猫における口腔内細菌叢の特性評価。猫の慢性歯肉口内炎における真菌の役割に関する新たな知見
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ジャーナル Pathogens Volume 10 Issue 7 10.3390/pathogens10070904
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オープンアクセス論文
猫における口腔内細菌叢の特性評価。猫の慢性歯肉口内炎における真菌の役割に関する新たな知見
Janina A. Krumbeck 1, Alexander M. Reiter 2, James C. Pohl 3, Shuiquan Tang 1, Young J. Kim 3, Annika Linde 3, Aishani Prem 1 and Tonatiuh Melgarejo 3, *ORCIDによるものです。
1
MiDOG LLC, Irvine, CA 92614, USA
2
ペンシルバニア大学獣医学部、フィラデルフィア、ペンシルバニア州19104、米国
3
西部健康科学大学獣医学部、ポモナ、カリフォルニア州91766、米国
*
著者名
Pathogens 2021, 10(7), 904; https://doi.org/10.3390/pathogens10070904
受理されました。19 June 2021 / Revised: 13 July 2021 / Accepted: 2021年7月14日 / 掲載：2021年7月17日
(この記事は Section Fungal Pathogens に属しています)
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要旨
猫慢性歯肉口内炎（FCGS）の発症および進行には，ウイルスおよび細菌の関与が示唆されているが，真菌の役割については全く不明である。本研究は，ネコの口腔の健康と疾患におけるバクテリオームとマイコバイオームを調査することを目的とした．個人所有の臨床的に健康な（CH）猫（n = 14）とFCGSに罹患した猫（n = 14）の口腔衛生評価を含む身体検査が行われた．無菌スワブを用いてCHおよびFCGS猫の口腔組織表面をサンプリングし、16S rRNAおよびITS-2次世代DNA配列の決定に供した。多数の真菌種（n = 186）が検出され、FCGSサンプルではMalassezia restricta、Malassezia arunalokei、Cladosporium penidielloides/salinae、Aspergillaceae sp.、CHサンプルではSaccharomyces cerevisiaeが著しく濃縮されていた。バクテリオームはグループ間で有意に区別され、有意なキンドーム間相互作用が記録された。Bergeyella zoohelcumは、健康なネコの口腔内マイクロバイオームのバイオマーカーとなる可能性があることが確認された。これらのデータは、FCGSの病因および病態に真菌が関与している可能性を示唆しており、口腔内の健康は、単に微生物感染がないことと見なすべきでないことを示唆している。口腔内の健康は，単に微生物感染がないことと考えるのではなく，口腔内の微小環境において複雑な平衡を保つために共存する細菌と真菌の集団間の生物学的相互作用として捉えることができるかもしれない．ネコの口腔内生態系とFCGSにおけるウイルス、細菌、真菌の潜在的な相互作用に関する理解を深めるために、さらなる調査が必要である。
キーワード：次世代DNAシーケンス，口腔マイクロバイオータ，マイクロバイオーム，マイコバイオータ，16S rRNA，fungal ITS，feline stomatitis
はじめに
猫慢性歯肉口内炎（FCGS）の有病率は、約0.7～12％である[1]。患猫は通常、口腔内の炎症、疼痛、食欲不振および嚥下障害を呈する。本疾患の発症には、ネコカリシウイルス（FCV）およびネコヘルペスウイルス-1（FHV-1）が関与しているとされていますが、FCGSの猫は、歯肉炎や歯周炎を超える口腔内炎症につながるプラーク細菌に対する異常な反応を示すのではないかという仮説もあります[2]。しかしながら、FCGSの正確な原因は未だ不明であり、部分的および全面的な抜歯と広範な内科的管理の他に治療法としてのゴールドスタンダードが存在しない。その結果、FCGSは、臨床家のみならず、顧客にとっても困難な疾患となりうるのです[3]。現在の治療アプローチには、専門家による歯のクリーニング、抜歯（部分的または全面的）、および広範な内科的管理（抗菌、抗炎症、免疫抑制、免疫調節）が含まれる。抗生物質の投与はほとんどの管理計画に含まれていますが、細菌培養および感受性試験は通常行われません。適切な診断情報なしにアモキシシリン、アモキシシリン・クラブラネート、クリンダマイシン、メトロニダゾールを用いたFCGSの経験的治療は、細菌耐性を促進し、結果として効果がない可能性がある。
FCGSの発症における微生物集団の生物学的役割をより理解するために、2つの科学グループが培養ベースの方法を用いて猫の口腔マイクロバイオームを部分的に説明した[4,5]。これらの研究により、ネコの口腔は一般的に偏性嫌気性菌と通性嫌気性菌が優勢な多菌性であり、そのうちルーチンラボ法で培養可能な細菌株はごくわずかであることが示されました[6]。次世代DNAシーケンシング（NGS）のような分子生物学的ツールは、培養に依存せず、より高感度であるという利点がある。NGSは、アンターゲットシーケンスアプローチを使用し、これまで知られていなかった微生物を含め、サンプルに存在する細菌や真菌を特定し定量化することができます。この技術はこれまでに、健康な状態[7,8,9,10,11]と疾患[12,13,14,15,16,17]の猫の口腔内の研究に適用されており、猫の口腔内の細菌プロファイルが豊富で非常に多様であることを示しています。臨床的に健康な猫では、Porphyromonas属、Moraxella属、Fusobacterium属が最も多く[18]、Capnocytophaga canimorsusが最も多く、XanthomonadaceaeとBergeyella属がそれに続く [10]（※1）．歯肉炎、軽度の歯周炎、またはその他の口腔疾患に罹患した猫では、SpirochaetesおよびBacteroidetes属 [11] とPeptostreptococcaceae属 [13] の主要病原体が優勢であった。別の研究では、Pasteurella multocida subsp.multocidaのメンバーが、対照群と比較して罹患した猫で有意に多く見られたことが示されています[5]。
細菌以外にも、真菌は様々な種 [19] や感染症 [16,20] において、哺乳類マイクロバイオームの重要な構成要素となっています。現在までに、健康な猫[9]やアレルギー体質の猫[21]の真菌の口腔内微生物叢、すなわちマイコビオタについて調査した研究は2件のみである。我々の知る限り、FCGSを発症した猫の口腔内マイコバイオオームを調査した研究は存在しない。FCGSにおける口腔内細菌叢の役割を理解することは、疾患の病態生理に重要な洞察をもたらすだけでなく、予防および治療のための新しいアプローチを概説する可能性がある。本研究の目的は、CH猫とFCGS発症猫の細菌および真菌の微生物叢を調査することであった。ネコの口腔内微生物の構成および構造は、2つのグループ間で異なるであろうという仮説が立てられ、これらの相違および集団動態は、FCGSの複雑な病因および潜在的な治療アプローチに対する臨床医の理解を深めることができるかもしれない、と考えられた。結果
本データセットでは、合計249の細菌属と186の真菌属が同定された。すべてのサンプルは細菌と真菌の両方を保有していたが、CHサンプル（CH_5）だけは例外で、真菌種が存在しないようであった。試料内の微生物多様性、すなわち試料中に何種類の微生物が存在するかを示す測定ツールとして、一般的に用いられているのがアルファ多様性です（図1a～c）。CHとFCGSサンプルのアルファ多様性測定では、観察された細菌種の数が真菌種の数よりも有意に多いことが示されました。FCGSとCHのサンプルでは、それぞれ平均76種と90種（丸めたもの）の細菌種が観察された。しかし、真菌の種数に関しては、FCGSとCHのサンプル間で有意な差は見られず、それぞれ平均15種と13種であった（Figure 1a）。細菌の多様性は、観察された種数およびシャノン多様性指数（生物多様性が高くなる値）ともにグループ間で有意差があり、CHサンプルで高いアルファ多様性を示した（図1a,c）。菌類については、種の相対的な存在量を示すシャノン多様性指数とシンプソン多様性指数の両方が、CHサンプルと比較してFCGSサンプルで有意に高くなりました（図1b、c）。ベータ多様性（サンプル間の微生物多様性の測定）は、FCGSサンプルがCHサンプルと細菌または真菌の構成で有意な差がないことを示した（図2a、b）。
Pathogens 10 00904 g001 550Figure 1. FCGSサンプルとCHサンプルの微生物多様性解析。有意な p 値はグラフに示す。(a) 各グループの細菌と真菌の観察種数。(b) 各サンプルのShannon Diversity Index（シャノン多様性指数）。(c) 各サンプルのSimpson Diversity Index。
病原体 10 00904 g002 550図2. (a) 細菌と (b) 真菌の微生物組成のベータ多様性（Bray-Curtis-distance）。赤がCHサンプル、青がFCGSサンプル（p値>0.05）を示す。
2.1. CH および FCGS キャットにおける細菌微生物相の分析
各グループの細菌組成プロファイルを分析した（図3、上）。健康な猫では、平均して最も優勢な上位5つの細菌種は、Porphyromonas gulae (10.0%), Moraxella sp. (7.3%), Porphyromonas sp. (2.8%) Porphyromonas circumdentaria (2.6%), および Bacteroidales sp. (2.6%) であった。FCGSサンプルの平均相対量に基づく上位5つの最も優勢な細菌種は、Porphyromonas gulae（16.9%），Peptostreptococcus canis（4.9%），Bacteroidales sp.（3.8%），Fretibacterium sp.（3.5%） および Propionibacteriaceae sp.（2.7%) であった。どのサンプルにおいても，微生物相の50％以上を占める細菌種はなかった．猫の正常な口腔内細菌叢で一般的に知られるモラクセラ属は、平均存在率5.8％で存在した。
病原体 10 00904 g003 550図3. 口腔内サンプル中の細菌（上段）および真菌（下段）の微生物分類群サマリープロット。図の左側はCHサンプル、右側はFCGSサンプルを示している。各列は猫1匹の微生物プロファイルを表している。グループごとに最も豊富な上位15種が表示されており、最も豊富な種が最初に記載されている。
LEfSe（Linear discriminant analysis Effect Size）分析を行い、すべての分類レベルでグループ間で差のある細菌微生物相の構成要素を特定した。補足図S1aに示すように、FCGSサンプルでは5科（緑で強調表示）、CHサンプルでは14科（赤で強調表示）が有意に濃縮されていた。種レベルでは、16の細菌種がFCGSサンプルで、39の細菌種がCHサンプルで有意に豊富であった。いずれかのグループで相対的な存在量が1.5%以上であった種をフィルタリングした後、FCGSグループで6種、CHグループで14種が残った（図4a）。両グループで確認された20の細菌のうち、9種は偏性嫌気性菌であった。CH群では、Xanthomonadaceae sp.、Moraxella sp.、Pseudoclavibacter sp.、Bergeyella zoohelcum、Flavobacterium sp.などの好気性細菌の数が著しく多かったが、FCGS群に濃縮されていた種は、好気性または通性嫌気性であるPropionibacteriaceae sp.を唯一の例外としてすべて好気性細菌であることが判明した。興味深いことに、Fretibacterium sp.、Propionibacteriaceae sp.、Spirochaetaceae sp.、Lachnospiraceae sp.はCHサンプルで高い頻度（すなわち、このサンプルセットでより頻繁に発見された）で、その相対量はFCGSサンプルで有意に高かった。CHサンプルで有意に多く、FCGSサンプルでCHサンプルより頻繁に見られる種はなかった。
病原体 10 00904 g004 550図4. グループ間で有意に異なる種を強調した、（a）細菌と（b）真菌の種レベルのLEfSe分析サマリー。棒グラフは、その分類群が存在した猫における特定の種の相対的な存在量を示す（左のy軸）。三角と丸は、グループごとのデータセットにおけるその種の頻度、すなわち、その種が微生物叢に存在した猫の数（右のY軸）を示している。青と三角で示されているのがFCGSサンプル、赤と丸で示されているのがCHサンプルである。細菌種の酸素依存性は、好気性細菌は白い箱、通性嫌気性細菌は灰色の箱、嫌気性細菌は黒い箱で示される。
2.2. CHおよびFCGS猫における真菌微生物叢（マイコビオタ）の解析
データセット全体で同定された186種類の真菌種（または123属）のうち、CH猫における平均相対存在量に基づく上位5種の優勢真菌種はSaccharomyces cerevisiae（28.0%）, Cladosporium sp.（13.0%）, Alternaria sp.（6.9%）, Fungi sp.（5.7%） and Cladosporium langeronii/psychrotolerans（4.1%) であることが判明した。6つの試料（CH_1、CH_9、CH_2、CH_6、CH_7、CH_16、図3の順）では、単一の真菌（Saccharomyces cerevisiae（4）、Cladosporium sp（1）、Fungi sp（1））が真菌相の50%を超えた（図3、下）。FCGS試料では、Malassezia restricta (11.9%), Cladosporium sp. (11.5%), Fungi sp. (9.2%), Saccharomyces cerevisiae (5.8%), Cutaneotrichosporon curvatus (5.2%) が上位5種（平均）の優勢菌であることが示された。真菌のプロファイルは、サンプル間で大きなばらつきがあることが特徴である。4つのサンプル（FCGS_1、FCGS_14、FCGS_3、FCGS_8、図3の順）は、単一の真菌（Fungi sp.（2）、Malassezia restricta（1）、Cutaneotrichosporon curvatus（1））に支配されており、これらのサンプルの真菌叢の50%を超えている。
2つのグループを区別する菌叢のメンバーを特定するために、LDA効果量（LEfSe）分析を実施した。このテストでは、CHとFCGSの猫の菌叢の違いを特徴づける、すべての分類学的レベル（門から種まで）で統計的に有意な真菌の分類群を同定した。LEfSe分析の結果、FCGSサンプルでは2つのクラス（EurotiomycetesとMalasseziomycetes）、2つの目（EurotialesとMalasseziales）、2科（AspergillaceaeとMalasseziaceae）が著しく豊富だった（補図S1b）。CHサンプルでは、1科（Saccharomycetaceae）のみが有意に濃縮された。種レベルでは、FCGSサンプルでは4種の真菌が有意に多く、頻度も高かった。具体的にはM. restricta、Cladosporium penidielliodes-salinae、M. arunalokei、およびAspergillaceae sp. Saccharomyces cerevisiaeの1種のみがCHネコで有意に濃縮されていた（図4b、および補足表S1）。この分析では、上記のように全データセットとは対照的に、種が存在するサンプルのみについて平均相対存在量を計算した。Cladosporium penidielliodes-salinaeとAspergillaceae sp.を除いて、すべての真菌がFCGSとCHの両方のサンプルで検出された。
2.3. 微生物相コア分析
コア分析は、（1）2つのグループ間で共有される微生物叢のコアメンバー（すなわち、健康状態に関係なくネコ口腔の一部であるもの）、および（2）CHグループ、または（3）FCGSグループのコアの一部であるものを識別するために実施された。ある種がコア微生物叢の一部と見なされるためには，その種は少なくとも50%のサンプルに存在し，そのサンプルセットの微生物叢の少なくとも1%を代表していなければならない．この解析は、真菌叢のLEfSe解析の結果を確認し、Cladosporium sp.がグループ間で共有される唯一の真菌種であり、M. restrictaとM. arunalokeiはFCGSコアに、S. cerevisiaeはCHコア微生物叢にのみ属していることが示されました（図5）。C. penidielloides/salinaeはFCGSサンプルに有意に濃縮されていたが、FCGSコア微生物叢の一部ではなかった。
病原体 10 00904 g005 550図5. 微生物コア分析。このグラフは、FCGSコア、CHコア、または共有のネコ口腔内コア微生物叢の一部である細菌および真菌種を示す。真菌は漫画の菌で示した。細菌種の酸素依存性は、好気性細菌は白いボックス、通性嫌気性細菌はグレーのボックス、嫌気性細菌は黒いボックスで示されている。
細菌コア微生物相解析の結果、15種が共有コアに含まれ、そのうちのいくつかはLEfSe解析で以前に同定されていたことがわかった（図4a）。CHサンプルで同定された種のうち、偏性嫌気性細菌は2種のみで、他のすべての種は好気性細菌（5種）または通性嫌気性細菌（4種）であった。興味深いことに、B. zoohelcumとP. canorisもCHコアの一部であった（図5）。
2.4. 共起性解析
この生態系の個体群動態をより理解するために、細菌と真菌の両方を組み合わせた共起性分析を行いました（図6）。この解析により、FCGSサンプルでは、FCGSグループに有意に濃縮されている種であるFretibacterium sp.（図4a）が、CHグループに有意に濃縮されている種でCHコア微生物相の一部であるArenimonas sp.とBurkholderiaceae sp.と負の共起を示すことが示された（図5）。同様に、FCGS群で有意に濃縮されコアメンバーであるP. canisは、CH群で有意に濃縮されCHコアメンバーであるXanthomonadaceae sp.と負の共起を示した。さらに、FCGS群では、4つの菌が同じ王国の間で正の共起を示した。この現象はCH群では見られなかった。また、CH グループでは、過去に同定された2つの細菌種間の共起が1つだけ検出された。具体的には、CHのコアメンバーであるFusobacterium sp.と（図5）、FCGSグループで有意に濃縮された共有コアメンバーであるFretibacterium sp.の間の負の共起である（図4a、および図5）。
病原体 10 00904 g006 550図6. FCGS（左）およびCH（右）サンプルの共起性解析のヒートマップ。この解析では、細菌と真菌の両方を組み合わせている。負の共起は黄色、正の共起は青色、ランダムな共起は灰色で表示されている。真菌は、識別しやすいように漫画の菌で表示されている。考察
我々のパイロット研究では、ネコの口腔内細菌叢は、細菌および真菌の組成に関して、CHおよびFCGSサンプルの間で明瞭であることが示された。両グループは、細菌と真菌の両方で高い微生物多様性を特徴とした（図2）。特に、FCGSサンプルは、健康なサンプルよりも高いα多様性を示した（図1）。グループ内のサンプルの不均一性が大きく、CHサンプルのサブセットが単一の真菌によって支配されている菌類プロファイルを有していたことが示された（n = 6）。
各グループを最もよく特徴づける種を同定するLEfSe分析によると、M. restrictaやP. canisなどの一般的に知られた病原体や、既知の常在菌（すなわちPasteurellaceaeやMoraxella）を含むいくつかの分類群がグループ間で明確に区別された（図4）。これらの常在菌は、CHサンプルにおいて有意に多く存在していた。さらに、FCGSサンプルでは4種の真菌が、CHサンプルではS. cerevisiaeが有意に濃縮されていることが実証された（図4b）。微生物相の集団動態をさらに理解するために、共起性分析を実施した。この解析により、細菌と真菌の分類群の間にいくつかの有意な相関が確認され（図5）、多数の細菌種が少数の真菌種と共存しているように見えることが示されました。
FCGSに罹患した猫の口腔内微生物叢組成を調査するツールとしてNGS技術を使用することは、与えられた実験室条件下で増殖できる微生物のみを報告する培養依存の方法とは対照的に、総微生物叢組成を把握する利点がある。今回紹介した NGS 技術は、微生物集団全体のダイナミクスを詳細に把握し、CH と FCGS の猫でそれらがどのように異なるかを示すものである。今回発表されたデータは、口腔の健康と疾病に関与する微生物相の複雑さを臨床医が理解するのに役立つと考えられる[18]。これは、将来の新規治療法の開発の基礎となる可能性がある。
伝統的に、特定の身体部位の微生物多様性が高いほど、患者の健康状態が良好であることと相関している[8,22]。本研究で得られたデータは、細菌の多様性と健康に関するこの概念を確認するものであった（図1a,c）。しかしながら、FCGSに罹患した猫を対象とした既報の研究では、FCGSの猫においてより高い微生物多様性が実証されており [18]、今回得られた結果とは相反するものであった。別の研究では、慢性歯肉炎を発症した猫と発症していない猫の細菌プロファイルの多様性に差は観察されなかった[23]。しかし、真菌学的分析では、FCGSの猫に比べ健康な猫では真菌の多様性が有意に低いことが示された（図1b,c）。CHとFCGSの猫における真菌叢を調査した既往研究はないため、これは新規の知見である。
バクテリオームと真菌叢の全体的な構成は、各グループの個体間で大きなばらつきを示し（図3）、これまでに報告されたいくつかの常在菌と口腔内病原体が検出された。さらにグループごとの微生物プロファイルを解剖するため、LEfSeを用いた2つのグループの比較分析により、CH猫はFCGS猫と比較して明らかに異なる細菌および真菌の微生物叢を有していることが示された。具体的には、CH猫はMoraxella[17]やPasteurellaceae[4]など、これまでに報告されている常在菌をより多く保有していた。CH群ではF. nucleatum，P. canoris，B. zoohelcumの3種が目立っていた。
F. nucleatumは歯肉炎の指標として知られているが、歯垢の初期コロニー形成者と後期コロニー形成者の「橋渡し役」としても知られている[24]。P. canorisは、以前、歯肉炎の犬で8％という低数値で報告され[25]、FCGSを患う猫1匹で報告されている[5]。本研究では、CH群とFCGS群に両種が確認されたが、頻度および相対的な平均存在量はCH群でより高かった。さらに、P. canorisはCHのコア微生物叢の一部であった。このことから、FCGSにおけるこの2種の潜在的な役割について、さらなる調査が重要であることが明らかになった。最後に、健康な動物の口腔微生物叢に関連する種であるB. zoohelcumは、CH群に有意に濃縮され、CHコア微生物叢の一部であった[26]。したがって、より大規模な研究でこの知見が裏付けられれば、健康なネコの口腔内細菌叢のマーカーとして使用できる可能性がある。全体として、CHの微生物叢はFCGSの微生物叢よりも酸素依存性種が多いことが特徴であり、これはプラーク形成が嫌気性細菌の多いことと関連している先行研究と一致している[27]。Neisseriaceae種は健康な口腔微生物叢と関連しており［10］、この分類群はCHサンプルでは有意に濃縮されていなかったが、Neisserialesは依然としてCHコア微生物叢の一部であった。
FCGSを発症した猫には、Fretibacterium sp.やPeptostreptococcusといった一般的に知られている細菌性病原体が生息しており、これは以前に発表された研究結果と一致している[11]。P. canisとM. oralisの2種は、有意に濃縮されており、P. canisもFCGSコアの一部であったため、特に興味深かった。P. canisは犬の歯周炎の後期コロニー形成者であり[28]，M. oralisは2013年に発見された比較的新しい口腔病原体であり[29]，ともに歯周炎で報告された嫌気性菌種である．P. canisを除いて，これらの種はいずれも他の細菌や真菌の微生物叢のメンバーとの有意な共起を示さなかった．FCGSサンプルとFCGSコアメンバーで有意に濃縮されているP. canisは、CHサンプルとCHコアメンバーで有意に濃縮されているXanthomonadaceae sp.と負の共起を示しました。このことは、この2つの分類群の間に拮抗関係があることを示唆しているのかもしれない。Xanthomonadaceaeの有意な濃縮は、歯肉炎を持たない猫についても以前に報告されており、今回示されたデータと一致する[23]。この点をさらに検討するためには、in vitroでの研究が必要かもしれない。
今回初めて、FCGSサンプル中のネコのマイコビオタが分析された。この分析により、FCGSのネコは、一般的に知られているヒトの頭皮の病原体であるMalassezia restricta [30] を、CHネコよりも有意に高い量と頻度で保有していることが示された。Malassezia arunalokeiは2016年に発見されたばかりの比較的未知の真菌で[31]、今のところFCGSとの関連は報告されていない。ヒト患者を対象とした研究では、マラセチア種は口腔内菌叢の常在菌と考えられると報告されています[32]。特に、真菌が口腔内で生存および増殖するためには、居住細菌微生物叢および宿主との共生関係が必要であるため、ネコの健康および疾患におけるこの真菌の役割を理解するための今後の研究が必要である［24］。興味深いことに、Malassezia arunalokeiの存在量の多さは、別の真菌であるCladosporium lignicola/spaerosperumの存在量と負の相関があった。ネコの健康におけるM. arunalokeiの役割について議論するためのメタゲノムまたはin vitroのさらなるデータがないため、いかなる結論も推測に基づくものである。FCGSサンプルではクラドスポリウム種が有意に多かったが、猫におけるこの属の健康への影響についてはほとんど知られていない。Cladosporium sphaerospermumは、以前、ヒトにおけるアレルギーおよび喘息症状の発症と関連していた[33]。アスペルギルスの異なる種は、様々なネコの病気を引き起こすことが報告されている[34,35,36]。本研究では、FCGSサンプルにおいてAspergillaceae sp.が有意に濃縮されており、陽性サンプルが1つと頻度は低いものの、CHサンプルのいずれからもこの分類群は検出されなかった。同じことが、検出された他の真菌種、Cladosporium penidielloides/salinae (FCGS 14サンプル中4サンプルが陽性 [28.6%]) にもあてはまり、これはCHサンプルには存在しなかった。より大規模な研究コホートにより、この2種が猫におけるFCGSの潜在的バイオマーカーであることが確認されるかもしれない。興味深いことに、CHサンプルおよびCHコアの一部で濃縮された真菌種は、Saccharomyces cerevisiaeのみであった。現時点では、ネコの健康におけるS. cerevisiaeの潜在的な役割に関するデータは非常に限られている。S. cerevisiaeの異なる株は、ヒト[37]や動物[38]のプロバイオティクスサプリメントとして使用されており、この種のネコの健康における有益な効果の可能性は、さらに調査する価値があると思われる。
真菌と細菌は、口腔のような限られた空間において、菌界間の密接な生態系を形成している。真菌の細胞数は細菌の細胞数に劣るが、真菌のバイオマスは細菌細胞の1000倍とかなり大きい [39] 。真菌は、酵母型と糸状型に変化することができ、このことは、その病原性、炭素および酸素代謝、サイズ、および口腔微生物叢の他のメンバーとの相互作用に影響を及ぼす [40]。特に、Candida albicansのような真菌は、S. mutansを含む微生物叢の様々な細菌と病原性のバイオフィルムを形成することが知られている[41]。このようなバイオフィルムは、化学的勾配、メンバー間の交差摂食、および抗生物質耐性によって特徴付けられる。本研究で重要視した2つの真菌分類群であるMalasseziaまたはCladosporiumと他の細菌との間のバイオフィルム形成または種間相互作用の可能性は、猫の口腔衛生またはFCGSとの関連でin vitroまたはin vivoで実施されたことはない。したがって、種間依存性についての臨床的な関連性は、現時点では見いだせない。真菌は、ヒト口腔内の基幹種として提案されており、口腔内コミュニティの安定性を維持する上で不可欠な存在であり、疾患の発症に向けたシフトに関与している[24]。多くの口腔疾患は、群集のバランスの乱れと関連しているため [24]、疾患がないことを超えて口腔の健康を定義するためには、健康な状態でのそのようなバランスがどのように見えるかを理解するためのさらなる研究が必要です [42]。特に、バイオフィルムが多菌性であるにもかかわらず、治療法の大半が単剤治療であることから、宿主とすべての内在微生物の間のバランスは不可欠である [24]。
本研究の限界は、サンプル数が比較的少なく、記述的であること、そしてトランスクリプトミクスデータが得られなかったことである。現在までのところ、ネコの口腔内真菌叢についてはほとんど知られておらず[21]、FCGSの文脈における真菌叢については基本的に何も知られていない。このため、今回発表された結果を臨床的な文脈に当てはめることが課題となっている。本研究は、FCGSの発症に真菌が関与している可能性を示唆するものである。したがって、このアッセイの分析的妥当性が確認されるまでは、真菌培養、またはより良いNGSが、将来のルーチン健康評価において考慮されるかもしれない。より大きなサンプルサイズを用いた今後の研究では、FCGSの診断から治療レジメンに至るまでFCGS猫を追跡し、疾患の進行および/または寛解における微生物成分を評価することに焦点を当てることができる。最後に、本研究では、過去に専門家による歯のクリーニング、抜歯、広範な医療管理を行った時期が記録されていない。材料と方法
4.1. 対象者および研究デザイン
本研究では、臨床的に健康な猫（CH）14頭と FCGS を持つ猫 14 頭、合計 28 頭を分析した。健康な猫のサンプルは、Western University of Health Sciences (WUHS), Pet Health Center (PHC), Pomona, CA (n = 14)で採取されたものである。FCGSサンプルは、WUHS-PHC（米国カリフォルニア州ポモナ）、Saddleback Animal Hospital（米国カリフォルニア州タスチン）、Advanced Veterinary Specialty Group（米国カリフォルニア州タスチン）、およびCat Care Clinic（米国カリフォルニア州オレンジ）から入手した。6つの異なる猫種が、幅広い年齢層（2歳から13歳）で、CHグループの平均年齢は4±0.5歳、FCGSグループの平均年齢は8±1.1歳であった。標準化された上流サンプリングプロトコル（セクション4.2.参照）を用いて、一貫してサンプルの収集と保存を確実に行った。CHの猫は、WUHS-PHCの外科セクションから、選択的処置（去勢手術など）のために入院した時点で募集した。CH群とFCGS群のすべての猫に同じ検査プロトコルを実施し、以前に発表されたFCGSスケールに若干の修正を加えて分類した[43]。すなわち、グレード0：病変なし、グレード1：軽度の歯肉炎、グレード2：中等度の歯肉炎、グレード3：重度の歯肉炎、グレード4：尾側口腔/口蓋垂および/または歯槽、口唇、頬、舌下および舌粘膜（歯肉外病変）の増殖性および/または潰瘍性病変を伴う歯肉炎であった。FCGS群にはグレード4の病変を有する猫のみが含まれる．CHグループの猫は、検査時に病変がないか、軽度の歯肉炎のみを呈していた（14頭中6頭）。
4.2. サンプル採取、DNA 抽出、ライブラリー調製、塩基配列の決定
サンプルは、MiDOG LLCが提供するスワブ採取キットを用いて、以前記載したように採取した[44]。簡単に言うと、FCGS猫からの口腔サンプルは、無菌のDNAフリー綿棒（HydraFlock®, Puritan® Cat.No.25-3406-H, Guilford, ME, USA）を用いて粘膜移行部（患部組織とそれに連続する正常部）で採取された。CH猫については、歯肉、硬口蓋、吻側背側舌、およびその他の口腔粘膜表面からスワブサンプルを採取した。すべてのサンプルは、MiDOG LLCの試験施設（米国カリフォルニア州アーバイン）で処理されるまで、直ちにDNA/RNA ShieldTM（Zymo Research Corp.、カタログ番号R1108、米国カリフォルニア州アーバイン）に浸漬して保存された。ゲノムDNAは、ZymoBIOMICSTM-96 DNA kit (Cat. No. D4304, Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA)を用いて精製した。細菌および真菌プロファイリングのためのサンプルライブラリ調製およびデータ解析は、Zymo Research Corp.がQuick-16S NGS Library Prep Kit (Cat. No. D6400, Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA) を用いて、若干変更した上で実施した。プライマー配列はMiDOG LLCサービス独自のもので、細菌については16S rDNA V1-V3領域を、真菌についてはITS-2領域をターゲットとしている。ライブラリーはIllumina HiSeq 1500シーケンサーでシーケンスし、リードはDada2 (R package version 3.4) [45]でフィルタリングされた。系統分類は、各サンプルの配列総数に基づくパーセント比率として計算した。菌類と細菌の相対的な存在比は、16S rDNA1コピーと菌類ITS1コピーの等価性を仮定して決定された。ここで用いた配列決定アプローチの種レベルの分解能は、以前にショットガンシーケンスで実証されている[44]。
4.3. 統計解析
特に断りのない限り、結果は中央値および標準偏差で表した。アルファ多様性と均等性の測定は、シャノン指数とシンプソン指数、および観察された種の数を使用して計算された。Βeta-diversityはBray-Curtis距離を用いて算出した。線形判別分析（LDA）と効果量（LEfSe）は、デフォルト設定を用いて、各グループで有意に濃縮された分類群を同定するために使用した[46]。分散分析およびタイプ I エラーを補正するための偽発見率制御は，プログラムのデフォルトパラメータを用いて p < 0.05 で行い，相関係数（r）値が r > 0.60 （絶対値）の場合は有意とした（stats v3.6.1 R Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2013）。存在度が1%以上の種を存在、1%未満の種を不在と仮定し、部位ごとの種の存在-不在データ行列を作成した。R の "coccur" 関数を用いて，正，負，およびランダムな関連を持つ種のペアワイズ分類を作成した（R version 3.5.2 の "cooccur" package, R Core Team, 2013）。5.結論
我々のデータは、FCGSの疫学において菌叢が不注意に見落とされていた可能性があること、および猫の口腔の健康は、猫の口腔常在菌叢の一部である細菌および真菌の集団間の複雑な平衡によって維持されているようであることを示唆している。診断ツールとしてのNGSが検証されれば、細菌・真菌の培養やPCRよりも包括的で感度が高く、迅速な手法となることが期待される。猫の口腔内生態系およびFCGSにおける細菌と真菌の重要な生物学的相互作用の理解をさらに深めるために、さらなる調査を実施する必要がある。
補足資料
以下は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens10070904/s1、図S1：グループ間で有意に異なる種を強調したLEfSeクラドグラム；表S1：FCGSと健康なネコのサンプル間で有意に異なる細菌と真菌の平均相対存在量。
執筆協力
構想、T.M.、方法論、J.A.K., J.C.P., Y.J.K., T.M. and A.L. 、ソフトウェア、J.A.K., S.T. and A.P. 、バリデーション、 S.T. and A.P. 、形式分析、J.A.K.., A.M.R., S.T., A.P., T.M. and A.L.、調査、J.C.P., Y.J.K. and T.M.、リソース、J.A.K. and T.M. 、データキュレーション、J.A.K, T.M.およびA.L.、執筆-原案作成、J.A.K.、執筆-レビューおよび編集、J.A.K.、 A.M.R., T.M. and A.L.、可視化、J.A.K. and T.M、指導、 J.A.K. and T.M., Project Administration, J.A.K. and T.M., funding acquisition, J.A.K. and T.M. All authors have read and agree for the published version of the manuscript.本原稿は、全オーナーの承諾を得て掲載されたものである。
資金提供
本研究は、カリフォルニア州ポモナのWestern University of Health SciencesのOffice For Research, College of Veterinary Medicine, and the Office of Research & Biotechnologyから資金提供を受けた。
施設審査委員会声明
この研究は、Western University of Health SciencesのInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC番号R21IACUC023）により承認された。
インフォームドコンセントステートメント
クライアントの同意書を確保した。
データ利用可能性ステートメント
これらのデータの利用可能性には、第三者によるデータ制限が適用されます。データはMiDOG LLCから入手したもので、データには配列の詳細に関する所有権情報が含まれています。また、MiDOG LLCの許諾を得た上で、合理的な要求があれば、対応する著者（T Melgarejo）から入手可能である。
謝辞
この研究のためにネコの口腔サンプルを提供してくれたMichael Kavanagh (Saddleback Animal Hospital, Tustin, CA, USA), Eric Van Nice (Advanced Veterinary Specialty Group, Tustin, CA, USA), Elaine Wexler-Mitchell のチーム Cat Care Clinic (Orange, CA, USA)に感謝します。また、サンプル採取の技術的サポートを提供してくれたWesternU Pet Health Centerのスタッフにも感謝する。
利益相反
著者らは利益相反を宣言しない。資金提供者は、本研究の立案、データの収集、分析、解釈、原稿の執筆、結果の公表の決定において、いかなる役割も担っていない。
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