蚊の常在菌の外膜小胞はホスファチジルコリン消去経路を介して原虫の標的殺傷を媒介する

2023年9月15日 09:12

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公開日：2023年8月24日
蚊の常在菌の外膜小胞はホスファチジルコリン消去経路を介して原虫の標的殺傷を媒介する

https://www.nature.com/articles/s41467-023-40887-6

ハン・ガオ、ジャン・ヨンマオ、...シバオ・ワン著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、論文番号：5157（2023）この記事を引用する

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指標詳細

要旨
腸内細菌叢は、抗原虫エフェクタータンパク質の産生を含め、蚊の原虫感染に重要な調節因子である。しかし、常在菌由来のエフェクターがどのようにして原虫に移行するのかは不明である。今回我々は、天然原虫阻止共生細菌Serratia ureilytica Su_YN1が、エフェクターであるリパーゼAmLipを外膜小胞（OMV）を介して原虫に送達することを明らかにした。血液摂取後、宿主の血清はSu_YN1を強く誘導し、OMVと抗マラリアエフェクタータンパク質AmLipを蚊の腸内に放出させる。AmLipはまずT1SSを介して細胞外に分泌され、次にマラリア原虫を選択的に標的とするOMVに優先的に搭載され、寄生虫の標的殺傷につながる。特筆すべきは、これらの血清誘導型OMVは、ホスファチジルコリンなどの特定の血清由来脂質を取り込んでいることである。このホスファチジルコリンは、ホスファチジルコリン消去経路を介したOMVの原虫による取り込みに不可欠である。これらの発見は、この腸内共生細菌が、寄生虫を選択的に攻撃し、蚊を原虫感染に対して不応性にするために、分泌されたエフェクター分子を細胞外小胞の形で送達するように進化したことを明らかにした。腸内共生細菌由来のOMVが、蚊の微生物叢とマラリア原虫との間の領域横断的なコミュニケーションにおけるキャリアーとしての役割を果たすという発見は、マラリア感染を阻止する革新的な戦略の可能性を提示するものである。

はじめに
現在のマラリア対策プログラムの主軸は、依然として媒介蚊の防除である1。しかし、蚊の殺虫剤耐性の増加2、蚊の屋外行動や早期刺咬3への変化、マラリア原虫の薬剤耐性4などにより、近年マラリア対策は進展していない5。そのため、マラリアを制圧するための新たな戦略が緊急に必要とされている。マラリア原虫の伝播は、蚊の中腸の内腔における複雑な発生プログラムの成功に依存しており、マラリア原虫はここで深刻な損失を被る6。マラリア対策の有望なアプローチは、蚊を殺すことではなく、寄生虫の発生段階である蚊の中腸を標的とすることで寄生虫の感染を阻害することである7。

蚊の成虫の腸内には、腸内細菌叢として知られる複雑な常在微生物の群集が形成されており、宿主の生理機能、特に病原体感染の調節に重要な役割を果たしている8。マラリア原虫と腸内細菌叢は、蚊が原虫の発育で最も脆弱な段階を迎える中腸という同じ区画を共有している7。寄生虫の発育を阻止するための戦略として、蚊に抗原虫共生細菌を寄生させることがますます魅力的になっている9。パラトランスジェネシスまたは共生細菌を用いた感染阻止戦略として知られるこの戦略は、有望視されている7。抗プラズマ原虫エフェクターを発現する腸内細菌を工学的に作製し10、さらに最近では、天然に存在する共生細菌Serratia ureilytica Su_YN1菌11が、原虫感染に対する蚊の抵抗性を高めながら蚊の集団に拡散できることが示された。S. ureilytica Su_YN1は、強力な抗原虫リパーゼタンパク質AmLipを分泌することで原虫の発育を阻害し、このタンパク質は原虫に輸送され、脂質加水分解活性によって原虫を破壊する11。しかし、AmLipを含む抗プラズマ原虫エフェクタータンパク質が原虫寄生体内へ輸送されるメカニズムはまだ全くわかっていない。

蚊の腸内共生細菌は主にグラム陰性菌であり、I型分泌系（T1SS）を広く利用してエフェクタータンパク質を細胞外腔に送り込む12。形質転換において、T1SSは蚊の中腸に寄生する原虫細胞を抑制するために、さまざまな抗原虫エフェクタータンパク質を分泌するために利用された7,10,13。しかし、T1SSから分泌されたエフェクタータンパク質は、標的細胞に直接輸送されることはなく、放出された後も保護されることはない。グラム陰性細菌もまた、T3SS、T4SS、T6SSといった特殊なタンパク質分泌系を進化させており、直接接触した後に細菌のエフェクタータンパク質を宿主細胞に移行させる14。さらに、多くの病原性細菌は外膜小胞（OMV）を放出し、生理活性分子を標的細胞に輸送するT0SSデリバリーシステムとして機能する15。しかし、我々の知る限り、腸内常在菌由来の細胞外小胞が腸内病原体に分子を送達する例は報告されていない。

ここで我々は、宿主の血食血清が、原虫を抑制する腸内常在菌セラチアSu_YN1にOMVと抗マラリアエフェクタータンパク質AmLipの分泌を強く誘導することを示す。分泌されたAmLipはOMV表面に優先的に担持され、原虫に運ばれる。注目すべきことに、Su_YN1のOMVには、ホスファチジルコリン消去経路を介して原虫がOMVを取り込むのに重要な、ある種の血清由来のリン脂質が取り込まれており、腸内常在菌がOMVを介してエフェクター分子を送達し、寄生虫を選択的に攻撃することで、蚊をマラリア寄生虫感染に抵抗性にするという新たなメカニズムが明らかになった。

研究結果
腸内常在菌由来の抗マラリアエフェクタータンパク質AmLipはOMVに優先的に蓄積する。
我々は最近、共生細菌S. ureilytica Su_YN1が抗マラリアリパーゼAmLip11の分泌を介して原虫の発育を直接阻害することを報告した。Su_YN1から分泌されたAmLipが蚊の腸内でどのように寄生虫に到達するかを調べるため、Su_YN1を保有する蚊の中腸を切開し、免疫電子顕微鏡（IEM）でAmLipの分布と局在を調べた（補足図1a、b）11。予想に反して、AmLipで染色した金粒子は、蚊の中腸の膜小胞様構造に主に集積しているように見えた（図1a）。エクソソームマーカーCD63とCD9陽性染色がなく、AmLip陽性染色が存在することから、これらの小胞様構造物は真核生物由来ではないことがわかった（補足図1c、d）。最近の研究では、細菌がある特定の条件に反応して特殊な外膜小胞（OMV）を放出する可能性が指摘されている16。我々は、Su_YN1が腸内で産生する膜小胞を透過型電子顕微鏡（TEM）（図1b、上段）と走査型電子顕微鏡（SEM）（図1b、下段）で調べた。驚くべきことに、S. ureilytica Su_YN1から大量のOMVが放出され、菌体外膜から出芽して近くに散らばっている。

図1：Su_YN1は血液を摂取したAn. stephensi蚊の中腸内腔でOMVを放出する。
図1
a Su_YN1を保有するAnopheles mosquitoの中腸の超薄切凍結切片における免疫電子顕微鏡（IEM）によるリパーゼAmLipの検出（摂血24時間後）。AmLip染色を示す金粒子を白矢印で示す。Mvは蚊の微絨毛、Bacはセラチア菌Su_YN1、スケールバーは1μm。b透過型電子顕微鏡（TEM、上段）および走査型電子顕微鏡（SEM、下段）による、蚊の中腸管腔に存在するSerratia Su_YN1菌（Bac）の画像。Su_YN1菌が産生したOMVを白矢印で示す。スケールバーは100 nm（上段）と500 nm（下段）。c 血液食または糖食を食べたSu_YN1保有アノフェレス蚊のTEM分析による中腸切片の比較。黒矢印はOMV、白矢印はSerratia Su_YN1細菌（Bac）の表面から出芽したOMV。スケールバーは100 nm。d.Su_YN1菌のNanoparticle Tracking Analysis（NTA）。RPMI1640培地にあらかじめ清澄化したウシ胎児血清（FBS）を添加したもの、または添加しないもので培養。OMV濃度は1×109細菌で規格化されている。粒子径の分布を折れ線で示した（平均±SD、各群についてn = 3独立測定）。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。e：dのOMVs超遠心ペレット（酢酸ウラニルによるネガティブ染色）のTEM解析。四角枠は、FBS誘導の有無にかかわらず、Su_YN1分泌OMVsを表示するための拡大画像。f FBS添加または無添加で培養したSu_YN1のビシンチコニン酸（BCA）アッセイによるOMV定量（平均±SD、n＝3）。OMV濃度は1×109菌で正規化。統計的有意性は一元配置分散分析（ANOVA）検定を用いて決定し、P値はプロットの上に示した。同様の結果が3回の生物学的反復から得られた。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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血粉の消化は蚊の腸内細菌にストレスを与える17。Su_YN1 OMVの産生が蚊の腸内で宿主の血液によって特異的に誘導されるかどうかを調べるため、Su_YN1を持つアノフェレス蚊に砂糖または血液ミールを与え、切片にしてTEM観察を行った。興味深いことに、Su_YN1 OMVの産生は血液を与えた蚊の腸でのみ検出され、砂糖を与えた蚊の腸では検出されなかった（図1c）。これは、宿主の血液成分がSu_YN1 OMVの産生を誘導することを示している。

宿主血清が常在菌セラチアSu_YN1にOMVを分泌させる
OMV産生は、さまざまな環境条件に反応して誘導される可能性がある16。どの血液成分がSu_YN1のOMV産生を誘導するかを調べるため、血液成分を全血、血清、赤血球溶解液に分画した。これらの成分をSu_YN1と共培養し、培養上清をTEMで調べた。その結果、宿主血清はOMVの産生を強く誘導するが、赤血球溶解液は誘導しないことがわかった（補足図2a）。さらに、様々な動物血清やヒト血清がSu_YN1のOMV産生を強く誘導した（補足図2b、c、d）。市販されており、品質も安定していることから、以降の実験ではウシ胎児血清（FBS）を使用した。血清が蚊の腸内で本当にSu_YN1 OMV産生を誘導するかどうかを確認するため、Su_YN1保有蚊にEVを含まないFBSを与え、TEMを用いて蚊の腸内でOMVを検出した。OMVは、FBSを与えたSu_YN1保有蚊の腸でのみ観察されたが、FBSを与えた腋生蚊や、糖ミールを与えたSu_YN1保有蚊では観察されなかった（補足図2e）。

次に、Su_YN1をFBSあり／なしで培養し、OMVの収量を定量した。FBSはあらかじめ超遠心分離で除去し、本来の細胞外小胞を枯渇させた（補足図2f）。血清誘導に応答して、Su_YN1 菌は粗培養液中に大量の OMV（1mlあたり約 109 個）を放出した（Nanoparticle Tracking Analysis、NTA 法）（図 1d）。その結果、約25mlのSu_YN1粗培養液を超遠心すると、OMVのペレットが目立った。この血清誘導 OMV は、淡黄色の半透明の外観を示した（図 1d）。ペレット中の OMV は、さらに TEM 分析で確認した。FBS誘導したOMVは、FBS誘導していない稀なOMVよりもふっくらとした形態を示した（図1e）。さらに、Bicinchoninic acid（BCA）アッセイ（総タンパク定量）（図1f）、3-Deoxy-d-manno-2-octulosonic acid（Kdo）アッセイ（リポ多糖定量）、および総脂質定量を用いてOMVを定量した（補足図2g、h）。一貫して、これらの異なる方法で同様の結果が得られたので、今後の研究ではBCAアッセイを用いてOMVを定量した。

細菌の細胞外小胞は、その種類と起源によって分類される。生きた細菌の外膜から放出されるOMVに加えて、細胞死によってEOMV（爆発性外膜小胞）や自己組織化OIMV（外-内膜小胞）が放出される18。さらに、Su_YN1 OMVが外膜に由来することがTEM観察で明らかに示されたことから、Su_YN1 OMVが生きた細菌によって放出されたことを確認した（図1b、下パネル）。さらに、Su_YN1はin vivoおよびin vitroの両方で強固な増殖を示し（補足図3a、b）、血清存在下ではさらに増殖が促進された。血清存在下でのSu_YN1の培養も、高いレベルの生存率を維持し（補足図3c）、血清刺激下でOMVを持続的に放出した（補足図3d）。

AmLipはまずT1SSを介して分泌され、その後OMVにロードされる
次にAmLipの発現と分泌をアッセイしたところ、AmLipの転写は血清の影響をあまり受けなかったが（補足図4a）、AmLipタンパク質の発現と分泌は血清によって強く誘導された（図2a、補足図4b）。しかし、AmLipの欠失はSu_YN1のOMV産生に影響を与えなかった（補足図4c）ことから、AmLipの分泌とOMVの生合成は独立して制御されていることが示された。

図2：宿主血清は、原虫を死滅させるAmLip-OMV複合体の形成を誘導する。
図2
a FBSを添加または無添加で培養したSu_YN1菌の上清へのAmLipタンパク質の分泌をウェスタンブロットで検出。b AmLip抗血清を用いて、Su_YN1培養上清、OMV除去上清、培養上清から精製したOMV中のAmLipタンパク質をウェスタンブロットで検出。c 免疫前血清とAmLip抗血清を用いた、Su_YN1 OMV上のAmLipのIEM検出の代表画像。白矢印はAmLip染色を示す金粒子を指す。スケールバー、100 nm。d OMV表面上のAmLipの検出。トリプシンまたはプロテイナーゼKで処理した（または処理しなかった）OMVのAmLip抗血清を用いたウェスタンブロット。e Su_YN1培養上清、OMV除去上清、およびRPMI1640で分解した精製OMVのP. berghei ANKAオオキニーテ阻害アッセイ（平均±SD、n＝3）。統計的有意性は、一元配置分散分析検定を用いて決定した。fトリプシンまたはプロテイナーゼKで処理した（または処理しなかった）Su_YN1 OMVによるP. berghei ANKA ookinete阻害アッセイ（平均±SD、n = 3）。統計的有意性は、両側スチューデントのt検定を用いて決定した。g 野生型（WT）、AmLip-KOおよびAmLip補完型Su_YN1細菌培養からのOMVによるP. berghei ANKAオオキニーテ阻害の濃度曲線（平均±SD、n = 3）。統計学的詳細はSource Dataファイルに記載。 h AmLip-KOのSu_YN1培養上清から精製したOMVに6×Hisタグ付き組み換えAmLipタンパク質を添加または非添加したP. berghei ANKA ookinete阻害アッセイ（平均±SD、n = 3）。組み換えAmLipタンパク質の負荷はウェスタンブロットで検出した（下パネル）。統計的有意性は一元配置分散分析検定を用いて決定した。i 宿主血清がSu_YN1を誘導してOMVを産生させ、AmLipを分泌させ、AmLip-OMV複合体を形成して原虫を殺すことを示す模式図。e、f、hのP値はプロットの上に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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細菌OMVは、様々な分子カーゴを輸送する重要なビークルである19。AmLipとOMVの結合を確認するため、Su_YN1をin vitroで培養し、超遠心分離によってSu_YN1 OMVを精製した20。予想通り、精製したOMVにはAmLipが多く含まれていた（補足データ1）。また、ウェスタンブロットを用いてAmLipの分布を検出したところ（補足図4d）、分泌されたAmLipタンパク質の大部分はOMVと会合していた（図2b）。その結果、上清中のAmLipタンパク質の大部分は、AmLipの分子量（〜64 KDa）よりも大きい100 KDaのメンブレンフィルターに保持され（補足図4e）、この分子がOMVと物理的に結合していることが示された。さらに、IEM（図2c）と免疫蛍光アッセイ（補足図4f）の両方を用いて、この観察を確認した。これらの結果から、AmLipはOMVと会合していることが明らかになった。

リパーゼは通常、I型分泌系（T1SS）21,22を介して分泌されることから、AmLipはT1SSを介して分泌された後、OMVに結合するのではないかと考えられた。この仮説を検証するため、AmLipのC末端T1SS認識領域（アミノ酸配列351-614）を欠失させたAmLip Δ351-614コンストラクトを作製し、ウェスタンブロッティングを用いてAmLipとAmLip Δ351-614の両方の分布を検出した（補足図5a）。予想通り、AmLip Δ351-614は細胞質に保持され、分泌やOMVの負荷は見られなかった（補足図5b）。さらに、AmLipがOMVの表面と内腔のどちらに負荷されるかを調べるため、トリプシンおよびプロテイナーゼK23,24を用いたプロテアーゼ消化試験を行った。OMVをプロテアーゼ消化すると、AmLipは完全に分解されたことから、AmLipは分泌後、OMVの表面に選択的に結合していることが示された（図2d）。

AmLipを添加したOMVは原虫の寄生を強く阻害する
AmLipはリパーゼファミリー（E.C.3.1.1.3）の一員であり、油-水界面に強い親和性を示すことから、血清誘導Su_YN1 OMVの表面はリパーゼ結合に有利である可能性が示唆された。AmLipとOMVの結合が特異的で、AmLipタンパク質の構造に依存しているかどうかを調べるため、全長のAmLipとAmLip断片を発現・精製した。断片1はT1SSによる認識に必要なC末端（Δ351-614）領域を欠き、断片2はN末端のリッド構造（Δ2-74）を欠き、断片3はC末端とN末端の両方の構造（Δ2-74; 351-614）を欠いた（補足図6a, b）。全長AmLipのみが卵黄プレート上でリパーゼ活性を示した（補足図6c）。これらの断片を Su_YN1 OMV とインキュベートし、OMV を精製した後、抗 6His 抗体を用いてこれらの AmLip 断片の結合を検出した。その結果、OMVと結合するのは全長のAmLipだけであることがわかった（補足図6d）。このことは、リパーゼ活性とOMV結合の両方に、無傷のタンパク質構造が必要であることを示している。

分泌型 AmLip タンパク質の大部分は OMV と結合しているので、次にこの結合が Su_YN1 培養の抗プラズマ熱活性と相関しているかどうかを調べた。Su_YN1培養上清、OMVsを除去した培養上清、および精製OMV画分について、原虫に対する抗原虫活性を試験した。抗原虫活性は主にOMV画分と関連しており（図2e）、OMVをプロテアーゼ消化すると抗原虫活性は消失した（図2f）。さらに、AmLipの結合がOMVに抗プラズマ原虫活性を与えるかどうかを調べるため、細菌のAmLip遺伝子をノックアウトし、野生型Su_YN1、そのAmLipノックアウト（AmLip-KO）変異株、およびAmLipを補った株のOMVの抗プラズマ原虫活性を比較した。AmLip-KO株のOMVは抗プラズマ原虫活性が著しく欠損していたが、AmLip補完株のOMVは抗マラリア活性を回復していた（図2g）。これらの結果は、OMVが抗原虫リパーゼAmLipを寄生虫に輸送することで、抗マラリア活性を発揮することを示している。

さらに、AmLipがOMVに結合し、その結合によってOMVに抗原虫活性が付与されることを証明するため、Su_YN1 AmLip-KO培養液に6×Hisタグの組み換えAmLipタンパク質を添加し、OMVを精製した。ウェスタンブロット解析から、組換えAmLipタンパク質がOMVに効率よくロードされることが示された（図2h）。予想通り、組換えAmLipタンパク質をOMVに担持させると、AmLip-KO OMVの抗プラズマ原虫活性が回復した（図2h）。これらの結果を総合すると、宿主血清はOMVの産生とAmLipの分泌を同時に誘導し、強力な殺原虫活性を持つAmLip-OMV複合体の形成につながることが示された（図2i）。

Su_YN1 OMVは蚊の腸内で原虫感染を阻害する
次に、Su_YN1を放出したOMVが、生理的条件下で蚊の腸内の原虫感染を本当に阻止するのかどうかを調べた。Su_YN1野生型株とAmLip Δ351-614株（AmLipを分泌してAmLip-OMVs複合体を形成できない）をAn. stephensiに導入した。これらの株は同程度の腸内コロニー形成を示したが（補足図 7a）、AmLip ∆351-614 株は抗プラズマ毒活性を失った（補足図 7b）。

AmLipを担持したOMVが蚊の腸内で原虫を抑制することを直接示すために、精製したOMVを感染血液に添加し、Standard Membrane Feeding Assays法を用いてAn.stephensiに与えた（補足図8）25。その結果、Su_YN1 OMVは蚊の中腸でのオーシスト形成を強く阻害することがわかった（図3a）。さらに、その阻害活性は AmLip の負荷に依存していた（補足図 9a）。次に、OMVの原虫阻害活性を様々な濃度で試験したところ、わずか2μg/mlのOMVでオーシスト負荷量と有病率を有意に減少させることができ、OMVが高い活性を持つことがわかった（補足図9b）。

図3：Su_YN1 OMVは原虫の中腸初期ステージを標的とする。
図3
a 蛍光mCherryトランスジェニックP. berghei ANKA株感染血液にPBS（Ctrl）またはOMVを添加したAn. stephensi蚊の中腸におけるオーシスト負荷量。オーシスト負荷量を左のパネルに示す。右のパネルはAn. stephensiの中腸の代表的な蛍光顕微鏡像（mCherryシグナルはオーシストを示す）。スケールバーは50μm。b Su_YN1 OMVとインキュベートした5分後のP. berghei ANKA接合体およびオーキネテのSEM観察。スケールバー、5μm。c Su_YN1 OMVを添加または無添加でインキュベートしたP. berghei ANKAの発育中の接合体の切片のTEM画像。スケールバー、5μm。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。 d ookinete glidingに対するOMVの効果。マトリゲルマトリックス上を滑走するオキネテのライブトラッキングを記録した。オキネテは最終濃度50μg/mlのOMVで前処理した。高倍率動画から追跡されたウキネテの経路を再構成すると、移動パターンが明らかになった。青矢印は滑走開始位置を、赤矢印は滑走停止位置をそれぞれ示し、線はオキネテの滑走軌跡を示す。OMVで処理した（または処理しなかった）生きたオオキネタを上段に示す。OMV処理後のオオキネはmCherryの蛍光を失い、細胞の生存率が損なわれたことを示している。スケールバーは5μm。e P. berghei ANKA ookinetesの滑空速度測定。運動性試験の前にOMVまたはPBS（Ctrl）と5分間インキュベートした。ボックスプロット図の中央の線は中央値を表し、ボックスは25パーセンタイルから75パーセンタイルまである。ひげは10パーセンタイルと90パーセンタイルを示す。両群間の滑空運動性の有意差は両側Mann-Whitney検定を用いて分析し、P値はプロットの上に示した。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。 f 蚊の中腸で発生中の接合体および卵虫を標的とするSu_YN1分泌OMVを示す模式図。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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次に、Su_YN1 OMVの原虫細胞への直接的なターゲティングを示すために、P. bergheiの接合体および卵胎生を精製OMVと5分間共培養し、SEMおよびTEM分析のために固定した。その結果、OMV粒子は寄生虫膜に結合し、寄生虫を溶解させることがわかった（図3b、c）。また、Su_YN1 OMVをオキネテに添加すると、急速にオキネテ細胞が損傷し（mCherry蛍光が消失）、オキネテの滑空運動が失われた（図3d、e、補足動画1、2）。これらの結果を総合すると、S. ureilytica Su_YN1が分泌するAmLipを結合させたOMVは、蚊の腸内で原虫と効率的に結合し、原虫を死滅させ、蚊を原虫感染に抵抗させることがわかった（図3f）。

OMV結合AmLipは原虫に選択的に侵入し、原虫を死滅させる
次に、Su_YN1 OMVが無性期の寄生虫も標的にできるかどうかを調べた。ヒトP. falciparum 3D7（Pf3D7）無性期寄生虫を精製OMVで5分間処理した後、培養した。OMV処理によりPf3D7の無性複製が強く阻害されたことから（図4a）、Su_YN1 OMVはマラリア原虫の無性血液期だけでなく、蚊の中腸期も標的にしていることが示された。注目すべきは、OMVは、感染していない赤血球（RBC）はそのままに、性・無性マラリア原虫を選択的に破壊できることである（図4a）。

図4：Su_YN1 OMVは効率的に原虫に侵入し、寄生虫を殺す。
図4
a 無性期のP. falciparum 3D7寄生虫に対するOMVの殺傷効果。寄生虫は最終濃度100μg/mlのOMVで5分間前処理した。未処理（Ctrl）とOMV処理した寄生虫を培養し、寄生虫血症をモニターした（平均±SD、n＝3）。2日目の寄生虫のギムザ染色を右のパネルに示す。黒矢印は原虫感染赤血球（上段）および溶解した寄生虫（下段）を示す。スケールバー、5μm。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。統計的有意性は、両側スチューデントのt検定を用いて決定した。 b P. falciparum 3D7無性寄生体に取り込まれたDiI標識OMV（赤）の共焦点ライブトラッキング。DiI標識OMVを寄生虫培養液に添加してから10分間、30秒間隔で画像を撮影した。BF明視野。スケールバー、5μm。c OMVとインキュベートした赤血球（RBC）とP. falciparum 3D7感染赤血球（iRBC）のSEM観察。黒矢印はiRBC表面に結合したOMVを示す。スケールバーは5μm。DiIで染色したSu_YN1 OMV（最終濃度50μg/ml）とインキュベートした無性P. falciparum 3D7寄生虫の間接免疫蛍光アッセイ。AmLip免疫蛍光シグナルとOMV-DiIシグナルはほぼ共局在し、寄生体上に強く集積している。BF、明視野。寄生虫の核はHoechst 33342（Hst）で染色。スケールバー、5μm。e FITC-ファロイジンを用いた宿主赤血球の細胞骨格の間接免疫蛍光検出（上段）およびEXP1抗血清で標識した寄生虫の寄生体液胞膜（PVM）（下段）。P. falciparum 3D7寄生虫を野生型（WT）およびAmlip-KO Su_YN1細菌培養から精製したOMVと5分間インキュベートし、検出のために固定した。寄生虫の核はHoechst 33342（Hst）で染色した。スケールバー、5μm。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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OMVの原虫への侵入を直接観察するために、精製したOMVをDiI（赤）またはDiO（緑）で染色した26。原虫を標識OMVと共培養し、蛍光顕微鏡で観察したところ、共培養後まもなく、有性寄生虫と無性寄生虫の両方で標識OMVシグナルが検出された（補足図10a）。

さらに、OMVが寄生虫の体内に侵入し、どのような速度で破壊されるかを観察するため、P. falciparum 3D7の無性期寄生虫を用いました。無性期寄生虫はin vitro培養で標準化されており、動かず、生きたまま追跡するのに適しているからです。Pf3D7の無性培養液に染色したOMVを添加し、生きている寄生虫のOMV蛍光シグナルを追跡した。OMVシグナルは、共存培養後1分もすると、寄生した宿主細胞膜と寄生虫に検出された（図4b）。OMVの蓄積により、寄生虫の細胞膜が急速に破壊され、細胞が死滅した（補足ビデオ3）。寄生された宿主細胞膜はふやけて縮んだように見え、寄生体は数分以内に崩壊し（図4b、c）、寄生体の液胞は損傷し、核は崩壊した（補足図11a）。注目すべきは、Su_YN1 OMVは原虫寄生体および寄生した赤血球に選択的に侵入して死滅させ、健康な赤血球には影響を与えないことである（補足図10bおよび11b）。免疫蛍光アッセイでは、OMVに結合したAmLipが効率よく寄生虫に送達されることが示された（図4d）。AmLip-KO OMVも効率よく原虫細胞に入ったが（補足図11c）、寄生虫を溶解することはできなかった（補足ビデオ4）。OMVで処理した寄生虫細胞の免疫蛍光分析から、野生型OMVでは寄生宿主膜と原虫寄生孔液胞膜（PVM）が破壊されたが、AmLip-KO OMVでは破壊されなかった（図4e）ことから、OMVによる抗マラリア活性はリパーゼAmLipの負荷に依存していることがさらに確認された。これらの知見を総合すると、Su_YN1 OMVはAmLipを搭載することで原虫を選択的に標的化し、迅速に死滅させることが明らかになり、腸内共生細菌がOMVを介して抗原虫エフェクターを送達し、マラリア原虫を死滅させるという新たなメカニズムが示された。

Su_YN1 OMVは特定の血清由来リン脂質で濃縮されている
次に、Su_YN1 OMVがどのようにしてAmLipをマラリア原虫に特異的に送達するのかを調べた。RPMI1640培地中で、エクソソームを除去したFBS（FBS+ OMVs）またはFBSなし（FBS- OMVs）で培養したSu_YN1からOMVを採取した。これらのOMVをDiIで染色し、無性P. falciparum 3D7寄生虫とインキュベートした。その結果、FBS- OMVではなく、FBS+ OMVのみが効率よく原虫細胞に侵入することがわかった（図5a）。

図5：Su_YN1 OMVはある種の血清由来脂質を取り込み、それが原虫のホスファチジルコリン消去経路を介してOMVの寄生虫への侵入を媒介する。
図5
a P. falciparum 3D7無性寄生虫による、FBSあり（FBS+ OMV）またはFBSなし（FBS- OMV）で培養したセラチアSu_YN1由来のDiI染色OMVの取り込み。寄生虫の核はHoechst 33342（Hst）で染色した。BF、明視野。スケールバー、5μm。b FBS+ OMVとFBS- OMVの脂質含量のクラスタリング解析。個々の行は検出された脂質、個々の列は独立したサンプルを示す（平均±SD、各群n = 4独立リピート）。FBS+ OMVに特異的に濃縮された脂質クラスターは四角枠で囲んだ。c RPMI1640＋10％FBS培地（FBS＋培地）、FBS＋培地で培養したSu_YN1上清（全上清）、OMVsを除去した全上清（OMVs除去）、およびOMVs画分（OMVs溶解）のホスファチジルコリン（PC）を定量し、PCの分布を評価した（平均±SD、各群n＝3独立反復）。統計的有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）検定を用いて決定した。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。 d OMVによる原虫の抑制に対するリン脂質の違いによる影響。P. berghei ANKAルシフェラーゼ無性期寄生虫を、Su_YN1 OMVを添加する前に、リン脂質でプレコートしたディッシュで培養した。寄生虫の生存率は、ルシフェラーゼ相対光単位（RLU）を測定することで推定した（n = 4）。ボックスプロット図の中央の線は中央値を表し、ボックスは25パーセンタイルから75パーセンタイルまで伸びている。ひげは10パーセンタイルと90パーセンタイルを示す。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。e. P. falciparum 3D7無性期寄生虫によるOMVの取り込みに対するPCの拮抗効果。この寄生虫はリン脂質でプレコートしたディッシュで培養した後、DiI染色したSu_YN1 OMVとインキュベートした。OMVの取り込みは、寄生虫上のDiI蛍光シグナルを観察することで推定した。寄生虫の核はHstで染色した。BF、明視野。スケールバー、5 µm。同様の結果が2回の生物学的反復から得られた。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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細菌のOMVは、外膜に由来するリン脂質ベースのナノ粒子である16。さらに、OMVの組成は環境に大きく影響される27,28。宿主の血清刺激条件下で放出されるFBS+ OMVは、ユニークなリピドームを持っている可能性がある。我々は、Su_YN1 FBS+ OMVとFBS- OMVの全脂質を抽出し、リピドーム解析を行った。FBS+ OMVのリピドーム組成は、FBS- OMVのそれとは異なっていた。特にFBS+ OMVには、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、スフィンゴミエリン（SM）などの主要なリン脂質が大量に含まれていた（図5b、補足データ2）。

さらに、Su_YN1 FBS+ OMVのリピドームが細菌性OMVの中で特異的であるかどうか、そしてこの特異性が原虫の標的化に関与しているかどうかを検討した。大腸菌K12はRPMI1640培地では増殖できず、FBS中では生存できないため、ルリアブロス（LB）培地で培養した大腸菌K12（K12 OMV）からOMVを精製した。比較として、LB培地で培養したSu_YN1のOMV（LB OMV）も調製した。K12 OMVもLB OMVも、原虫細胞に入ることができなかった（補足図12a）。比較リピドーム解析の結果、FBS+ OMVの脂質組成は他のOMVとは異なっており（補足図13a、b）、FBS+ OMVはFBS- OMV、LB OMV、K12 OMVと比較して、特定の脂質、特にPC、PE、SMを含む主要なリン脂質の濃度が有意に高いことが明らかになった（補足図13bおよび補足データ3）。まとめると、血清誘導下でSu_YN1が放出するFBS+ OMVには、PC、PE、SMを多く含む特異的脂質が存在する。

細菌膜は、ホスファチジルグリセロール（PG）、PE、カルジオリピン（CL）を含む脂質で主に構成されている28。真核生物ではPCが膜を形成する主要なリン脂質であるが、細菌の膜にPCが存在するのはごく一部と推定されている29。注目すべきことに、PCとPEは血清中に最も豊富に存在するリン脂質である30。この結果は、Su_YN1が宿主の血清由来脂質、特にPCを効率的に外膜に取り込み、特殊なOMVを産生する可能性を示している。血清中のPCがSu_YN1 OMVの生合成に組み込まれていることをさらに確認するため、Su_YN1菌体および培養上清のPCレベルを定量した。FBSを含まない培地（FBS-）で培養したSu_YN1細菌細胞ではPCはほとんど検出されず、血清を含む培地で培養したSu_YN1細胞ではPCが検出された（補足図12b）。しかし、OMVsを除去した上清中のPC濃度は低下し、精製OMVs中に高濃度のPCが検出されたことから、菌体による血清PCの取り込みとOMVsへのPCの統合が示唆された（図5c）。さらに、FBS+ OMVは、FBS- OMV、LB OMV、K12 OMVよりも有意に高いPC含量を含んでいた（補足図12c）。Su_YN1 OMVの生合成過程におけるPCの取り込みを直接的に証明するため、NBD-蛍光標識PC（NBD-PC）をSu_YN1培養液に添加し、OMVを精製した。蛍光ナノ粒子分析から、OMVへのNBD-PCの高いレベルでの取り込みが示された（補足図13c）。NBDの蛍光はSu_YN1細菌とそのOMVの両方で検出され、NBD蛍光の大部分はOMV画分に検出された（補足図12d, e）。

マラリア原虫のホスファチジルコリン消去経路はOMVの取り込みを媒介する
マラリア原虫は進化の過程でいくつかの脂質代謝経路を失い、宿主から特定の脂質を回収しなければならなくなった31,32。例えば、宿主のリン脂質、リポ酸、コレステロールは、マラリア寄生虫の生存の鍵となるメディエーターである33,34。血清由来のリン脂質が存在することから、Su_YN1 FBS+ OMVは寄生虫が取り込むための理想的な基質となる可能性がある。培養皿の底をさまざまなリン脂質成分でコーティングし、ルシフェラーゼを発現した無性期寄生虫によるOMVの取り込みに拮抗するものがあるかどうかを調べた（補足図14a）。PCとPEは、FBS+ OMVおよび宿主血清中に高濃度に存在するリン脂質である。SMは溶解性に乏しく、SMとその誘導体であるセラミドには抗プラズマ原虫活性があることが報告されている35,36。このことは、AmLip-KO OMVが非常に高い濃度で抗マラリア活性を示したことの説明となるかもしれない（図2g）。ホスファチジルセリン（PS）も試験したが、OMVの抗マラリア活性に明らかな拮抗作用は見られなかった。しかし、PCとPEの添加は、寄生虫のルシフェラーゼ相対光単位（RLU）で示されるように、OMVの抗原虫活性を有意に拮抗させた（図5d）。さらに、PCはOMVの抗原虫活性に対して濃度依存的に拮抗作用を示した（補足図14b）。蛍光顕微鏡分析により、PC前処理がPf3D7無性期寄生虫によるOMVの取り込みを強く阻害することが確認された（図5e）。同様に、PCの添加は、Su_YN1 OMVの原虫に対する殺傷効果にも強く拮抗した（補足図14c）。

原虫は常に宿主のPCを取り込んでおり、宿主細胞膜からPVM34に速やかに移行する。注目すべきは、宿主膜由来のPCは寄生虫に非常に好まれることで、取り込まれた後に目立ったリモデリングを起こさず、寄生虫膜の生合成に直接使われる34。Su_YN1のOMVの迅速な取り込みと、宿主膜から寄生虫膜へのOMVの迅速な移動は、OMVがPC消去経路を通って寄生虫に入る可能性を示している。OMVの取り込みにPC消去経路が関与していることを調べるため、DiI染色したOMVとインキュベートする前にPf3D7無性寄生虫をNBD-PCで前処理し、フローサイトメトリーを用いて寄生虫によるOMVの取り込みを観察した。NBD-PCは速やかに寄生虫に入り（補足図15a）、OMVの取り込みを有意に減少させた（補足図14d, e）。原虫のPC消去は4 °Cで停止し、37 °Cで非常に活性化し、ATP枯渇37,38で阻害される（補足図15a）。4℃と37℃でOMVの取り込みを比較したところ、4℃ではOMVの取り込みはほとんど見られなかったが、37℃では取り込みが速やかに活性化した（補足図15b）。さらに、アジ化ナトリウム処理によって寄生虫のATPを枯渇させると、寄生虫によるOMVの取り込みが著しく阻害された（補足図15b）。PCの消去を介したOMVの寄生虫への侵入をより具体的に示すため、PCと同じコリン頭部基構造を持ち、PCの取り込みに拮抗するL-αグリセロホスホリルコリン（L-α GPC）を用いて寄生虫を処理した37,38。L-α GPC処理により、寄生虫によるPC（補足図15c）およびOMV（補足図15d）の取り込みが有意に阻害された。これらの知見を総合すると、PC消去経路が原虫によるSu_YN1 OMVの取り込みを仲介していることが示された。

考察
細菌による膜小胞の放出は、重要な細胞間情報伝達機構である。細菌のOMVの機能研究のほとんどは、哺乳類と細菌の相互作用に焦点を当ててきた。病原性細菌から放出されるOMVは、病原性因子の宿主細胞への伝達や宿主防御の調節など、病原体と宿主の相互作用において重要な役割を果たしている19,39。本研究では、蚊の腸内共生細菌から血液摂取後に放出されるOMVが、原虫にエフェクタータンパク質を送達することで、腸内病原体に対する防御に重要な役割を果たしていることを報告する（補足図16）。このような腸内微生物と真核寄生虫の間の領域間相互作用の発見は、蚊の微生物叢の常在細菌が選択的に腸内寄生虫にエフェクター分子を送達するという新しいパラダイムを明らかにした。

細菌のOMV産生は、成長段階や栄養状態、温度、酸化ストレスなどさまざまな条件によって誘導される18。他の多くの吸血性無脊椎動物と同様、蚊は卵を産むために血液を必要とする。今回の研究から、哺乳類の宿主の血清が、腸内共生細菌によるOMV産生を刺激する新たな強力なストレス要因として機能することが明らかになった。宿主の血清にはかなりの脂質が含まれており40、腸内細菌によってこの脂質が流用され、脂質代謝の再プログラミングを促進し、膜ホメオスタシスの変化につながる可能性がある41。さらに、脊椎動物の血液を消化すると、ヘモグロビンと血清鉄輸送タンパク質トランスフェリンの分解に由来する過剰なヘムや鉄が放出され42,43、腸内細菌叢への酸化的挑戦を促進する可能性がある44。膜の不安定性は、過剰なOMV生成に共通する特徴である45。脂質代謝の再プログラミングや酸化ストレスがリン脂質二重膜の安定性を乱し、膜の出芽やOMVの放出につながる可能性がある。

OMVはグラム陰性菌では外膜のブリービングによって生成される。OMVの組成は一般的に親菌の膜と類似しているが、OMVの組成や含有量は細菌の増殖段階や環境条件によって変化する28。タンパク質、脂質、核酸、多糖類がOMVに優先的にパッケージングされている証拠があるが46、これらの成分をOMVに誘導する選別機構はまだ解明されていない47。我々は、宿主の血清誘導によって、血清由来の脂質が組み込まれ、Su_YN1 OMVの脂質組成が再構築されることを発見した。特に、宿主血清に豊富に含まれるリン脂質PCとPEは、血清含有培地で培養したSu_YN1 OMVで非常に濃縮され、これによりOMVと原虫の特異的相互作用が促進される。興味深いことに、Su_YN1培養液にPCを直接添加しても、OMVの生合成は有意に誘導されなかった（補足図13d）。このことから、細菌が利用するPCの供給源はリポタンパク質である可能性が高く、PCの取り込みにはタンパク質部分が重要である可能性が示唆される。あるいは、血清中に存在する他の因子が、強固なOMVの生合成を誘導している可能性もある。

本研究では、Su_YN1 OMVが原虫（蚊の中腸期と無性血液期の両方）を選択的に標的としていることを発見した。宿主由来の脂質は原虫の生存に不可欠である48。トキソプラズマ属やトリパノソーマ属などの真核寄生虫も、かなりのリン脂質を摂取している。T. gondiiの合成能力は、寄生体が倍増するのに必要なホスファチジルコリン（PC）の5～10％程度であり49、またT. gondiiはPSとPEを積極的にサルベージしている50。ほとんどの真核寄生虫は、必須のリン脂質合成経路の一部（例えば、PCとPE合成のためのケネディ経路）を保持しているが、それでも、特に増殖が活発な段階では、かなりのリン脂質をサルベージする必要がある32,51。従って、特定の脂質を含む膜小胞が脂質サルベージによって真核寄生体に侵入することは、他の微生物-病原体相互作用ではまだ確認されていない一般的な現象であると考えられる。

マラリア原虫は、赤血球膜や細胞外培地からリン脂質を積極的に取り込む52が、特定のリン脂質を取り込むトランスポーターやその経路については、いまだ不明な点が多い53。以前の研究では、小胞がマラリア原虫の荷物輸送の重要な媒介物であることが示されている54。血清由来の脂質が多く含まれ、そのサイズが適切な範囲にあることから、Su_YN1 OMVと寄生虫との相互作用が促進される可能性がある。今回の結果から、マラリア原虫によるOMVの取り込みには、他の脂質取り込み経路や膜レセプターも関与している可能性はあるが、PC消去経路が重要な役割を果たしていることがわかった。寄生された赤血球はOMVを取り込まず、OMVカーゴAmLipによる溶解を免れる。注目すべきは、原虫がPCスカベンジング経路を介してOMVを速やかに取り込むことで、これまでに報告されているLPSを介した侵入経路55や脂質を介した取り込み経路56とは異なる。これらの知見は、真核生物の寄生虫が独自の栄養要求を満たすために、新たな小胞取り込み機構を進化させたことを示している。

OMVは様々な機能的役割を担っているが、OMVの最終的な機能は、そのユニークなカーゴによって決定される47。OMVのカーゴ選択が制御されたプロセスであることを示す証拠は増えつつあるが、カーゴタンパク質がどのようにしてOMVに選択的にパッケージされるのか、そのメカニズムはほとんど解明されていない46,57,58。抗マラリアタンパク質AmLipは、OMVの表面に結合する前に、T1SSを介して細胞外に分泌される。AmLipがOMVに結合する理由は、リパーゼ特有の疎水性にあると考えられる59,60。このことは、Su_YN1 OMVが、自身の分泌するリパーゼと結合するためのユニークで特異的な親和性を持っていることを示している。全体として、この結果は、特殊化したOMVがT1SS分泌エフェクタータンパク質を補助して、標的を定めたクロスキングダム相互作用を行うという、微妙な制御機構を示すものである。

パラトランスジェニック戦略では、T1SSは宿主昆虫の腸内共生生物に病原体の感染を阻害するエフェクタータンパク質を分泌させるために用いられた7,10,13,61。しかし、T1SSから分泌されたエフェクタータンパク質は標的細胞に直接輸送されず、分泌後も保護されない。OMVに取り込まれることで、タンパク質分解からの保護62、長距離輸送の促進63、そして今回示したような受容細胞ターゲティングの特異性など、様々な有益な特性をタンパク質カーゴに付与することができる。リパーゼAmLipとOMVとの相互作用は、強力な抗プラズマ活性に必要である。AmLipがOMVと結合していない場合、放出後に拡散し、原虫細胞を弱く標的化するのみである。しかし、OMVに結合すると、AmLipのマラリア標的性が強く増強され、強力な抗プラズマ原虫活性につながる。注目すべきは、セラチア菌Su_YN1が蚊の中腸で安定的にコロニー形成し増殖できることで、OMVの原虫への送達は中腸での寄生虫の発生過程で累積的に行われる。OMVによる抗原虫エフェクター分子の原虫膜および感染赤血球（iRBC）膜（寄生虫によって著しく再編成される）への送達は、これらの膜上へのAmLipタンパク質の蓄積を促進し、エフェクターAmLipを介した膜構造の分解、およびiRBC膜の膨潤と分解、寄生虫の崩壊をそれぞれ引き起こす。まとめると、Su_YN1 OMVはマラリア原虫を選択的かつ正確に標的化する理想的なエフェクター送達システムであり、この致命的な疾患と闘うための介入ツールの開発に新たな戦略を提供する。

方法
倫理声明
本研究は、CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences (Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology) Animal Care and Use Committee (A01MP2001)のガイドラインに従って実施された。6週齢の雄性SPF（特異的病原体フリー）グレードのICR（Institute of Cancer Research）マウスを、ベルゲ平原虫感染および感染採血に使用した。O型ヒト血液は、上海赤十字血液センター（承認番号：shblood2019-28）から、署名入りのインフォームドコンセントフォームとともに提供された。

透過型電子顕微鏡（TEM）分析
中腸サンプル：中腸切片をエプソン樹脂に包埋し、切片化した。得られた超薄切片試料は、TEM（型番：H-7700、日立）分析に先立ち、2％酢酸ウランおよびクエン酸鉛で処理した。

OMVサンプルの場合： 3μlのOMV調製液をカーボンコート銅グリッド（Cat# BZ10021b、ZJKY）に塗布し、3分間吸着させた。その後、余分な液体を捨て、サンプルを2％（wt/vol）酢酸ウラニルで3分間ネガティブ染色し、TEMで評価した。

原虫サンプルの場合：寄生虫をPBSで洗浄し、1000gで3分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを2.5 %グルタルアルデヒドで固定し、その後TEM分析用に切片化した。

走査型電子顕微鏡（SEM）分析
細菌サンプルの場合：細菌懸濁液をカバースリップに塗布し、2.5%グルタルアルデヒド（3802-75 ML、Sigma-Aldrich）で1時間固定した後、カバースリップをPBS緩衝液で4回洗浄した。その後、試料を濃度の上がる一連のエタノール（10％ステップ）で10分間ずつ脱水した。臨界点乾燥後、サンプルを薄い（10nm）金層でスパッタコーティングし、電界放出型走査電子顕微鏡（Carl Zeiss社、オーバーコッヘン、ドイツ）で分析するまで脱水保存した。

OMV結合原虫サンプルについて： OMVで処理した原虫をPBSで洗浄した後、カバースリップに塗布し、5分間風乾した後、100％メタノールで固定した。風乾後、カバースリップを直ちに金でスパッタコーティングし、電界放出走査型電子顕微鏡で分析した。

免疫電子顕微鏡（IEM）分析
カーボンコート銅グリッド、またはOMVを吸着させたカーボンコート銅グリッド上で蚊の腸を切開したサンプルを、pH7.4の0.1MのPBS緩衝液中、2％（w/v）の新鮮なパラホルムアルデヒドと0.5％（v/v）のグルタルアルデヒドで固定した。0.1%(v/v)のTWEEN 20を含むPBS中、5%(w/v)のウシ血清アルブミン(A23088-100G, Abcone)でサンプルを1時間ブロックした。サンプルを、前記のように調製したAmLip抗血清11または陰性血清（1:10）、CD63抗体（A22343、ABclonal）（1:10希釈）、CD9抗体（Santa Cruz Cat#sc-59140）（1:10希釈）と2時間インキュベートし、TBS-TWEEN 20バッファーで3回洗浄した。サンプルは10nmの金粒子に結合した二次抗体（1:50）で1時間インキュベートした（Goat Anti-Mouse IgG H&L Gold, Cat# bs-0296G-Gold, BIOSS）。切片は透過型電子顕微鏡（モデル番号H-7700、日立）を用いて80KVで画像化した。

細菌の培養とOMVの調製
一般に、OMVは若干の変更を加えた手順で単離した20。特に断りのない限り、細菌はRPMI 1640（10-041-CV、コーニング社製）に10% FBS（10099141C、サーモフィッシャー社製）を添加または無添加の状態で、30℃で一晩培養した。FBSは、超遠心分離（250,000 g, 4 °C, 3 h）によりネイティブベシクルを除去し、使用前に0.22 μmフィルター（SLGPR33RB、Merck）で濾過した。細菌培養液を 4,000 rpm で 20 分間遠心し、上清を 0.45 μm フィルター（SLHP033RS、メルク社製）および 0.22 μm フィルター（SLGPR33RB、メルク社製）で順次ろ過した。濾過した上清中の OMV を、Backman 70Ti ローターを用いて 26 ml 超遠心チューブ（355654、Beckman）で超遠心（250,000 g、4 ℃、1 時間）してペレット化した。OMV ペレットを PBS で洗浄し、再度超遠心した。洗浄したOMVペレットを1.5mlのPBS（定量および生化学試験用）またはRPMI1640培地（原虫培養試験用）に懸濁した。

OMV定量分析
OMVは以下の3種類の方法で定量した。

BCAアッセイ： BCA Protein Assay (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, 23227)を用い、製造元のマニュアルに従ってOMVタンパク質の濃度を測定し、各培養の109菌で正規化した。

KDOアッセイ： Kdo ammonium salt (k2755, Sigma, St. Louis, MO)を標準試料とし、各培養菌109個に対して標準化した。

総脂質アッセイ： OMVの脂質含量は、脂質定量キット（STA-613、Cell Biolabs社）を用いて、製造元のマニュアルに従って定量し、それぞれの培養の109菌体に対して標準化した。

OMVプロテアーゼ消化アッセイ
OMV表面タンパク質のプロテアーゼ消化試験は、前述の方法に従って行った2。OMV（反応液中500μg/ml）をトリプシン（T8150、solarbio社製）（37℃、pH7.4、最終濃度100μg/ml）またはプロテアーゼK（T8936、TargetMol社製）（50℃、pH7.4、最終濃度100μg/ml）を用いて30分間消化し、精製した。コントロールとして、同量の熱不活性化トリプシンまたはプロテアーゼK（95℃で1時間不活性化）を用いた。処理したOMVをウェスタンブロットアッセイと抗プラズマ活性試験に使用した。

LC-MS/MSによるSu_YN1 OMVのプロテオーム解析
PBS溶液中で精製したSu_YN1 OMVをLC-MS/MS分析に用いた。50μgのOMVを37℃で一晩トリプシンを用いて溶液中で消化した64。ペプチドの同定はQ Exactive質量分析計とEasy nLC（Thermo Fisher Scientific）の組み合わせで行った。RP-C18 5μm樹脂を充填したC18逆相カラム（長さ15cm、内径75μm）を使用し、バッファーA（HPLCグレードの水に0.1%ギ酸）とバッファーB（84%アセトニトリルに0.1%ギ酸）のリニアグラジエントを、IntelliFlowテクノロジーにより制御された250nl/分の流速で60分間かけて行った。MSデータはMaxQuantソフトウェアバージョン1.3.0.565を用いて解析した。MSデータはUniProt_Serratia_267125_20181228データベースに対して検索した。質量分析プロテオミクスソースデータは、PRIDE66パートナーリポジトリを介してProteomeXchange Consortiumにデータセット識別子PXD042831で寄託された。

ナノ粒子追跡解析（NTA）およびナノフローサイトメトリー測定（NFCM）
ナノ粒子追跡解析 Su_YN1フィルター培養上清（図1d）を100倍希釈し、NanoSight NS300装置（Malvern Panalytical社製）を用いて25℃で解析した。粒子の動きは、製造元の説明書（NanoSight NS300 User Manual, MAN0541-02-EN, 2018）に従い、最小予想粒子径、最小トラック長、ぼかし設定をすべて自動に設定して、ナノ粒子追跡解析ソフトウェアで解析した。その後、各ビデオを解析してOMVサイズの平均と分布を決定した67。ナノフローサイトメトリー測定68（NFCM）を用いて、さまざまな供給源の血清で培養したSu_YN1からのPBS分解精製OMVの粒子径と粒子割合を解析した（26mL培養から精製したOMVを1mL PBSで分解）。また、NFCMを用いて蛍光ナノ粒子分析を行い、OMVに取り込まれたNBD-PCの割合を推定した。NFCM 実験はネオランドバイオサイエンス株式会社によって行われた。OMVのサイズは、使用した方法の違いにより異なる場合があることをご了承ください。

AmLip 転写の qRT-PCR 解析
各群の様々な時点で、2×109 Su_YN1細菌細胞から全RNAを抽出した。PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Takara RR047B)を用いて、製造者の指示に従って、全RNAから相補的DNA（cDNA）を合成した。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）解析は、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme Q111-03）を用い、PikoReal 96（Thermo社製）を用いて行った。セラチア菌安定発現遺伝子 gyrB (Gene ID: NPGAP_00015) は、ref. 69. gyrBリファレンスのプライマーは以下の通りである：参考のgyrBのプライマーは、Forward 5'-GTATATCGGCGATACCGATGACG-3'；Reverse 5'-ATGATGACCTCTGCGGCTG-3'である。AmLipのプライマーは以下の通りである：フォワード5'-GAGGCGAAGGCGACATAGTTGGA-3'；リバース5'-CTATGCCGACGGCTATACGCT-3'。

P. berghei ookinetesに対するOMVの抗プラスモディウム活性アッセイ
P. berghei ANKA ookinete形成の阻害を評価するために、感染ICRマウス（6週齢雄、承認番号：A01MP2001）から採取した高配偶子血症血液をin vitro ookinete培養に使用した70。濾過した培養上清またはOMV溶液を卵胎仔培養に添加した。20℃で20時間培養後、対照群と試験群のオオキナネコを計数し、対照群のオオキナネコ形成率を100％として阻害率を算出した。

組換え AmLip タンパク質による OMV ローディング
AmLip-KO変異体Su_YN1菌を10％FBS添加RPMI1640培地で6時間培養し、組換えAmLipタンパク質またはAmLipタンパク質断片を最終濃度10μg/mlで添加した。コントロールは、10%FBS入りRPMI1640培地で、細菌は加えず、同量の組換えAmLipタンパク質を添加した。さらに20時間培養した後、培養上清を回収し、ウェスタンブロットアッセイと抗プラズマ活性試験のためにOMVを精製した。あるいは、20μgの組み換えAmLipタンパク質（6Hisタグ）を、同量の100μgの精製大腸菌W3110 K12 OMVおよびAmLip-KO Su_YN1 OMVと6時間インキュベートし、ウェスタンブロットアッセイ用に精製した。

タンパク質抽出とウェスタンブロット解析
セラチアSu_YN1菌、293T細胞、またはMSQ43細胞からのタンパク質抽出は、完全プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび1mM PMSFを添加したRIPA緩衝液（R21237、Yuanye Biotech）を用いて行った。超音波処理後、タンパク質溶液を10,000 g、4℃で15分間遠心した。得られた上清を回収し、Laemmli sample buffer (PG112, Yamei Biotech)を加えた。培養上清からのタンパク質抽出には、ろ過した培養液に直接Laemmli sample bufferを加えた。OMVからのタンパク質抽出は、精製したOMV溶液にLaemmliサンプルバッファーを添加し、超音波処理を行った。抽出したタンパク質サンプルを10% SDS-PAGEで分画し、PVDF膜に転写した。この膜をブロッキングバッファー（TBST中5%BSA）でブロックし、AmLipマウス抗血清（前述3）を含む一次抗体（希釈度1:1000）、ウサギ抗HA抗体（CST、cat#3724 S）を含む一次抗体（希釈度1:1000）、マウスモノクローナル抗HA抗体（CST、cat#3724 S）とインキュベートした： 1000；マウスモノクローナル抗Hisタグ抗体（ab18184、Abcam）を1：1000の希釈で；抗CD63ウサギモノクローナル抗体（A22343、ABclonal）を1：500の希釈で；抗CD9マウスモノクローナル抗体（sc-59140、Santa Cruz）を1：500の希釈で。一次抗体でインキュベートした後、メンブレンをTBSTで3回洗浄し、HRP標識二次抗体（ab6789、ab6721、Abcam）でインキュベートした。強化化学発光検出（SQ201、Yamei Biotech）の前に、メンブレンをTBSTで4回洗浄した。

P. berghei標準膜フィーディングアッセイ（Pb SMFAs）
本研究で用いたP. berghei Standard Membrane Feeding Assays（Pb SMFAs）の手順は、以前に発表された方法25を応用したものであり、手順を示すワークフロー図を補足図8に示す。Pb SMFAを成功裏に実施し、蚊への確実な感染を達成するためには、採集中の血液温度の著しい低下を避け、抗凝固剤ヘパリンの使用量を注意深く管理することが極めて重要である。ヘパリン溶液は、ストック溶液としてPBS中に10mg/mlの濃度で調製した。血液を採取するために、10μlのヘパリン溶液を1.5mlのチューブに加え、ボルテックスで十分に混合した。採血に先立ち、チューブを乾燥恒温器で37℃に予熱した。各マウスから採血するために1本のチューブを使用し、通常1～1.3mlの血液を採取した。Pb SMFAの簡単な手順は以下の通りである： 1) 37℃に設定したドライサーモスタット内で、膜供給装置、および試験するサンプル（対照PBSおよびRPMI 1640に添加したOMVs溶液）を入れたチューブをセットアップし、あらかじめ温める。2) 37℃のドライサーモスタット内で、血液を採取するためにヘパリンを入れたチューブをあらかじめ温め、あらかじめ温めたチューブにマウスの血液を速やかに採取する； 3) 採血した血液を直ちに目的の試料を含むチューブに移し、十分に混合した後、速やかに38℃に設定した循環水槽に接続した給餌用膜装置に加える；4) 蚊の給餌は、環境温度を21℃に設定した室内で行った。蚊は15～20分間摂食させた。

メンブレンフィーディングアッセイによるオーシスト形成に対するOMVの効果
P. berghei ANKAのオーシストに対するOMVの阻害活性を調べるため、「P. berghei Standard Membrane Feeding Assays (Pb SMFAs)」の手順25に従った。簡単に説明すると、P. berghei ANKA感染マウスから感染血液を採取し、最終濃度100μg/mlの精製OMVを含む37℃予熱RPMI1640培地、またはPBSを含む37℃予熱RPMI1640培地（コントロールとした）で2倍希釈し、直ちにメンブレンフィーダーを通して蚊に与えた。対照群（PBS添加）および試験群（OMVs溶液添加）の蚊は、すべて同じ条件下で、同じ時期に同じマウスから採取した血液を用いてメンブレンフィーディング装置を通して給餌した。摂食させた蚊は22℃、75±5％RHに保った。食餌後8日目に中腸を解剖し、蛍光顕微鏡を用いてオーシスト数をカウントした。

卵胎仔の運動性に及ぼすOMVの影響
In vitroで培養したP. berghei ANKAのオオキネタをRPMI 1640培地で洗浄し、最終濃度100μg/mlのOMVと25℃で5分間インキュベートした後、前述のようにマトリゲル（356234、BD Biocoat）に包埋してオオキネタの運動性を追跡した70。15匹以上のオキネテを15分間モニターし、移動距離を測定し、運動速度を算出した。

無性期マラリア原虫に対するOMVの抗原虫効果
P. falciparum 3D7の無性期寄生虫を、最終濃度100μg/mlのSu_YN1 OMVと37℃で5分間インキュベートし、RPMI 1640培地で洗浄してOMVを除去した後、0.1 %の寄生虫血症に調整し、さらに4日間培養した。ギムザ染色した血液塗抹標本で寄生虫の複製をモニターし、培養2日目と4日目に寄生虫血症をカウントした。

OMV染色とマラリア寄生虫による取り込み
DiO（DiOC18(3)、C1038、Beyotime社製）またはDiI（DiIC18(3)、E607331-0100、Sangon Biotech社製）を、Su_YN1を12時間培養した後の培養液（最終濃度5μM）に添加し、培養上清をろ過してOMVを精製する前にさらに12時間培養した。標識したOMVをP. berghei ANKA寄生虫（無性期および接合体培養）と10分間共培養し、蛍光顕微鏡を用いてOMVの取り込みを観察した。

マラリア原虫無性寄生虫による生体追跡とOMVの取り込みアッセイ
DiIで染色したOMVをP. falcuparum 3D7無性期寄生虫に最終濃度100μg/mlで添加し、ガラス底培養皿（YA0572、Solarbio社製）に入れ、倒立型TCS SP8共焦点顕微鏡（Leica Microsystems社製）を用いて生きた状態でモニターした。タイムラプス画像を30秒間隔で10分間撮影した。これらの画像は、OMVによる寄生虫の溶解を示す動画の作成にも使用した。

OMVおよびOMVで処理した寄生虫の免疫蛍光アッセイ
OMVの免疫蛍光アッセイは、小胞タンパク質の検出実験で確立されたプロトコールに従った71,72。OMVはまずDiIで前染色し、精製・洗浄して未結合のDiI色素を除去した。その後、染色したOMVをPBSに懸濁し、ポリ-D-リジン処理したカバースリップとインキュベートして、カバースリップ表面への付着を促進した。カバースリップ上にOMVを付着させた後、AmLip抗血清とAlexa 488標識ヤギ抗マウスIgGでOMVを免疫標識し、免疫蛍光染色を行った。OMVで処理した寄生虫の免疫蛍光アッセイでは、OMVで処理した異なるステージの原虫（未染色またはDiOまたはDiIで前染色）をPBSで洗浄し、PBSで調製したばかりの4％パラホルムアルデヒド（P6148、Sigma-Aldrich）を用いて室温で15分間固定し、ポリ-l-リジン（E607015、Sangon Biotech）で処理したカバースリップを底部に含む24ウェルセルプレートに移した。固定した細胞を0.1% Triton X-100 PBS溶液で5分間室温で透過処理し、PBSで3回洗浄した後、5%ウシ血清アルブミン（BSA）溶液で60分間室温でブロックし、5%BSA-PBSで希釈した一次抗体（AmLipマウス抗血清、EXP1ウサギ抗血清、またはFITC-Phalloidin（YP0059S、UelandyInc））と4℃で12時間インキュベートした。PBSで3回洗浄後、カバースリップを蛍光標識二次抗体（Alexa 488標識ヤギ抗マウスIgG抗体、A11001；Alexa 555標識ヤギ抗ウサギIgG抗体、A21428）と室温で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄した。細胞をHoechst 33342（#62249, Thermo Fisher Scientific）で染色し、90%グリセロール溶液でマウントし、マニキュアで密封した。画像はすべて、ライカSP8共焦点顕微鏡で同一のセット設定で撮影・処理した。

OMVの脂質抽出とリピドーム解析
異なる起源（LBで培養した大腸菌K12、LBで培養したSu_YN1、FBSを含むか含まないRPMI1640で培養したSu_YN1）から精製したOMVの全脂質は、Bligh and Dyer法73による脂質抽出の標準的手順に従って抽出した。簡単に説明すると、PBS中のOMV溶液を1容量のクロロホルムと2容量のメタノールと混合した。十分にボルテックスした後、1容量のクロロホルムを加え、さらに混合した。その後、1容量の蒸留水を加え、再度ボルテックスした。その後、チューブを2000 gで20分間遠心分離し、相分離を完了させ、Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometerを用いたリピドーム分析用に下相を回収した。移動相A（ACN：H2O、60：40、v/v、2mMギ酸アンモニウム含有）、移動相B（IPA：ACN、90：10、v/v、2mMギ酸アンモニウム含有）、移動相Bは30％から開始し、徐々に100％まで上昇させた。ソースリピドームデータはMS-DIALソフトウェア（ver.4.38）を用いて処理した。処理されたデータは、Clustvis (ClustVis: a web tool for visualizing clustering of multivariate data (BETA)) (http://biit.cs.ut.ee/clustvis/)74 によってさらに解析された。

OMVの抗原虫活性におけるリン脂質の拮抗作用
脂質拮抗試験は、以前に報告された方法32を改良したものである。簡単に説明すると、クロロホルムに溶解したホスファチジルコリン（#L0023、TCI）、ホスファチジルエタノールアミン（GC44631-5、GLPBio）、ホスファチジルセリン（S20166、Yuanye Biotech）をガラス底48ウェル培養プレート（P24-1.5H-N、Cellvis）に添加した（500μg /ml）。リン脂質溶液は、156μg/cm2、312μg/cm2、625μg/cm2になるように培養皿にコーティングした。対照としてクロロホルム溶媒を用いた。クロロホルム溶媒を蒸発させた後、0.5% Album Max I (11020-021, Gibco)を含むRPMI1640原虫培養液250μlをディッシュに加え、37℃で30分間インキュベートした。培養後、ICRマウスから採取したPb NAKA-GFG/ルシフェラーゼ無性寄生虫を37℃に予熱したRPMI1640培地で4％RCTに希釈し、250μlの寄生虫培養液をプレートウェルに分注し、1時間培養した。寄生虫の生存率は、100μg/mlの基質D-ルシフェリン（MX4603-100MG、MKBio社製）添加後の生物発光シグナル強度（RLU）をモニターすることにより測定した。

リン脂質はOMVの取り込み解析に拮抗する
リン脂質底面コート培養プレートで培養したP. falciparum 3D7無性寄生虫を上記のように調製し、回収した。DiIで染色したOMVを寄生虫に添加し、37℃で5分間インキュベートした。その後、寄生虫を蛍光DNA染色剤Hoechst 33342（62249、Thermofisher）で染色し、直ちに倒立共焦点顕微鏡Leica SP8を用いて生理的生活条件下でモニターした。

PC定量アッセイとOMV組み込み試験
PCレベルは、ホスファチジルコリン定量キット（Sigma-Aldrich MAK049）を用い、添付の説明書に従って定量した。PC定量には、PCアッセイバッファー中の培養上清100μl、菌体1OD、またはOMV溶解液100μgを使用した。PC加水分解酵素を含まないサンプルブランクは、バックグラウンドを差し引くために含まれた。結果は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いてEx/Em: 535/587 nmの蛍光を測定した。Su_YN1によるPCのOMVへの取り込みを検出するため、10% FBSを含むSu_YN1培養液に1 mM Nitrobenzoxadiazole標識ホスファチジルコリン（NBD-PC、Avanti Polar Lipids、#810132C）を添加し、12時間培養した。NBD-PCの取り込みは、蛍光実体顕微鏡で可視化するか、蛍光マイクロプレートリーダーを用いてEx/Em: 467/539 nmで測定した。

フローサイトメトリー解析
P. falciparum 3D7無性寄生虫を、3 mM Nitrobenzoxadiazole標識ホスファチジルコリン（NBD-PC、Avanti Polar Lipids、#810132 C）を含むRPMI 1640培地（Album Max Iなし）中、37℃で15分間インキュベートした。その後、NBD-PC処理（および未処理のコントロール）した寄生虫をHoechst 33342で染色し、DiI染色したOMVと2分間インキュベートし、SONYフローサイトメーターSH800Sを用いてデータを収集した。寄生虫（Hoechst陽性集団）はゲートアウトされ、DiIシグナルがモニターされ、ヒストグラムとして表示された。データはFlowJo（V10.8.1）を用いて解析した。

原虫PC消去阻害分析
原虫のPC消去を阻害するために、寄生虫を4℃で15分間インキュベートするか、1mM NaN3 (S2002-5G, Merck)で37℃で6分間処理してATPを枯渇させるか、または10mM L-α-GPC (G5291, Merck)で氷上で30分間処理してから室温に戻した37。その後、処理した寄生虫を3 mM NBD-PCまたはDiI染色したOMVと5分間インキュベートし、直ちに倒立型TCS SP8共焦点顕微鏡（Leica Microsystems）を用いて生きた状態でモニターした。

統計解析
オーシスト数およびオーキネテ運動速度の差の統計的有意性は、両側マン・ホイットニー検定を用いて解析した。複数群比較の統計的有意性は一元配置分散分析（ANOVA）検定を用いて解析した。様々な濃度における原虫殺傷に対する様々な改良OMVの効果の統計的有意性は、二元配置分散分析（way-way ANOVA）検定を用いて分析した。その他の統計的有意性は、両側スチューデントのt検定を用いて計算した。P < 0.05の値を統計的に有意な差とみなした。すべての統計は、GraphPad Prism version 5.00 for Windows（GraphPad Software）を用いて行った。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの入手可能性
本研究の結果を裏付けるデータは、論文および補足情報に掲載されている。ソースデータは本論文とともに提供される。本研究で得られたSu_YN1 OMVs質量分析プロテオミクスデータは、PRIDEパートナーリポジトリを通じてProteomeXchange ConsortiumにアクセッションコードPXD042831で寄託された。ソースデータは本論文とともに提供される。

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謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（助成金31830086、32000348、32021001）、NSFC/BMGF共同グランドチャレンジプログラム（82261128007、2022YFML1006）、中国国家重点研究開発プログラム（助成金2019YFC1200800）、中国科学院（317GJHZ2022028GC）、青少年イノベーション推進協会CASの助成を受けた。ジョンズ・ホプキンス大学公衆衛生大学院のMarcelo Jacobs-Lorenaにコメントと原稿の校正をしていただいた。蚊の飼育にご協力いただいたFang Li氏に感謝する。大腸菌K12株を提供してくれたShen Yangに感謝する。CAS Centre for Excellence in Molecular Plant Sciences, Core Facility CentreのXiaoyan XuとXingru Liaoにはリピドーム解析を、Xiaoyan Gao、Jiqin Li、Zhiping Zhang、Lina Xuには電子顕微鏡の技術サポートを、Wenjuan Caiには共焦点顕微鏡の技術サポートをいただいた。Malvern Panalytical社にはナノ粒子追跡分析を支援していただいた。ナノフローサイトメトリー測定（NFCM）をサポートしてくれたNeoland BioSciences社のHaoran Wang氏とJunfeng Wang氏に感謝する。OMVプロテオミクス解析にご協力いただいたShanghai hoogen biotech co.ltdのQiyu Chu氏に感謝する。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Han Gao、Yongmao Jiang、Lihua Wang。

著者および所属
中国科学院上海植物生理生態研究所昆虫発生進化生物学CAS重点研究室

Han Gao、Yongmao Jiang、Lihua Wang、Guandong Wang、Wenqian Hu、Ling Dong & Sibao Wang

中国科学院大学CAS生物相互作用研究センター（中国・北京

ハン・ガオ、ジャン・ヨンマオ、ワン・リホア、ワン・グァンドン、フー・ウェンチアン、リン・ドン、ワン・シバオ

貢献
S.W.とH.G.がプロジェクトを発案した。S.W.、H.G.、Y.J.が研究を計画した。Y.J.とH.G.は蚊の腸管切開とTEM解析を行った。Y.J.とH.G.がIEM解析を行った。H.G.とY.J.がSEM解析を行った。L.W.、H.G.、Y.J.およびW.H.はOMVの分離、精製および定量分析を行った。H.G.とY.J.はOMVナノ粒子追跡分析を行った。H.G.、L.W.、Y.J.がウェスタンブロット実験を行った。H.G.、Y.J.およびL.W.がOMVプロテアーゼ消化アッセイおよび組換えAmLipタンパク質結合試験を行った。H.G.、Y.J.およびL.W.が抗プラズマ活性試験を実施した。H.G.、Y.J.、G.W.はオーキネテ運動性試験を行い、OMVのオーシストおよびスポロゾイトに対する殺傷効果を調べた。H.G.、L.W.およびY.J.は、OMVの寄生虫へのターゲティングおよび追跡をライブセルで行い、間接免疫蛍光アッセイを行った。H.G.、L.W.、Y.J.およびW.H.はOMVリピドーム解析を行った。H.G.、Y.J.、L.W.は脂質拮抗アッセイを実施した。H.G.とY.J.はフローサイトメトリー解析とPC消去経路阻害アッセイを実施した。D.L.はリビングトラッキング実験と間接免疫蛍光アッセイに技術協力を行った。H.G.とS.W.はデータの解析を行った。原稿はH.G.とS.W.が執筆した。

筆者
Sibao Wangまで。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communicationsは、本論文の査読に貢献した鹿糠弘隆氏、およびその他の匿名の査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

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出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権主張および所属機関に関して中立を保っています。

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この記事を引用する
蚊の常在菌の外膜小胞は、ホスファチジルコリン消去経路を介して原虫の標的殺傷を媒介する。Nat Commun 14, 5157 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40887-6

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受領
2022 年 11 月 10 日

受理
2023年08月09日

出版
2023年8月24日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-40887-6

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