抗生物質分解耐性は、種特異的応答によって細菌群集構造を変化させる

2023年6月30日 11:09

オープンアクセス
出版：2023年6月29日
抗生物質分解耐性は、種特異的応答によって細菌群集構造を変化させる

https://www.nature.com/articles/s41396-023-01465-2

アユシュ・パタック
ダニエル・C・アングスト
...
アレックス・R・ホール
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ISMEジャーナル (2023)この記事を引用する
12 Altmetric
メトリクス詳細
要旨
いくつかの耐性菌機構は抗生物質を分解し、隣接する感受性細胞を抗生物質曝露から守る可能性がある。このような効果が、自然界で典型的な2種以上の細菌群集にどのような影響を与えるかはまだ分かっていない。ここでは、臨床的に重要なpOXA-48プラスミドにコードされた耐性が、抗生物質に対する群集レベルの反応に及ぼす影響を調べるために、実験的な多種群集を用いた。その結果、ある生物種の耐性は他の生物種の抗生物質阻害を減少させるが、ある生物種は他の生物種よりも大きな恩恵を受けることがわかった。さらに上清と純粋培養増殖アッセイを用いた実験から、無害化によって最も利益を得る感受性種は、分解された抗生物質濃度（ゼロより大きく、開始濃度より低い）で最もよく増殖する種であることが示された。このパターンは寒天表面でも観察され、同じ種は抗生物質濃度が高い初期段階において、他のほとんどの種に比べて比較的高い生存率を示した。対照的に、我々の実験群落では、無害化に対する群落レベルの反応において、高次の相互作用やプラスミドの水平移動の役割を示す証拠は見つからなかった。この結果は、1つの種が抗生物質分解耐性機構を持つことで、抗生物質に対する群集レベルの応答が劇的に変化することを示唆しており、抗生物質の無害化によって最も利益を得る種の正体は、抗生物質濃度が変化しても生き残り成長する本来の能力によって予測される。
はじめに
抗生物質耐性は、細菌感染症の効果的な治療の障害となっている[1, 2]。耐性メカニズムを持つ菌株は、しばしば多種の細菌群集の中で他の種と共存している。そのため、抗生物質に対する反応を個々の生物種あるいは群集／マイクロバイオーム全体のレベルで予測するためには、ある生物種が保有する耐性機構が、同じ群集内の近隣の生物種にどのような影響を与えるかを理解する必要がある [3, 4]。ある種の耐性機構が周囲の微生物に影響を与える一般的なメカニズムの一つは、抗生物質の濃度を下げることである。この種の解毒の重要な例として、カルバペネマーゼやその他のβ-ラクタマーゼ [7,8,9,10,11]があり、これらはβ-ラクタム抗生物質を酵素的に不活性化する。過去の研究から、暴露防御は同じ種または種のペアの菌株間で起こりうることが示されている [3,6,7,8,9,10,11]。このことは、解毒が耐性菌の群集構造に影響を与える重要なメカニズムであることを示唆している。しかし、解毒抵抗性メカニズムが、2種以上の群集における群集構造（異なる種の相対的存在量）に影響を与えるかどうか、あるいはどのように影響を与えるかは、まだわかっていない。
抗生物質の分解に応じて群集構造が変化する可能性は複数ある。例えば、常在種が抗生物質の分解濃度で増殖する能力に差がある場合、無毒化から最も利益を得る種の同定は、関連濃度の純粋培養で増殖する能力から予測できるかもしれない。分解の程度によっては、抗生物質非存在下での最小発育阻止濃度（MIC）や発育速度など、広く測定されているパラメータの種間変動と相関する可能性がある[12]。あるいは、ある種の常在菌が水平移行や他のメカニズムによって抗生物質濃度に耐性を持つようになった場合、無害化されたときの群集構造は、耐性進化速度の変動を反映することになるかもしれない。第三の可能性は、抗生物質の分解に対する群集レベルの応答が、高次の相互作用に依存することである。例えば、耐性種の存在下でのいくつかの感受性種の増殖が、他の感受性種との相互作用に影響されるような場合である。微生物間で高次の相互作用が起こりうるという証拠はいくつかあるが [13, 14]、抗生物質曝露時の群集構造に対する重要性については明確なコンセンサスは得られていない [3, 15, 16, 17]。したがって、耐性種が局地環境を無毒化する際に、どのような常在感受性種が最も利益を得る（相対的な存在量が最も増加する）のかを理解することは、抗生物質耐性が微生物の多様性にどのような影響を与えるのかについての基本的な理解を深め、自然界や治療環境における抗生物質に対する群集レベルの応答を予測する能力を向上させるであろう。
無毒化する可能性のある耐性機構が、異なる種の相対的存在量にどのような影響を与えるかを調べるため、我々は実験的に、大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ腸炎菌、腸球菌、緑膿菌、肺炎桿菌からなる多種の群集を構築した。これらの菌種を選んだのは、系統学的にも表現型的にも多様であり、すべてヒトに常在菌[18,19]または病原体[20,21,22,23]として関連しているからである。我々は、カルバペネマーゼをコードするプラスミドpOXA-48[24,25,26]を1つの群集メンバー（大腸菌）が保有することによって、群集構造が影響を受けるかどうかを検証した。私たちは、ピペラシリンとタゾバクタム[27]という臨床的に重要な組み合わせを用いて、抗生物質の有無によるプラスミドの群集構造への影響をモニターした。ピペラシリンはアンピシリンのピペラジン誘導体であり[28, 29]、一般にβ-ラクタマーゼ阻害剤であるタゾバクタム（ペニシラン酸スルホン誘導体）と併用される[30, 31]。我々は、大腸菌によるプラスミドのキャリングが抗生物質の分解を介して群集構造に影響を与え、その恩恵を最も受けている種が、抗生物質濃度を低下させても増殖する相対的な能力によって同定されることを発見した。
材料と方法
細菌と増殖培地
7株（6種；補足表S1）を用いて、多種の群集を構築した：すなわち、Escherichia coli K-12 MG1655（pOXA-48プラスミドの有無にかかわらず）、Staphylococcus aureus subsp.aureus（タイプ株）、Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344、Enterococcus faecalis JH2-2、Pseudomonas aerμginosa PAO1、Klebsiella pneumoniae subsp. これらの菌種はそれぞれ、クロマチック寒天培地上で、明瞭な色／形態を持つコロニーを形成した（補足図S1）。
プラスミドと抗生物質
ほとんどのβ-ラクタム系抗生物質[25]に耐性を示すβ-ラクタマーゼ遺伝子 blaOXA-48を1個持つIncLファミリーの63.6-kB pOXA-48様プラスミドを用いた。このプラスミドは、スイスのバーゼル大学病院の臨床微生物学部門で分離された臨床大腸菌株から得られた[32]。このpOXA-48様プラスミド(acc.番号UWXP01000003.1)は、最初に記載されたpOXA-48プラスミド[33]および最もよく研究されたpOXA-48様変異体の一つであるpOXA48_K8[34]と、カバー率97%、同一性99%以上を共有している。カバレッジの違いは主に、頻繁に切除／挿入されることが示唆されているグループIIイントロンのltrAがないためである[34]。IncLプラスミド、特にpOXA-48は共役性で、宿主範囲が広いことが示されている[34,35,36,37]。ここで使用したpOXA-48プラスミドが細菌細胞間で水平移行できるかどうかを調べるために、プラスミドを保有するネイティブ臨床株とクロラムフェニコール耐性大腸菌K-12 MG1655（CmR、ΔgalK::cat）との交配アッセイを寒天上および液体中で行った（補足図S2）。主実験では、大腸菌K-12 MG1655のプラスミド保有バージョンまたはプラスミド非保有バージョンを含むことにより、pOXA-48プラスミドを含む／含まないコミュニティを構築した。抗生物質添加群では、特に断りのない限り、7.5μg/mlのピペラシリンと1.5μg/mlのタゾバクタムを用いた。一部の実験では、7.5または10μg/mlのピペラシリンと1.5または2μg/mlのタゾバクタムを含む選択的クロマチック寒天培地を用いた。プラスミド保有コロニーの周囲にサテライトコロニーが形成されるのを防ぐため、場合によってはより高濃度のものを使用した。
抗生物質とプラスミドの有無による実験的群集の形成
群集の構造が抗生物質とプラスミドによってどのような影響を受けるかを調べるために、4つの処理（抗生物質±プラスミド±のすべての組み合わせ）で5つの複製群集を培養した。各レプリケート・マイクロコズムについて、まず96ウェル・マイクロプレート中の200μlのLB中で、それぞれ別々のコロニーから接種した別々の一晩培養で、全構成種を培養した。各レプリケート・マイクロコズムについて、独立した一晩の純粋培養セット（各構成種につき1つ）を使用した。各マイクロコズムへの接種には、各構成種の一晩培養液を1000倍に希釈し、総量200μlとした。24時間培養の前後に、希釈液をクロマチック寒天培地にプレーティングし、初期および最終的な存在量と群集組成を推定した。プラスミド保有株と培養した感受性菌種における抗生物質耐性の出現を調べるため、抗生物質＋プラスミド処理（プラスミド保有大腸菌を除く）のいずれかの複製で生き残ったすべてのコロニー（S. Typhimurium 37個、緑膿菌 13個）を摘出した。次に、これらのコロニーをピペラシリンとタゾバクタムを添加したクロマチック寒天培地で再培養し、先祖株に対する阻害濃度で安定した生育が確認されたかどうかを調べた。耐性変異株に関する2つ目の試験として、全処理区の全マイクロコズムから採取した20μlのアリコートを、ピペラシリンとタゾバクタムを添加したクロマチック寒天培地に直接プレーティングした。
液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）
LC-MSを用いて、プラスミド添加群と非添加群（抗生物質添加群）で増殖培地中の抗生物質濃度が変化するかどうかを調べた。サンプルを調製するために、抗生物質＋プラスミド処理と抗生物質＋プラスミドなし処理、および対照処理（抗生物質入りの滅菌培地）で、上記のように3つの複製マイクロコズムを培養した。培養液は上記のように調製したが、容積を大きくした（40ml）。ろ過（0.2μm）と凍結（-20℃）の前に、0、6、24時間後に各培養液をサンプリングした。サンプルは、順序の影響を避けるため、処理前にランダムに識別子を割り当てた。勾配分離クロマトグラフィーは、Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18カラム（150 mm×2.1 mm、内径1.9 µm；米国カリフォルニア州サンタクララ）を用い、移動相Aはアセトニトリル中0.1%ギ酸、移動相Bは水中0.1%ギ酸で行った。最初の移動相組成は、1.5分までは1%相Aで、その後25%相Aにステップアップし、1分間保持した。0.5分以内にA相の割合は99%まで直線的に増加し、0.5分間保持した。2.5分間のリコンディショニングにより、合計ランタイムは6分となった。カラム温度は40℃に維持され、注入量は10 µlであった。このクロマトグラフィー条件では、タゾバクタムとピペラシリン-Naの保持時間は2.8分と3.8分であった。質量分析検出は、Bruker Maxis II ESI-Q-TOFシステム（Billerica, Massachusetts, United States）を用いて行った。イオン化は、マイナスイオンモードでエレクトロスプレーを用いて行った。スプレー電圧は負極性で3000Vに設定した。ネブライザーおよび乾燥ガスとして窒素を使用し、それぞれ1.6 barおよび10.0 l/minに設定した。気化器の温度設定は250℃であった。測定濃度は、0時間後の対照処理の平均値に対するパーセンテージで表した（ピペラシリン：5.5μg/ml、タゾバクタム：2.2μg/ml；これらの値は、測定誤差や処理中の分解など、さまざまな理由で接種濃度と異なる可能性があることに注意）。
寒天培地での抗生物質解毒の種特異的効果の試験
液体培養で解毒の種特異的効果の証拠を見つけた後、固体培地で2回目の試験を行った。クロマチック寒天培地7.5 µg/mlピペラシリン＋1.5 µg/mlタゾバクタム培地にプラスミドを保持した大腸菌をストリークし、次にそれぞれの抗生物質感受性株を垂直にストリークした。その後、感受性株がプラスミド保有株に近接することで増殖が促進される証拠を確認した。2種以上の群集におけるこのような相互作用を調べるため、感受性種の集合した群集を、プラスミドを保有する大腸菌の株と一緒に抗生物質勾配上にプレーティングした。
抗生物質の用量反応曲線、抗生物質なしの生存と増殖
各菌種が適切な抗生物質濃度で増殖する本来の能力を推定するために、様々な濃度のピペラシリン＋タゾバクタムに対する感受性を試験した。上記のように各培養株を調製し、それぞれ独立した一晩培養から1000倍希釈で1株あたり3反復接種した。LB中のピペラシリンを37.5～0.585μg/mlの範囲で2倍希釈したものに0μg/mlを加え、0μg/mlを除くすべてのピペラシリン濃度で15μg/mlのタゾバクタムを添加した。24時間後、上記のようにODを測定した。これにより各菌種の用量反応曲線を作成した。検出可能な増殖のカットオフ値としてOD≧0.045を用い、検出可能な増殖がない濃度とした。別の実験では、7.5μg/mlと1.5μg/mlのピペラシリンとタゾバクタムを上記のように植菌した純粋培養物（0、2、4、6、24時間後、1菌種につき3反復培養）において、寒天培地にプレーティングし、コロニー形成単位をカウントすることにより、各菌種の生存率を測定した。
人為的に抗生物質濃度を下げた場合の群集構造の変化に関する試験
人為的に抗生物質濃度を低下させた場合、プラスミドを保有する大腸菌を含まないマイクロコズムでは、本実験の抗生物質＋プラスミド処理による群集と比較して、同様の群集組成になると仮定した。つまり、抗生物質濃度を外部的に低下させることで、プラスミドの解毒効果を模倣することを目指した。上記のように、プラスミド保有株を含まない4つの複製群集を、様々な抗生物質濃度（ピペラシリン＋タゾバクタム7.5＋1.5、0.9＋0.18、0.46＋0.09、0.23＋0.04、0＋0μg/ml、主実験の濃度の100、12.5、6.25、3.125、0％に相当）で接種した。培養後、上記と同様にプレーティングを行い、群集構造と存在量を推定した。
プラスミドを保有する大腸菌と他の生物種とのペアワイズ相互作用
上記の主実験で解毒の恩恵を最も受けた種が、プラスミド保有大腸菌のみを用いた2種培養でも解毒の恩恵を最も受けたかどうかを検証した。言い換えれば、解毒の恩恵は6種群集に特有のものなのか（高次の相互作用に依存しているためなど）、あるいは個々の感受性種とプラスミドを保有する大腸菌株との間の一対の相互作用で説明できるのか、ということである。純粋培養（抗生物質なし）とプラスミド保有大腸菌との共培養（抗生物質あり・なし）で、各菌種を3反復培養した。上記のように培養を準備し、それぞれの種の一晩培養から1000倍に希釈して接種した（つまり、2種培養では純粋培養よりも細胞総数が多かった）。このセットアップでは、過去の研究[38, 39]に従い、プラスミドを保有する大腸菌を加えることで、同じ密度で接種した場合の大腸菌単独での増殖と比較して、それぞれの種の増殖が変化するかどうかをテストした。その後、ピペラシリン＋タゾバクタム（piperacillin+tazobactam）による別個のプレーティングを含め、上記と同様に培養とプレーティングを行い、耐性の進化を調べた。
統計解析
図1、2、5、6に関連する実験は無作為化し、解析はR 4.1.0で行った。群集構造を解析するために、主実験における各菌種の絶対量（CFU/ml）の主成分分析を用いた。変数はゼロ中心になるようにシフトし、単位分散になるようにスケーリングした。また、R パッケージ「vegan」[40, 41]を用い、Bray-Curtis 非類似度行列に基づく並べ替え多変量分散分析（permANOVA）を用いた。抗生物質を含まない純粋培養の成長率を推定するために、"fitR "パッケージ [42]を使用した。これは、定義された連続ポイント数（ここでは、15分間隔の連続5ポイント）について、時間経過に伴うODの最大勾配を推定するスライディングウィンドウアプローチを使用する。
図1：抗生物質と耐性プラスミドの有無による群集の存在量と構造。
A 各処理（大腸菌が保有する耐性プラスミドの有無、およびピペラシリン＋タゾバクタムによる抗生物質処理の有無）における5反復マイクロコズムの推定総存在量（CFU/ml）。B 異なる処理における群集構造の主成分分析；入力変数は各マイクロコズムにおける6種の絶対量。C 異なる処理における群集構造；各処理における5反復のマイクロコズムにおける各生物種の推定相対存在量。プラスミドを含む処理では、プラスミドは大腸菌によって運ばれ、各マイクロコズムには1つの大腸菌株（処理によってプラスミドを含むか含まないか）のみが含まれた。
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図2：0、6、24時間培養後の、プラスミド添加、無添加、または無菌培地による群集培養の上清中のLC-MSで測定したピペラシリンとタゾバクタム濃度。
濃度は、対照処理における0時間の平均濃度に対する相対値で示した（Methods参照）。バーは平均値（n = 3）を表し、"BDL "は化合物の検出限界以下を意味する。
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結果
耐性大腸菌が緑膿菌とS. Typhimuriumを抗生物質阻害から救う
大腸菌に耐性プラスミドを組み込むことで、抗生物質が総菌量に及ぼす影響が減少した（図1A、二元配置分散分析、プラスミド×抗生物質の交互作用： F1,16 = 229.5, p < 0.001）。異なる種の相対的な存在量から見た群集構造（図1B、C）も、抗生物質とプラスミドの両方によって有意に影響を受けた（permanOVA、プラスミドの効果：擬似F1,16 = 14、p = 0.001、抗生物質の効果：擬似F1,16 = 16.3、p = 0.001）。プラスミド非存在下では、抗生物質処理により、複製マイクロコズム間のばらつきが大きくなり、実験終了時に検出された菌種は少なくなった（図1C）。これらのマイクロコズム（抗生物質あり、プラスミドなし）における総菌体量は、24時間後の方が0時間後よりも低く、このことは、プラスミドを含まない種間での集団増殖の変動よりも、いくつかの種から生き残ったごく一部の細胞を反映した群集構造であることを示している（24時間後の平均総菌体量＝95 CFU/ml、SD＝106.65、0時間後の平均＝2.2×106 CFU/ml、SD＝1.3×106）。プラスミドは、抗生物質非存在下では群集構成にほとんど影響を与えなかったが、抗生物質処理によって緑膿菌、S. Typhimurium、大腸菌の増殖が可能になった（permANOVAにおける抗生物質×プラスミドの交互作用：擬似F1,16 = 14.2, p = 0.001；図1C）。このように、プラスミドを持つ株（大腸菌）の抗生物質存在下での生育を増加させるだけでなく、プラスミドは、そうでなければ感受性のあるコミュニティメンバー（緑膿菌とS. Typhimurium）を抗生物質による阻害から救った。
抗生物質感受性種における耐性進化の証拠なし
実験中に抗生物質耐性を獲得する能力という点で、感受性種間でばらつきがあることは、プラスミドを保有する大腸菌と抗生物質の共存下で、ある種が他の種よりも優れた結果を示した理由を説明する可能性がある。実験終了後、最初に感受性を示した各菌種のコロニーを抗生物質寒天培地に再破砕し、この点を検証した。抗生物質＋プラスミド処理で得られた5枚のクロマチック寒天培地プレートからS. Typhimuriumと緑膿菌の全コロニー（S. Typhimuriumコロニー37個、緑膿菌コロニー13個）を取り出し、抗生物質を添加したクロマチック寒天培地で再破砕した。抗生物質寒天培地では、再培養したコロニーのいずれも新しいコロニーを形成しなかった。第二のテストとして、4つの処理（図1）のすべてのマイクロコズムから20μlのアリコートを、10μg/mlのピペラシリンと2μg/mlのタゾバクタムを添加したクロマチック寒天培地プレートにプレーティングした。これらのプレートで観察されたコロニーは、pOXA-48プラスミドを持つ大腸菌のみであった。従って、抗生物質存在下でのプラスミド添加による感受性菌種のレスキュー（上記の観察）が、実験中の耐性獲得と関連しているという証拠は見つからなかった。にもかかわらず、本来の臨床的ドナー株と大腸菌MG1655_CmRとの間の別の交配実験では、他の変異株について以前に報告されたように、pOXA-48プラスミドが他の実験条件下で高い割合で結合性であることが示された（補足図S2）[34]。
大腸菌によるプラスミドキャリッジは他の生物種の環境を無害化する
群集処理から抽出した増殖培地中の抗生物質濃度を経時的に測定した結果、大腸菌によるプラスミドキャリッジがピペラシリンとタゾバクタム濃度の低下を大幅に加速することがわかった（図2）。抗生物質＋プラスミド処理、抗生物質＋プラスミドなし処理、抗生物質入り無菌培地で主実験と同様に培養した群集の上清で各菌種を個別に培養し、感受性種の増殖に対するこのような変化の下流への影響を調べた（補足図S3）。すべての感受性種（プラスミドを持たない種）において、プラスミドを持つ群集の上清の方が、持たない群集の上清よりも個体群増殖が高かった（補足図S3）。この効果の大きさは、感受性のある種の間で異なっていた（対照上清を除いた原液上清での増殖を応答変数とする二元配置分散分析、種×上清のタイプの交互作用： F5,24 = 26.4, p < 0.01）。緑膿菌、K. pneumoniae、S. aureusおよびS. Typhimuriumはすべて、E. faecalisおよびプラスミドを含まない大腸菌と比較して、無毒化に対して比較的強い反応を示した（プラスミド＋上清タイプとプラスミド-上清タイプの違い）。抗生物質濃度以外にも、栄養状態の変化や細菌増殖の他の影響 [43]など、増殖培地に対する他の変化にも注意することで、その後の培養において種特異的な影響を及ぼす可能性がある。いずれのタイプのコミュニティ由来上清（プラスミドあり、なし）も、細菌を含まないコントロール上清よりも多くの増殖を支持したことから、例えば標的細胞との相互作用やピペラシリン固有の不安定性[44, 45]などにより、プラスミドがなくても抗生物質の無毒化があることが示された（補足図S3）。まとめると、プラスミドを持つ生物群集は抗生物質を分解することで生物環境を無害化するが、これを利用するのに優れた種もあった。
寒天培地における抗生物質分解の種特異的利点
プラスミド保有株による抗生物質分解の種特異的な利点に関する2つ目の試験として、主実験の抗生物質＋プラスミド処理から得られたすべての抗生物質感受性種を、抗生物質を添加したクロマチック寒天培地上でプラスミド保有大腸菌に垂直にストリークした（図3Aおよび補足図S4）。培養後、緑膿菌とS. Typhimuriumのみが、プラスミド保有株の近傍でのみ、目に見える増殖を示した。寒天培地上での相互作用をさらに調べるために、群集レベルで、ピペラシリン＋タゾバクタムの勾配をつけた寒天培地に、プラスミドを保有する大腸菌を真ん中にして、多種群集全体をプレーティングした（図3B）。このことから、緑膿菌とS. Typhimuriumが、解毒作用を最もよく利用できる菌種であることが再び示された（プラスミド保有株に近接した、プレートの抗生物質濃度の高い側のコロニー；図3Bおよび補足図S5）。このことは、液体培養で観察された種特異的な無毒化の利点を裏付けるものであり、空間的に構造化された環境でも適用できることを示している。
図3：寒天培地における種特異的な無毒化の利点。
A 5種の抗生物質感受性菌のうち2種（緑膿菌とS. Typhimurium）が、抗生物質寒天培地上で、プラスミドを保有する耐性大腸菌の近傍で目に見える増殖を示した。各感受性菌種は、抗生物質（黒の縦線）をpOXA-48を保有する大腸菌（紫の横線）に対して垂直に入れたクロマチック寒天培地上にストリークし、24時間培養した。各組み合わせを3回反復し、1つの複製を示す。他の複製はすべての組み合わせで同様であった（緑膿菌では3つ中3つが、S. Typhimuriumでは3つ中2つが質的に同一であった；補足図S4参照）。B. プラスミドを保有する大腸菌株を水平にストリークした、ピペラシリン＋タゾバクタム（左から右へ；オーバーレイ寒天培地中の最大濃度＝5μg/mlピペラシリンおよび1μg/mlタゾバクタム）のグラジエント上にプレーティングした多種のコミュニティー（補足図S5）。
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無毒化によって最も利益を得る菌種は、純粋培養では抗生物質濃度を下げても比較的よく増殖する。
種特異的な無毒化の利点の説明として考えられるのは、抗生物質濃度を下げると他の種よりもよく生育する種があるということである。我々の実験における濃度範囲には、7.5μg/ml（主実験で使用した開始濃度）と7.5μg/mlより低いゼロでない濃度が含まれる。純粋培養では、プラスミドを保有する大腸菌以外は、7.5μg/mlピペラシリン以上では有意な増殖を示さなかった（図4）。7.5μg/mlより低いゼロでない濃度では、P. aeruginosaとS. Typhimuriumが、試験した1つの濃度を除くすべての濃度で最も良好な感受性を示した（図4）。このように、本実験（図1）、上清アッセイ（補足図S3）、寒天平板アッセイ（図3）において、プラスミド保有大腸菌による抗生物質の無毒化から最も利益を得た菌種は、抗生物質濃度を下げた純粋培養で最もよく増殖した菌種であった。濃度を下げた場合の増殖に関する感受性菌種間のばらつきは、相対的なMIC（図4に示した用量反応曲線から推測される）によって単純に予測できるものではなかった：肺炎桿菌（MIC：9.375 μg/ml）は、緑膿菌（MIC：4.65 μg/ml）および腸炎菌（MIC：4.65 μg/ml）よりも高いMICを示したが、7.5 μg/mlより低いほとんどの非ゼロ濃度では成績が悪かった。K. pneumoniaeのMICが比較的高いことも、寒天培地上で、他の菌種に比べて高い抗生物質濃度で密に増殖することと一致している（図3B）。
図4：ピペラシリン濃度を変化させ、タゾバクタム濃度を一定にした場合の全菌種の用量反応曲線。
棒グラフは平均値（n = 3）。
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抗生物質濃度を下げた場合の増殖とは異なり、抗生物質非存在下での異なる種の相対的な増殖能力は、主実験の抗生物質＋プラスミド処理における緑膿菌とS. Typhimuriumの成功を説明するものではなかった。このことはまず、別の種（K. pneumoniae）が、プラスミドなし、抗生物質なしの本実験のマイクロコズムでは緑膿菌と同程度かそれ以上の存在量に達したが、抗生物質＋プラスミド処理では排除されたことで示されている（図1）。また、抗生物質とプラスミドを添加した群集マイクロコズムにおける最終的な相対的存在量は、上記で測定した抗生物質無添加での最終的な相対的存在量よりも、むしろ抗生物質無添加の指数関数期における個々の生物種の固有の増殖速度に依存している可能性もある（図1）。このことを調べるために、抗生物質非存在下での最大増殖率を各生物種について推定した（補足図S6）。その結果、緑膿菌とS. Typhimuriumの両方について、抗生物質非存在下での最大増殖速度が同等かそれ以上の抗生物質感受性種が少なくとも1種存在することがわかった（補足図S6；一元配置分散分析における種の効果：F6,14 = 12.4、p < 0.05、Tukey's HSD比較）。同じ純粋培養アッセイにおける最終的な存在量も、同様の結論を支持した（補足図S6）。
さらに、緑膿菌とS. Typhimuriumが多種混合のマイクロコズムで成功した原因として、分解前の初期段階において抗生物質にさらされた際に、増殖ではなく生存率が変化したことが考えられる。純粋培養で24時間にわたる時間分解殺滅アッセイ（補足図S7）を行ったところ、緑膿菌とS. Typhimuriumは、大腸菌、E. faecalis、K. pneumoniaeに比べて、いくつかの時点、特に最初の数時間で比較的高い生存率を示した。黄色ブドウ球菌も比較的高い生存率を示した。したがって、比較的高い生存率（時間経過に伴うCFU/mlの比例的減少が少ない）も、本実験における緑膿菌とS. Typhimuriumの成功に寄与している可能性がある。
人為的に抗生物質濃度を下げると、プラスミド導入時に観察されたのと同じダイナミクスの一部が再現された。
この結果は、プラスミドにコードされた耐性菌が局所の生物学的環境を無害化することによってもたらされたものであると我々は仮定した。もしそうであれば、プラスミドにコードされた耐性がない場合でも、人工的に抗生物質の濃度を下げることで、主実験の抗生物質＋プラスミド処理で観察されたのと同じような群集構造の変化が起こるはずである。抗生物質無添加の場合、予想通り、群集構造は本実験の抗生物質無添加の群集と類似していた（図5、0%）。中間濃度（ゼロより高いが本実験で使用した濃度より低い）では、緑膿菌が最も多い感受性種であった。S. Typhimuriumもまた、試験したすべての中間濃度において、いくつかのマイクロコズムで良好な結果を示した。この結果は、プラスミドを介した無毒化によってこれら2つの菌種が最も利益を得ることを示す、我々の他の結果を支持するものである。というのも、開始濃度を変えるだけでは、抗生物質分解の時間的動態やプラスミドが宿主である大腸菌の増殖に及ぼす影響など、われわれの主実験で起こりうるすべての影響を再現できるわけではないからである。
Fig. 5: 抗生物質の開始濃度を変えた場合の、プラスミドを持たない大腸菌のマイクロコズムにおける群集構造。
各パネルは、主実験（図1）の開始濃度に対するパーセンテージで示した異なる抗生物質濃度を示している： 12.5％＝0.9μg/mlピペラシリンと0.18μg/mlタゾバクタム、6.25％＝0.46μg/mlピペラシリンと0.09μg/mlタゾバクタム、3.125％＝0.23μg/mlピペラシリンと0.04μg/mlタゾバクタム、0％＝抗生物質なし。100％処理（7.5μg/mlピペラシリン、1.5μg/mlタゾバクタム）は示していない。この処理ではごくわずかな増殖しか検出されず、4複製中3複製でコロニーが全くなかった。
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高次の相互作用は、種特異的な解毒の利点を説明するのに必要ではない
上記の実験から、緑膿菌とS. Typhimuriumは、抗生物質が分解された濃度で他の種よりもよく増殖するため、無害化によって最も利益を得ることが示唆された。この場合、各感受性種をプラスミド保有大腸菌株のみと培養した場合（他の感受性種は含まない）、本実験と同様のパターンが見られると予想される。プラスミド保有株と抗生物質との共培養では、S. Typhimuriumと緑膿菌のみが検出可能な個体群密度に達した（図6）。主実験と同様、抗生物質寒天培地にプレーティングした結果、感受性菌種の耐性変異体の証拠は得られなかった。同じ実験で、純粋培養と共培養の両方で抗生物質を使用しない処理も行った。図6；一元配置分散分析における菌種の影響：純粋培養ではF4,10 = 4.8、p < 0.05、抗生物質無添加の共培養ではF4,10 = 7.7、p < 0.05；Tukey's HSD：両処理における緑膿菌、S. Typhimuriumと他の菌種の多重一対比較ではp > 0.05）。従って、この実験から、上記のように、他の感受性種がいない場合でも、緑膿菌とS. Typhimuriumが無毒化から最も利益を得ており、これはこれら2種の抗生物質を使わない優れた増殖とは無関係であることが示された。
図6：プラスミドを保有する大腸菌と抗生物質との共培養において、緑膿菌とS. Typhimuriumのみが生存可能な集団増殖を示した。
24時間培養後の大腸菌を除く各抗生物質感受性菌種の存在量（CFU/ml）を、抗生物質無添加の純粋培養、抗生物質無添加のプラスミド保有大腸菌とのペアワイズ共培養、または抗生物質添加のプラスミド保有大腸菌とのペアワイズ共培養の3反復について示す。赤いバーは各条件の中央値を示す。抗生物質処理における検出限界はかなり高い（5×106 CFU/ml；検出限界以下はy軸に "BDL "と表示）。
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考察
6種の群集において、耐性プラスミドを保有する大腸菌は他の種の環境を無害化した。このことは群集構造に大きな影響を及ぼし、ある種は他の種よりも無害化によってより多くの利益を得たからである。最も利益を得ている種の同定は、抗生物質濃度を下げた（開始濃度より低い）ときの内在性個体群成長（純粋培養で測定）の種間変動によって説明された。対照的に、耐性進化において広く測定されている2つのパラメーター（MICと抗生物質無添加での純粋培養増殖率）は、無害化された群集マイクロコズムにおける緑膿菌とS. Typhimuriumの成功を部分的にしか説明できなかった。無害化によって群集構造がどのように変化するかという点では、さらなる実験でも同様のパターンが支持された。最も利益を得た2つの菌種は、抗生物質が多い初期段階において、他のほとんどの菌種と比較して生存率が比較的高かったことから、個体数の増加だけでなく、生存能力の変動が群集レベルの応答に影響を与えることが示唆された。他のいくつかのシナリオではこのような証拠があるにもかかわらず [13, 14, 46]、感受性種間の直接的または高次の相互作用が、無害化に対する群集レベルの反応に影響を与えたという証拠は見つからなかった。したがって、我々の結果は、抗生物質の分解によって相対的な存在量が増加する可能性が最も高い種を含む、無害化耐性メカニズムの群集レベルの影響を明らかにした。
われわれの結果の第一の重要な意味は、プラスミドを介した無毒化によって観察された群集組成の変化は、MICや抗生物質無添加の増殖速度などの古典的に測定されるパラメーターよりも、分解された抗生物質濃度で増殖する能力の種間変動によってよりよく説明されるということである。緑膿菌とS. Typhimuriumは、開始濃度以下の非ゼロ濃度では他の菌種よりもよく増殖し、主実験の群集処理で解毒に成功した唯一の2菌種であった。これら2つの菌種はMICも比較的高かったが、K. pneumoniaeも同様であった（液体および寒天上）。従って、MICが参考にならないとは言わないが、我々の実験でどの種が最も利益を得たかを完全に説明することはできなかった。同様に、緑膿菌やS. Typhimuriumと比較して、抗生物質非存在下では他の菌種も同様の増殖率を示したが、無害化された群集微生物叢では増殖しなかった。このことは、無毒化耐性機構が存在する場合、個々の菌種の反応は、抗生物質非存在下での増殖率やMICだけでなく、分解濃度に対してどのように反応するかに決定的に依存することを示唆している[3, 47]。今後、より多くの生物種を用いた研究が進めば、この種の種間変異の解釈は、薬力学的モデリングによって容易になるであろう［48］。我々のデータはまた、高抗生物質濃度への曝露の初期段階における生存の種間変動が、緑膿菌とS. Typhimuriumの成功に寄与したことを示唆している。殺生物濃度に対する生存率は、暴露防御の決定因子として以前に報告されている[8]。全体として、これは個々の種の反応の原動力として、分解濃度での初期生存とその後の増殖を支持している。
我々の発見は、他のシナリオにも当てはまりそうである。第一に、pOXA-48プラスミドは広範囲に存在し、臨床的に非常に関連性が高いので［49］、この特定のプラスミドを理解すること自体が重要である。第二に、このプラスミドにコードされている抗生物質分解β-ラクタマーゼ酵素による解毒機構は、他のプラスミド、細菌、耐性遺伝子に共通している [3, 8, 10]。第三に、私たちの群集に存在する種は自然界で一般的であり、常在菌および／または病原体としてヒトと関連している。さらに、我々の実験で群集組成が変化した主なメカニズムは、抗生物質分解に対する応答の種間変動に依存しており、これは自然界の群集にも広く存在すると予想される。第四に、液体中と寒天培地上で、無毒化に対する種特異的な反応という点で同様のパターンを見出したことから、これは空間的に構造化された条件下でも当てはまることが示された。今後の研究として興味深いのは、抗生物質曝露に対する群集成長の時空間ダイナミクスをより詳細に調べることである。例えば、曝露前にバイオフィルムを形成することで、より多くの種が無毒化から利益を得ることができるかどうかなどである。
pOXA-48プラスミドは、少なくとも1つの感受性株への導入が可能であったにもかかわらず、無害化に対する群集レベルの反応においてプラスミドの水平移動が果たした役割を示す証拠は見いだされなかった [34, 50]。この実験では、プラスミド転移の可能性は否定できないが、仮に転移が起こったとしても、どの菌種が無害化から利益を得たかを説明することはできない（緑膿菌もS. Typhimuriumも検出可能な耐性を獲得していない）。したがって我々の結果は、無毒化耐性が非移動性エレメントにコードされているシナリオにも関連する。とはいえ、他の条件下で他の感受性種への移行動態を調べる今後の研究は有益であろう。さらに我々は、耐性種が抗生物質を分解しないシナリオと比較して、無毒化そのものが感受性種による耐性獲得（水平移動または染色体変異による）の役割を減少させることに寄与しているのではないかと推測している。というのも、無毒化によって、新たに生じる耐性変異株の選択的優位性が、感受性株と比較して低下し（この優位性は、感受性株のMIC以上、耐性株のMIC未満で最大になると予想される）、その結果、経共役頻度の増加が遅くなるからである。とはいえ、無毒化株を含む群集の中で、生き残った感受性種が最終的に耐性を進化させる可能性は排除できない。抗生物質に対するこのような長期的な進化的反応は、最近緑膿菌とステノトロフォモナス・マルトフィリアの間で観察されたように、感受性種間の相互作用を変化させる可能性もある[46]。
結論として、1つの種が代表的な抗生物質分解耐性機構を保有することで、多種の生物群集における抗生物質曝露に対する近隣の種の応答が変化した。その結果、耐性のない同等の群集と比較して、群集組成と総存在量が変化した。感受性のある種が抗生物質の分解からどの程度恩恵を受けるかは、抗生物質濃度が変化しても生き残り、成長する本質的な能力に依存していた。このことは、抗生物質に対する個々の菌種の応答が、その近傍に存在する耐性メカニズムに依存する可能性があることを示している。臨床メタゲノムデータがより広く利用されるようになり、治療や診断に応用できるようになると[51]、対象となる病原体では検出されなくても、マイクロバイオームサンプル中のβ-ラクタマーゼのような潜在的な分解抵抗性メカニズムのアノテーションが有益となる可能性がある。私たちの実験のような抗生物質分解メカニズムが、ヒト関連コミュニティで一般的であるという証拠によって、この関連性がさらに支持されている[52]。
データの利用可能性
本研究で作成されたデータセットおよび/または解析されたデータセットは、dryadリポジトリ（DOI: 10.5061/dryad.63xsj3v7k）で入手可能である。
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謝辞
チューリッヒ工科大学のMichael MeierとMolecular and Biomolecular Analysis Service (MoBiAS)のLC-MSの協力に感謝する。プラスミド保有株を提供してくれたバーゼル大学のAdrian Egliに感謝する。Steve KettとJustus Finkにはフィードバックを、Helena Kleinには可視化のアドバイスをいただいた。
資金提供
資金源スイス国立科学財団プロジェクト310030_192428。スイス連邦工科大学チューリッヒ校よりオープンアクセス資金提供。
著者情報
著者および所属
スイス連邦工科大学チューリッヒ校環境システム科学科（D-USYS）統合生物学研究所
アユシュ・パタック、ダニエル・C・アングスト、リカルド・レオン＝サンペドロ、アレックス・R・ホール
貢献
APとARHが研究をデザインした。AP、DCA、RL-Sが研究を実施。APはデータを分析した。APとARHはDCAとRL-Sの助言を得て原稿を作成した。著者全員が原稿を修正した。ARHは研究資金を獲得した。
責任著者
Ayush Pathakに連絡。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
補足情報
抗生物質分解耐性は、種特異的応答を介して細菌群集構造を変化させる
権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものです。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
この記事の引用
Pathak, A., Angst, D.C., León-Sampedro, R. et al. Antibiotic-degrading resistance changes bacterial community structure via species-specific responses. isme j (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01465-2
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2022年12月16日受領
2023年6月15日改訂
2023年6月19日受理
2023年6月29日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41396-023-01465-2
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