠損は軽度であり、大部分はLC-MSベースのメタボローム解析に適していた（図1AおよびS1A）。
図1メタボローム解析プラットフォーム
図1妊娠中期から後期および糖尿病妊娠中の胎児代謝を評価するためのメタボロームプラットフォーム
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われわれは、秋田県産の妊娠中の母親と野生型の母親から採取した胎児組織のメタボロームプロファイルを、発育を通して、特に妊娠中期から後期にかけてマップすることを目指した。この目的を達成するため、マウスの妊娠をE10.5、E12.5、E15.5、E18.5の段階に定時設定した。野生型および糖尿病（秋田犬）のダムを一晩絶食させ、胎児組織採取の前に[U-13C]グルコースを注入し、代謝経路を通して13Cを追跡した。3時間のトレーサー注入後、解剖した胎児の胎盤、脳、心臓、肝臓から代謝物を抽出した（図1B）。母親の血漿サンプルはグルコース測定とLC-MS代謝物分析のために採取され、秋田県のダムではグルコースレベルが上昇し、野生型と秋田県のダムでは同様の13C-グルコース濃縮が確認された（図S1BおよびS1C）。E15.5妊娠マウスのコホートでは、野生型および秋田県産ダムにおいて一晩絶食によるマウス体重の有意な変化が観察されないことを確認した（図S1D）。さらに、[U-13C]グルコースを4時間注入する間、母体の血漿サンプリングと連続帝王切開を行い、グルコース、インスリン、標識の動態を評価することができた。インスリン濃度はトレーサー注入の各時点で野生型と秋田犬の間で同等であったが、血糖値は注入3時間で野生型に比べて秋田犬の方が大きな反応を示した（図S1E）。母体血漿および胎児組織における13C-グルコース濃縮の時間発展は、野生型および秋田県産の両方のダムの循環および胎児組織において、トレーサー注入後3時間で（擬似）定常状態が達成されたことを裏付けた（図S1FおよびS1G）。
サムネイル図1
図S1妊娠秋田マウスの母体高血糖モデル（図1関連
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この実験セットアップにより、発育の文脈の中で3つの分析的次元：（1）発育段階、（2）胎児組織由来、（3）母体の血糖状態、を提供する高品質のデータセットが得られた。私たちのデータ解析パイプラインは、[U-13C]グルコースからの同位体トレーシングだけでなく、ターゲットとアンターゲットの両方のメタボロミクスを含み、パスウェイの利用と栄養源に関する洞察を提供した（図1C）。メタボロミクスデータのターゲット解析では、162代謝物からなる代謝物ライブラリと相互参照しました（表S1）。すべての組織、妊娠ステージ、および母親の血糖状態にわたって、さらなる解析のための代謝物レベルの包括的な定量化を作成した（図1D）。さらに、代謝フラックスに関するさらなる洞察を得るために、各代謝物の同位体を測定した（表S2）。分画13C濃縮分析では、発生段階と代謝経路で異なる活性が示された（図1E）。すべての胎児組織において、解糖系代謝産物はE10.5からE15.5の間にほとんど標識されたが、解糖系代謝産物の標識はE18.5の胎児組織で急激に減少した。野生型ダムのE18.5胎仔の肝臓と脳における解糖代謝産物の標識は、秋田県産ダムを有意に下回っており、母体の血糖状態によってこれらの中間体の供給源に格差が生じていることを示している。ペントースリン酸経路（PPP）の13C濃縮度は、組織ごとに異なる発生段階でのピーク活性を示唆した：胎盤と肝臓のPPP活性はE10.5でピークに達したが、心臓と脳ではE12.5とE15.5でピークに達した。トリカルボン酸（TCA）サイクルの代謝物プールには複数の栄養素が寄与している。したがって、その13C濃縮は、TCAサイクルへのグルコースの直接的および間接的な寄与を示した。E10.5およびE12.5の初期段階では野生型ダムの胎児組織が有意に多く標識されていたが、E18.5までに秋田県産ダムの胎児組織の標識が野生型ダムを追い越したことから、高血糖発生における持続的なグルコース異化が示唆された。
母親の高血糖は胎児組織にソルビトール蓄積を引き起こす
二元配置分散分析を偽発見率（FDR）制御の手順で行い、標的メタボロミクスデータセットにおける相当数の差異を強調した（図S2；表S3）。グルコース代謝に注目すると、このデータセットでは、秋田県産のダムと野生型ダムから採取した胎児の組織で、ソルビトールレベルが著しく上昇していることが明らかになった（図2A）。ソルビトールはポリオール経路の一部としてアルドース還元酵素の作用によりグルコースから生成される（図2B）。秋田県産と野生型ダムを比較して採取した胎児組織におけるソルビトール蓄積の程度を評価するため、野生型ダムのE10.5胎児組織に対するソルビトールレベルの増加を測定した。その結果、母親の高血糖にさらされた胎児の胎盤、心臓、肝臓、脳でソルビトールレベルの増加が観察された。特に、E15.5およびE18.5の秋田県産ダムから単離された胎児の脳は、野生型ダムから単離されたE10.5の胎児の脳と比較して、最大のソルビトール蓄積を示した（図2C）。成人糖尿病患者におけるソルビトール蓄積は、組織の浸透圧ストレスにつながり、網膜、腎臓、神経などのインスリン非依存性組織で起こる損傷の一因となる14。今回のデータから、母体の高血糖にさらされた胎児はソルビトール蓄積から保護されないことが明らかになり、胎児の発育過程におけるソルビトール蓄積が、糖尿病妊娠中に観察される発育異常の高い発生率に寄与している可能性が示唆された。
サムネイル図2
図S2図2に関連する、野生型および秋田県産ダムの母体血漿および胎児組織における代謝プロファイルの有意な特徴
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図サムネイルgr2
図2母体の高血糖は胎児組織にソルビトールを蓄積させる
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母体高血糖は胎児の脳におけるアミノ酸代謝を変化させる
母親の高血糖が胎児の代謝をどのように変化させるかについて興味があった。私たちは、野生型と秋田県産のダムを比較して、胎児組織におけるアミノ酸レベルの変化を観察した（図3A）。発育段階を経るにつれて、秋田県産ダムから採取した胎児の心臓のアミノ酸レベルのほとんどは、野生型ダムから採取した胎児の心臓と比較して減少の程度が小さかったが、秋田県産胎児の肝臓と脳のアミノ酸レベルはより強く上昇する傾向にあった。最も注目すべき点として、胎児の脳内アスパラギン酸濃度は、野生型から採取した胎児と秋田県産の母親から採取した胎児では、評価した発育期間にわたって異なる傾向を示した（図3B）。一方、秋田県産のダムから単離された胎児の脳では、アスパラギン酸レベルはE10.5からE12.5まで変化せず、E12.5からE15.5の間に約2倍増加した（図3B）。これらの変化は、胎児脳のアスパラギンレベルとは対照的であり、評価した発育期間と条件にわたって変化しなかった（図3B）。グルタミン酸およびグルタミン酸由来のγ-アミノ酪酸（GABA）のレベルも、野生型と秋田県産のダムから採取した胎児の脳で異なっていた（図3C）。グルタミン酸およびGABAレベルは、秋田県産ダムから単離されたE10.5およびE12.5胎仔脳では、野生型ダムから単離されたE10.5およびE12.5胎仔脳と比較して低かった。また、麻酔や一晩絶食させることなく単離した秋田産のE12.5胎仔脳では、GABAレベルも同様に低かった（図S3A）。13CによるGABA合成を追跡したところ、野生型および秋田県産ダムのE12.5胎仔脳において、M + 2グルタミン酸で規格化した同様のM + 2 GABA標識が観察された（図S3B）。これらの神経伝達物質のレベルが低いことが、母親の高血糖にさらされた胎児で観察される先天性脳欠損の高い発生率に寄与している可能性がある15。
図サムネイルgr3
図3母体高血糖は妊娠中期から後期にかけて胎児の脳内のアスパラギン酸およびグルタミン酸レベルを変化させる
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サムネイル図3
図S3図3に関連する胎児組織におけるGABAの測定値
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同位体トレーシングから明らかになった胎児の成長戦略
U-13C]グルコースを中心的な炭素代謝を通して追跡することで、胎児組織がバイオマスの構成要素をどのように調達しているかが明らかになった。代謝物の13C標識率は、その安定な13C供給源の13C標識率よりも大きくなり得ないという原則を利用して、2つの異なるレベルで13Cを追跡した：（1）栄養交換フラックスを明らかにする全身レベルと、（2）代謝経路を通るフラックスを明らかにする組織レベル。全身レベルでは、胎児循環系は胎盤から肝臓、心臓、脳への経路を通じて母体循環系とつながっていると考えた（図4A）16,17。胎児では7種類の非必須アミノ酸（Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Ser、Gly）が13C標識されており、そのうちアスパラギン酸とグリシンは母体血漿では標識されていないことが観察された（図4B）。したがって、アスパラギン酸とグリシンはすべて胎児組織で合成された。母体および胎児の代謝は、胎児の5つのアミノ酸（Asn、Glu、Gln、Pro、Ser）に寄与し、他の13のアミノ酸はすべて母親から供給された。E15.5およびE18.5胎児における循環経路を介したグルタミン酸標識の上昇傾向は、すべての胎児組織が自らグルタミン酸を作っていることを示唆していた。一方、肝臓でのセリン標識のピークは、心臓と脳が必ずしも自らセリンを作らず、肝臓からのセリンのオーバーフローに依存している可能性を示唆していた。同様に、胎盤中のプロリンは、E15.5胎児で証明されているように、肝臓と脳がプロリン合成能力を発達させる前に、E10.5で胎児組織に寄与している可能性がある。アスパラギン標識の時間発展から、野生型ダムから単離された胎児肝臓におけるアスパラギン生合成はE18.5で始まるのに対し、秋田県産ダムから単離された胎児肝臓ではE15.5でより早く始まることが明らかになった（図S4A）。
図サムネイルgr4
図4胎児組織の同位体トレーシングから、胎児の栄養摂取と利用が明らかになった
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図サムネイルfigs4
図S4胎児組織の同位体トレーシングによる代謝戦略の解明（図4関連
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組織レベルでは、13Cトレーシングによってアミノ酸の標識に関与する代謝経路が明らかになった（図4C）。組織代謝産物は、胎盤を介した母体[U-13C]グルコース輸送や、[U-13C]グルコースからダムが産生した他の循環代謝産物の輸送を介して、13Cを獲得することができる18,19。胎児アスパラギン酸は、アスパラギン酸の直接の前駆体であるオキサロ酢酸の代用物質であるリンゴ酸と同等かそれ以下であったが、血漿アスパラギン酸よりも標識された（図4D）。胎児グルタミン酸標識は、血漿グルタミン酸標識および胎児グルタミン標識の両方よりも一貫して高かったが、組織α-ケトグルタル酸標識と同程度であった（図4EおよびS4B）。標識源（すなわちグルコース）が定常状態にあり、生成物プールがその前駆体プールより多く標識されることはありえないことを考えると、これらの観察結果は、胎児組織がアナプレローシスとTCAサイクルを介してアスパラギン酸とグルタミン酸をde novo合成することを示唆した。
我々は、胎児組織の解糖系中間体における13C標識が、グルコースから直接あるいは間接的に供給されたものであるかどうかを調べることにした。他の中心的な炭素代謝経路では、個々の代謝物プールの段階的な標識により、13Cが各経路でどのように移動したかが明確に示された（図S4CおよびS4D）。しかし、解糖系代謝物の標識はより非単調なプロフィールを示した。循環中の乳酸も高フラックス炭素源であるため、異なる13C標識が得られる3つのシナリオを検討した：主要炭素源は、(1)血漿グルコース、(2)血漿グルコースと乳酸の両方、(3)血漿乳酸（図4FとS4E）20。胎盤では、解糖標識は血漿グルコースと血漿乳酸の両方の寄与を反映しており、それらは妊娠中期から後期にかけてダムで標識されていた（図4GおよびS4F）。一方、肝臓では、野生型と秋田型では異なる解糖標識が見られた。E10.5およびE12.5において、野生型ダムの胎児肝臓は、解糖系全体にわたって上向きの標識勾配を示し、13C標識乳酸からの糖新生と、おそらくグリコーゲン分解によるヘキソース13C標識の希釈を示していた（図4GおよびS4G）。しかし、13Cグルコース標識は、妊娠中期から後期にかけて秋田県産の哺乳動物から採取した胎児の肝臓でより高く、母体循環系におけるグルコース標識のレベルとより類似していた。以上をまとめると、母体の高血糖は胎児の炭素骨源を変化させるだけでなく、妊娠後期のアミノ酸生合成へのグルコースの寄与を維持する。
胎児のヌクレオチド合成は妊娠中期から後期にかけて遅くなる
ヌクレオチドは、急速な細胞分裂の際に大量に必要とされるが、循環によって利用できるわけではない。そこで我々は、胎児組織がどのようにヌクレオチド生合成を管理しているのかを調べた。E10.5と比較してE12.5、E15.5、E18.5では、胎盤ではなく心臓、肝臓、脳でヌクレオチドの胎児組織特異的増加が観察された（図5AおよびS5A）。ヌクレオシド三リン酸ではなく、ヌクレオシド一リン酸および二リン酸は、E10.5に対してE15.5およびE18.5の胎児脳組織で上昇している。しかし、測定されたほとんどすべてのヌクレオチドは、E10.5に対してE12.5～E18.5の胎児肝臓組織で上昇している。イノシン一リン酸（IMP）、アデノシン二リン酸（ADP）、アデノシン三リン酸（ATP）のような特定のヌクレオチドは、アデノシン一リン酸（AMP）、シチジン一リン酸（CMP）、グアノシン一リン酸（GMP）、ウリジン一リン酸（UMP）のような特定のヌクレオチドは、E10.5に対してE15.5とE18.5の胎児心臓組織で最も上昇していた。我々は、妊娠中期から後期にかけて、プリンとピリミジンの代謝が胎児の組織間でどのように変化するかを調べることに興味を持った。胎盤と胎児の心臓では、AMPとUMPのプールレベルは、私たちが測定した発育段階では増加しなかった（図5Bと5C）。しかし、胎児の肝臓と脳では、AMPとUMPのプールレベルは増加した（図5Bと5C）。さらに、AMPとUMPへの13C濃縮は、プールレベルの変化にかかわらず、胎生日が進むにつれて胎児組織全体で一貫して減少した（図5Dと5E）。同様に、IMPとGMPについては、プールレベルの傾向とは無関係に、標識の減少が観察された（図S5B-S5G）。
図サムネイルgr5
図5胎児発生過程におけるde novoヌクレオチド合成の漸進的減少
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図S5図5に関連する胎児組織ヌクレオチド中の[U-13C]グルコース濃縮度の漸進的減少
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均一な13C-グルコース注入手順にもかかわらず、ヌクレオチド中の13C濃縮は妊娠中期から後期にかけて減少した（図5AおよびS5A）。ヌクレオチドの標識は3時間では同位体定常状態に達しなかったが、これはヌクレオチドのターンオーバー速度を示している。したがって、レベルまたはプールサイズの減少と一致した標識の減少は、注入されたグルコース源に由来するヌクレオチド生合成フラックスの遅れを示唆していた。胎盤と心臓では、注入されたグルコース源からのヌクレオチド生合成が、肝臓や脳（E15.5以降）よりも早い発生段階（E10.5またはE12.5）で減速し始めることが観察された。
ヒスチジン由来の代謝物は後期胎児に蓄積する
検出されたすべてのLC-MSピークをアンターゲットで調査し、発達の移行を特徴づける代謝シグネチャーを同定するために、解析プラットフォームを拡張した。MetaboAnalystプラットフォームを使って、野生型と秋田型の両方のダムから採取したE18.5とE10.5の胎盤の非標的データを比較した（表S4）22。この解析の結果、野生型のダムから採取したE18.5の胎盤とE10.5の胎盤で、正規化濃縮スコアと有意性が最も高い代謝経路としてヒスチジン代謝が得られた（図6A）。同様の結果は、秋田県のダムから採取した胎仔の胎盤代謝物を比較した場合にも見られた（図S6A）。E10.5胎盤に対して後期胎盤ではヒスチジン代謝が有意に豊富であることから、この経路を胎児組織全体および妊娠中期から後期を通してより詳細に調べることにした。ヒスタミンはヒスチジンから誘導されるが、ヒスチジンはヒスタミンだけでなくウロカニン酸にも異化される（図6B）。我々は、ヒスチジンプールレベルは胎児組織全体で一般的な傾向を示さず、実際、野生型ダムから単離された胎児の心臓と脳では減少していることを見いだした（図6C）。しかし、胎盤、心臓、肝臓、脳の各組織では、E18.5期にヒスチジン由来の代謝産物の蓄積が観察された（図6D-6F）。特に、ヒスチジン由来の代謝産物であるヒスタミンとイミダゾール-4-アセテートの顕著な蓄積が観察された（図6Eおよび6F）。非標的分析によって同定されたこれらのシグナルは、化学標準物質によって裏付けられた（図S6B）。E18.5におけるヒスチジン由来の代謝産物の増加は母体循環においても観察され（図S6C）、母体と胎児の代謝の相互作用が強調された。一晩の絶食がヒスチジン異化代謝産物で観察された変化に寄与しているかどうかを調べるために、野生型および秋田県産の両ダムから解剖したE12.5およびE18.5の胎児組織について、絶食せず、麻酔もトレーサー注入もせずにLC-MSベースのメタボローム測定を行った。このような乱れのない状態では、血糖状態にかかわらず、後期胎児組織においてヒスチジン由来の代謝産物、特にヒスタミンとイミダゾール-4-アセテートの大きな増加が再び観察された。このことは、後期胎児組織におけるヒスチジン代謝の顕著な増加は、ダムの一晩絶食の影響ではないことを示唆している（図S6D）。興味深いことに、早産の女性では、正期産と比較してヒスタミン血漿レベルの上昇が検出されている23。
図サムネイルgr6
図6ヒスチジン由来の代謝産物は発育後期に胎児組織に蓄積する
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図S6図6に関連する、妊娠後期におけるヒスチジン由来代謝産物レベルの上昇を明らかにする標的外分析
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考察
我々の広範なメタボロームデータセットは、母体の低血糖と高血糖の両方の状況下で、妊娠中期から後期にかけてのin vivoでの胎児組織代謝を初めて詳細に評価したものである。胎児組織における相対的な代謝物プールレベルを調べたところ、高血糖のダムを用いて調べたすべての胎児組織において、グルコース由来の毒性代謝物であるソルビトールレベルが上昇していた（図2）。これらの所見から、母体の高血糖下で発育する場合、胎児組織はソルビトールの蓄積から保護されないことが示唆される。糖尿病患者における制御不能な高血糖は、網膜、腎臓、神経などのインスリン非依存性組織にソルビトールの蓄積と組織障害をもたらすことが認められている14。初期の研究では、母体の高血糖にさらされたラット胎児の肝臓と胎盤、および神経外胚葉組織にソルビトールが蓄積することが示唆されていた24,25。胎盤におけるソルビトールの産生は、いくつかの動物種やヒトの正常妊娠においてよく報告されているが、妊娠期をまたがるソルビトールの存在量や濃度の時間的変化に関するデータは乏しい。正常妊娠におけるポリオール経路の生理学的役割はよくわかっておらず、まだ解明されていないが、この経路は糖尿病における酸化還元不均衡の一因として関与している29。われわれのin vivoメタボロミクスデータは、糖尿病マウスの胎児が野生型マウスの胎児に比べて3～5倍のソルビトール蓄積を示すことを確認している。さらなる研究により、このソルビトール蓄積量が胎児の発育に与える影響を調べる必要がある。ソルビトール産生酵素であるアルドース還元酵素の阻害剤は、糖尿病性神経障害の治療に臨床で使用されている。30 アルドース還元酵素阻害剤をラットの培養胎仔に使用した過去の研究では、ソルビトールの減少が認められたが、高グルコース誘発性の成長遅延や形態異常の予防には効果がなかった31。しかし、アルドース還元酵素阻害剤を用いてin vivoで胎児のソルビトール濃度を低下させることができるかどうか、またそれによって母体の高血糖に関連する発育異常のいくつかを防ぐことができるかどうかを検証するには、さらなる研究が必要であろう。
さらに、妊娠中期から後期にかけての胎児組織における相対的な代謝物プールレベルの解析から、胎児の脳アミノ酸レベルの変化傾向が明らかになった（図3）。各分析組織では、妊娠中期から後期を通じてアミノ酸レベルのユニークな傾向が見られたが、特定のアミノ酸が神経伝達物質として脳のネットワークを形成する上で重要な役割を担っていることを考慮し、脳のアミノ酸レベルを取り上げた32。現時点では、秋田犬の胎児の脳におけるGABAレベルの低下が、産生の減少によるものなのか、分解の亢進によるものなのかは不明であり、この観察された傾向の機序的側面を解明するためには、追跡研究が必要である。さらに、脳の発達と機能におけるグルタミン酸作動性システムの重要性が認識されつつあるが33、代謝異常がこのようなシステムにどのような影響を及ぼすかについての情報は乏しい。したがって、アスパラギン酸、グルタミン酸、GABAのようなアミノ酸神経伝達物質が、高血糖のダムから単離された胎児の脳で異なるレベルを示すという我々の知見は、これらの変化が、母体の高血糖の状況下で発生する先天性脳欠損症の高い発生率に寄与しているかどうかを調べる追跡研究を示唆している。
我々は、代謝物プールレベルの動態を理解するだけでなく、13C標識情報を活用して、胎児組織の中心炭素経路の使用状況や栄養源についても調査した。例えば、哺乳動物に注入された13C-グルコースによる胎児と血漿の栄養素標識の違いから、特定の栄養素が母体循環を介して供給されるのか、それとも胎児が合成するのかを知ることができる。この分析を通して、胎児組織は妊娠中期から後期にかけてアスパラギン酸とグルタミン酸の合成を示すが、プロリンの生合成は肝臓と脳の発達後期に顕著になることがわかった。さらに、我々のデータは、胎児肝組織は循環グルコースとは異なる供給源から炭素骨格を得ることを示唆しているが、胎児がグルコース依存性を持続する母体高血糖の場合はそうではない。このことは、発育中の胎児、特にE10.5における炭素供給源に関する重要な考察を提起している。優血症では、胎児はグリコーゲンの分解や糖新生を介した乳酸から柔軟に炭素骨格を得る。今回紹介した研究を、13C-乳酸のような他の標識栄養素を組み込んだ追加的な標識実験で補完することは、論理的な将来の方向性を示すものであり、それによって、E10.5の肝臓と心臓が、優血症および高血糖のダムから得た別の炭素源に依存していることを明らかにするのに役立つであろう。とはいえ、高血糖ダムからの胎児における炭素供給源におけるこの興味深い変化は、変化する栄養微小環境にさらされたときに胎児組織が受ける代謝の可塑性と適応を浮き彫りにしている。
我々の大規模なデータセットの非標的解析から、E18.5の胎児組織と母体血漿において、ヒスタミンとイミダゾール-4-アセテートを含むヒスチジン由来の代謝物が顕著に蓄積していることが明らかになった（図6）。興味深いことに、ヒスタミンの血漿中濃度の上昇は、正期産と比較して早産時の女性で検出されている23。したがって、これらの代謝産物は、分娩促進における潜在的役割を考えると、特に興味深い。胎児がE18.5後期に入ると、ヒスチジン由来の代謝物が著しく増加することが観察されたが、これは、代謝が発達の移行を調節する潜在的な役割についてほとんど知られていないことを強調している。
全体として、ここで紹介したデータ資源は、代謝と細胞運命の移行を結びつけるよりメカニズム的な洞察につながる、今後の検証のための新たな仮説を生み出すのに役立つだろう。例えば、今後の研究では、糖尿病妊娠中の胎児組織で上昇した代謝物が、先天性異常の発生率上昇に関与しているかどうかを調べるとともに、代謝物の急激な変動が重要な発生学的遷移を規定するかどうかを明らかにする必要がある。母体の代謝が胎児の代謝と発育にどのような影響を与えるかをよりよく理解することは、母体の健康を促進し、糖尿病妊娠という緊急の臨床問題に対処する戦略を立案する上で極めて重要であろう。
研究の限界
マウスの発育はヒトの発育を完全に模倣しているわけではないが、我々のメタボロームデータセットは、ゲノミクスとトランスクリプトミクスのレンズを通して発育を見る広範な研究を補完する貴重な役割を果たすと期待している。実験の性質上、妊娠のタイミングに注意する必要があるため、尾静脈注入を実施するプラットフォームを合理化することにしました。そのため、より長時間の注入を実施する能力が制限され、[U-13C]グルコースからの13C標識を取り込む代謝物の数が制限されました。この研究で注入されたマウスの数と収集された胎児の数を考慮すると、同位体標識された単一の栄養素である[U-13C]グルコースを使用し、解剖された胎児1匹につき4つの組織を収集することを実験的アプローチの中心に据えた。今後の研究において、13C-グルタミンや13C-乳酸のようなトレーサーを追加利用することで、経路の利用を評価するための新たな層が提供されるであろう。本研究で評価した4つの代表的なステージの他に、さらに胚の日数を追加することで、胎児の代謝ネットワークのより正確な解剖が可能になるだろう。サンプルの正規化にもかかわらず、E10.5胎児肝臓はE12.5サンプルと比較して、多くの代謝産物で代謝産物プールレベルが有意に低かった。この差は多くの代謝物には見られませんでしたが、この傾向が生物学的に価値があるのか、むしろ代謝物プールレベルの潜在的な過少表示を反映しているのかは不明であることを認めます。秋田マウスの使用は、マウスの糖尿病モデルに使用されるいくつかのアプローチの一つであることを認識している。秋田マウスはIns2遺伝子の変異によりインスリンの機能不全を起こし、血糖値を下げることができないため、本研究で用いたグルコーストレーサー注入パラメータではグルコースの増加が大きくなった。秋田マウスは、ヒトの糖尿病妊娠を特徴づける可能性のあるすべての機序的特徴を完全に表現しているわけではないが、本研究の目的は、子宮内の高グルコースが発育中の胎児の代謝に及ぼす影響を分析する出発点を提供することであった。
STAR★方法
主要リソース表
REAGENTまたはRESOURCE SOURCE IDENTIFIER
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
メタノール; LC-MSグレード Fisher Scientific Cat#: A456-212
アセトニトリル、LC-MSグレード Fisher Scientific Cat#: A955-4
水、LC-MS グレード Fisher Scientific Cat#: W6-4
炭酸アンモニウム Sigma Aldrich Cat#: 379999-50G
[U-13C]グルコース Cambridge Isotopes Cat#: CLM-1396
重要な市販アッセイ
インスリン ELISA キット Crystal Chem Cat#: 50-194-7920
寄託データ
胎児組織および母体血漿メタボロミクス https://doi.org/10.21228/M83139 NMDR: PR001761
実験モデル 生物/系統
マウス系統 C57BL/6J The Jackson Laboratories Cat#: 000664
マウス系統 C57BL/6-Ins2Akita/J The Jackson Laboratories Cat#: 003548
ソフトウェアおよびアルゴリズム
Prism 10 グラフパッド https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/
MZmine 2 Github http://mzmine.github.io/
Accucor Github https://github.com/lparsons/accucor
El-MAVEN Elucidata https://resources.elucidata.io/elmaven/
MetaboAnalyst Pang et al.22 https://www.metaboanalyst.ca/
その他
Q Exactive Thermo Fisher N/A
BeadMill ホモジナイザー Fisher Scientific Cat#: 15-340-163
Vanquish UHPLC Thermo Fisher N/A
SeQuant ZIC-pHILIC Polymeric column (2.1 × 150 mm 5 μm) EMD Millipore Cat#: 150460
2.4mmメタルビーズ入り2mLチューブ Fisher Scientific Cat#: 15-340-151
輸液ポンプ Harvard Apparatus Cat#: HA1100
窒素エバポレーター Organomation Cat#: 11250-O
ポリエチレンチューブ Instech Cat#: BTPE-10
新しいタブで表を開く
リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるHeather R. Christofk (hchristofk@mednet.ucla.edu)までご連絡ください。
材料の入手可能性
本試験では新たな試薬は得られていない。
データおよびコードの利用可能性
本研究で報告されたメタボロミクスデータセットはNational Metabolomics Data Repository (NMDR)に寄託されており、公開日現在公開されている。DOIは主要リソースの表に記載されています。本論文ではオリジナルコードは報告していない
実験モデルと被験者の詳細
マウス
マウスはカリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）の病原体フリー施設で飼育した。すべての動物実験はUCLA動物研究委員会（ARC）の承認を得ており、動物実験を行う際には関連するすべての倫理規定を遵守した。
方法の詳細
動物実験
健康な野生型および秋田型ダムを定時交配用にセットした。翌朝、膣栓のある雌は妊娠していると同定され、胚日（E）0.5として記録され、適切な胚日まで新しいケージに移された。
妊娠マウスの輸液
標識グルコース溶液をろ過した0.9％塩化ナトリウム溶液に100 mg/mLの濃度で調製した。一晩絶食させた後（前日18:00～）、すべての妊娠ダムを対象に9:00～10:00頃に輸液を行った。マウスは5％のイソフルランガスで麻酔され、温かいパッドの上に置かれた。点滴の間、マウスは2.5%のイソフルラン下に保たれた。カテーテルの設置には、28ゲージのインスリン注射針をポリエチレンチューブ（PE-10）を介して輸液ポンプ（Harvard Apparatus）に設置したシリンジ（グルコース溶液を含む）に接続した。注入開始時に、28ゲージの針を尾静脈に挿入した。4μL/gBWのグルコースボーラスを投与した。ボーラス投与直後から、注入速度を連続0.085μl/gBW/minに設定し、総注入時間を3時間とした。
連続帝王切開
妊娠マウスをイソフルラン麻酔（2.5%）下に置いた。時間ゼロのために眼窩後採血を行い、その後、胎児組織採取のために妊娠マウスの下腹部を小切開して単一受精卵を露出させた。最初の採血と胎仔採取の直後に尾静脈カテーテルを留置し、妊娠マウスの輸液法に記載されているようにボーラスを投与した後、連続輸液を行った。U-13C]グルコース注入中の複数の時点で、最初の小切開からアクセスした単一の受精卵を採取した。母体血液中のトレーサー濃縮をモニターするため、注入期間中、眼窩後採血（<20μL）を行った。ゼロ時間後の採血の時点は以下の通りであった： 30分、1時間、2時間、3時間、4時間。
胎児組織抽出
マウスを安楽死させ、心臓穿刺により血液を採取した。胎児組織（胎盤、脳、肝臓、心臓）を氷冷滅菌PBS中で解剖した。解剖後すぐに体重を記録し、胎児組織を、金属ビーズとドライアイス上で冷やしたメタノール：水（80：20）溶液500μLを含むあらかじめ充填したビーズミルチューブに入れた。Fisherbrand™ Bead Mill Homogenizerを用いて胎児組織をホモジナイズした。サンプルを17,000 g（4 °C）で10分間回転させ、沈殿した細胞物質（タンパク質/DNA）を除去した。上清を回収し、清潔なチューブに移し、窒素エバポレーター（Organomation）を使用して蒸発させた。蒸発した代謝物抽出物は-80℃で保存した。タンパク質/DNAを含むペレットをヒートブロック（55℃）上で乾燥させ、-80℃で保存した。
母体血漿抽出および測定
採取した血液を5,000xgで遠心分離し、血漿を回収した。血漿は液体窒素でスナップ凍結し、抽出まで保存した。母体血漿からグルコースの絶対値を測定するためにグルコメーターが使用された。インスリンの測定は、メーカーの指示に従い、ELISAで行った（Crystal Chem）。代謝物抽出のため、5μLの血漿を500μLのメタノール：水（80：20）溶液（-80℃）と混合した。サンプルを 17,000 g (4 °C) で 10 分間遠心し、窒素エバポレーター (Organomation) を使用して各サンプル 450 μL を蒸発させた。蒸発した代謝物抽出物は-80℃で保存した。
胎児組織 DNA 測定および体重正規化
凍結ペレットを、100mM NaCl、20mM Tris-HCl（pH7.4）、5mM EDTA、0.1% SDS、Proteinase K（500μg/mL）を含む溶液に再懸濁した。ペレットの再懸濁量は、すべての材料が溶解するように、胎児組織ペレットのサイズごとに変化させた。再懸濁量は希釈倍率として記録した。DNA濃度はナノドロップを用いて測定し、希釈倍率から全DNA濃度を算出した（Thermo Fisher Scientific）。
LC-MSによる代謝物測定
乾燥代謝物抽出物を50％アセトニトリル（ACN）50％dH20溶液で再構成した。胎児肝臓、脳、胎盤については、代謝物抽出液の再懸濁量は体重 1 mg あたり 75 μL とした。胎児心臓の場合、代謝物抽出液の再懸濁量は体重 1 mg あたり 90 μL とした。代謝物再懸濁量の精度を高めるため、各胎児組織群からの総 DNA 濃度測定値を、2mg 以上の直接測定組織重量と相関させ、2mg 未満の重量を記録した組織サンプルの重量値を算出するために線形回帰式を使用した。血漿代謝物抽出物については、再懸濁量を 100 μL とした。再懸濁後、サンプルをボルテックスし、17,000g で 10 分間スピンダウンした。上清75μLをHPLCガラスバイアルに移した。サンプルは、Vanquish（Thermo Scientific社製）UHPLCシステムで、移動相A（20mM炭酸アンモニウム、pH9.7）と移動相B（100% ACN）を用い、SeQuant ZIC-pHILIC Polymericカラム（2.1 × 150 mm 5 μm、EMD Millipore社製）を用いて、流速150μL/min、35℃で行った。注入量は10μLに設定した。分離は、20分間で20%Aから80%Aへの直線勾配を行い、その後20分間から20.5分間まで80%Aから20%Aへの直線勾配を行った。UHPLCはQ-Exactive (Thermo Scientific)質量分析計に接続し、スプレー電圧=3.2kV、シースガス=40、補助ガス=15、スイープガス=1、補助ガス温度=350°C、キャピラリー温度=275°Cの極性切り替えモードで動作させた。両極性とも、マススキャン設定は、full-scan-range=(70-1000)、ms1-resolution=70,000、max-injection-time=250ms、AGC-target=1E6に保った。MS2データも、各スキャンで最も多く存在する上位3つの単荷電イオンから、normalized-collision-energy=35で収集した。得られた各.rawファイルをセントロサイド化し、ProteoWizardのmsconvertを使用して2つの.mzXMLファイル（1つはポジティブイオンモードスキャン用、もう1つはネガティブイオンモードスキャン用）に変換した34。
定量化と統計解析
メタボロームデータ解析
.mzXMLファイルは、MZmine 2ソフトウェアパッケージにインポートされた。35 イオンクロマトグラムは、内蔵のAutomated Data Analysis Pipeline（ADAP）を介してMS1スペクトルから生成された。36 クロマトグラムモジュールとピークは、ADAPウェーブレットアルゴリズムを介して検出された。ピークは、Random sample consensus alignerモジュールを介して全サンプルにわたってアライメントされ、ギャップ充填され、社内のMS1-RTデータベースの精密質量MS1(±15ppm)および保持時間RT(±0.5分)検索を使用して同一性が割り当てられました。ピークの境界と同定は、手動キュレーションによってさらに精密化されました。ピークは曲線積分下面積により定量され、CSVファイルとしてエクスポートされました。同位体分析では、R パッケージ AccuCor を使用してピーク面積を処理し、天然同位体存在量を補正しました37。非標的メタボローム解析のピーク選択は、El-Maven (Elucidata) の自動特徴検出を使用して実行しました。アンターゲットデータの機能解析アノテーションは、MetaboAnalyst 5.0を使用し、入力としてピーク強度テーブルを使用し、質量許容差を15 ppmに設定し、四分位範囲（IQR）フィルタ、log base 10変換、および自動データスケーリング機能を通してデータを処理しました。
ラベリングダイナミクスの解析
連続帝王切開（0分、30分、1時間、2時間、4時間）中にプローブされた各タイムポイントにおける加重グルコース濃縮度をグラフ化することにより、母体血漿と胎児組織の両方における同位体濃縮の時間発展を分析した。トレーサー注入3時間後の定常状態を評価するために、2つの数学的アプローチが適用された。母体血漿中のグルコースの定常状態の評価に適用された最初のアプローチは、線形回帰分析の傾きで表される標識画分の変化率を計算することであった。この情報を用いて、変動するグルコース濃度範囲の上限値100-500mg/dLおよび変動する血液量77-80mL/kgマウス体重を考慮して、標識グルコースの経時的変化nmolを計算した38。これらの測定基準を用いて、標識グルコースの変化を計算し、以前に報告されたマウスのグルコースの全循環回転フラックス150.9±46.7nmol/g/分20と比較した。
母体血漿グルコースと胎児組織グルコースの両方に適用された第二のアプローチは、指数関数的上昇から最大（一相会合）モデルへの適合であった。
�

�
(
1

e

�
t
)

Lは標識率、Pは標識プラトー、tは時間、kは速度定数（h-1）である。プラトーPに比べてkt値が大きい（主要な結果ではtは3時間に等しい）ことは、（擬似）定常状態を示唆する（図S1）。
代謝物同位体分布の解釈
代謝物プールの炭素標識は、最高標識同位体の割合（炭素数6の代謝物ではM+6）、または全同位体の加重平均による総炭素標識割合（代謝物プール中の個々の炭素原子が標識された割合）の2つの方法で分析した。
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13

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ここで、N は代謝物の炭素原子数、Pi は M+i 同位体の分画存在量である。
各経路で予想される標識の分画存在量を決定するために（図1E）、それぞれの経路で測定されたすべての代謝物（図1Eの経路パネルの黒文字で示す）と、すべての標識同位体の分画存在量を使用した。図 1E の経路パネルで灰色で示された代謝物は測定されていない。各経路について、報告された値は代謝物中の13C炭素の割合の平均を表す。
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ここで、m は総代謝物数 M の経路中の各代謝物、i は総炭素数 Nm の代謝物の各同位体、Pm,i は代謝物 m 中の同位体 i の分量である。
統計解析
対象としたメタボロミクスデータセットの実質的な差の数を強調するために、Benjamini-Hochberg FDR制御手順による2元配置分散分析を使用し、対数変換と欠損値のインピュテーションを行った後、潜在的な交互作用効果だけでなく、両方の要因（血糖状態と胚発生日）にまたがる有意な代謝物の変化を特定しました。相対代謝物量を表す場合、統計学的有意性は複数の両側t検定で決定し、Benjamini-Hochberg FDR制御法を用いて調整し、本研究で示した関連するすべての比較（各発育段階での血糖状態の比較、および各血糖状態での発育段階の比較）で多重検定を補正した。標識データについては、Holm-Sidakの多重比較調整を用いた複数の両側t検定によって統計的有意性を決定した。箱ひげ図として表示されたデータは、ひげと外れ値を定義するためにTukey法を適用した。有意性の表現は、n.s.（有意ではない）、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、＊＊＊p＜0.0001。メタボローム解析のサンプル数は、胎盤n=121、胎児心臓n=120、胎児肝臓n=121、胎児脳=120、母体血漿n=32。
謝辞
UCLA Crump Preclinical Imaging Technology Centerにはマウスin vivoトレーシングのための機器を提供していただき、Christofk研究室のメンバー全員には議論と建設的なフィードバックをいただいた。C.A.P.-R.はUCLAのBroad Stem Cell Research Center (BSCRC) Training Programの支援を受けた。本研究の研究資金は、H.R.C.、A.N.、J.O.P.に授与されたUCLAのBSCRC Innovation Awardから提供された。J.O.P.はR35 GM143127から資金提供を受けた。A.N.はR01 HL142801および日本学術振興会19K24689から研究助成を受けた。H.R.C.はR01 CA215185およびR01 AR070245から研究助成を受けた。
著者貢献
H.N.、A.N.、H.R.C.は、発生臓器の代謝時間経過の検討を構想した。C.A.P.-R.、H.N.、A.N.、H.R.C.が研究をデザインした。C.A.P.-R.はin vivo [U-13C]グルコース注入の最適化と実施、すべての胎児組織および血漿代謝物抽出の実施、標識解析および標的/非標的メタボロミクスデータ解析を行った。H.N.は定時妊娠の設定、採血、母体グルコースレベルの測定、胎児欠損のカウント、胎児組織の解剖を行った。N.M.はLC-MSサンプルの実行、生ファイルの処理、ターゲットピークの割り当てを行った。R.C.L.とJ.O.P.は標識データを分析し、栄養源と経路利用を評価するモデルを開発した。J.T.は胎児組織処理を補助し、A.P.はin vivo [U-13C]グルコース注入と代謝物抽出を補助した。C.A.P.-R.、H.N.、R.C.L.、J.O.P.、A.N.、H.R.C.はデータ解釈を行い、全著者の意見を取り入れて原著論文の執筆および/または編集を行った。
利益宣言
H.R.C.はCell Advisory Boardのメンバーである。
インクルージョンと多様性
我々は、包括的で多様性のある、公平な研究実施を支持する。本論文の著者のうち1名以上が、研究分野または地理的な位置において、十分に代表されていないエスニック・マイノリティであることを自認している。本論文の著者のうち1名以上がLGBTQIA+コミュニティのメンバーであることを自認している。
補足情報
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表S1. 図1に関連する胎児組織と母体血漿のターゲットメタボロミクス
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表S2. 図1に関連する胎児組織および母体血漿の代謝物アイソトポログ分布
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表S3. 図2に関連する、実験群間で有意差のある標的分析で同定された代謝物
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表S4. 胎盤E18.5およびE10.5における非標的メタボロミクス（図6関連
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全文
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グーグル奨学生
松上敏郎
種村和彦
三重田光男
中冨理恵子
山田和彦
近藤哲也
小川雅彦
小畑和彦
渡辺美樹
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他
表紙から 脳の発達におけるグルタミン酸トランスポーターGLASTとGLT1の必須性。
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日本学術振興会特別研究員
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MZmine 2: 質量分析ベースの分子プロファイルデータの処理、可視化、解析のためのモジュラーフレームワーク。
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論文リスト(2607)
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クロスリファレンス
グーグル奨学生
マイヤーズ O.D.
サムナー S.J.
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バーンズ S.
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質量分析メタボロミクスデータからの偽陽性および偽陰性の化合物同定を減らすための一歩前進：抽出イオンクロマトグラムの構築とクロマトグラフィピークの検出のための新しいアルゴリズム。
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スコープス (227)
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グーグル奨学生
蘇 X.
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ラビノウィッツ J.D.
オービトラップ上の代謝物スペクトル精度。
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スコープス (147)
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グーグル奨学生
ミトルカ B.M.
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正常実験動物における臨床生化学的および血液学的基準値。
マッソン出版, 1981
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グーグル・スカラー
論文情報
出版履歴
出版 2023年12月8日
受理 受理：2023年11月8日
改訂版受理 2023年9月27日
受理：2023年9月27日 受理日：2022年9月7日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.011

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図
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グラフィカルアブストラクト
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図1妊娠中期から後期および糖尿病妊娠中の胎児代謝を評価するメタボロームプラットフォーム
図サムネイルfigs1
図S1図1に関連した母体高血糖モデルへの妊娠秋田マウスの使用
図サムネイル図2
図S2図2に関連する、野生型および秋田県産マウスの母体血漿および胎児組織における代謝プロファイルの有意な特徴
図サムネイルgr2
図2母体高血糖は胎児組織にソルビトールを蓄積させる
図サムネイルgr3
図3母体の高血糖は妊娠中期から後期にかけて胎児の脳のアスパラギン酸およびグルタミン酸レベルを変化させる
図サムネイルfigs3
図S3図3に関連する胎児組織のGABA測定値
図サムネイルgr4
図4胎児組織における同位体トレーシングにより、胎児の栄養摂取と利用が明らかになった
図サムネイルfigs4
図S4胎児組織の同位体トレーシングによる代謝戦略の解明（図4関連
図サムネイルgr5
図5胎児発生過程におけるde novoヌクレオチド合成の漸進的減少
図サムネイルfigs5
図S5胎児組織ヌクレオチド中の[U-13C]グルコース濃縮度の進行的低下（図5関連
図サムネイルgr6
図6発生後期の胎児組織におけるヒスチジン由来の代謝産物の蓄積
図サムネイルfigs6
図S6妊娠後期におけるヒスチジン由来代謝物の増加を明らかにした標的外解析（図6関連
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