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末梢神経細胞の活性化がマイクロバイオームを形成し、腸内生理を変化させる

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リソース|43巻4号1139532024年4月23日
末梢神経細胞の活性化がマイクロバイオームを形成し、腸内生理を変化させる

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247%2824%2900281-X



ジェシカ・A・グリフィス 10
ブライアン・B・ユー 10
ピーター・トゥイ＝ブーン 11
ロブ・ナイト
ビビアナ・グラディナル
サルキス・K・マズマニアン 16
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脚注を表示オープンアクセス掲載:2024年3月21日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.113953

ハイライト

ChAT+およびTH+ニューロンは、マウスのENS内で異なる空間的構成を示す

ChAT+ニューロンとTH+ニューロンは腸内細菌叢の組成を異なって形成している

腸関連TH+ニューロンは腸の真菌コロニー形成を制御する

腸関連ChAT+ニューロンの活性化は、体液分泌と大腸運動を促進する。
概要
消化管は、腸神経系（ENS）の内在性ニューロンと中枢神経系および末梢神経節の外在性ニューロンによって支配されている。消化管には多様なマイクロバイオームも存在するが、ENSとマイクロバイオームとの相互作用はまだ十分に理解されていない。ここでは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）発現またはチロシンヒドロキシラーゼ（TH）発現の腸管関連ニューロンをマウスで活性化し、腸内微生物群集とその代謝産物、および宿主生理への影響を調べた。その結果、マルチオミクスのデータセットから、胆汁酸プロファイルや真菌のコロニー形成の調節など、マイクロバイオーム構造の形成における、個別の末梢神経サブタイプの広範な役割が支持された。生理学的には、ChAT+ニューロンまたはTH+ニューロンのいずれかが活性化されると便の排出量が増加するが、ChAT+ニューロンだけが活性化されると大腸収縮力が亢進し、下痢様の体液分泌が増加する。これらの知見は、末梢で活性化されたニューロンの特定のサブセットが、脳からのシグナルに関与することなく、マウスの腸内細菌叢と消化管生理を異なる形で制御していることを示唆している。
図抄録
図サムネイルfx1
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キーワード
腸神経系
末梢神経系
腸内細菌叢
腸運動
アッケマンシア・ムチニフィラ
コリン作動性
ノルアドレナリン作動性
ドーパミン作動性
研究テーマ
CP: 微生物学
CP：神経科学
はじめに
哺乳類の消化管は、交感神経系、副交感神経系、および感覚神経系に由来する約10万本の外在性神経線維を通じて神経信号を受け取り、伝達している3。腸管はまた、腸管内の2つの異なる区画、すなわち腸管神経叢と粘膜下神経叢に組織された1億個以上の固有ニューロンの広範なネットワークによって支配されている4。腸管神経系（ENS）を構成する腸管のニューロンは、消化5、免疫6、7、さらには複雑な行動8を含むプロセスに関与していることがマウスで明らかにされている。消化管の神経細胞と他の細胞種との相互作用は、ENSの多様な役割を浮き彫りにしている。例えば、腸管の神経経路は、腸内分泌細胞を通じて栄養感覚を調節し9、上皮バリアと粘膜免疫を調節し10,11,12、マイクロバイオームとダイナミックに相互作用する13,14。
コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）とチロシンヒドロキシラーゼ（TH）は、それぞれアセチルコリンとカテコールアミンの生合成における律速酵素であり、脳と末梢における神経伝達の重要な化学的メディエーターである。アセチルコリンは腸の主要な興奮性神経伝達物質であり、コリン作動性ニューロンはENSの60％を占め、腸の推進と分泌を媒介する。例えば、加齢に伴うENSのChAT+ニューロンの減少は、便秘や排便障害と一致している15,16。また、臨床研究では、抗コリン薬は便秘を引き起こし、コリン作動薬は下痢を引き起こすことが示されている20,21。疾患関連では、コレラ毒素がマウスの粘膜下ChAT+ニューロンの分泌過多と持続的な活性化を誘導する22,23。特性はあまり明らかにされていないが、TH+ニューロンおよびドーパミンシグナル伝達経路もまた、消化管運動に影響を及ぼすことが示されており24、パーキンソン病（PD）の患者におけるTH+ニューロンの損傷は、便秘の増加と相関する25,26。
運動および分泌運動機能に重要であることは知られているが、ChAT+およびTH+ニューロンは、GI生理学における役割について、まだ体系的に特徴付けられ、調べられていない。エフェクターを直接投与する必要性を回避するため、私たちは、ENSおよびマウスの他の末梢神経節に対する向性能を増強したアデノ随伴ウイルス（AAV）を全身投与した28。重要なことは、このベクターであるAAV-PHP.Sは中枢神経系に移行しないため、末梢の活性化と脳から腸へのシグナル伝達を切り離すことができることである。マウスの腸関連ChAT+およびTH+ニューロンを化学遺伝学的モジュレーター29で活性化すると、腸の転写およびプロテオミクス的ランドスケープが変化し、腸のメタゲノムおよびメタボロームも変化することがわかった。マルチオミクス解析により、宿主と微生物の詳細かつ複雑な相互作用が明らかになり、二次的な胆汁酸産生や真菌集団の制御など、興味深い関連性についての知見が得られるなど、腸内の多くの生物学的プロセスに対するニューロンの影響を予測することが可能になった。さらに、腸関連ニューロンの活性化が、運動や体液分泌などの消化管機能に顕著な影響を与えることも示した。この研究により、腸内環境と消化管生理の形成におけるChAT+およびTH+ニューロンの非脳内活性化の影響の違いが明らかになり、さらなる研究のためのリソースとして豊富なデータセットが得られた（https://doi.org/10.5281/zenodo.10525220, https://github.com/mazmanianlab/Griffiths_Yoo_et_al/）。
研究結果
ENSにおけるChAT+ニューロンとTH+ニューロンの空間的局在の違い
より高い解像度でマウスのニューロンをマッピングするため、我々は組換えAAVを用いてin vivoで腸管ニューロンを蛍光標識し、組織クリアリング技術を用いて無傷の消化管組織の可視化を高めた32,33,34。AAVカプシド変異体AAV-PHP.Sは、マウスの全身投与に最適化されており35 、ENSを含む末梢神経系（PNS）に対する向精神性を高めている28 。ENSの発現をさらに最適化するため、以前28に使用したCAGプロモーターを、遺伝子発現をニューロンに限定し28、後根神経節（DRG）などの末梢ターゲットでの発現を最小化することが示されているヒトシナプシン1（hSYN1）プロモーターに置き換えた。 36 オフターゲット効果を評価するため、GI機能に影響を及ぼすことが知られている様々な非ENS組織において、AAV-PHP.S送達hSYN1-mNeonGreenの発現をCAG-mNeonGreenの発現と比較した（図S1）。CNSでは、AAV-PHP.S-hSYN1は脳、脳幹、脊髄のニューロンを標識しなかった（図S3）。
我々は、hSYN1プロモーターの制御下で蛍光タンパク質（tdTomatoまたはmNeonGreen）をコードする遺伝子をAAV-PHP.Sにパッケージングし、全身投与したところ、汎神経タンパク質であるタンパク質遺伝子産物9.5（PGP9.5）に対する抗体で標識されたENS細胞の90％（±2.6％SD）が、小腸（SI）および結腸のウイルスで標識された神経細胞と共局在することを見出した（図1A）。1012ウイルスゲノム（vg）のAAV-PHP.S-hSYN1-mNeonGreenの単回全身注射は、腸間膜の近位および遠位の神経節など、ENSの空間的に多様な領域を標識するのに十分であった（図S4A）。ウイルス導入はSIと結腸全体で均一であったが、結腸内側の小さな（約1.5cm）セクションは、理由は不明であるが、一貫してうまく導入されなかったため、さらなる解析から除外された（図S4B）。
図サムネイルgr1
図1ENSにおけるChAT+ニューロン分布とTH+ニューロン分布
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ENSの一般的な構造を調べるため、複数の蛍光タンパク質をパッケージングしたAAV-PHP.Sプール（AAV-PHP.S-hSYN1-XFP）を野生型マウスに1回静脈内注射した（図1B）。SIの7つの領域と結腸の2つの領域の腸管神経叢と粘膜下神経叢において、神経細胞と神経節の数、および神経節の大きさ（すなわち、各神経節に含まれる神経細胞の数）を定量した（図S5A-S5F）。領域の長さは約1cmで、組織は2-3cmごとに採取した。SIでは、ニューロンと神経節の数は一般に腸管神経叢の遠位部に向かって増加し、一方、粘膜下神経叢ではその逆であった（すなわち、遠位部では近位部よりも数が少ない）（図S5AおよびS5B）。さらに、神経節の大きさ（すなわち神経節あたりのニューロン数）は、SI腸管神経叢の遠位領域で増加したが、これは粘膜下神経叢では観察されなかった特徴である（図S5C）。大腸神経叢の近位領域と遠位領域ではニューロン数は同程度であったが（図 S5D）、腸管神経節の数は増加し（図 S5E）、一方で各神経節のサイズは大腸遠位部で減少した（図 S5F）。興味深いことに、近位結腸の粘膜下ニューロンは組織内の自然なひだに局在していた（図1B、破線、下、右から2番目）。
ChAT+およびTH+ニューロンを可視化するために、それぞれの遺伝子プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼ（Cre）が発現するマウス系統を用い、導入遺伝子が反転してCre依存的に発現するように、二重反転配向（DIO）で導入遺伝子を持つウイルス構築物を操作した。ChAT-CreマウスまたはTH-CreマウスにAAV-PHP.S-hSYN1-DIO-XFPを導入したところ、ChAT+ニューロンは主に腸管神経叢に、TH+ニューロンは粘膜下神経叢に多く存在し、両方のニューロン集団が消化管の空間的に異なる層を占めることが観察された（図1C）。この効果を定量化すると、腸管神経叢のすべてのアッセイ領域で、TH+ニューロンよりもChAT+ニューロンの方が多かったが（図1D）、TH+腸管ニューロンの密度は遠位になるほど増加した（図1D；SI-1対SI-7で10倍増加；SI-7対SI-10/13/15で2倍増加）。対照的にSIでは、ChAT+粘膜下ニューロンよりもTH+ニューロンの方が多かった（図1E）。ENSの構造に関するこのような洞察を提供するだけでなく、抗体標識（深層への浸透には限界がある）を必要としない全組織イメージングのこのアプローチは、腸内の他の神経細胞や非神経細胞タイプのプロファイリングに広く役立つはずである。
腸関連ニューロンの活性化が腸内マイクロバイオームを再構築する
われわれが観察したChAT+ニューロンとTH+ニューロンのユニークな空間構成は、潜在的に異なる機能を示唆している。まず、AAV-PHP.S-hSYN1の特異性を、腸外性PNS神経節のTH染色によって調べたところ、DRGや頸動脈-結節神経節ではTH+細胞のトランスダクションは見られなかった（図S2BおよびS2C）。これらの末梢神経節にはChAT+ニューロンは存在しない（図S2C）37,38。先行研究では、AAV-PHP.S-hSYN1が、腸を支配することが知られている椎骨前交感神経節をトランスダクションすることが示されている39が、これらの神経節にもChAT+ニューロンは存在しない40。実際、椎体前交感神経節のニューロンの大部分はTH+である40,41。したがって、この原稿の残りの部分では、ENSのChAT+ニューロン、またはENSのTH+ニューロンに加え、椎体前交感神経節を支配するENSのTH+ニューロンを指して、「腸関連」という用語を使用する。
細胞特異的な神経細胞活性化のために、私たちは、hM3Dqと名付けられた、デザイナー創薬によってのみ活性化される活性化デザイナー受容体（DREADD）をコードするCre依存性の遺伝子構築体を採用した。hM3Dqは、この受容体に特異的な「デザイナー創薬」である化合物21（C21）にさらされたときに神経細胞活性化を誘導するように設計された、改変された神経伝達物質受容体である42。活性化DREADDとカルシウムセンサーGCaMP6fをコードするコンストラクトを導入したChAT-Creマウスの腸管摘出物を用いて、機能的な遺伝子導入と発現を検証したところ、C21投与後にカルシウム過渡と一致する蛍光の漸増が観察された（図S5G；ビデオS1）。

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ビデオS1. ChAT+で活性化された腸管ニューロンのカルシウムイメージング（図S5に関連
私たちは、腸における神経細胞の活性化が、腸内細菌叢の組成と群集構造に影響を与える可能性があると考えた。そこで、ChAT-CreマウスまたはTH-Creマウスに、活性化DREADDを持つウイルス（AAV-PHP.S-hSYN1-DIO-hM3Dq-mRuby2）または蛍光レポータータンパク質のみを発現するコントロールウイルス（AAV-PHP.S-hSYN1-DIO-mRuby2）を導入した。C21によるChAT+ニューロンまたはTH+ニューロンの活性化前と活性化後（C21投与2、6、10日目）に採取した糞便サンプルと、10日目に採取した終盲腸の内容物の縦断的シリーズについて、ショットガン・メタゲノミクスを実施した（図2A）。ChAT+活性化マウスでは、10日目の糞便および盲腸サンプルにおいてフェイスの系統多様性（すなわちα多様性）が劇的に減少し（図2B）、多くの微生物分類群の存在量が減少した（図2I-2K、S6、S7）。対照的に、TH+活性化マウスは、実験期間を通してコントロールと同様の系統的多様性を示した（図2B）。加重UniFrac距離と主配位分析（PCoA）を用いて微生物群集の構成（すなわちβ多様性）を決定したところ、糞便と糞便内容物の両方でChAT+活性化マウスと対照動物との間に区別が観察され、このシフトはTH+活性化マウスと対照動物からのサンプルには見られなかった（図2C-2H）。実験時間の経過とともに、VerrucomicrobiaはChAT+活性化マウスで有意に濃縮された（図2I）。有意に豊富な細菌分類群を探索するために、線形判別分析効果量（LEfSe）43を用い、有意に豊富な分類群の系統関係を描いたクラドグラムを作成した（図2J-2M）。この解析により、ChAT+活性化マウスで観察されたVerrucomicrobiaの増加は、Akkermansia muciniphilaという細菌種が牽引していることが明らかになった（図2Nおよび2O）。
図サムネイルgr2
図2腸関連ChAT+およびTH+ニューロンの活性化が腸内細菌叢を変化させる
キャプション
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メタゲノム解析は、微生物種の同定に加え、マイクロバイオームにおいて発現量の異なる遺伝子ファミリーやパスウェイを明らかにすることができる。TH+活性化マウスではなく、ChAT+活性化マウスでは、遺伝子ファミリーとパスウェイの両方のベータ多様性に変化が見られ、活性化から9日後に採取した糞便内容物でシフトが明らかになった（図2P-2S）。最も特徴的なのは、対照群では発現量が高く、ChAT+活性化マウスでは発現量が低下していることで、主にヌクレオチドの生合成・代謝やタンパク質の翻訳・輸送などの細菌プロセスに関連していた（図2P-2S、S7C、S7D）。このダウンレギュレーションは、ChAT+活性化マウスで観察された細菌α多様性の減少と一致している（図2B）。我々は、神経細胞の活性化が、ChAT+ニューロンとTH+ニューロンの効果にかなりの差異を伴いながら、群集、種、遺伝子レベルで腸内細菌叢を積極的に再構築していると結論づけた。
神経細胞刺激は腸内メタボロームに影響を与える
マウスと微生物の共代謝が密接に絡み合っていることを考えると、神経細胞の活性化に反応して観察された微生物のメタゲノムにおける変化から、腸内代謝産物のプロファイルにも変化があるだろうと予測された。そこで、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を用いてアンターゲットメタボロミクスを実施し、腸内の神経細胞活性化に伴う、糞便内容物および糞便中の分子変化を測定した。ChAT+およびTH+で活性化された神経細胞では、活性化されていない対照（DREADDなし）と比較して、最後のC21注入から1時間後に採取された糞便サンプルにおいて、メタボロームプロファイルの強い分離が観察された（図3Aおよび3B）。このように、ChAT+およびTH+腸関連ニューロンの標的活性化は、腸内メタボロームに強い影響を与えるようである。
図サムネイルgr3
図3腸関連ChAT+またはTH+ニューロンの活性化が宿主および微生物由来の管腔代謝物を変化させる
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これらのデータを文脈化するために、オープンアクセスのMSリポジトリと解析パイプラインであるGlobal Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)ツール45を適用した。GNPSにより、ChAT+活性化マウスとTH+活性化マウスの糞便内容物における、注釈付き分子と未注釈分子の代謝ネットワークが明らかになり（図3Cと3D）、対照サンプルと活性化サンプルで存在量に差がある代謝物を同定することができた。TH+ニューロンの活性化により、スペクトルが最もよく一致する代謝物は、リノエライジン酸（ID: 626）、オレアノール酸メチルエステル（ID: 378）、およびコプロポルフィリンI（ID: 739）であった。キサンチン（ID: 259）、ゲニステイン（ID: 846）、トランス-フェルラ酸（ID: 707）にスペクトル的に類似した代謝物は、TH+ニューロンの活性化により減少した（表S1）。
ChAT+活性化マウスとTH+活性化マウスの両方において、分子ネットワークは、胆汁酸分子ファミリーに属する化合物とその抱合体、およびアノテーションされていない類似体のレベル3アノテーション（Metabolomics Standards Initiative [MSI]46に基づく）から主に構成されていた（図3Cおよび3D）。一次胆汁酸は、宿主（マウス）のコレステロール生合成に由来する化学物質で、その後、腸内細菌によって二次胆汁酸に共代謝される47,48。興味深いことに、一次胆汁酸コール酸（ID：108、114、215、219、221、224、259）に最も近いスペクトルを持つ代謝物が、ChAT+活性化マウスの盲腸で有意に濃縮された（図3D～3F、表S1）。タウロコール酸（ID: 234および248）やタウロヒオコール酸（ID: 235）のような、タウロ共役一級胆汁酸にスペクトル的に類似した代謝物がさらに増加傾向にあった。逆に、ウルソデオキシコール酸（ID:13）、デオキシコール酸（ID:100）、β-ヒオデオキシコール酸（ID:1および143）および12-ケトデオキシコール酸（ID:19および138）のような二次胆汁酸および胆汁酸代謝物のスペクトルに一致する特徴は、ChAT+活性化マウスで減少した（図3D-3F）。これらのデータは、ChAT+ニューロンの活性化が、直接的または間接的に、一次胆汁酸分泌および／または二次胆汁酸への代謝を調節する可能性を示唆している。
神経細胞亜集団は腸管内腔プロテオームを異なる形で形成する
マウス、腸内微生物、食事から得られるタンパク質は、消化管で収束し、相互作用する49。我々は、C21最終処理から1時間後に採取した、ChAT+活性化マウスとTH+活性化マウス、およびコントロールマウスの糞便内容物の無細胞上清について、LC-MS/MSによる非標的ラベルフリープロテオミクスを行った（図2A）。ChAT+活性化マウスで観察された糞便中の胆汁酸代謝産物の増加と一致して、これらのマウスの盲腸におけるNiemann-Pick C1-like 1 protein (NPC1L1)の存在量の増加が報告された（図4A）。NPC1L1は腸管細胞の先端表面に発現しており、胆汁酸の前駆体である遊離コレステロールを盲腸から吸収するのに不可欠である50。GABAは中枢神経系における主要な抑制性神経伝達物質であるが、ENSにおける役割についてはほとんど知られていない。ChAT+活性化マウスの糞便内容物で最も有意に発現が上昇したタンパク質は、キモパシン（CTRL）、キモトリプシノーゲンB1（CTRB1）、膵リパーゼ関連タンパク質2（PNLIPRP2）などの膵消化酵素であった（図4A）。したがって、アップレギュレートされたタンパク質のネットワーク解析により、消化に関連するKEGGパスウェイがネットワークの大部分を占めることが明らかになった（図4B）。このことは、コリン作動性臓器神経が消化管から膵臓を含む消化器系の他の臓器にシグナルを送るという証拠と一致する4。膵臓のコリン作動性神経支配は、消化酵素の分泌やインスリン分泌などの膵臓機能の制御に重要な役割を果たしている53。
図サムネイルgr4
図4腸関連ChAT+またはTH+神経細胞の活性化は、宿主および微生物由来の管腔タンパク質を変化させる
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TH+腸関連ニューロンの末梢での活性化は、盲腸の内腔プロテオームも変化させた。特筆すべきことに、異なる量のタンパク質（padj. < 0.25）の88％（59個中52個）は、ChAT+活性化マウスで同定されたものとは異なっていた。その結果、TH+活性化マウスでは約90％（59個中53個）のタンパク質の発現が上昇したのに対し、ChAT+活性化マウスでは約18％（112個中20個）であった。このことは、異なる神経細胞サブセットの活性化が、消化管機能の相反する変化と関連していることを示唆している。TH+活性化マウスの糞便内容物には、より多くのネットワークノードと結合によって証明されるタンパク質間相互作用の増加のサインが観察された（図4D）。フィラミンB（FLNB）とスペクトリンβ鎖非赤血球1（SPTBN1）は、TH+ニューロンの活性化後に最も有意に濃縮されたタンパク質の2つであった（図4C）。54,55それに伴い、コートマータンパク質も増加傾向にあり（COPAとCOPB2）（図4C）、小胞を介した輸送は、変化した主要なタンパク質ネットワークの一つであった（図4D）。他の発現が増加したタンパク質相互作用ネットワークは、代謝経路、リボソーム活性、免疫系に関連していた（図4D）。例えば、免疫関連タンパク質である免疫グロブリン重合定数α（IGHA）（ChAT+活性化）、免疫グロブリン重合定数γ2C（IGHG2C）、補体成分3（TH+活性化）は上昇傾向にあった（図4Aおよび4C）。
おそらく最も興味深い観察は、TH+ニューロンの活性化に伴い、酸性哺乳類キチナーゼ（CHIA）が強く枯渇したことであろう（図4C）。キチンは真菌細胞壁の主要成分である天然の多糖類であるが56、腸管キチナーゼはマウスではあまり研究されていない。この結果を受けて、パン・プロテオミクスのデータセットを微生物タンパク質データベースと照合してみたところ、TH+ニューロンの活性化に伴うCHIAの存在量の減少に伴って、マイクロバイオーム中の真菌関連ペプチドが大きく増加していることが明らかになった（いずれかの微生物にマップされたペプチドの約59％）（図4E）。対照的に、真菌ペプチドはChAT+活性化マウスの内腔に濃縮されたペプチドの約0.4％を占めるに過ぎなかった（図4F）。残念ながら、私たちが用いたDNA抽出法が真菌に最適化されていなかったため、これらのプロテオミクスデータをメタゲノム解析で裏付けることはできなかった。しかし、これらの知見は、活性化TH+細胞のキチナーゼ産生の減少が、真菌タンパク質の劇的な増加と直接関連していることを示唆しており、将来実験的に検証されれば、マウスの腸関連ニューロンが腸内の真菌負荷を制御する回路を示すことになるであろう。
ChAT+およびTH+ニューロンの活性化は腸内トランスクリプトームを変化させる
観察された腸内細菌叢、プロテオーム、およびメタボロームへの変化を踏まえ、われわれはニューロンの活性化が腸内トランスクリプトームに及ぼす組織レベルの影響に興味を持った。そこで、最後のC21注射から1時間後に採取した遠位SIおよび近位結腸の1cmの組織について、定量的3′mRNAシーケンス技術であるQuantSeqを用いて遺伝子発現をプロファイリングした。即時型初期遺伝子（IEG）の急速で一時的な発現は、神経細胞活性の亢進の指標として広く用いられており57、Fos、Egr1、Jun、およびKlf2のIEGは、ChAT+-およびTH+-活性化マウスの両方のSIおよび結腸で同定された最も有意にアップレギュレートされた転写産物の一つであった（図5A〜5D）。これらのIEGはまた、免疫細胞58,59平滑筋細胞60や腸上皮細胞61のような高活性細胞タイプの成長や分化の際に発現が上昇することが知られている。
図サムネイルgr5
図5ChAT＋とTH＋の活性化を介したトランスクリプトーム変化
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遠位SIでは、ChAT+活性化マウス（162 DEGs）とTH+活性化マウス（165 DEGs）で、同程度の数の差次発現遺伝子（DEGs；padj. < 0.05）が見つかった（図5Aおよび5C）。しかし、制御の方向は異なり、ChAT+活性化によって約73%のDEGが上昇し（118のDEGが上昇、44のDEGが下降）、TH+活性化によって約58%のDEGが下降した（69のDEGが上昇、96のDEGが下降）。IEGもこの全体的なパターンに従い、ChAT+活性化マウスの遠位SIでは29個が発現上昇したが、TH+活性化マウスでは2個しか発現上昇せず（図5E）、3個（すなわち、Hbegf、Soca3、Mcl1）が発現低下した（図5C）。ChAT+活性化マウス（169の発現上昇と84の発現低下）とTH+活性化マウス（130の発現上昇と62の発現低下）の近位結腸では、同様の割合のDEGが発現上昇した（図5Bと5D）。TH+活性化マウスでは、真菌タンパク質が濃縮され、CHIAタンパク質のレベルが低下していることから、真菌に対する潜在的な免疫応答を調べたが、対照マウスと比較して明らかな炎症シグナルは認められなかった（表S3）。
DEGの細胞機能を知るために、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を用いた（図5F-5I；表S2）。注目すべきは、ChAT+活性化マウスの遠位SIで最も高度に濃縮された遺伝子オントロジー（GO）項が「平滑筋細胞増殖の制御」（図5F）であったのに対し、TH+活性化マウスでは「細菌に対する反応」（図5H）であり、プロテオミクスデータセットから示唆された免疫関連反応の増加と一致していたことである。結腸近位部では、ChAT+活性化マウスとTH+活性化マウスで同様のGOパスウェイが観察され（図5Gと5I）、トランスクリプトームシグネチャーは活性化ニューロンの文脈に依存する可能性が示唆された。SIでは、ChAT+ニューロンは主に腸管神経叢の筋細胞に隣接し、TH+ニューロンはSI遠位部の粘膜下神経叢で細菌に反応する上皮細胞や免疫細胞に隣接している（図1C-1E）。結腸では、どちらのニューロンサブセットも腸管神経叢に豊富である（図1D）。腸管神経叢と粘膜下神経叢の両方において、TH+ニューロンよりもChAT+ニューロンの活性化によってアップレギュレートされる経路の幅が広く、ChAT+ニューロンの活性化は、内皮細胞、上皮細胞、免疫細胞、脂肪細胞を含む消化管の多様な細胞機能に影響を与えることがわかった（図5G；表S2）。
ChAT+ニューロンおよびTH+ニューロンの活性化による機能的GI結果の違い
腸の神経細胞集団の活性化後に観察された反応の複雑さに触発され、我々は機能的なGI結果をアッセイすることにした。ChAT+とTH+の両神経細胞集団は、運動と分泌機能に重要であることが知られている17,27が、自由に行動する哺乳類における消化管生理学を研究するために、特別に調節されたことはなかった。ChAT+またはTH+腸関連ニューロンのいずれかを活性化すると、コントロールマウスと比較して、全腸通過時間が速くなり、糞便ペレットの排出量および糞便内容物の質量が増加した（図6A～6C）。これは、ChAT+腸管ニューロンが体液分泌に関与しているという文献の報告と一致している（図6D-6F）。1,21,22 この違いは、体液の分泌と吸収に大きく関与している粘膜下神経叢（図1）のほとんどの領域で、ChAT+ニューロンよりもTH+ニューロンの濃度が高いことを考えると、特に注目に値する。対照マウス（DREADDなし）にC21を9日間毎日投与しても、明らかな健康障害は起こらず、マウスは実験期間を通じて体重を維持した（図S6CおよびS6D）。TH+活性化マウスも体重を維持したが、ChAT+活性化マウスはわずかな体重減少を経験し、これは連続9日間の下痢様表現型を反映していると思われた。外因性神経支配がない場合の腸の運動性をさらに調べるため、我々は生体外システムで推進性の大腸移動運動複合体（CMMC）を分析した。C21投与によりChAT+ニューロンを活性化すると、運動複合体の移動がより頻繁になったが（図6G、6I、6J；表S4）、TH+ニューロンの活性化はCMMCに影響を与えなかった（図6H；表S4）。in vivoとex vivoで観察された結果の食い違いは、腸に投射している交感神経の椎体前部神経節にあるTH+ニューロンの活性化によるものかもしれない。
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図6活性化後のChAT+マウスとTH+マウスにおけるGI生理の違い
キャプション
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考察
20世紀初期の神経科学の先駆者たちは、モデルとしてENSに焦点を当てたが、最近の研究は脳が中心であり、中枢神経系に対する理解は、生体の他の神経系に対する理解を凌駕している。その結果、腸管内の神経細胞の構造と機能の多くの側面に関する基本的な知識は、まだ初歩的なものにとどまっている。15,21,22 ここでは、ENSに対する向精神性を高めたウイルス送達システムを用いて、マウス消化管全体のChAT+およびTH+ニューロンの分布をマッピングし、それらの末梢の活性化が生理機能と機能に及ぼす複雑な影響を調べた。この研究で用いたDREADDに基づく活性化パラダイムは、本質的に人為的なものであるが、その結果、神経細胞集団の役割が著しく異なることが明らかになり、ほぼすべての特徴（空間的分布、メタゲノム、代謝、転写、プロテオミクスプロファイル、さらには生理学的出力）が細胞タイプによって異なることが明らかになった。
我々が使用したAAV-PHP.Sというウイルスベクターは、DRGのようなPNSの他の神経細胞サブタイプを導入することができ、強力なユビキタスプロモーターによって導入遺伝子の発現を誘導することができる28。このオフターゲット効果を制限するために、我々はENS特異性を高める弱いプロモーターを使用し、GI組織と管腔に焦点を絞って解析を行った。こうして、既知のほとんどの外因性神経支配経路を除外することで、脳からのシグナル伝達とは無関係な、腸関連神経細胞活性化の細胞タイプ特異的効果を明らかにした。
腸は外部環境にさらされることで、食事性栄養素の吸収・消化、有害物質の排除、腸内感染からの保護、腸内細菌叢との連携など、多くの責任を負っている。腸管ニューロンにおけるChATの欠失はマイクロバイオーム異常症を引き起こすが62 、我々はChAT+ニューロンの活性化に特異的な腸内マイクロバイオームの組成プロファイル（メタゲノムおよびプロテオミクスの両方）の違いを観察した。A.muciniphilaは宿主由来の粘液を栄養源として代謝することから68、ChAT+活性化マウスで観察された管腔ムチンタンパク質や消化酵素の増加と一致する。特に興味深い宿主と微生物の相互作用は、TH+細胞の活性化によってもたらされた。CHIAタンパク質の発現が劇的に減少し、それに伴って真菌が増加したことから、神経回路が腸内の真菌集団を制御できることが示唆された。この興味深い宿主と微生物の相互作用が検証されれば、健康への影響が期待される。ENSの活性化は、大腸の運動性の変化、粘液産生の変化、粘膜免疫応答の調節、代謝と栄養の利用可能性の変化などに関与している可能性がある。
ヒトの腸内マイクロバイオームは肝臓と同程度の代謝能力を有している。したがって、マウスの腸生理学とマイクロバイオームの両方に対する変化が、腸内メタボロームに大きな影響を及ぼすことは驚くべきことではない。相互作用の顕著な例として、我々は、宿主と微生物の共代謝によって産生される分子である腸内胆汁酸のプールに対する広範な変化を報告した。TH+ニューロンではなく、ChAT+ニューロンの活性化は、コレステロール輸送に関与するNPC1L1の発現に影響を与えた。哺乳類では、コレステロールは一次胆汁酸産生の基質であり、その後、腸内細菌叢によって二次胆汁酸に代謝される。胆汁酸は、脂肪の吸収、69 腸の運動性、70 ホルモンシグナル伝達71 や免疫機能、72 神経症状において重要な役割を担っている。74,75,76,77,78 ENSが胆汁酸プールのレベルや構成にどのような影響を及ぼすかについては、さらなる研究が必要であるが、二次胆汁酸の合成を制御するプロセスを理解することは、全身の臓器系に影響を及ぼす可能性がある。
我々の研究は、特定の腸管ニューロンを選択的に活性化し、腸管内の様々な系統の細胞間のダイナミックな相互作用を探索する能力を与えることによって、ENSニューロンのトランスクリプトームに関する最近のシングルセルRNA配列決定（RNA-seq）研究79を補完するものである。重要なことは、我々が観察したトランスクリプトームの変化は、神経細胞の活性化による直接的または間接的な影響の結果である可能性があるということである。実際、ChAT+ニューロンやTH+ニューロンの活性化が誘導されると、消化管通過パターンや体液分泌パターンが急速に変化した。これは、上皮細胞や免疫細胞にフィードバックし、それらの遺伝子発現プロファイルを変化させる可能性のあるプロセスのほんの一部に過ぎない。さらにシングルセル解析を進めることで、腸の機能を調整するために協働する様々な腸細胞の役割を解明できるかもしれない。
ENSは、環境からの驚くほど多様な分子的合図に順応し、反応する。そして、腸は「第二の脳」と呼ばれる神経細胞の豊富なネットワークを持つ、最大かつ最も広範な内臓器官であるため、腸の全長と表面積を通じて、そのような反応をしなければならない80。不思議なことに、脳の多くの疾患も消化器症状と関連している。81,82,83,84,85 腸と脳をつなぐメカニズムや、それらが健康に及ぼす影響は活発な研究分野であるが、ENS内の神経細胞の活性化が及ぼす影響については、ほとんど未解明である。ここでは、脳からの入力から切り離された腸の内在性・外在性ニューロンの制御された活性化を可能にする実験系を確立し、活性化されたニューロン集団によって異なる腸内環境とその生理学における広範な変化を実証する。われわれが作成した2つの主要な腸関連ニューロン集団の活性化に関する広範なデータセットは、腸の生理学とマイクロバイオームとの間の複雑な関係を支配する、相互に関連した生物学的システムに関するさらなる研究のためのリソースとなるはずである。このアプローチを将来的に展開することで、腸の内外におけるニューロン結合のマッピングが可能になり、ENSが全身の組織とどのようにネットワークしているのかについての洞察が得られる。
研究の限界
ChAT-CreマウスにAAV-PHP.S-hSYN1を用いた同様の戦略により、心臓神経節のChAT+ニューロンも標識され、コリン作動性ニューロンの活性化が心拍数と血圧を低下させることが最近明らかになった86,87。心臓求心性ニューロンは、迷走神経と頸動脈-結節神経節を通じて脳へ、またDRGと脊髄を介した感覚経路でシグナルを伝達する88。心臓神経節から腸関連ニューロンへの直接的なシグナル伝達経路は知られていないが、中枢神経系が関与する間接的な経路によって腸が影響を受ける可能性はある。将来、AAVをさらに進化させることで、ENSに排他的なトロピズムを持つ血清型が生成され、腸関連神経細胞サブセットの内在性活性化と外在性活性化の機能を完全に分離できるようになるかもしれない。使用したhSYN1プロモーターは神経細胞でのみ発現を促進することが示されているため89,90、腸内分泌細胞（EEC）など他の細胞タイプの特性は明らかにしなかった。EECは腸神経細胞とシナプスを形成し、迷走神経を通じて腸から脳への感覚伝達に寄与することが最近明らかになった。これらの細胞は数日ごとに入れ替わり91、THやChATを発現することが報告されていないため、我々が観察した活性化誘発性表現型の主要な原因とは考えにくいが、その関与を完全に否定することはできない。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
ウサギ抗PGP9.5 Millipore Cat# AB1761-I, RRID:AB_2868444
ウサギ抗チロシン水酸化酵素 Abcam Cat# ab112, RRID:AB_297840
ウサギ 抗コリンアセチルトランスフェラーゼ Abcam Cat# ab178850, RRID:AB_2721842
マウス抗NeuN Abcam Cat# ab104224, RRID:AB_10711040
ロバ抗ウサギ Alexa 568 Thermo Fisher Scientific Cat# A10042, RRID:AB_2534017
ヤギ抗ウサギ Alexa 647 Thermo Fisher Scientific Cat# A-21245, RRID:AB_2535813
ヤギ抗マウス Alexa 594 Thermo Fisher Scientific Cat# A-11032, RRID:AB_2534091
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
化合物 21 二塩酸塩 (C21) HelloBio Cat# HB6124
重要な市販アッセイ
MagAttract PowerSoil DNA キット Qiagen Cat# 27100-4-EP
PicoGreen 蛍光アッセイ ThermoFisher Cat# P7589
QuantSeq 3′mRNA-Seq ライブラリー調製キット FWD for Illumina Lexogen Cat# 015
バイオアナライザー高感度 DNA キット Agilent Technologies Cat# 5067-4626 および -4627
寄託データ
メタゲノムデータ 本論文 EBIアクセッション ERP131523
メタボロームデータ UCSD MassIVE: MSV000084550
プロテオームデータ UCSD MassIVE: MSV000087917
QuantSeqデータ 本論文 GEO： GSE180961
実験モデル 細胞株
HEK293T/17 ATCC Cat# CRL-11268, RRID:CVCL_1926
実験モデル 生物／系統
マウス B6.129X1-Thtm1(cre)Te/Kieg(TH-cre)テッド・エベンダル92からの寄贈 RRID:MGI:3487234
マウス B6J.129S6-Chattm2(cre)Lowl/MwarJ (ChAT-cre) Jackson Laboratories ME- Stock# 028861, RRID:IMSR_JAX:028861
マウス C57BL/6 Jackson Laboratories ME- Stock# 000664, RRID:IMSR_JAX:000664
組み換えDNA
プラスミド AAV-PHP.S Gradinaru Lab Addgene プラスミド# 103006, RRID:Addgene_103006
プラスミド: hSYN1-tdTomato この研究は Addgene プラスミド# 99116, RRID:Addgene_99116 およびプラスミド# 99126, RRID:Addgene_99126 から採用した。
プラスミド：hSYN1-mRuby2 Gradinaru Lab Addgeneプラスミド# 99126, RRID:Addgene_99126
プラスミド：hSYN1-DIO-mRuby2 Addgene plasmid# 99126, RRID:Addgene_99126 より作成。
プラスミド CAG-mNeonGreen Gradinaru Lab Addgene plasmid# 99134, RRID:Addgene_99134 から改変。
プラスミド：hSYN1-mNeonGreen Gradinaru Lab Addgene プラスミド# 99135, RRID:Addgene_99135
プラスミド：hSYN1-DIO-mNeonGreen この研究はAddgeneプラスミド# 99125, RRID:Addgene_99135 から採用した。
プラスミド：hSYN1-mTurquoise2 Gradinaru Lab Addgene plasmid# 99125, RRID:Addgene_99125 より引用。
プラスミド：hSYN1-DIO-mTurquoise2 Addgene plasmid# 99125, RRID: Addgene_99125 より作成。
プラスミド：hSYN1-DIO-hM3Dq-mRuby2 この研究はAddgeneプラスミド# 50474 RRID:Addgene_50474およびAddgeneプラスミド# 99126, RRID:Addgene_99126から採用した。
プラスミド CAG-GCaMP6f Addgene plasmid# 100837 RRID:Addgene_100837 から導入した。
ソフトウェアとアルゴリズム
FIJI Schindelin et al.93 RRID:SCR_002285, https://imagej.net/software/fiji
R R Project for Statistical Computing RRID:SCR_001905, https://www.r-project.org/
Qiita Bolyen 他44 https://www.qiime2.org/
Bowtie2 Langmead and Salzberg94 RRID:SCR_016368, http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
HUMAnN2 v2.8.1 Franzosa et al.95 RRID:SCR_016280, https://huttenhower.sph.harvard.edu/humann2
QIIME 2 v.2019.10 Bolyen et al.44 RRID:SCR_021258
MetaPhlAn2 Truong et al.96 RRID:SCR_004915, https://huttenhower.sph.harvard.edu/metaphlan2
UniRef Suzek et al.97 RRID:SCR_010646, https://www.uniprot.org/help/uniref
Mzmine version 2.51 Pluskal et al.98 RRID:SCR_012040, https://mzmine.github.io/
MetaboAnalyst Xia et al.99 RRID:SCR_015539, https://www.metaboanalyst.ca/
Cytoscape v3.7.2 Shannon et al.100 RRID:SCR_003032, https://cytoscape.org/
Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) Wang et al.45 RRID:SCR_019012, https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp
UniProt The Uniprot Consortium101 RRID:SCR_002380, https://www.uniprot.org/
ComPIL 2.0 Park et al.102 https://github.com/robinparky/prolucidComPIL
ProLuCID/SEQUEST (1.4) Xu et al.103,104 http://fields.scripps.edu/yates
DTASelect2 (2.1.4) Cociorva et al.105 & Tabb et al.106 http://fields.scripps.edu/yates
CD-HIT 4.8.1 Fu ら 107 & Li ら 108 RRID:SCR_007105, http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/)
DESeq2 Love et al.109 1.25.13, RRID:SCR_015687, https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html
DEPパッケージ Zhang et al.110 RRID:SCR_023090, https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEP.html
STRING データベース Szklarczyk et al.111 RRID:SCR_005223, https://www.string-db.org/
BBDuk (BBTools) Bushnell et al.112 Bestus Bioinformaticus Duk, RRID:SCR_016969, https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/bbduk-guide/
HISAT2 Kim et al.113 バージョン 2.1.0, RRID:SCR_015530, https://daehwankimlab.github.io/hisat2/
HTSeq Anders et al.114 RRID:SCR_005514, https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.9.1/)
GraphPad Prism v9.2.0 グラフパッドソフトウェア RRID:SCR_002798, https://www.graphpad.com/
新しいタブで表を開く
リソースの有無
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトである Sarkis K. Mazmanian (sarkis@caltech.edu)までお願いします。
材料の入手可能性
本研究では新しい試薬は使用していない。
データおよびコードの利用可能性

微生物シーケンスデータはEuropean Bioinformatics Institute (ERP131523)に、メタボロームデータはUCSD MassIVE repository (MSV000084550)に、プロテオームデータはUCSD MassIVE repository (MSV000087917)に、QuantSeqデータはNCBI GEO repository (GSE180961)に、それぞれ寄託されており、発表日現在公開されている。本論文で報告された図を作成するために使用された他のすべての実験データは、(DOI:105281/zenodo.10525220, https://github.com/mazmanianlab/Griffiths_Yoo_et_al/)に掲載されており、公開日現在入手可能である。

本論文はオリジナルのコードを報告するものではない。

本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求があれば主担当者から入手可能である。
実験モデルと研究参加者の詳細
マウス
すべてのマウス実験は、カリフォルニア工科大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコールを用いて、NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行われた。マウスには実験期間中、自由食を与えた。ホモ接合TH-Cre（Ted EbendalよりV.G.に贈られた、B6.129X1-Thtm1(cre)Te/Kieg92）およびChAT-Cre（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME- Stock# 028861, RRID:IMSR_JAX:028861）マウスを野生型マウスと交配させ、我々の研究に用いた雌雄ヘテロ接合Creマウスを得た。野生型特定病原体フリー（SPF）C57BL/6（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME- Stock #000664 , RRID:IMSR_JAX:000664）の雌雄を繁殖および実験に用いた。実験には6～8週齢のマウスを用いた。
ウイルス産生
ウイルスは、Challisら、201939およびdx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzn6p5heに記載の方法を用いて産生した。簡単に述べると、ヒト胚性腎臓（HEK293T）細胞をpUCmini-iCAP-AAV-PHPでトリプルトランスフェクトした。 S、pHelperプラスミド、および以下のpAAVゲノムの1つをトリプルトランスフェクトした： hSYN1-tdTomato、hSYN1-mRuby2、hSYN1-DIO-mRuby2、hSYN1-mNeonGreen、CAG-mNeonGreen、hSYN1-DIO-mNeonGreen、hSYN1-mTurquoise2、hSYN1-DIO-mTurquoise2、hSYN1-DIO-hM3Dq-mRuby2、CAG-GCaMP6f。細胞は、DMEM＋Glutamax＋Pyruvate（Gibco, Gaithersburg, MD- Stock# 10569-010）＋5％FBS＋非必須アミノ酸（Gibco, Gaithersburg, MD- Stock# 11140-050）＋ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco, Gaithersburg, MD- Stock# 15070-063）で培養した。細胞および上清から8％PEG溶液（w/v）でウイルスを沈殿させ、15％、25％、40％、60％積層ヨウジキサノール勾配を用いた超遠心分離で精製した。
方法の詳細
AAVの全身投与
マウスを2%イソフルランで麻酔した。ウイルスを1x1012vgに凝集させ、滅菌PBSで100μLに再懸濁し、dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzn6p5heに記載されているように軌道後注射した。
消化管の神経活性化
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzp5p5q6を参照。これらの実験にはTH-CreマウスとChAT-Creマウスを用いた。"Activated "マウスはAAV-PHP.S-hSYN1-DIO-hM3Dq-mRuby2に感染させ、"Control Mice "はAAV-PHP.S-hSYN1-DIO-mRuby2に感染させた。これは、AAV-PHP.Sを介した発現と化合物21二塩酸塩（C21）（HelloBio, Princeton, NJ- HB6124）の影響の両方をコントロールするためであった。C21を3 mg/kgの用量で10日間連続して両群のマウスに腹腔内（i.p.）注射した。時系列実験用のマウスは、最初のC21投与後、オートクレーブ滅菌水を入れた滅菌ケージで単独飼育した。C21の注射は毎日同じ時間（午前10時）に行った。マウスは10日目の注射の1時間後に犠牲にした。
組織調製、免疫組織化学、画像化、定量化
手順はdx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzp6p5reに記述されている。100mg/kgのペントバルビタール（Euthasol - Virbac, Carros, France）をi.p.投与し、組織を30mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で灌流した後、PBS中の冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流した。消化管は4%PFAで4℃で一晩後固定し、PBS+0.025%アジ化ナトリウムで保存した。その後の免疫組織化学を受けた組織は、Treweekら、2015のように、受動的CLARITY法（PACT）によって透明化した33。簡単に言えば、灌流・固定した組織を重合4％（w/v）アクリルアミドで包埋し、8％（w/v）SDS溶液を用いて脂質を除去した。頚結節神経節および後根神経節の組織は、PBS中の10%スクロース、次いで30%スクロースでそれぞれ1日間凍結保護した。組織はOCTで包埋・瞬間凍結し、クライオスタットで40μMの切片に切り出した。脊髄と脳の組織はビブラトームで50μMの切片にした。組織は3％ロバ血清でブロックし、PBS＋0.3％トリトン（PBST）で透過処理した。一次抗体をPBST中で48時間インキュベートし、PBSTで24時間洗浄した（洗浄液を3回交換）。次に組織を二次抗体（およびDAPI）で24時間インキュベートし、PBSで48時間洗浄した。一次抗体にはウサギ抗PGP9. 5（1:300、Millipore Cat# AB1761-I、RRID:AB_2868444）、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（1:500、Abcam Cat# ab112、RRID:AB_297840）、ウサギ抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（1:250、Abcam Cat# ab178850、RRID:AB_2721842）、マウス抗NeuN（1:300、Abcam Cat# ab104224、RRID:AB_10711040）。使用した二次抗体は、ロバ抗ウサギAlexa 568（Thermo Fisher Scientific Cat# A10042、RRID:AB_2534017）、ヤギ抗ウサギAlexa 647（Thermo Fisher Scientific Cat# A-21245（A21245も）、RRID:AB_2535813）、ヤギ抗マウスAlexa 594（Thermo Fisher Scientific Cat# A-11032、RRID:AB_2534091）。ウイルス発現の内因性蛍光を画像化したGI組織は、Hamaら、2015と同様に、ソルビトールベースの光学的クリアリング法、ScaleSを用いて透明にした32。組織は、0.5mmスペーサー（iSpacer、SunJin Lab Co.）付きのスライドグラス上の方法に応じたマウント培地（RIMSおよびScales S4）にマウントした。画像はZeiss LSM 780または880で取得し、顕微鏡、レーザー設定、コントラスト、ガンマは、直接比較する画像間で一定に保った。すべての共焦点画像は以下の対物レンズで撮影された： Fluar 5 × 0.25 M27 Plan-Apochromat, 10 × 0.45 M27 (working distance 2.0 mm) and Plan-Apochromat 25 × 0.8 Imm Corr DIC M27 multi-immersion. 各神経節の神経細胞は、色のはっきりした細胞を数えることでカウントした。大腸神経節は3個以上の神経細胞の幅で区切られているものを明瞭な神経節と定義した。
生体外腸管標本におけるGCaMP6f蛍光
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzqap5seに記載されているように、小腸組織をChAT-Creマウスから素早く採取し、洗浄後、酸素添加（95％O2、5％CO2）した氷冷Krebs-Henseleit溶液に1時間、その後室温で15分間置いた。腸間膜の付着部に沿ってセグメントを切断し、酸素添加したKrebs-Henseleit溶液中でシルガードライニングを施した記録チャンバー（Warner Instruments社製、PH1）に平らに固定した（粘膜は下向き）。C21を10nMで添加し、GCaMP6f蛍光を正立顕微鏡（Zeiss, Oberkochen, Germany- Examiner D1）で検出した。
メタゲノミクス
手順はdx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzqep5teに記述されている。
糞便採取
AAV-PHP.S-hSYN1-DIO-hM3Dq-mRuby2（1012vg）をTH-CreマウスおよびChAT-Creマウスに全身投与した。感染3-4週後にC21（3 mg/kg）を10日間連日投与した。初回C21投与の1日前、および注射2日目、6日目、10日目に糞便ペレットを滅菌容器に採取した。
糞便サンプルDNA抽出およびライブラリー調製
このプロトコールは、反応あたり1 ng DNAのインプット量に最適化されている。ライブラリー調製の前に、インプットDNAを384ウェルプレートに移し、PicoGreen蛍光アッセイ（ThermoFisher, Inc）を用いて定量した。入力DNAは、Echo 550 acoustic liquid-handling robot (Labcyte, Inc)を用いて、3.5μLの分子グレードの水中で1ngに正規化した。断片化、末端修復、A-tailing、ライゲーション、PCR用の酵素ミックスを調製し、Mosquito HVマイクロピペッティングロボット（TTP Labtech社製）を用いて約1:8の容量で添加した。フラグメンテーションは37℃で20分間、続いてエンドリペアとA-tailingを65℃で30分間行った。
シーケンスアダプターとバーコードインデックスは、iTruアダプタープロトコールに従って2段階で添加した116。ユニバーサル「スタブ」アダプター分子とリガーゼミックスを、まずMosquito HVロボットを用いて末端修復したDNAに添加し、20℃で1時間ライゲーションを行った。その後、未ライゲーションのアダプターとアダプターダイマーを、AMPure XP磁気ビーズとBlueCat精製ロボット（BlueCat Bio）を用いて除去した。7.5μLの磁性ビーズ溶液を、アダプターをライゲーションした総サンプル量に加え、70% EtOHで2回洗浄し、7μLの分子グレードの水に再懸濁した。
次に、Echo 550ロボットを用いて、アダプターで固定したサンプルにi7とi5をそれぞれ添加した。このリキッドハンドラーはウェルに個別に対応し、384個のユニークなエラー補正i7およびi5インデックスのフルセットを使用したため、バーコードを繰り返すことなく384個のライブラリーの各プレートを作製することができ、バーコードのスワッピングによる配列のミスアサイメントの問題を排除することができた117,118。必要であれば、異なるプレートで作製したライブラリーをプールできるようにするため、また、ラン間のサンプルのキャリーオーバーによる汚染の可能性を防ぐため、i7とi5のインデックスの割り当てをランごとに繰り返し、各独自のi7:i5インデックスの組み合わせが、147,456ライブラリーごとに1回だけ繰り返されるようにした。溶出したビーズ洗浄ライゲーションサンプル4.5μLをPCRマスターミックス5.5μLに加え、15サイクルPCR増幅した。増幅されインデックス化されたライブラリーは、磁気ビーズとBlueCatロボットを用いて再度精製され、10μLの水に再懸濁され、最終精製ライブラリー9μLが、ライブラリー定量、配列決定、保存のためにMosquito HV液体処理ロボットを用いて384ウェルプレートに移された。384サンプルはPicoGreen蛍光アッセイに基づいて正規化された。
シャローショットガンメタゲノムシーケンスと多様性解析
各HiSeqレーンのイルミナデータを、メタゲノムデータの処理と解析のための標準化されたパイプラインを持つツールであるQiitaにアップロードした119。Atropos v.1.1.15（RRID:SCR_023962, https://github.com/jdidion/atropos）120コマンド（qp-shogun 0.1.5パイプラインから）を用いてリードからアダプター配列を除去し、トリミングした配列をQiitaからダウンロードした。各サンプルのリードは、Bowtie2 v.2-2.2.394 (RRID:SCR_016368, https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)を用いて、マウスのコンタミネーションの可能性がないようにフィルターした。WoLには10,575の細菌および古細菌ゲノムが含まれ、各ゲノムはOTU（operational taxonomic unit）を表す。単一の参照ゲノムにマップされなかったシーケンスリードや複数のゲノムにマップされたリードは解析に含まれなかった。OTUの相対存在量があるサンプルで0.01%未満の場合、そのOTUはそのサンプルに含まれなかった。さらに、割り当てられたリード数が5未満のOTUは考慮されなかった。サンプルは12,750リードの深さまで希釈され、希釈深度未満のものは除外された。QIIME2 v.2019.744 (RRID:SCR_021258, https://qiime2.org/)のDEICODEプラグインを使用して、Aitchison距離、構成β多様性指標を計算し、Robust Aitchison PCAを実行して、特徴とサンプル間の関係を可視化するバイプロットを作成した123。QIIME2の多様性プラグインを使用して、本研究で使用した他のαおよびβ多様性指標を計算した。
メタゲノミクスに基づく機能プロファイリング
フィルター処理したリードは、HUMAnN2 v2.8.195 (RRID:SCR_016280, https://huttenhower.sph.harvard.edu/humann2)を用いて解析し、サンプルの機能プロファイルを確立した。HUMAnN2は、MetaPhlAn2を用いて、サンプルで検出された生物種に基づいた参照ゲノムのカスタムデータベースをコンパイルすることから始まるパイプラインである96。HUMAnN2は次に、フィルターされたリードをこれらのカスタムデータベースにマップし、どの参照にもマップされなかったリードは、UniProt Reference ClustersまたはUniRef97（RRID:SCR_010646, https://www.uniprot.org/help/uniref）に対して翻訳検索される。ここでは、UniRef90データベースを翻訳検索に使用し、HUMAnN2のドキュメントに従ってインストールした。カスタムリファレンスゲノムデータベースを用いて行った検索とUniRef90データベースに対する検索の両方の結果を組み合わせ、各サンプルで同定された遺伝子ファミリーを、遺伝子の長さを考慮するためにReads per kilobase (RPKs)の単位で報告した。HUMAnN2はまた、サンプルで見つかった遺伝子ファミリーをMetaCycパスウェイデータベース124 (RRID:SCR_007778, https://metacyc.org/)と比較し、各サンプルで見つかったパスウェイのアバンダンスを報告するテーブルを出力した。遺伝子ファミリーのテーブルを166,000 RPKの深さまで希釈し、パスウェイ存在量に22,600の深さを使用した後、QIIME2多様性とDEICODEプラグインを使用して、アルファ多様性とベータ多様性のメトリックスを計算した。この研究のメタゲノミクスデータは、以下のサイトから入手できる。
(https://github.com/mazmanianlab/Griffiths_Yoo_et_al/tree/main/metagenomics）。
メタボロミクス
手順はdx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzqfp5tnに記述されている。
サンプル調製
メタボロミクス解析のために、凍結した糞便サンプルをドライアイスで輸送した。サンプルを秤量し、抽出溶媒（1:1メタノール/水、内部標準物質1μMスルファメタジン）を1:10mg/マイクロリットルの割合で添加した。その後、TissueLyser II（Qiagen）を用いて25 Hzで5分間ホモジナイズし、14,000 rpmで15分間遠心した。上清120μLを96ウェルDeepWellプレート（Eppendorf）に移し、CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator（Labconco）を用いて凍結乾燥し、-80℃で保存した。データ取得時に、凍結乾燥したプレートを、1μMのスルファジメトキシンを添加した1：1メタノール/水溶媒に懸濁した。プレートを2分間ボルテックスし、14,000rpmで15分間遠心し、上清120μLを96ウェルオートサンプラープレート（Eppendorf）に移した。プレートはLCMS分析前に4℃で保存した。
データ取得
超高分解能四重極飛行時間型（qTOF）質量分析計（Bruker Daltonics MaXis HD）と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーシステム（Thermo Dionex Ultimate 3000 UHPLC）を使用して、非標的メタボロミクス分析を完了しました。クロマトグラフィー分離にはPhenomenex Kinetexカラム（C18 1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm）を使用した。各サンプルには5μLの注入量を使用し、分析中は0.500mLの流量を使用した。移動相は、溶媒A：0.1％ギ酸を添加した100％LC-MSグレードの水、溶媒B：0.1％ギ酸を添加した100％LC-MSグレードのアセトニトリルで構成された。クロマトグラジエントは以下の通り： 0.0-1.0分、5%B; 1.0-9.0分、5-100%B; 9.0-11.0分、100%B; 11.0-11.5分、100-5%B; 11.5-12.5分、5%B。データはエレクトロスプレーイオン化でポジティブモードで収集され、.dファイルフォルダとして保存された。
データ処理
raw.dデータファイルは、Bruker Compass DataAnalysis 4.1ソフトウェアを用いてmzXML形式に変換した。得られた.mzXMLファイル、元の.dファイルフォルダ、およびプレパレーション基本情報シートは、UC San Diego MassIVEデータリポジトリにアクセッション番号MSV000084550で保存されています。MS1 レベルの特徴検出には、オープンソースのソフトウェア MZmine version 2.51 (RRID:SCR_012040, https://mzmine.github.io/) を使用しました。使用したパラメータは以下の通り： 1) Mass Detection (Centroid, Noise Level MS1 1E3, MS2 1E2); 2) ADAP Chromatogram Builder (Min Group size in # of scans = 3, Group Intensity Threshold = 3E3, Min Highest Intensity = 1E3, m/z tolerance 0.01 m/z or 10. 0 ppm）；3）クロマトグラムデコンボリューション（ローカルミニマムサーチ＞クロマトグラフィーのしきい値0.01％、RT範囲の最小値0.50分、＜最小相対高0.01％、最小絶対高3E3、ピークトップ／エッジの最小比2、ピーク持続時間範囲0.05-0. 50 min; m/z Calculation Auto, m/z range for MS2 pairing 0.01 Da, and RT Range for MS2 Pairing 0.1 min); Isotopic Peaks Grouper (m/z Tolerance 0.01 m/z or 10.0 ppm, Retention Time Tolerance 0.3 min, Maximum Charge 4, Representative Ion Most Intense); Join Aligner (m/z Tolerance 0. 01m/zまたは10.0ppm、m/z 75に対する重み、保持時間許容差0.3分、RT 25に対する重み）、ギャップ充填ピークファインダー（強度許容差20%、m/z許容差0.005m/zまたは10.0ppm、保持時間許容差0.2分）。得られたフィーチャーテーブルは、GNPSとMetaboAnalystで使用するために.csvファイルと.mgfファイルとして保存された。
分子ネットワーキングと統計解析
分子ネットワーキングは、Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS, RRID:SCR_019012, https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp) portal:https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/index.jsp?params={"workflow":"FEATURE-BASED-MOLECULAR-NETWORKING","library_on_server":"d.speclibs;"}で利用可能なフィーチャーネットワーキングツールを用いて行った。
このワークフローで得られたアノテーションは、MSI レベル 2 または 3 に分類され、特徴解析に使用された46。簡単に説明すると、レベル 2 の化合物は仮にアノテーションされたもので、化学的な参照標準を使用した同定ではなく、物理的特性および/または利用可能なスペクトルライブラリ（一般に入手可能なものと購入した NIST17 CID）とのスペクトル類似性に基づいていることを意味する。レベル 3 化合物は、レベル 2 化合物と同様に同定された化合物の仮特性クラスである。オープンソースソフトウェアMzmine version 2.5198 (RRID:SCR_012040, https://mzmine.github.io/)を用いて作成した特徴量テーブルに関連するスペクトルを解析するために、GNPS125上の特徴量ベース分子ネットワーキングのワークフローを利用した。ワークフローの実行には、MZmine v2.51からの.mgfと.csv出力を使用した。使用したGNPSワークフローのパラメータは以下の通り： Precursor Ion Mass 0.02Da、Fragment Ion Mass Tolerance 0.02Da、Min Pairs Cos 0.7、Minimum Matched Fragments 6、Maximum Shift Between Precursors 500Da、Network TopK 10、Maximum Connected Component Size (Beta) 100、ファイルは行合計で正規化。その他の設定にはデフォルトのパラメータを使用した。可視化と統計解析は、QIIME 2 v.2019.1044 (RRID:SCR_021258), MetaboAnalyst99 (RRID:SCR_015539, https://www.metaboanalyst.ca/), Cytoscape v3.7.2100 (RRID:SCR_003032, https://cytoscape.org/) を用いて行いました。本研究のメタボロミクスデータは以下のサイトから入手できます。
(https://github.com/mazmanianlab/Griffiths_Yoo_et_al/tree/main/metabolomics）。
プロテオーム調製
手順はdx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzqcp5swに記載されている。
タンパク質抽出
C21最終投与1時間後にマウスを犠牲にし、糞便内容物を単離し、400μLのリン酸緩衝液に再懸濁し、20,000xgで遠心分離して細胞をスピンダウンし、溶解液を得た。得られた上清から、Wessel-Flüggeのメタノール／クロロホルム抽出法（Wessel and Flügge, 1984）を用いてタンパク質を単離した。簡単に言うと、MeOHとクロロホルムをそれぞれ4:1と1:1の割合でサンプルに加えた。次にdH2Oを3:1の割合で加え、サンプルをボルテックスし、20,000 xgで遠心分離した。得られた沈殿タンパク質を回収し、MeOHで洗浄した。沈殿したタンパク質を遠心分離し、風乾した後、タンパク質消化まで-20℃で保存した。
溶液中でのタンパク質消化と脱塩
沈殿させたタンパク質サンプルを40μLの8M尿素（100mM Tris-HCl pH 8.5）で変性させた。ジスルフィド結合を還元するために、1.25μLの100mM Tris(2-カルボキシエチル)ホスフィンを加え、室温(RT)で20分間インキュベートした。その後、1.8μLの250mMヨードアセトアミドを加え、暗所でRTインキュベートし、システインをアルキル化した。消化の第一段階は、0.1μg/μLのリシルエンドペプチダーゼを1μL加えることで開始した。4時間のインキュベーション後、120μLの100mM Tris-HCl pH8.5を加えて尿素濃度を2Mに調整した。消化の第二段階は、2μg/μLのトリプシン2.5μLと100mM CaCl2 1.6μLを加え、暗所で一晩インキュベートした。ギ酸を加えてトリプシン消化を停止させた。消化されたペプチドは、C8ペプチドマイクロトラップ（Microm Bioresources）を用いてHPLCで脱塩し、凍結乾燥し、LC-MS/MS分析の前に0.2%ギ酸で200ng/μLに希釈した。
LC-MS/MS
サンプルはQ Exactive HF Orbitrap質量分析計とEASY nLC 1200液体クロマトグラフィーシステム（Thermo Scientific, San Jose, CA）を組み合わせて分析した。約200 ngのペプチドを、ReproSil-Pur C18-AQ 1.9 μm（Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany）を自社で充填した、10 μmエレクトロスプレーチップ（New Objective, Woburn, MA製PicoFrit）を備えた内径50 μm × 25 cmのカラムにロードした。溶媒Aは0.2% FA中2% MeCN、溶媒Bは0.2% FA中80% MeCNであった。分析用のペプチドを分離するために、2%Bから40%Bまで60分間の非線形グラジエントを使用した。質量分析計はデータ依存モードで操作され、MS1スキャンは400から1650 m/zまで60,000の分解能で収集され、MS/MSスキャンは200から2000 m/zまで30,000の分解能で収集された。45秒の動的排除が用いられた。荷電状態が2～5の最も豊富なペプチド上位12種を選択し、正規化コリジョンエネルギーを28としてフラグメンテーションを行った。
ペプチドとタンパク質の同定
Thermo.rawファイルは、データ依存モードで動作するRawConverter 1.1.0.18を使用し、モノアイソトピックm/zを選択して、.ms1および.ms2ファイルに変換しました。タンデムマススペクトル（.ms2ファイル）は、Integrated Proteomics Pipeline 6.5.4 (IP2, Integrated Proteomics Applications, Inc., http://www.integratedproteomics.com)を用いたデータベース検索法により同定した。タンデムマススペクトルは、ProLuCID/SEQUEST（1.4）103,104ソフトウェアパッケージを用いて、ペプチド配列にマッチさせた。スペクトル-ペプチドのマッチングの妥当性は、DTASelect2（2.1.4）105,106ソフトウェアパッケージのSEQUEST定義パラメータXCorr（相互相関スコア）およびDeltaCN（相互相関スコアの正規化差）を用いて評価した。検索設定は以下のように設定した： (1)プリカーサーイオンの質量許容差5ppm、(2)フラグメントイオンの質量許容差10ppm、(3)ペプチドの偽発見率1%、(4)タンパク質あたり最小2ペプチド、(5)600-6000 Daのプリカーサー質量ウィンドウ、(6)ペプチドあたり最大2差分修飾（メチオニン酸化：M+15. 994915 Da）、（7）ペプチドあたり無制限の静的修飾（システインのカルバミドメチル化：C+57.02146 Da）、および（8）検索空間には、無制限（マウスデータベース、カスタムメタゲノムショットガンデータベース）または2つのミス切断イベント（ComPIL 2.0）を持つハーフトリプシンおよび完全トリプシン（K残基およびR残基へのC末端切断）ペプチド候補が含まれた。
ペプチド-スペクトルマッチ（スペクトルカウント）を用いた検出タンパク質の差分解析
検出されたタンパク質は、CD-HIT 4.8.1 (RRID:SCR_007105, http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/)107,108,128を用い、配列の類似性により以下の類似度カットオフで「クラスター」にグループ分けした： 65%、75%、85%、95%。以下はコマンドライン入力の例である： 「cd-hit -i fastafile.fasta -o outputfile -c 0.65 -g 1 -d 0"。ペプチドとして同定されたタンデムマススペクトル（ペプチドスペクトルマッチ、PSM）は、CD-HITが生成したクラスターにマッピングされました。1つ以上のクラスターにマッピングされたPSMは破棄された。クラスター-PSMテーブルが作成され、DESeq2（1.25.13, RRID:SCR_015687, https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）で差分解析が行われた。109 簡単に言うと、カウントデータ（PSM）は負の二項分布を用いてモデル化され、平均-分散の関係が推定された。分散は情報共有法を用いて推定され、1つの特徴（またはクラスター）の分散は、同じ実験で測定された他のクラスターの分散を考慮して推定された。特徴量の有意性判定と順位付けは、推定された効果量を用いて行った。多重検定補正はDESeq2パッケージのBenjamini-Hochberg法で行った。ボルケーノプロットはPrism（GraphPad）で作成した。
イオン強度（前駆体強度）を用いた検出タンパク質の差分解析
検出されたタンパク質は、CD-HIT 4.8.1107,108,128を用い、以下の類似度カットオフで配列類似度による「クラスター」にグループ分けした： 65%、75%、85%、95%。以下はコマンドライン入力の例である： 「cd-hit -i fastafile.fasta -o outputfile -c 0.65 -g 1 -d 0"。Censusソフトウェアパッケージ129（Integrated Proteomics Pipeline 6.5.4）を使用して、.ms1ファイルからペプチドイオン強度を計算しました。ペプチドのイオン強度を親ペプチドに割り当て、親ペプチドを適切なCD-HIT生成クラスターにマッピングした。1つ以上のCD-HITクラスターにマッピングされた親ペプチドに属するイオン強度は破棄された。クラスター-イオン強度表が作成された。
イオン強度データはRで動作するDifferential Enrichment analysis of Proteomics data DEP package (RRID:SCR_023090, https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEP.html)110 を用いて解析した。強度値はDEPで自動的にLog2変換された。その後、'filter_proteins'関数を用いて、閾値65%以上の欠損値を持つクラスターを除外するように、クラスターのリストをフィルタリングした。残りの強度は'normalize_vsn'関数でさらに変換した。対照群または治療群のいずれかがヌル項目のみを含むクラスターは、'missing not at random'（MNAR）として分類され、0値でインプットされた。他のすべてのグループは「missing at random」（MAR）として扱われ、最尤法（「MLE」）を用いてインプットされた131。与えられたクラスターについて、治療グループの欠損値は治療グループごとに別々にインプットされたことに留意されたい。差次的発現解析は、'test_diff'関数132 を用いて、充填されたクラスター-イオン強度表に対して実行され、多重検定補正は'add_rejection'関数を用いて実行された。
STRINGデータベースを用いたネットワーク解析
公称p値<0.2のアップレギュレートタンパク質をSTRINGデータベース111 (RRID:SCR_005223, http://www.string-db.org)のタンパク質間相互作用から検索し、信頼度の高い相互作用を選択した。簡単に説明すると、STRINGデータベースは、ゲノムコンテキスト予測、ハイスループットラボ実験、（保存された）共発現、自動テキストマイニング、データベース内の過去の知識からなる一次データベースからタンパク質-タンパク質相互作用を情報源としている111。
unipeptを用いたメタプロテオーム解析
アップレギュレートされたトリプシン性微生物ペプチド配列を、それぞれ2倍以上の変化と0.2未満の公称p値カットオフで、Unipept（http://unipept.ugent.be）133,134に入力し、ロイシンとイソロイシンを等化し、重複ペプチドをフィルタリングした。簡単に説明すると、UnipeptはUniProtKBからトリプシンペプチド配列にインデックスを付け、NCBIの分類学データベースでペプチドの詳細を調べる。各トリプシンペプチドについて最小公倍数を計算した。この研究のプロテオミクスデータは、以下のサイトから入手できる。
(https://github.com/mazmanianlab/Griffiths_Yoo_et_al/tree/main/proteomics).
3′mRNA配列決定
手順はdx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzqbp5snに記載されている。
組織採取とRNA抽出
マウスを頚椎脱臼させ、消化管を摘出した。盲腸の上下1cmの組織を切り離し、それぞれSI遠位結腸と近位結腸の組織となるように洗浄した。組織をTRIzol (ThermoFisher Scientific, Waltham. MA- Cat. No. 15596018)溶液中でビーズベースのホモジナイズ法を用いてホモジナイズし、製造業者の指示に従ってクロロホルムを用いて全RNAを抽出した。
ライブラリーの調製、配列決定、解析
cDNAライブラリーは、UMI（ユニーク分子インデックス）を補充したQuantSeq 3′mRNA-Seq Library Prep Kit FWD for Illumina（Lexogen, Greenland, NH）を用いて、製造業者の指示に従って調製した。手短に言えば、オリゴ（dT）プライマーを用いて全RNAを逆転写した。第2のcDNA鎖は、DNAポリメラーゼが次のハイブリダイズしたランダムプライマーに到達したときに効率的に停止するような方法で、ランダムプライミングによって合成した。UMIは各リードの最初の6塩基に組み込まれ、その後に4塩基のスペーサー配列が続く。UMIはシーケンシングデータセット中のPCR重複の可能性を排除するために使用され、それゆえ偏りのない遺伝子発現プロファイリングを促進する。UMI重複排除ステップの基本原理は、マッピング座標とUMI配列が同一のリードを折りたたむことです。このステップにより、遺伝子発現レベルのダウンストリーム解析のためのシーケンスリードカウントの精度が向上する。処理したライブラリーは、Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA- Cat. No. 5067-4626 and -4627)を用いてサイズ分布と濃度を評価した。プールしたライブラリーをEBバッファー（Qiagen, Hilden, Germany, Cat.No.19086）で2nMに希釈し、イルミナのプロトコルを用いて変性させた。ライブラリーをプールし、10 mM Tris-HCl、pH 8.5を用いて2 nMに希釈し、イルミナのプロトコルを用いて変性させた。変性したライブラリーをあらかじめ冷やしたハイブリダイゼーションバッファーで10 p.m.に希釈し、製造元の説明書に従ってシングルリードのレシピを使用して150サイクルでIllumina MiSeq v3フローセルにロードした。シングルエンド75bpリード（最大4.5Mリード）が得られた。脱多重シーケンスリードは、Illumina BaseSpaceを使用して生成しました。
PCRアーチファクト（すなわち重複排除）のないリードを抽出するために、Lexogen社が開発・配布しているUMI特有のワークフローを使用した。まず、umi2indexツールを使用して、各リードの識別子に6塩基のUMI配列を追加し、各リードの先頭からUMIをトリミングした。これにより新しいFASTQファイルが生成され、トリミングとアライメントが行われた。次に、BBDuk112 (Bestus Bioinformaticus Duk, RRID:SCR_016969, https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/bbduk-guide/)によるqualityとpolyAのトリミングと、HISAT2 (version 2.1.0, RRID:SCR_015530, https://daehwankimlab.github.io/hisat2/)によるアライメントの後、113 マッピングされたリードを各リードのUMI配列に従って折りたたんだ。同じマッピング座標（CIGAR文字列）を持ち、同じUMI配列を持つリードは折りたたまれた。このようにリードを折りたたむことで、PCRの重複を除去した。リードカウントはHTSeq（RRID:SCR_005514, https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.9.1/）114を用い、Ensembl遺伝子アノテーション（GRCm38.78）を補足して算出した。生リードカウントをShynySeqで実行し、発現差のある遺伝子と下流の遺伝子オントロジー解析を得た135。
(https://github.com/mazmanianlab/Griffiths_Yoo_et_al/tree/main/RNAseq）。
全腸通過時間、糞便水分量、および糞便排出量
手順はdx.doi.org/10.17504/protocols.io.36wgq3p1xlk5/v1に記述されている。
6%(w/v)のカルミンレッド（Sigma-Aldrich, St. ChAT-CreおよびTH-CreマウスにC21（3 mg/kg）を腹腔内投与し、その後150μLのカルミンレッド溶液を経口投与した。マウスは実験期間中、寝具のない単独飼育で、動物は事前に絶食させなかった。経口投与後5時間にわたり、各糞便ペレットの排出時間を記録し、各ペレットをあらかじめ秤量した1.5mLの微量遠心チューブに採取した。回収された各ペレットはカルミンレッドの存在を確認し、最初にカルミンレッドのペレットが排出された時間をGI通過時間として記録した。採取した糞便ペレットの質量を測定し、80℃のオーブンで2日間乾燥させた後、乾燥ペレットの重量を測定し、ペレットの初期含水量を算出した。各マウスの糞便排出率は、C21投与後5時間の経過中に排出されたペレットの総数を、最後の糞便ペレットが排出された時間で割った値として算出した。
生体外腸管調製における大腸移動運動複合体
手順はdx.doi.org/10.17504/protocols.io.n92ldm61nL5b/v1に記述されている。
ChAT-CreマウスおよびTH-Creマウスから無傷の大腸を摘出し、洗浄後、あらかじめ酸素化（95％O2、5％CO2）したKrebs-Henseleit溶液に入れた。近位端および遠位端を直径2mmのチューブにカニュレーションし、37℃で連続的に酸素を供給するKrebs-Henseleit溶液を入れた臓器槽の中央に固定した。シリンジポンプを入口と出口のチューブに接続し、結腸を通して500μL/分の速度で溶液の流れを維持した。システムは記録前に30分間平衡化させた。ベースライン記録を30分間行った後、臓器浴中のクレブス溶液を短時間取り出し、C21を最終濃度2μMになるように混合し、臓器浴に入れ替えた。記録はさらに30分間行った。
定量化と統計解析
この研究で様々なタイプのマルチオミクス解析を行うために使用した統計的方法論とソフトウェアは、STAR Methodsの本文中で適宜引用している。ウイルス導入、マイクロバイオームの違い、消化管機能、動物福祉に関するp値計算は、Prism GraphPad v.9.2.0を用いて行った。各図で使用した特定の統計検定は図の凡例に記した。エラーバーは特に断りのない限り平均値の標準誤差を表す。
謝辞
Mazmanian研究室のメンバーおよびJonathan Hoang博士には、研究プロジェクト全体を通して議論し、原稿を批判的に読んでいただき、Catherine Oikonomou博士には貴重な原稿の校正をしていただいた。Andres Collazo博士とCaltech's Biological Imaging Facilityには顕微鏡のトレーニングと利用について、Caltech Proteome Exploration LaboratoryにはLC-MS/MSの利用について感謝する。CMMCヒートマップのMATLABスクリプトを提供してくれたElisa Hill-Yardin教授に感謝する。本研究の一部は、Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF)を通じて、Aligning Science Across Parkinson's (ASAP-020495 and ASAP-000375)から助成を受けた。オープンアクセスを目的として、著者らは本投稿から生じたすべてのAuthor Accepted ManuscriptsにCC BY 4.0のパブリック著作権ライセンスを適用した。S.K.M.はHeritage Medical Research Institute、Emerald Foundation、Caltech Center for Environmental and Microbial Interactions (CEMI)、National Institutes of Health (GM007616 and DK078938)、Department of Defense (PD160030)からの助成を受けた。P.C.D.は、米国国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所（R01DK136117およびU24DK133658）の助成を受けた。
著者貢献
J.A.G.、B.B.Y.、S.K.M.が実験を計画した。J.A.G.とB.B.Y.が実験を行った。K.Y.C.、C.C.（V.G.指導）およびJ.A.G.は、AAVを介したENSの特性解析に協力した。P.T.-B. (P.T.-B.（D.W.W.指導）、M.J.S.、A.M.はプロテオミクスデータの取得と解析を行った。V.C.、G.H.、G.S.、Q.Z.、J.S.（R.K.指導）はメタゲノミクスデータの取得と解析を行った。K.W.（P.C.D.指導）はメタボロミクスデータの取得と解析を行った。T.M.T.は動物関連作業を手伝った。原稿はJ.A.G.、B.B.Y.、S.K.M.が執筆した。
利益申告
B.B.Y.は、本研究とは無関係のNuanced Health社との金銭的利害関係を申告した。S.K.M.は、Axial Therapeutics社およびNuanced Health社との金銭的利害関係を申告しているが、本研究とは無関係である。P.C.D.は、Cybele社およびSirenas社の顧問および株式保有者であり、カリフォルニア大学サンディエゴ校の事前承認を得た上で、Ometa社、Enveda社、Arome社の科学共同設立者兼顧問および株式保有者である。2023年にはDSMアニマルヘルス社のコンサルタントも務めた。R.K.はBiomeSense社の科学顧問委員会メンバーおよびコンサルタントであり、株式を保有し、収入を得ている。GenCirq社の科学顧問委員であり、株式を保有。DayTwo社のコンサルタントおよび科学諮問委員会メンバーであり、収入を得ている。Cybele社のコンサルタント。Biota, Inc.の共同設立者であり、持分を保有。Micronoma社の共同設立者であり、持分を有し、科学諮問委員会メンバー。これらの取り決めの条件は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の利益相反ポリシーに従って検討され、承認されている。
補足情報
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ドキュメントS1. 図S1-S7
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表S1. 図3に関連する代謝物ネットワークノードの拡張GNPS注釈
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表S2. GO用語のGSEA（図5に関連
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表S3. 図5に関連するTヘルパー応答関連遺伝子
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表S4. 図6に関連する大腸移行運動複合体の注釈
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論文情報
出版履歴
オンライン公開 2024年3月21日
受理済み 受理：2024年2月27日
改訂版受理 2023年12月7日
受理：2023年12月7日 受理日：2022年9月30日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.113953

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図1ENSにおけるChAT+ニューロン分布とTH+ニューロン分布
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図2腸関連ChAT+およびTH+ニューロンの活性化が腸内細菌叢を変化させる
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図3腸関連ChAT+またはTH+ニューロンの活性化が宿主および微生物由来の管腔代謝産物を変化させる
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図4腸関連ChAT+またはTH+神経細胞活性化は宿主および微生物由来の管腔タンパク質を変化させる
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図5ChAT+およびTH+の活性化を介したトランスクリプトーム変化
図サムネイルgr6
図6活性化後のChAT+マウスとTH+マウスにおけるGI生理の違い
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