経鼻弱毒化SARS-CoV-2ワクチンはウイルス伝播を制限する

2024年2月4日 12:29

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出版：2024年2月2日
経鼻弱毒化SARS-CoV-2ワクチンはウイルス伝播を制限する
https://www.nature.com/articles/s41467-024-45348-2

Julia M. Adler, Ricardo Martin Vidal, ...Jakob Trimpert 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ15巻、記事番号：995（2024）この記事を引用する

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メトリクス詳細

要旨
効果的なSARS-CoV-2ワクチンの開発は、COVID-19の制圧に不可欠であるが、重大な課題が残されている。問題の一つは筋肉内投与であり、これは感染とウイルス排出の主要部位である上気道において強固な粘膜免疫応答を誘導しない。ここでは、SARS-CoV-2亜型B.1およびOmicron BA.5の感染を予防するための、粘膜感染型、複製コンピテント、完全弱毒ウイルスワクチンsCPD9-ΔFCSと一価mRNAワクチンBNT162b2の有効性を2つのシナリオで比較した。第一に、ワクチンを接種した雄のシリアンハムスターを感染した相手と接触させ、ワクチンの防御効果を評価した。次に、ワクチンを接種し、その後チャレンジした雄ハムスターからナイーブな接触者へのチャレンジウイルスの感染を評価した。その結果、弱毒化ワクチン（LAV）であるsCPD9-ΔFCSは、両シナリオにおいてmRNAワクチンよりもウイルス伝播の防止において有意に優れていた。この結果は、感染予防とウイルス伝播の抑制において、筋肉内投与のmRNAワクチンよりも局所投与のLAVの方が優れていることを示す証拠となる。

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はじめに
COVID-19パンデミックは人類の健康に多大な影響を及ぼし、数百万人の死者を出し、世界的に日常生活に広範な混乱をもたらした。SARS-CoV-2は現在も流行を続けており、病原体の絶え間ない進化を可能にしている。このパンデミックとの闘いにおける最も重要な成果のひとつは、SARS-CoV-2に対する有効なワクチンの迅速な開発である。開発されたワクチンは、上気道および下気道の重症度、特にウイルス感染に伴う死亡者数を減少させることに成功しているが、重大な課題も残されている。

主な課題の1つは、SARS-CoV-2感染に対する効果的な防御を提供する上で、現在のワクチンが不十分であることである1,2,3,4,5。さらに、より効果的な感染と免疫回避につながるウイルスの変異・進化能力は、現在のワクチンの有効性をさらに危うくしている2,3,4。この課題は、感染力の強いオミクロン亜種とその多数の亜種の出現で特に顕著であり、利用可能なワクチンではわずかにしか制御できない2,3。このことは、感染を効果的に予防し、感染を減少させ、ウイルスの進化を抑える可能性のあるワクチンを開発することの重要性を浮き彫りにしている。

私たちの研究の焦点は、生ワクチン（LAV）候補であるsCPD96,7,8,9,10の開発である。このワクチン候補は、コドン対の最適化（CPD）8によって開発された。CPDはウイルスゲノム内の同義コドンを再配置し、減弱させるが、ウイルスタンパク質の配列は完全に維持する11。sCPD9の場合、SARS-CoV-2 ORF1ab6の3'末端にある明確な配列を再コード化することで、SARS-CoV-2の完全な抗原レパートリーが保持された、複製コンピテントで完全に弱毒化されたワクチンウイルスが得られ、経鼻的に適用される8。このような特性により、sCPD9はさまざまなウイルス抗原に対する全身性免疫だけでなく、気道の強力な粘膜免疫も誘導するため、筋肉内投与やスパイクベースのmRNAワクチン、ベクターワクチンとは一線を画している10。しかし、LAVは意図しないウイルス拡散のリスクをもたらす可能性がある。この懸念に対処するため、我々はウイルススパイクタンパク質からフリン切断部位を除去することで、sCPD9-ΔFCSと呼ばれる非伝達性のsCPD9バージョンを作製した9。驚くべきことに、sCPD9-ΔFCSをシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）に投与したところ、完全に非伝達性でありながら、オリジナルのsCPD9ウイルスと同レベルのSARS-CoV-2に対する防御効果を示した9。

経鼻ワクチンは、主に免疫グロブリンA（IgA）反応を誘発し、呼吸器粘膜に常在メモリB細胞とT細胞を定着させることで、筋肉内ワクチンよりもいくつかの利点がある12。この2つの防御層は感染に対する効果的なバリアとなり、全身性免疫のみを誘導する筋肉内ワクチンよりも効果的にウイルスの複製、ウイルス排出、気道からの感染を抑制する。

本研究では、LAV候補であるsCPD9-ΔFCSと一価mRNAワクチンBNT162b2が、2種類の野生型（WT）ウイルス（変種B.1およびオミクロン亜変種BA.5）の拡散を予防する効果を比較した。われわれは、2つの異なるシナリオでその性能を調べた： (1)WTウイルスに感染した排出者に暴露された後、ワクチン接種者を感染から守る、(2)ワクチン接種者がワクチン接種35日後にWTウイルスに感染した場合、初対面の接触者へのウイルス感染を防ぐ、である。重要なことは、両ワクチンともSARS-CoV-2 B.1変種をベースにしており、同種および異種ウイルスのチャレンジに対する有効性を正面から比較できることである。その結果、弱毒化ウイルスワクチンであるsCPD9-ΔFCSは、両シナリオにおいて、ウイルス伝播の阻止においてmRNAワクチンを有意に上回った。さらに、感染予防、ウイルス伝播の抑制、さらなるウイルス進化の抑制という点で、複製ウイルスに対する経鼻投与ワクチンの明確な利点が示された。

結果
LAVおよびmRNAワクチンは、SARS-CoV-2 B.1およびBA.5の自然感染後の臨床症状の発現を予防する。
最初の実験では、シリアンハムスターにsCPD9-∆FCS、BNT162b2、または模擬ワクチンを3週間の間隔で2回投与した。14日後、ハムスターを1日前にウイルス変異体B.1またはオミクロンBA.5のいずれかに感染した動物と接触させた。ワクチン接種を受けた2匹の動物を1匹の脱落ハムスターと6日間同居させ、疾患症状と上気道のウイルス量を注意深く観察した（図1a）。

図1：試験スキームおよびワクチン接種した接触ハムスターのウイルス学的結果。
図1
a 実験の概略。シリアンハムスターに0日目と21日目にsCPD9-∆FCSを経鼻接種（i.n.）、mRNAワクチンを筋肉内接種（i.m.）、または模擬ワクチンをプライムブーストで接種した。ワクチン接種35日後（dpv）に、SARS-CoV-2 B.1またはOmicron BA.5に感染した排出動物と同居させ、宿主間感染のスクリーニングを行った。接触6日後（dpc）、ハムスターを安楽死させ、綿棒、血液、肺サンプルを採取した。b B.1排出動物と接触動物、c BA.5排出動物と接触動物の体重変化。バイオリンプロット（切り捨て）は、ワクチン接種を受けた接触動物（n = 6）の体重、グループの中央値、および四分位値を示す。排出者（n = 3）の体重は中央値で表示。d B.1およびe BA.5感染シェダーハムスターおよびそれぞれのワクチン接種接触動物から毎日採取した口腔スワブ中のウイルスgRNAコピー。f B.1およびg BA.5感染シェダーおよびそれぞれのワクチン接種接触動物について、口腔咽頭スワブおよび肺組織中のウイルスgRNAコピー、ならびに集束形成単位（FFU）として定量化した複製ウイルス。d, e 通常の二元配置分散分析（Tukeyの多重比較検定付き）。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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SARS-CoV-2変種B.1に感染した3群の排出動物はすべて、中程度の体重減少およびCOVID-19様肺炎に典型的な臨床症状を示した（図1bおよびS1a）。予想通り、BA.5 変異体13,14に感染した排出動物は、感染グループ間で多少のばらつきはあるものの、あまり顕著な体重減少を示さなかった（図1cおよびS1b）。

sCPD9-∆FCSワクチンおよびmRNAワクチンは、B.1またはBA.5の両排菌に曝露されたワクチン接種接触動物の体重減少を効果的に予防した（図1c、b）。予想された通り、B.1排菌に暴露された模擬ワクチン接種動物は、接触後3日目から体重が徐々に減少した（図1b）。一方、BA.5排出者に暴露された模擬ワクチン接種動物は体重減少を経験しなかったが、これはおそらくBA.5変異体の病原性が低く、感染動物で観察された疾病転帰が比較的軽度であったためであろう（図1c）。

LAVのみがSARS-CoV-2 B.1およびBA.5の感染を防ぐ
ウイルスの複製と伝播をモニターするため、感染動物と接触動物の共同飼育中に毎日口腔スワブを採取した。さらに、接触後6日目（dpc）に口腔咽頭ぬぐい液と肺を採取し、ウイルスRNAレベルと複製ウイルスを定量化した（図1a）。感染した排出動物は高レベルのSARS-CoV-2 RNAを示したが、6日目にかけて徐々に減少した。一般に、ウイルス量はBA.5排出者に比べてB.1排出者で高かった。個々の排出者間のSARS-CoV-2コピー数の差はわずかに顕著であったが、BA.5感染動物ではまだ有意差はなかった（図1d、eおよびS1c-h；表S1）。感染経路への影響は認められなかった。

観察された体重減少と一致して、B.1排出者に暴露された模擬ワクチン接種接触者の口腔スワブには、2dpc以降、高レベルのSARS-CoV-2ゲノムRNA（gRNA）が認められた（図1d）。mRNAワクチン接種は体重減少を防いだが、2日目以降も口腔スワブ中のSARS-CoV-2 gRNAレベルが高値を維持していることから明らかなように、B.1感染に対する予防効果はなかった。とはいえ、mRNAワクチン接種は模擬ワクチン接種と比較してウイルスgRNAレベルを低下させた。対照的に、sCPD9-∆FCSワクチンを接種した接触者は、検出限界付近で変動する最小限のSARS-CoV-2 gRNAレベルを示し、上気道における生産的感染の徴候なしにウイルスに繰り返し曝露されることを示唆した（図1d）。

同様の結果が、BA.5感染排出者に曝露されたワクチン接種ハムスターでも得られた。mRNAワクチン接種動物および模擬ワクチン接種動物の口腔スワブ中のSARS-CoV-2 gRNAレベルはdpc 4から5でピークに達したが（図1e）、sCPD9∆FCSワクチン接種ハムスターのウイルスgRNAレベルは検出限界に近かったことから、BA.5感染の効果的な予防が示唆された（図1e）。

これらの所見と一致して、B.1またはBA.5の排出者に暴露されたmRNAハムスターと模擬ワクチン接種ハムスターの両方が、6dpcの口腔咽頭ぬぐい液と肺で高いSARS-CoV-2 gRNAレベルを示した（図1f、g）。さらに、B.1排出者に暴露された模擬ワクチン接種動物の肺組織には、複製コンピテントウイルスが存在したが、ほとんどの排出者はその時までに感染を除去していた（図1fおよびS1g）。ウイルスのgRNAレベルがわずかに低いにもかかわらず、BA.5排出者に暴露されたmRNAワクチン接種ハムスター2匹と模擬ワクチン接種ハムスター3匹の肺から複製ウイルスが検出されたのは、B.1感染に比べてウイルス複製のピークが遅れたことを反映している（図1g）。

さらに、ウイルス複製RNA中間体の存在は、ウイルス複製が活発であることを確実に示すため15,16,17、毎日の口腔スワブ中のサブゲノムRNA（sgRNA）転写物の存在を定量することにより、ウイルス複製をモニターした。gRNAの定量結果と一致するように、sgRNAはB.1またはBA.5に感染した排出者と同居していたすべてのmRNA接種動物および模擬ワクチン接種接触動物で検出された。対照的に、sCPD9-∆FCSを接種した接触動物は、sgRNAコピー数が検出されないか、非常に少なかったことから、SARS-CoV-2 B.1およびBA.5感染に対するsCPD9-∆FCSワクチン接種の防御効果が確認された（図2a、bおよび表S2）。

図2：ワクチン接種を受けた接触動物のサブゲノムRNAレベル。
図2
a.B.1およびb.BA.5に感染した脱落ハムスターおよびそれぞれのワクチン接種済み接触動物から毎日採取した口腔スワブ中のウイルスsgRNAコピー数。a,b ワクチン接種済み接触動物（n = 6）の結果は、中央値および範囲として表示し、記号は個々の値を示す。脱落ハムスター（n = 3）については中央値を示した。対数変換データのパラメトリック統計。Tukeyの多重比較検定を用いた通常の二元配置分散分析を行った。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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模擬ワクチン接種動物で観察された肺炎とは対照的に、肺病変はsCPD9-∆FCSワクチン接種動物ではほとんど見られず、mRNAワクチン接種動物ではB.1排出者に暴露してもあまり顕著ではなかった。B.1ウイルスに実験的に感染させたハムスター、または模擬ワクチン接種後にB.1に感染した動物は、COVID-19様肺炎に典型的な病変を発症した（図3aおよび図S2a、b）。具体的には、感染動物は、壊死性膿疱性気管支炎および気管支炎、肺胞II型上皮の増殖、血管内皮炎、びまん性肺胞損傷、ならびに血管周囲および肺胞の浮腫を伴う顕著な斑状気管支間質性肺炎を呈した。病理組織学的解析では、sCPD9-∆FCSワクチン接種動物およびmRNAワクチン接種動物において、組織変化、免疫細胞浸潤、および浮腫の有意な減少が確認された（図3c-f）。炎症性損傷はオミクロンBA.5に感染したすべての動物で軽度であり、実験的に感染させたシェダーハムスターで最も顕著であった（図3bおよびS2a, b）。しかし、模擬ワクチンを接種した接触者は依然として軽度の肺炎を発症した（図3b）。mRNAワクチンを接種したハムスターでは、防御効果はわずかに低かった。対照的に、sCPD9-∆FCSを接種したハムスターはB.1またはBA.5の排出者に接触しても肺炎を発症しなかったことから、このワクチンによる高い防御効果が確認された（図3）。

図3：ワクチンを接種した接触ハムスターの病理組織学的所見。
図3
a, b a B.1またはb BA.5排出者と接触したワクチン接種動物における、左肺葉のヘマトキシリン・エオジン染色切片の概要像、および細気管支、肺胞、血管内皮の病理組織学的所見。スケールバー：左列3mm、他はすべて20μm。 c-f B.1-またはBA.5-に感染した排菌者（n = 3）と接触したワクチン接種ハムスター（n = 6）で認められた病理学的変化の半定量的評価。 c 連結肺面積（百分率） d 好中球、リンパ球、マクロファージの流入、気管支上皮壊死、気管支炎、肺胞上皮壊死、血管周囲リンパ球カフ、肺細胞II型過形成を含む肺炎症スコア。e リンパ球、好中球、マクロファージの浸潤、血管周囲のリンパ球カフスを含む免疫細胞流入スコア。 f 血管周囲および肺胞の浮腫を考慮した肺水腫スコア。脱落動物の結果は中央値で示した。通常の一元配置分散分析とTukeyの多重比較検定。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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LAVの保護効果には強い体液性免疫反応が伴う
体液性免疫を評価するため、6dpcで採取した血清のSARS-CoV-2変異体B.1、Delta、BA.1、BA.5に対する中和能を評価した。さらに、6日齢で採取した血清および鼻洗浄液を用いて酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を実施した。

以前の研究8,9,10と一致して、sCPD9-∆FCSのワクチン接種は中和抗体の強固な産生を誘発した。sCPD9ワクチン接種ハムスターは、チャレンジに用いたウイルス変異体にかかわらず、同レベルの中和抗体を産生した（図4a）。この所見は、ウイルス学的結果と合わせて、sCPD9-∆FCSワクチン接種によって誘導された粘膜免疫が自然感染ウイルスの複製を阻止したことを示唆している。しかし、感染した排出者との共同飼育中にウイルス抗原と接触した結果、中和活性がわずかに上昇した可能性がある。対照的に、模擬ワクチン接種動物では、特定のチャレンジウイルスに対する血清中和能が上昇した。同様の傾向はmRNAワクチン接種動物でも観察されたが、その差はあまり顕著ではなかった（図4a）。予想通り、特異的血清中和能はすべての排出動物で同様であり、チャレンジウイルスによって決定された（図S3a）。

図4：ワクチン接種した接触動物の全身および粘膜免疫。
図4
a B.1またはBA.5のいずれかの排出者と接触したワクチン接種動物（n＝6）から6dpc採取したハムスター血清のSARS-CoV-2変異体B.1、BA.5、Delta、およびBA.1に対する中和能（検出上限＝1：1,024、検出下限は点線で示す）。b 接種後6日目（dpc）にワクチン接種を受けた接触者から採取した血清中のB.1スパイク、BA.5スパイク、ヌクレオカプシド、ORF3aに対するSARS-CoV-2特異的IgGレベル c 接種後6日目にワクチン接種を受けた接触者から採取した鼻洗浄液中のB.1およびBA.5スパイクに対するSARS-CoV-2特異的IgAレベル。箱ひげ図は25～75パーセンタイルを示し、中心線は中央値、ひげは最小値から最大値を示す。記号は、1群につきワクチン接種を受けた接触者（n＝6）の個体値を示す。a-c Dunnの多重比較検定によるクラスカル・ワリス検定。*p < 0.05、p < 0.01、 p < 0.001、***p < 0.0001. d ワクチン接種接触者（n = 6）の鼻上皮におけるSARS-CoV-2 N蛋白免疫組織化学（IHC）シグナルの半定量的スコアリング。リンパ球、好中球の流入、嗅覚上皮および呼吸器上皮の壊死、アポトーシス、繊毛の消失、扁平化した上皮細胞を含む鼻上皮の炎症性変化のスコアリングを中央値と範囲で表示。記号は個々の値を示す。通常の一元配置分散分析とTukeyの多重比較検定。*e, f 鼻上皮細胞におけるSARS-CoV-2ヌクレオキャプシド抗原の免疫組織化学的染色は、3,3′-ジアミノベンジジン発色剤（茶）およびヘマリウム対比染色（青）を用いた。スケールバー：20 µm。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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ELISAにより、sCPD9-∆FCSおよびmRNAワクチン接種ハムスターにおける抗B.1スパイクおよび抗BA.5スパイクIgG抗体のレベルは同程度であることが明らかになった（図4b）。予想通り、ヌクレオカプシド特異的抗体とORF3a特異的抗体はsCPD9-∆FCS-ワクチン接種動物にのみ存在し、LAVによる広範な免疫が強調された（図4b）。驚くことではないが、排出動物のIgGレベルは比較的均一で、チャレンジウイルスの影響を強く受けた（図S3b）。

粘膜免疫については、6日齢の鼻洗浄液中のSARS-CoV-2特異的IgAレベルを測定することで調べた（図4c）。チャレンジウイルスに関係なく、sCPD9-∆FCSワクチン接種動物は同程度の抗B.1スパイクおよび抗BA.5スパイクIgA抗体を示した（図4c）。対照的に、B.1排出株に暴露されたmRNAワクチン接種ハムスターのみが、評価できるレベルのIgAを産生した。BA.5排出株に暴露されたmRNAワクチン接種動物および両模擬ワクチン接種群は、測定可能な粘膜IgA反応を欠いた。BA.5排出体と接触したmRNAワクチン接種ハムスターの鼻洗浄液にIgAが認められなかったことから、mRNAワクチン接種はウイルス暴露前に限定的な粘膜免疫しか与えないことが確認された。しかし、同種のB.1変異体への曝露は、粘膜IgA抗体の有意な誘導を引き起こした（図4c）。脱落動物は低いIgAレベルを示し、これは感染に使用されたウイルスに対応していた（図S3c）。

LAVによるワクチン接種は、SARS-CoV-2 B.1およびBA.5による粘膜感染を予防する。
ワクチン接種によって誘導された上気道の保護をさらに評価するために、6dpcの鼻上皮を免疫組織化学的にSARS-CoV-2ヌクレオカプシド抗原の存在について評価し、感染と炎症の徴候について組織学的に調べた。SARS-CoV-2陽性細胞はsCPD9-∆FCSワクチン接種群の鼻呼吸器上皮および嗅覚上皮には認められなかったが、mRNAワクチン接種群および模擬ワクチン接種群では抗原が豊富に検出された（図4d, e）。

これらの結果と同様に、免疫細胞の流入と炎症性損傷は、mRNAワクチン接種動物とモックワクチン接種動物の嗅覚上皮と呼吸器上皮でのみ観察され、mRNAワクチン接種ハムスターでは炎症が軽減していた（図4d-f）。B.1排出菌と比較すると、BA.5排出菌に暴露された動物では炎症性損傷はそれほど顕著ではなかった。以前の観察18,19,20,21と一致し、SARS-CoV-21818抗原は、7dpiまでに脱落ハムスターにおいて著しく減少または消失した。SARS-CoV-2抗原の低存在は、軽度の炎症徴候を伴っていた（図S3d）。

LAVによるワクチン接種は、SARS-CoV-2 B.1のナイーブコンタクトへの感染を阻止した。
第2の実験セットでは、ワクチン接種および実験的に感染させたハムスターからナイーブな動物へのウイルス伝播を制限するワクチン接種の効果を調べた。シリアンハムスターにsCPD9-∆FCSまたはBNT162b2を21日間隔で2回投与した。14日後、ハムスターにSARS-CoV-2 B.1またはOmicron BA.5のいずれかを感染させた。感染から24時間後、感染動物を6日間ナイーブな接触者と同居させ、臨床状態と体重をモニターした。口腔スワブは毎日採取し、口腔咽頭スワブと肺サンプルは6日目に採取した（図5a）。

図5：予防接種を受けたB.1排出者のナイーブコンタクトの研究スキーム、臨床的、ウイルス学的、病理組織学的結果。
図5
a 試験スキーム。プライムブーストスケジュールに従い、シリアンハムスターは0日目と21日目にsCPD9-∆FCSを経鼻投与（i.n.）、mRNAワクチンを筋肉内投与（i.m.）、または模擬ワクチンを接種した。その後、プライムワクチン接種（dpv）から35日後に、ワクチン接種動物をSARS-CoV-2バリアントB.1またはOmicron BA.5でチャレンジ感染させた。チャレンジ感染から24時間後、チャレンジ感染動物を免疫学的にナイーブな動物と同居させ、宿主間伝播を評価した。ハムスターは接触後6日目（dpc）に安楽死させ、綿棒、血液、肺サンプルを採取した。 b ワクチン接種動物、B.1感染排出動物、およびナイーブな接触動物の体重減少率。バイオリンプロット（切り捨て）は、群中央値および四分位数におけるナイーブコンタクト（n＝6）の体重を表す。排出者（n = 3）の体重は中央値で示す。e 終了時に採取した口腔咽頭スワブおよび2.5 mgホモジナイズ肺組織中のウイルスgRNAコピー。f ハムスター肺の病理組織学的スコアリングは、肺圧密の割合、好中球、リンパ球およびマクロファージの流入を含む炎症性損傷、気管支上皮壊死、気管支炎、肺胞上皮壊死、血管周囲リンパ球カフおよび肺細胞II型過形成を表示した。免疫細胞流入スコアは、リンパ球、好中球、マクロファージ浸潤、血管周囲リンパ球カフを評価する。浮腫スコアは血管周囲の浮腫と肺胞浮腫を含む。c-f ナイーブな接触動物（n＝6）の結果を中央値で範囲とともに示す。記号は個々の値を表す。c-e 対数変換したデータのパラメトリック統計。c, d 通常の二元配置分散分析（Tukeyの多重比較検定付き） e, f 通常の一元配置分散分析（Tukeyの多重比較検定付き）。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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両ワクチンとも体重減少を効率的に防止したが、模擬ワクチン接種動物はB.1感染時に体重減少を示した（図5bおよびS4a）。ウイルス学的および病理組織学的結果から、SARS-CoV-2 B.1チャレンジ感染に対するsCPD9-∆FCSワクチンの強力な防御効果が確認された（図S4b-f）。sCPD9-∆FCSワクチン接種群とB.1感染群に同居させたナイーブコンタクトの体重は安定していた。対照的に、模擬ワクチンまたはmRNAワクチン接種群およびSARS-CoV-2感染群の接触者は、それぞれ2dpcおよび4dpcから体重が減少し（図5b）、その口腔スワブは高レベルのSARS-CoV-2 gRNAを示した（図5cおよび表S3）。さらに、ウイルス複製が活発なときに産生されるsgRNAが、後者のグループの口腔スワブから検出された（図5d、および表S4）。しかし、mRNAワクチンを接種したシェダーの接触は、模擬ワクチンを接種した動物の接触に比べ、ウイルス複製速度がわずかに遅れていた（図5c、d）。肺に高いgRNAレベルが存在し、複製コンピテントウイルスが検出されたことから、mRNAまたは模擬ワクチン接種ハムスターおよびB.1感染ハムスターと接触したすべてのナイーブ動物がチャレンジウイルスに感染したことがさらに確認された（図5e）。対照的に、sCPD9-∆FCSワクチン接種動物およびB.1感染動物との接触は、上気道および下気道においてSARS-CoV-2 sgRNAおよびgRNA陰性であり、下気道では複製ウイルスは検出されなかった。これらの所見は、sCPD9-∆FCSによるワクチン接種が、ナイーブな接触者へのB.1ウイルスの伝播に対して非常に効果的な防御を与えることを強く示している（図5c-e）。(図5c-e）。

これらの観察と一致して、ワクチン接種動物およびチャレンジ動物からB.1感染にかかったハムスターは、壊死性膿疱性細気管支炎および細気管支炎、肺胞II型上皮の増殖、血管内皮炎、びまん性肺胞損傷、ならびに血管周囲および肺胞の浮腫を含むCOVID-19肺炎の典型的な徴候を示した。しかし、免疫細胞の流入と浮腫は、mRNAワクチン接種動物と同居したハムスターでは、模擬ワクチン接種動物と比較して減少した。重要なことは、sCPD9-∆FCSワクチン接種動物およびB.1感染動物と接触したハムスターは、いずれも肺炎の徴候を示さなかったことである（図5fおよび6）。

図6：ワクチン接種したSARS-CoV-2 B.1排出者と接触したハムスターの病理組織学的所見。
図6
気管支炎、肺炎、内皮炎の異なる重症度を示す各群n = 3匹のハムスターの代表的な病理組織像。スケールバー：左列3mm、その他は20μm。

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LAVはオミクロンBA.5感染とその伝播に対して優れた防御効果を示す
オミクロンBA.5に感染したハムスターでは、シリアンハムスター14,22におけるその減弱のため、有意な体重減少は観察されなかった（図7aおよびS5a）。sCPD9-∆FCSをワクチン接種し、その後オミクロンBA.5に感染させた動物では、gRNAコピー数は急速に減少し、2 dpcで検出限界以下となった。対照的に、mRNAワクチン接種は、模擬ワクチン接種と比較して、上気道および下気道におけるウイルス量をわずかに減少させただけであった。重要なことに、mRNAワクチン接種ハムスターの口腔スワブからは、5 dpcまでSARS-CoV-2 gRNAが検出された（図7b、cおよびS5b、c）。これらの結果と一致して、sgRNAは、sCPD9-∆FCSワクチン接種ハムスターでは、チャレンジウイルス接種直後の日にのみ検出可能であった。対照的に、sgRNAの存在は、mRNAワクチン接種動物では最長5日間、模擬ワクチン接種動物では最長7日間、BA.5が複製されることを示唆しており、すべてのケースで継代が可能であった（図7cおよびS5d）。ワクチン接種したハムスターとB.1感染したハムスターの病理組織学的検査では、両ワクチンの有効性が確認されたが、BA.5感染動物で観察された病理組織学的変化は、B.1感染動物で観察された変化と比較して一般的に微細であり、原始ウイルスと比較して、この変種の病理学的変化は全体的に穏やかであることが示唆された（図S5e、f）。

図7：ワクチン接種を受けたBA.5排出者のナイーブコンタクトの臨床的、ウイルス学的、および病理組織学的結果。
図7
a ワクチン接種およびBA.5感染した排出動物とナイーブな接触者の体重減少率。バイオリンプロット（切り捨て）は、グループの中央値および四分位数におけるナイーブ接触者（n = 6）の体重を表す。排出者（n = 3）の体重は中央値で示す。d 終了時に得られた口腔咽頭スワブおよび2.5 mgの肺組織で検出されたgRNAコピー数。ホモジナイズした肺 50 mg 中の複製コンピテントウイルス数を FFU（Focus Forming Units）として示す。肺炎スコアには、好中球、リンパ球、マクロファージの流入、気管支上皮壊死、気管支炎、肺胞上皮壊死、血管周囲リンパ球カフ、および肺細胞II型過形成が含まれる。リンパ球、好中球、マクロファージ浸潤、血管周囲リンパ球カフを含む免疫細胞流入スコア。血管周囲浮腫と肺胞浮腫を含む浮腫スコア。 b-e ナイーブな接触動物（n = 6）の結果は、中央値と範囲として表示し、記号は個々の値を表す。b-d 対数変換したデータのパラメトリック統計。b, c 通常の二元配置分散分析（Tukeyの多重比較検定付き） d, e 通常の一元配置分散分析（Tukeyの多重比較検定付き）。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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ワクチン接種ハムスターおよびBA.5感染ハムスターと接触したナイーブ群では、体重減少は観察されなかった（図7a）。しかし、mRNAワクチン接種では、BA.5ウイルスの継代を防ぐことはできなかった。3日齢以降、mRNAワクチン接種群または模擬ワクチン接種群と接触したすべての動物で、上気道におけるSARS-CoV-2 gRNAおよびsgRNAの負荷量は同等であった（図7b、c）。さらに、高いSARS-CoV-2 gRNAレベルは、これらの動物から終了時に採取した口腔咽頭スワブおよび肺サンプルにも認められた（図7d）。対照的に、sCPD9-∆FCSワクチン接種はナイーブな接触者への感染を大幅に減少させ、2dpc頃に感染したのは1頭だけであった。同じケージにいた2匹目のナイーブな動物は6dpcで陽性となり、二次感染を示した（図7b）。両ハムスターとも感染終了時に口腔咽頭ぬぐい液と肺でSARS-CoV-2 gRNAが陽性であったが、感染終了時に複製ウイルスを保有していたのは1匹だけであった。一方、複製ウイルスはmRNAと模擬ワクチン接種の両方の排出者の3人の接触者に存在した（図7d）。

組織病理学的所見は、ワクチン接種ハムスターおよびBA.5感染ハムスターに曝露された接触者ではあまり顕著ではなかった。模擬あるいはmRNAワクチン接種ハムスターの接触者では、免疫細胞の流入増加を伴う軽度から中等度の肺炎が認められたが、肺の圧壊は認められなかった。sCPD9-∆FCSワクチン接種動物のナイーブコンタクトでは、感染状態を反映し、徴候がないか、あるいは軽度の肺炎を示した（図7eおよび8）。

図8：ワクチン接種したオミクロンBA.5排出者のナイーブコンタクトにおける病理組織学的所見。
図8
気管支炎、肺炎および内皮炎の異なる重症度を示す各群n = 3匹のハムスターの代表的な病理組織像。スケールバー：左列3mm、その他は20μm。

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LAVによって誘導された体液性および粘膜免疫は、SARS-CoV-2の感染経路を減少させた。
sCPD9-∆FCSワクチン接種者およびB.1感染シェダーのナイーブな接触者は血清転換を示さなかったが、mRNAワクチン接種者または模擬ワクチン接種者および感染シェダーの接触者は、チャレンジウイルスに依存した血清転換を示した（図9a、b）。予想通り、sCPD9-∆FCSワクチン接種動物は感染前に広範で強い体液性免疫応答を示したが、mRNAワクチン接種ハムスターは体液性応答をB.1スパイクタンパク質のみに向けた（図S6a-d）。BA.5に対する中和抗体価は、sCPD9-∆FCSを接種した動物でのみ検出された（図S6a、d）。チャレンジ感染により、すべての群で抗体応答が上昇した（図S6c、d）。

図9：ナイーブコンタクト動物の全身および粘膜免疫。
図9
a ワクチン接種群、B.1またはBA.5感染群に接触したナイーブハムスター（n = 6）から6dpcで採取した血清中のSARS-CoV-2変異体B.1、BA.5、Delta、BA.1に対する中和抗体。検出下限は点線で示し、検出上限は1:1,024である。結果は平均値±SEMで表示した。 b 6dpc時に採取したナイーブな接触者の血清中のB.1スパイク、BA.5スパイク、ヌクレオカプシド、ORF3aに対するSARS-CoV-2特異的IgGレベル。 c 終息時に得た鼻洗浄液中のB.1スパイクおよびBA.5スパイクに対するSARS-CoV-2特異的IgAレベル。箱ひげ図は、中央値を示す25～75パーセンタイル、最小値から最大値までのひげ、および記号で示したナイーブコンタクトの個々の値を示す（n = 6）。 d ナイーブコンタクト（n = 6）の鼻上皮におけるSARS-CoV-2 N蛋白免疫組織化学（IHC）の半定量的スコアリング。リンパ球、好中球の流入、嗅上皮および呼吸上皮の壊死、アポトーシス、繊毛の消失、扁平化した上皮細胞を含む鼻上皮の炎症性変化のスコアリング。e, f 鼻上皮細胞におけるSARS-CoV-2ヌクレオキャプシド抗原の免疫組織化学的染色（DAB発色剤（茶）およびヘマリウム対比染色（青））。スケールバー：20 µm。a-d Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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ウイルス学的結果と一致して、sCPD9-∆FCSワクチン接種ハムスターとBA.5感染ハムスターのナイーブコンタクト1匹のみがセロコンバージョンを示した。SARS-CoV-2のB.1、DeltaおよびBA.1に対する抗体は、BA.5排出者の接触動物から得られた血清サンプルのいずれからも検出されなかった。さらに、B.1タンパク質S、N、ORF3aに対する抗体はELISAでは検出できなかった（図9b）。全体として、sCPD9-∆FCSワクチン接種のみが広範な体液性免疫を誘導し、ナイーブな接触者へのBA.5伝播を効果的に減少させた。

sCPD9-∆FCSワクチン接種者および感染シェダーの鼻腔洗浄では、チャレンジウイルスにかかわらず、B.1およびオミクロンBA.5スパイクに対する高いIgAレベルを示した。一方、mRNAワクチン接種ハムスターおよび模擬ワクチン接種ハムスターおよび感染ハムスターはIgAレベルが低いか、まったくなかったことから、鼻腔内ワクチン接種による優れた粘膜免疫が確認された（図S7a）。ナイーブな接触者では6dpcでIgA抗体は認められなかったが、mRNAワクチン接種動物および模擬ワクチン接種動物、感染動物の接触者では、ウイルス学的および血清学的所見と一致して、IgA発現のわずかな傾向が認められた（図9c）。

mRNAワクチン接種者の接触者は、SARS-CoV-2亜型の両方に感染し、鼻上皮にヌクレオカプシドの豊富な発現を示した（図9d-f）。模擬ワクチンを接種したハムスターとB.1チャレンジしたハムスターの接触者は、mRNAワクチンを接種した動物の接触者と比較して、鼻上皮のSARS-CoV-2陽性細胞の数が少なく、6dpcの口腔スワブのウイルスRNAレベルと一致していた（図9d）。

これまでの観察結果と一致し、sCPD9-∆FCSワクチン接種群とB.1-またはBA.5感染群との接触者の鼻上皮には、BA.5感染した1匹のハムスターを除き、SARS-CoV-2ヌクレオキャプシドタンパク質は認められなかった（図9d）。免疫組織化学的結果と一致し、2つの変異型のいずれかに感染したすべてのハムスターで、炎症と免疫細胞のリクルートメントが様々な程度で検出され（図9d-f）、sCPD9-∆FCSがウイルス感染を防ぐのに有効であることが裏付けられた。組織学的所見から、ワクチン接種群と感染群のすべてで感染が完全に消失していることが確認された（図S7b-d）。

考察
既存のCOVID-19ワクチンは、入院と死亡を減少させることに成功しているが、絶えず出現するSARS-CoV-2亜種によって、その有効性が損なわれている23,24,25。特に、伝播性の高いオミクロン変異体は、BA.5適合ワクチンが市場に導入された直後からその有効性を低下させてきた3,4,25。ウイルスの初感染部位で粘膜免疫を誘導するためには、経鼻投与経路が有利であることは確かである。この点を考慮し、mRNAワクチンやベクターベースのワクチンの経鼻投与による有効性を評価する試験が行われた。これらのワクチンは体液性免疫を誘発し、臨床症状とウイルス量を減少させたが、前臨床モデルではSARS-CoV-2感染を予防できなかった26,27,28。さらに、経鼻mRNAワクチン接種によって誘導された全身性中和抗体は、新興のオミクロン変異体28に対して限られた交差反応性しか示さなかった。そのため、強力で広範な粘膜免疫を誘発できる新しいワクチンや製剤の開発が必要であるというコンセンサスが高まっている12,29,30。

二量体IgA抗体は、粘膜組織、特にSARS-CoV-2が最初に遭遇する上気道において支配的な抗体タイプである。最近の研究で、単量体IgA抗体は対応するIgG単量体よりも中和活性が低いが、二量体IgA抗体は単量体よりも15倍強力であることが示された31。したがって、粘膜表面で二量体IgA抗体の産生を刺激するワクチンは、SARS-CoV-2に対する優れた防御を提供する可能性がある。IgGは下気道における防御免疫において重要であるが、IgAは初感染とウイルス排出の主要部位である上気道区画において比較的重要である32,33,34,35,36。以前我々は、sCPD9が筋肉内投与ワクチンよりも強力なIgA抗体応答を誘導することを示した10。本研究では、sCPD9-ΔFCSワクチン接種が、今回試験した2つの進化的に離れたウイルス変異体を効果的に中和できる強固なレベルのIgA抗体を誘導することを証明し、これらの知見をさらに裏付けた。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質の抗原可塑性が極めて高いため、スパイクベースのワクチンは抗原ドリフトによる免疫回避の影響を非常に受けやすい37。しかし、特異的なT細胞免疫によって、スパイクタンパク質の外側にあるいくつかの保存抗原を標的とすることができるため、異なるウイルス変異体間でも、抗SARS-CoV-2免疫の幅を大きく広げることができる38。私たちが開発したLAVは、ウイルスの抗原レパートリー全体を呼吸器粘膜に提示し、特に、初感染やワクチン接種後も呼吸器粘膜などの特定の組織に定常的に存在するT細胞の特殊なサブセットである組織常在記憶T細胞（TRM細胞）の形成を誘発する39,40。これらの細胞は、体表面から組織に再侵入する病原体を迅速に認識し応答することで、再感染に対する防御の第一線を担っており40,41、ウイルスの複製を早期に制御し、気道内でのウイルスの拡散を抑えることに貢献している。中和（IgA）抗体とともに、TRM細胞はSARS-CoV-2に対する包括的な防御に貢献し、ウイルスの侵入点と最初の複製部位を効果的に標的とすることで、気道感染と伝播の可能性を減少させる10。

以前の研究で、我々は、sCPD9が、筋肉内投与されたスパイクベースのmRNAワクチンやベクターワクチンと比較して、SARS-CoV-2感染に対する優れた防御を提供することを証明した10。本研究では、弱毒ウイルスsCPD9-ΔFCSを経鼻投与したワクチンと、mRNAワクチンBNT162b2を筋肉注射したワクチンのSARS-CoV-2感染抑制効果を比較することを目的とした。両ワクチンともSARS-CoV-2スパイク蛋白の原型をコードしている。われわれは、弱毒ウイルスがウイルスの感染を予防したり、著しく減少させたりする優れた能力を持つことを示す直接的な証拠を提供した。重要なことは、このことは、SARS-CoV-2の変種であるBA.5でも同様であるということである。スパイクタンパク質に多数のアミノ酸変化を持つオミクロン変異体の出現13,42は、二価mRNAワクチンの開発に拍車をかけた。これらのワクチンには、B.1変異体およびBA.4/BA.5変異体のスパイクタンパク質が含まれており、一価ワクチンと比較してオミクロン変異体に対する優れた防御効果を発揮する2,43。しかし、SARS-CoV-2の伝播は、スパイクベースの筋肉内ワクチンでは抑制できない、あるいは十分に抑制できないことが次第に明らかになってきている44。

上気道の上皮がSARS-CoV-2の主な感染部位であることを考えると、強固で持続的な免疫を誘導できる経鼻ワクチンの開発が強く望まれている。現在のSARS-CoV-2 mRNAワクチンは経鼻投与用にデザインされていないが、ある研究では、実験モデルで経鼻投与した場合、SARS-CoV-2に対する限定的な防御能を示した28。これらの知見は、経鼻投与用に特別に調整されたmRNAワクチンの開発可能性を示唆している。さらに、経鼻投与など同じ経路で投与される様々なタイプのワクチンの有効性を評価する比較研究により、その性能に関する貴重な知見が得られる可能性がある。しかしながら、mRNAワクチンを経鼻投与用に最適化するためには、粘膜投与特有の特徴を考慮し、ワクチン製剤の大幅な変更が必要となる可能性がある。ワクチン製剤、アジュバント、標的抗原などの重要な因子は、結果に大きく影響する可能性があるため、慎重に検討する必要がある。われわれの研究は、経鼻ワクチンによって優れた防御が提供されることを証明するものであり、異なる経鼻ワクチンや製剤を比較することは、今後の研究の重要な分野となるであろう。

さらに、我々の知見から、SARS-CoV-2の場合、弱毒粘膜ワクチンには、ウイルス感染とその後の伝播を効率的に予防または減少させる能力がある可能性が示された。さらに、我々のB.1ベースのワクチンは、B.1変異体とは抗原的にかけ離れたBA.5変異体に対して非常に効率的な防御を提供するため、ウイルス抗原の頻繁な更新を必要としない可能性もある。私たちの研究では、sCPD9を2回続けて投与することで免疫が効果的に増強されることも示されている。このことは、SARS-CoV-2感染によってもたらされるような既存の免疫が、今回試験した粘膜ワクチンの有効性を妨げるものではないことを示している。それどころか、粘膜ワクチンによって既存の免疫を定期的に増強することは、SARS-CoV-2を長期的にコントロールするための重要な戦略であると考えられる。本研究の重要な限界は、ワクチンによる防御の持続性を調査していないことである。今後の研究では、数ヵ月にわたるワクチン接種の有効性や、最適なブーストレジメンを検討する予定である。

結論として、ここで示された知見は、SARS-CoV-2だけでなく他の呼吸器系ウイルスの制圧を強化するために粘膜ワクチンを開発することの意義と利点を強調するものである。ウイルス伝播の抑制は、呼吸器RNAウイルスの循環と進化を抑制し、遅らせる可能性がある。

研究方法
研究デザイン
本研究では、2つの異なるタイプのワクチンによるSARS-CoV-2感染防御を比較することを目的とした。SARS-CoV-2が感染した脱落ハムスターからワクチン接種動物へ、およびワクチン接種後に感染した脱落ハムスターから接触ハムスターへ伝播する程度を、2つの異なる試験で調査した。この目的のために、ハムスターは12匹のグループに無作為に割り付けられた。両試験の実験計画には、ハムスターにそれぞれ0日目と21日目にワクチン接種を行うプライムブーストスケジュールに従った3群が含まれていた。3群には、sCPD9-∆FCS（104 FFU）を2回経鼻接種、mRNAワクチンBNT162b2（Comirnaty®、ファイザー・バイオンテック社製）5μgを筋肉内接種、または模擬ワクチンを2回経鼻接種した。

最初の試験では、ブースターワクチン接種の2週間後から、ワクチン接種を受けたハムスター2匹を1ケージあたり1匹の感染排出動物と同居させた。同居させる24時間前に、脱落ハムスターにSARS-CoV-2変種B.1またはオミクロン亜変種BA.5のいずれか105 FFUを全身麻酔下で経鼻投与した。2回目の実験では、2回目のワクチン接種から2週間後、ワクチン接種動物を麻酔して採血と感染を行った。採血後、SARS-CoV-2変種B.1またはオミクロン亜変種BA.5の105 FFUで経鼻的にチャレンジ感染させた。感染24時間後、ワクチンを接種し感染させた1匹を、1ケージあたり2匹のナイーブコンタクトハムスターと同居させた。両試験ともハムスターは6日間同居させた。この期間中、毎日口腔粘膜スワブを採取し、脱毛ハムスターおよび接触ハムスターの上気道のウイルス量を測定した。さらに、接触動物からは、排出動物と接触する前の接触後0日目に綿棒を採取した。体重および臨床状態は毎日評価した。接触後6日目にすべてのハムスターを安楽死させ、その後のウイルス学的、血清学的、および病理組織学的検査のために血液、鼻洗浄、口腔咽頭スワブ、肺、および頭蓋骨を採取した。

細胞
Vero E6（ATCC CRL-1586）およびVero E6-TMPRSS2（NIBSC 100978）細胞を、10％ウシ胎児血清（PAN Biotech）、100 IU/mlペニシリンGおよび100 mg/mlストレプトマイシン（Carl Roth）を含む最小必須培地（MEM）で培養した。TMPRSS2発現細胞の選択を確実にするため、Vero E6-TMPRSS2細胞用の培地にはさらに1000μg/mlのジェネティシン（G418）を加えた。CaLu-3 細胞（ATCC HTB-55）は、20％ウシ胎児血清（PAN Biotech）、1％非必須アミノ酸、100 IU/mlペニシリンG、100 mg/mlストレプトマイシン（Carl Roth）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、Gibco）で培養した。細胞はすべて37℃、5% CO2で培養した。

ウイルス
Vero E6細胞で増殖させたSARS-CoV-2変種B.1（B.1、hCoV-19/ドイツ/BY-ChVir-929/2020、EPI_ISL_406862）およびCaLu-3細胞で増殖させたオミクロン亜変種BA.5（BE.1.1、hCoV-19/ドイツ/SH-ChVir29057_V34/2022、EPI_ISL_16221625）を脱落ハムスターの感染に用いた。さらに、Vero E6-TMPRSS2細胞上で増殖させたデルタ変種B.1.617.2（B.1.617.2、ヒト、2021、ドイツ、インド、20 A/452 R、EVAg: 009V-04187）と、CaLu-3細胞上で増殖させたオミクロン亜変種BA.1（BA.1.18、hCoV-19/ドイツ/BE-ChVir26335/2021、EPI_ISL_7019047）を用いて血清中和アッセイを行った。感染実験の前に、すべてのウイルスストックの力価を測定するために、Vero E6細胞でプラークアッセイを実施した。バイアルは-80℃で保存した。

倫理声明
動物実験は、適用されるすべての国内および国際規制を遵守し、規制当局であるドイツ、ベルリンのLandesamt für Gesundheit und Sozialesの承認を得て実施した（許可番号0086/20）。すべてのin vitroおよび動物実験は、ドイツ・ベルリン自由大学のInstitut für Virologieの認定BSL-3実験室で行われた。

動物飼育
雄のシリアンハムスター（Mesocricetus auratus；品種RjHan:AURA）を5～7週齢でJanvier Labsから購入した。巣材を備えた個別換気ケージ（IVC；Tecniplast）で2～3匹の群に分けて飼育した。ワクチン接種に先立ち、7日間飼育環境に慣れさせた。ハムスターは常に水と餌に自由にアクセスできた。実験中、ケージの温度は22～24℃、相対湿度は40～55％であった。

ワクチンの調製と接種
生ワクチン候補sCPD9-∆FCSをVero E6-TMPRSS2細胞で増殖させた。力価はVero E6細胞を用いたプラークアッセイで決定した。ワクチン接種の前に、ストックを最終力価 2×105 FFU/ml に調整した。全身麻酔（0.15mg/kgメデトミジン、2.0mg/kgミダゾラム、2.5mg/kgブトルファノール）下で、1匹あたり104FFUの経鼻ワクチン接種を行った。

BNT162b2（Comirnaty®）は製造業者の説明書に従って調製した。mRNAの最終濃度は、ヒトでの使用に推奨される100μg/mlではなく、50μg/mlに希釈した。希釈液はワクチン接種の直前に0.9%NaCl滅菌水で調製し、ハムスター1匹あたり5μgを筋肉内に投与した。

模擬群には全身麻酔下で最小必須培地（MEM）を経鼻投与した。

鼻洗浄
鼻腔洗浄を行うために、鼻中隔の前方にある頭蓋骨をカニューレで穿刺した。その後、ピペットチップを挿入し、200μlのPBSを鼻腔内に静かに注入した。鼻孔から洗浄液を採取し、洗浄手順を2回繰り返した。1匹あたり約150μlの鼻腔洗浄液を採取した。

綿棒採取
実験期間中、ウイルス gRNA および sgRNA 負荷をモニターするため、すべてのハムスターから毎日口腔スワブを採取した。ただし、実験終了時（6 dpc）には、上気道のウイルスRNA検出感度を高めるため、毎日の口腔スワブに加え、口腔咽頭スワブも採取した。

RNA単離とRT-qPCR
肺組織からRNAを抽出するため、まず25mgの肺組織をビーズミル（Analytic Jena社製）でホモジナイズした。innuPREP Virus DNA/RNA Kit（Analytik Jena, Jena, Germany）を用いて、口腔スワブ、口腔咽頭スワブ、ホモジナイズした肺組織からRNAを単離した。全SARS-CoV-2 RNAは、フォワードプライマーE_Sarbeco_F1（ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT）を用いた定量的逆転写PCR（RT-qPCR）により定量した、リバースプライマーE_Sarbeco_R2（ATATTGCAGCAGTACGCACACA）、プローブE_Sarbeco_P1（FAM-ACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG/ZEN/-IBFQ）を用い、SARS-CoV-245のE遺伝子領域を標的とした。サブゲノムSARS-CoV-2 RNA転写物は、フォワードプライマーをSARS-CoV-216のリーダー配列を標的とするプライマーsgLeadSARSCoV2（CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC）に代えた以外は、同じアッセイを用いて定量した。アッセイは、NEB Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit（New England Biolabs）と以下のサイクリング条件を用いて、qTower G3 cycler（Analytik Jena）で行った：逆転写のために55℃で10分間、ポリメラーゼの活性化のために94℃で3分間、94℃で15秒間、58℃で30秒間を40サイクル。

プラークアッセイと間接免疫蛍光染色
50mgの肺組織中の複製コンピテントウイルス粒子数を測定した。定量化のために、肺サンプルをビーズミル（Analytik Jena）でホモジナイズし、MEMで連続希釈し、コンフルエントになったVero E6細胞を含む12ウェルプレートにプレーティングした。37℃、5% CO2で2.5時間後、接種液を除去し、1.5%の微結晶セルロースとカルボキシメチルセルロースナトリウム（Vivapur 611p; JRS Pharma）を含むEagle's Minimum Essential Medium (EMEM; Lonza™ BioWhittaker™)培地に細胞を重層した。感染から72時間後、プレートを4％PBS緩衝ホルムアルデヒドで固定した。

間接免疫蛍光染色を行うため、細胞を0.1% Triton X-100で透過処理し、PBSで希釈した3% BSAで30分間ブロックした。PBSでプレートを洗浄後、一次ポリクローナル抗SARSコロナウイルスヌクレオキャプシド抗体（Invitrogen）を1時間、続いてヤギ-抗ウサギIgG-AlexaFluor 488二次抗体（Invitrogen）を45分間添加した。力価を測定するため、倒立蛍光顕微鏡（Axiovert S100、Zeiss）を用いてプラークを数えた。

血清中和アッセイ
SARS-CoV-2変種B.1およびオミクロン亜変種BA.5に対する中和活性をすべてのハムスター血清で測定した（チャレンジ後0日、6dpc. さらに、デルタ変異体およびオミクロン亜変異体BA.1に対する中和能を6日目の血清サンプルで試験した。補体不活化（56℃で30分間）したハムスター血清の2倍連続希釈液（1:8～1:1,024）を96ウェルプレートに調製した。MEMで希釈した200 FFUのSARS-CoV-2を各ウェルに塗布し、37℃で1時間インキュベートした。その後、希釈液を96ウェルプレートで培養したVero E6細胞にプレーティングし、37℃で72時間（B.1、Delta）または96時間（Omicron BA.1、BA.5）培養した。その後、細胞をPBS緩衝ホルムアルデヒド（4％、pH6.5）で固定し、メチレンブルー（0.75％水溶液）で染色した。細胞病理学的効果を示さなかったウェルでは、中和は有効であるとみなされた。最後に中和されたウェルを力価として報告した。すべてのプレートに陽性対照と陰性対照が含まれていた。結果をプロットするため、中和活性のないサンプルは1:4の力価とした。

酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
B.1およびBA.5変異体のスパイクタンパク質、ならびにヌクレオカプシドおよびORF3aタンパク質に対するSARS-CoV-2特異的IgG濃度を、自社ELISAを用いてハムスター血清中で測定した。底が平らな透明な96ウェルプレート（MEDISORP、Thermo Fisher Scientific、カタログ番号：MW96F）に、精製、組換え、Hisタグを付けたSARS-CoV-2抗原5μlをコートした：B.1変種のスパイクタンパク質（D614G）（Acro Biosystems、カタログ番号：SPN-C52H3）、BA.5.5変種のスパイクタンパク質（GenBank: BA. .5変異体のスパイクタンパク質（GenBankアクセッション：QHD43416、Acro Biosystems、カタログ番号：SPN-C522p）、ヌクレオカプシドタンパク質（GenBankアクセッション：QHD43423、Ray Biotech、カタログ番号：230-01104）、およびORF3aタンパク質（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号：RP-87667）。抗原はPBSで最終濃度20μg/mlに希釈した。さらに、各ウェルに45μlのコーティングバッファー（50mM Na2CO3, 50mM NaHCO3, pH9.6）を加えた。プレートを4℃で12時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファー（PBS中0.05% Tween 20）で4回洗浄し、ブロッキングバッファー（PBS、1% BSA、10% FCS）で1時間ブロッキングした。血清サンプルを希釈バッファー（PBS、2% BSA、0.1% Tween 20）で1:100に希釈し、各ウェルに50μlずつ複製してプレートした。その後、プレートをRTで2時間インキュベートし、さらに洗浄した。次に、PBSで1:1000に希釈した二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ポリクローナルゴート抗ハムスターIgG(H + L)抗体(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号: PA129626)を各ウェルに50μlずつ添加した。RT で 1 時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄し、発色基質である 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB; TCI chemicals, カタログ番号: T3854)を各ウェルに 50 μl 添加した。反応は15分後に1M H2SO4で停止させた。SpectraMax Plus 384プレートリーダー（Molecular Devices社製）を用いて、450nmと570nmで光学密度を測定した。

さらに、B.1変異体およびBA.5変異体のスパイク蛋白に対するSARS-CoV-2特異的IgAレベルを、若干の修正を加えた上記のプロトコールに従って、鼻腔洗浄で測定した。鼻腔洗浄液を希釈バッファーで1:50に希釈し、二重にプレートした。IgAの検出には、ポリクローナルHRP標識ウサギ抗ハムスターIgA（Brookwood Biomedical、カタログ番号：sab3003a）を1：750に希釈し、二次抗体として用いた。RT で 1 時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、50μl の 1-StepTM Ultra TMB ELISA 基質溶液（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号：34028）を各ウェルに添加した。室温で 20 分間インキュベートした後、反応を停止した。すべてのアッセイに陽性対照と陰性対照を含めた。

病理組織学および免疫組織化学
病理組織学的解析のため、左肺葉と皮を剥いだ頭骨をPBS緩衝ホルムアルデヒド溶液（4％）で48時間固定した。頭骨を水道水で30分間洗浄し、緩衝EDTA溶液（pH＝7.0）で65℃、3日間脱灰した。硬口蓋の第一三角稜の先端で吻側の切片を、さらに第一大臼歯の高さで尾側の切片を得るために頭骨を切り取った。ルーチンでホルマリン固定、パラフィン包埋したサンプルから厚さ2μmの切片を切り出し、ヘマトキシリン・エオジンで染色するか、免疫組織化学用に調製した。肺切片の病理組織学的解析は、記載されたとおりに行った46。鼻の切片は、リンパ球、顆粒球、壊死、上皮の扁平化、繊毛の消失の有無について、0＝罹患した上皮の5％未満、1＝罹患した上皮の5～40％、2＝罹患した上皮の41～80％、または3＝罹患した上皮の80％以上として採点した。さらに、気道滲出液の特徴を調べた。免疫組織化学的解析のために、鼻切片はキシレンで脱脂し、エタノールの下級で再水和した。内因性ペルオキシダーゼはH2O2を用いてブロックした。抗原の回収は、1％Triton X-100（Roth）を加えた750mlのクエン酸緩衝液中で、切片を600Wのマイクロ波で12分間加熱することにより行った。一次モノクローナルマウス抗SARS-CoV/SARS-CoV-2ヌクレオキャプシドタンパク質抗体（Sino Biological, 40143-MM05、希釈度：1:500）を4℃で一晩インキュベートした。ユニバーサルネガティブコントロールとして、抗SARS-CoV-2抗体の代わりに無関係な精製マウスIgG（BioGenex）を用いて切片をインキュベートした。非特異的結合は20％ヤギ血清で30分間ブロックした。PBS/Tritonバッファーで洗浄後、二次抗体であるヤギ抗マウスIgG（Vector Laboratories、1:200で希釈）を適用し、30分間インキュベートした。Vectastain Elite ABC Kit（Vector Laboratories）を用いてシグナルを8分間増強した後、ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（Merck）で現像した。カウンターステインとしてヘマトキシリンを用いた。病理組織学的評価には、DP80 Microscope Digital Camera（Olympus）およびcellSensTM Imaging Software, Version 1.18（Olympus Soft Imaging Solutions）を搭載したOlympus BX41顕微鏡を使用した。自動デジタル化は、Aperio CS2 スライドスキャナー（Leica Biosystems）を用いて行った。顕微鏡写真は、Image Scope Software（Leica Biosystems）を用いて作成した。Adobe PhotoshopまたはGIMPソフトウェアを用いて図パネルを作成した。

統計
ウイルス学的所見、血清学的所見、および病理組織学的所見の統計解析は、Prism 10.1.0（GraphPad Software）を用いて行った。解析から除外されたデータはなく、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。代わりに、SARS-CoV-2のワクチン接種とシリアンハムスターへの感染に関する過去の経験に基づいてサンプルサイズを選択した。3Rの原則を遵守するため、本研究で使用した動物の数を、過去の研究で実験的に決定された最小限の数に減らした7,8,9,10。また、他の研究47,48の例も参考にした。これらの出版物は、選択したサンプルサイズが適切であることを示し、使用した動物数が研究に必要な最小限の数であったことを示す証拠となる。各データセットで実施した統計解析の詳細な説明は、それぞれの図解にある。動物試験は、盲検化された担当者による無作為化設定で実施された。

報告の要約
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
本研究で作成および/または解析されたデータセットは、論文本編に掲載されているか、補足データとして添付されている。ソースデータは本論文に掲載されている。

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参考文献のダウンロード

謝辞
本研究はRocketVax Inc.、DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft)、助成金番号OS 143/16-1（N.O.へ）、SFB-TR84 Z01b（A.D.G.およびJ.T.へ）から助成を受けた。我々は、生産的な議論とデータの交換のために、スイス国立科学財団（Swiss National Science Foundation）の資金提供による国家研究プログラム "Covid-19"（NRP 78）のワクチンコンソーシアムに感謝する。C. Thöne-Reinekeには動物福祉と飼育管理の面でお世話になった。European Virus Archive、Robert-Koch-InstitutのD. Bourquain、Charité BerlinのV. Corman、National Institute for Public Health and the EnvironmentのC. Reuskenには、本研究で使用したSARS-CoV-2変異体を提供していただいた。Vero E6-TMPRSS2細胞は英国NIBSC Research Reagent Repositoryより提供された。欧州連合（EU）のHorizon 2020 Research and Innovation Program-EVA-GLOBAL助成金871029は、SARS-CoV-2亜種の入手に資金を提供した。パネル1aと5aはBioRender.comで作成した。

資金提供
Projekt DEALによるオープンアクセス資金提供。

著者情報
著者ノート
これらの著者は共同で本研究を監修した： Dusan Kunec、Jakob Trimpert。

著者および所属
ベルリン自由大学ウイルス学研究所、ベルリン、ドイツ

Julia M. Adler, Ricardo Martin Vidal, Christine Langner, Daria Vladimirova, Azza Abdelgawad, Daniela Kunecova, Xiaoyuan Lin, Nikolaus Osterrieder, Dusan Kunec & Jakob Trimpert

重慶大学生命科学学院（中国・重慶市

林暁元・呉海波

ベルリン・シャリテ医科大学感染症・呼吸器・クリティカルケア科、ベルリン自由大学およびベルリン・フンボルト大学法人会員、ドイツ・ベルリン

ジェラルディーヌ・ヌアイユ

ベルリン自由大学病理学研究所（ドイツ・ベルリン

アンネ・ボス、サンドラ・クンダー、アヒムD.グルーバー

寄稿
Du. K.とJ.T.がプロジェクトの構想を練った。J.M.A.、R.M.V.、C.L.、D.V.、A.A.、G.N.、Da. K.、X.L.、A.V.、S.K.、Du. K.、J.T.が調査を行った。J.M.A.、G.N.、H.W.、A.V.、S.K.、Du. K.、J.T.がデータの解析と可視化を行った。A.D.G.、H.W.、J.T.はリソースを提供。N.O.、A.D.G.、J.T.は資金を獲得。J.T.はプロジェクトの管理を行った。A.D.G.、N.O.、Du. K.、J.T.がプロジェクトを監督した。J.M.A.、Du. K、J.T.が原案を執筆。著者全員が原稿を校閲・編集した。

筆者
Jakob Trimpert宛。

倫理申告
競合利益
この研究に関連して、ベルリン自由大学はsCPD9およびsCPD9-ΔFCSをワクチンとして使用する特許出願（PCT/EP2022/051215）を行った。この出願では、J.T.、N.O.、D.K.がsCPD9の発明者として名を連ねている。本特許出願は、sCPD9の科学的目的での使用を妨げるものではない。ベルリン自由大学は、sCPD9-ΔFCSのワクチンとしてのさらなる開発のため、ロケットバックス社と共同研究を行っており、研究費の助成を受けている。残りの著者は、競合する利害関係はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、本研究の査読に貢献してくださった匿名の査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

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転載と許可

この記事について
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この記事の引用
Adler, J.M., Martin Vidal, R., Langner, C. et al. 鼻腔内弱毒化SARS-CoV-2ワクチンはウイルス伝播を制限する。Nat Commun 15, 995 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-45348-2

引用文献のダウンロード

受領
2023年11月17日

受理
2024年1月17日

掲載
2024年02月02日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-024-45348-2

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