高齢者における呼吸器合胞体ウイルス感染による症状の発症を、抗体よりもT細胞が予防する可能性

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オリジナル研究論文
Front. 免疫学、2023年10月13日
ウイルス免疫学
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1260146
高齢者における呼吸器合胞体ウイルス感染による症状の発症を、抗体よりもT細胞が予防する可能性

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1260146/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FIMMU_XXXXXXXX_auto-dlvrit

Bruno Salaun1* Jonathan De Smedt1 Charlotte Vernhes2 Annick Moureau2 Deniz Öner3 Arangassery Rosemary Bastian4 Michel Janssens1 Sunita Balla-Jhagjhoorsingh4 Jeroen Aerssens3 Christophe Lambert1 Samuel Coenen5,6 Christopher C. Butler7 Simon B. Drysdale8 Joanne G. Wildenbeest9 Andrew J. Pollard8 Peter J. M. Openshaw10 Louis Bont9,11 on behalf of the RESCEU Investigators
1GSK, Rue de l'Institut, Rixensart, Belgium
2サノフィ、フランス、リヨン
3Biomarkers Infectious Diseases, Janssen Pharmaceutica NV, Beerse, Belgium
4Janssen Vaccines & Prevention B.V., Leiden, Netherlands
5ベルギー、アントワープ、アントワープ大学、家庭医学・人口健康学科（FAMPOP）、総合診療センター
6ベルギー、アントワープ、アントワープ大学、ワクチン・感染症研究所（VAXINFECTIO）、医療微生物学研究室
7オックスフォード大学プライマリ・ケア・ヘルス・サイエンス学科（英国、オックスフォード
8オックスフォード大学小児科、オックスフォードワクチングループ、英国オックスフォード、国立医療介護研究機構（NIHR）オックスフォード生物医学研究センター
9オランダ、ユトレヒト、ユトレヒト大学医療センター、ウィルヘルミナ小児病院、小児感染症・免疫科
10インペリアル・カレッジ・ロンドン国立心肺研究所（英国・ロンドン
11ReSViNET財団、ユリウス・クリニカル、ザイスト、オランダ
はじめに 呼吸器合胞体ウイルス（RSV）による再感染や疾患からの部分的防御を支える免疫機構は、完全には解明されていない。高齢者では、症状は通常軽度であるが、併存疾患を有する患者では、感染が下気道に及ぶと重篤となる可能性がある。

方法 本研究は、北欧におけるRESCEU高齢者前向きコホート研究（2017～2019年；NCT03621930）の一環であり、1000人の参加者をRSVシーズンにわたって追跡した。(i)RSVによる症候性急性気道感染症（RSV-ATI、N=35）または(ii)無症候性RSV感染症（RSV-Asymptomatic、N=16）を発症した参加者の末梢血液サンプル（シーズン前、シーズン後、罹患中、回復期に採取）を解析した。これらの解析では、抗体（Fc媒介）の機能的特徴および細胞媒介免疫の評価を行い、単変量および機械学習（ML）モデルを用いて群間差を検討した。

結果 RSVシーズン前の末梢血バイオマーカーは症候性RSV感染の予測因子であった。T細胞データは機能抗体データよりも予測性が高かった（モデルの受信者動作特性曲線下面積［AUROC］はそれぞれ99％と76％）。MLモデリングによって選択されたRSVシーズン前のT細胞表現型は、RSV-ATI群よりもRSV-無症候性群で頻度が高く、RSV-ATIからの回復期に同定された顕著な表現型（例えば、CD4+ではIFN-γ+、TNF-α+、CD40L+、CD8+ではIFN-γ+、4-1BB+）と一致した。

結論 RSVシーズン中の数多くの免疫学的パラメーターの評価と統計的モデル化は、高齢者における症候性RSV感染の予防における細胞性免疫の主要な役割を示唆している。

1 はじめに
高齢者では、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染症は一般的に軽度の上気道結膜症状を引き起こすが、重篤な肺炎や生命を脅かす肺炎に至ることもある(1-5)。過去に感染したことがあると、再感染や疾患から部分的に保護されるが(6)、この免疫は通常一過性である(7)。RESCEU高齢者前向きコホート研究は、高齢者における自然免疫とRSVの疫学との関係をさらに理解するために計画された。北欧で60歳以上の参加者1000人を募集し、2017年から2019年のRSVシーズンにわたって追跡調査し、末梢血と鼻咽頭ぬぐい液のサンプルを提供した(8)。2017-2018年および2018-2019年のRSVシーズン中のRSV感染率は、それぞれ4.2％および7.2％と推定された（9）。

RESCEUがこれまでに報告した解析では、RSV急性気道感染症（RSV-ARTI）感受性とある種の抗体レベルとの間に関連があることが判明した（10）。われわれは、RSV-ARTIに対する感受性が以下のことに関連していることを示した： (i)RSVシーズン前のプレF特異的IgGの血清レベル、(ii)RSVシーズン前のプレF特異的IgAs（IgGは含まない）の粘膜レベル、(iii)RSVシーズン前のRSV G蛋白特異的IgGの血清レベル。対照的に、症候性・無症候性感染と中和抗体を含むRSV特異的抗体レベルとの間には関係は認められなかった(10)。また、最近の研究では、中和抗体以外にも、RSVチャレンジから身を守る抗体の機能的特徴が同定されている（ワクチン接種によって強化される特徴も含まれる）(11, 12)。

また、RSV-ARTIに対する感受性が加齢とともに亢進し、末梢血中のRSV F特異的IFN-γ産生T細胞が減少することが示されている。しかし、T細胞認識が自然症候性感染に対する防御にどの程度寄与しているかは不明である。

本研究の3つの目的は、(i)RSV-ARTIとRSVに対するT細胞応答の関係を明らかにすること、(ii)RSVシーズン前にT細胞または機能的抗体データからRSV-ARTI感受性を予測できるかどうかを明らかにすること、(iii)T細胞データと機能的抗体データを組み合わせることで、RSV-ARTI感受性の予測を改善できるかどうかを評価することである。

2 材料と方法
2.1 研究デザインと人口統計
検体は、RESCEU高齢者研究（ClinicalTrials.gov: NCT03621930）から得られた。この研究は、多施設、多国籍、縦断的、前向き、観察コホート研究である(8, 10)。全体として、60歳以上の地域在住成人1040人を2017-2018年または2018-2019年のRSVシーズン（10月1日～5月1日）前に募集し、その後のシーズン中に追跡した。対象者はオランダ、ベルギー、イギリスの一般地域住民であった。年齢中央値は75歳で、54％が女性であり、RSV-ARTIに罹患した参加者とそうでない参加者の人口統計学的特徴に顕著な差はなかった（年齢中央値はそれぞれ75.5歳と76.0歳であった(8, 10)）。本研究では、RESCEUの高齢者集団全体から同定された2つのグループを分析した。(i)ARTI症状を有し、RSV感染者（すなわち、分子POC検査およびqPCR陽性；RSV-ARTI群；N=35）、または(ii)ARTIを有さず、RSV感染者（RSV-無症候性群；N=16）であり、RSV特異的抗体価（RSV A2中和抗体価、またはpreFもしくはpostF結合抗体価）がRSVシーズン終了時にRSVシーズン前のベースラインから4倍以上増加していたことに基づく(10)。そのため、RSVシーズン前後の来院時（来院1および来院3）、およびRSV-ARTI群ではARTI発症時（来院2）とその2週間後の回復期（来院2c）に両群から血液サンプルが採取された。しかし、すべての血液サンプルが評価可能であったわけではない。RSV-無症候性群との比較には、RSV-ARTI群のサブセット（RSV-ARTI 4X サブセット N=11）のみを使用した。このサブセットでは、RSV-ARTIシーズン中（Visit 3まで）に、RSV-ARTIシーズン前のベースラインから4倍以上上昇したRSV特異的抗体価を有しており、抗体価の違いによるバイアスの可能性を排除した。

RESCEU試験は、ベルギー、オランダ、イギリスの施設審査委員会によって承認され、参加者は試験に参加する前にインフォームドコンセントを行った(8, 10)。

2.2 末梢血サンプルにおけるCD4+およびCD8+ T細胞の頻度
CD4+およびCD8+ T細胞頻度は、PBMC培養のin vitro刺激と免疫マーカーの染色によって測定された(16)。簡単に述べると、PBMCを、(i)RSV-A溶解物、(ii)RSV-B溶解物；または(iii)RSV-A F、(iv)M2-1、または(v)Nのコード配列にまたがるペプチドのプール（11個重なった15mers）で刺激し；あるいはバックグラウンド測定のためにPBMCを刺激しなかった（培地のみで培養した）。RSV溶解物（Zeptometrix, Buffalo, NYから市販）をVero細胞株で増殖させ、スクロース密度勾配、超遠心分離を用いて精製し、0.5% Triton X-100非イオン性洗剤/0.6 M KClの存在下で破砕し、熱不活性化した）PBMC刺激には、ウイルス溶解物を最終濃度5μg/mLで、ペプチドを1.25μg/mLで用いた。PBMCは約18時間刺激され、最後の16時間はサイトカインの細胞内蓄積を促進するために培養液にブレフェルジンAを入れた。解析は生細胞のみに焦点を当て、T細胞の同定にはCD3、CD4、CD8の染色を用いた。マーカー4-1BB、CD40L、IL-2、IL-13、IL-17、IFN-γ、TNF-αの染色は、抗原特異性と表現型を示すために用いられた。ポリ陽性T細胞（CD4+またはCD8+）は、少なくとも1つのサイトカインを含む少なくとも2つの免疫マーカーを発現するT細胞と定義された。事前のアッセイ検証から、定量下限（LLoQ）は CD4+（または CD8+）T細胞 100 万個あたりポリ陽性 CD4+（または CD8+）T細胞 590 個と定義され、空白限界（LoB）は CD4+（または CD8+）T細胞 100 万個あたりポリ陽性 CD4+（または CD8+）T細胞 310 個と設定された。LLoQは、変動係数が50%未満で検出可能な最低頻度に等しく、LoBは記述的なものであり、分析におけるカットオフとしては使用せず、培地のみを使用して細胞を刺激した場合のバックグラウンドで差し引かれた頻度の分布の95パーセンタイルを表す。RSV-AおよびRSV-Bライセートで刺激されたサンプルのアッセイLLoQ以上のT細胞頻度間の相関を解析するために、それぞれ線形回帰を使用した。

2.3 Fc介在抗体の機能性評価
システム血清学的評価は、標的特異性を定義するために preF 抗原を用いて SeromYx Systems (SeromYx Systems, Inc., Cambridge, MA 02139, USA) で実施された (17)。FcR結合、アイソタイピング、サブクラス分けに加えて、抗体依存性細胞性貪食（ADCP）、好塩基球（ADBP）、樹状細胞（ADDCP）、好酸球（ADEP）、好中球（ADNP）を含む細胞型特異的抗体依存性貪食、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）、NK細胞活性化（ADNKA）、補体沈着（ADCD）の機能アッセイを行った。機能アッセイ法の詳細については、参考文献(18, 19)および補足的方法を参照されたい。

2.4 存在頻度差分析
T 細胞頻度については、CD4+ T 細胞または CD8+ T 細胞のそれぞれの総数をオフセットとして用い、対数変換したデータにポアソン回帰モデルを当てはめた。

抗体価については、両側Studentのt検定を用いて群間の有意差を同定した。

異なるT細胞表現型と機能的抗体型については、それぞれ、症候性データポイントと無症候性データポイントの平均間の比を、絶対的な大きさでランク付けした。異なるT細胞表現型については、調整P値≦0.05が、それらの比率をランキングに含めるための閾値となった。機能的な抗体タイプについては、未調整P値を用いて、調整P値よりも厳しくない閾値で解析した。P値はBenjamini-Hochberg多重検定補正を用いて調整され、関連する表（T細胞）と図（抗体）に記載されている。

2.5 一般的な機械学習戦略
一般的に、機械学習（ML）戦略は2つの部分、すなわち最適化と評価で構成された（補足方法参照）。最適化ステップは、特徴選択と、検討されたすべてのMLモデル（すなわち、ロジスティック回帰[LR]、ランダムフォレスト[RF]、サポートベクターマシン[SVM]、K-最近傍[KNN]、および勾配ブースティング分類器[GBC]）のハイパーパラメータのチューニングに使用された。すべてのMLモデリングは、PythonのScikit-Learnフレームワークを使用して実行された。

MLモデリングから値を除外する手順については、補足方法に記述されている。

3 結果
3.1 RSV自然感染に対するT細胞反応
RSV抗原に対するT細胞応答は、RSVシーズン中、RSV感染が確認された症候性RSV感染者（RSV-ATI群）において追跡された。RSVシーズン前の期間（Visit 1）において、全ウイルス溶解液中のエピトープに特異的なCD4+（CD8+ではなく）T細胞の頻度は、一部のRSV-ARTI被験者の末梢血サンプルにおいて定量下限（LLoQ）を超えていた（表1、図1A）。抗原F、M2-1またはNに対するLLoQを超えるCD4+ T細胞頻度は、どの被験者においても同定されなかったことから、RSVシーズン前に検出されたRSV-A特異的およびRSV-B特異的CD4+ T細胞は、主に他の抗原を標的としていることが示唆された。しかしながら、2人の被験者においてのみ、LLoQ以上のCD8+ T細胞頻度が、それぞれ抗原FまたはNに対して同定された。対照的に、LLoQを超えるCD8+ T細胞頻度は、RSVライセートで刺激した後では同定されなかった。おそらくアッセイの性質が、HLA-A/B/C（MHC-I）上のライセート断片の効果的な提示に向いていなかったためであろう。

図1
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図1 RSV症候性感染の経過に伴うT細胞動態の変化。被験者別（RSV-ATI群）および来院（すなわち時点）別にT細胞頻度をバックグラウンドで差し引いた。(A）RSVシーズン前（Visit 1［V1］；N=27）、症候性RSV-ARTIが報告された時点（Visit 2［V2］；N=24）、および約2週間後の回復期（Visit 2c［V2c］；N=29）のT細胞頻度を示す。ポリ陽性表現型（すなわち、4-1BB、CD40L、IL-2、IL- 13、IL- 17、IFN-γ、およびTNF-αのうち少なくとも1つのサイトカインを含む少なくとも2つの免疫マーカーが陽性染色）についてのRSV-A特異的、RSV-B特異的、およびF特異的CD4+ T細胞頻度（CD4+ T細胞100万個当たり）、ならびにM2-1特異的、およびN特異的CD8+ T細胞頻度（CD8+ T細胞100万個当たり）を示す。(B) RSV-A特異的ポリ陽性CD4+ T細胞頻度とRSV-B特異的ポリ陽性CD4+ T細胞頻度のプロット。定量下限（LLoQ；590；水平および垂直点線）以下の値を含むすべての値を示す。空白限界（LoB；310）以下の値は310とした。r係数は、それぞれRSV-AおよびRSV-B溶解液で刺激されたT細胞頻度>LLoQの相関を表す。

表1
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表1 社会人口統計学的特徴。

症候性RSV感染はT細胞の活性化と関連していた（表1、図1A）。RSV-ATIが報告された時点（Visit 2）およびRSVシーズン前（Visit 1）と比較して、被験者の高い割合がLLoQ以上のRSV特異的CD4+ T細胞頻度を示した（RSV-A特異的、18/24（75％）対11/27（41％）；およびRSV-B特異的、17/24［71％］対7/27［26％］）。約2週間後の回復期時点（Visit 2c）では、これらの割合は再び全般的に高くなった（RSV-A特異的：27/29 [93%]、RSV-B特異的：24/29 [83%]）。同じ時点で、LLoQ以上のCD4+ T細胞頻度は、N（7/23 [30%]→4/28 [14%]）やM2-1（1/24 [4%]→1/28 [4%]）よりもF（12/24 [50%]→13/28 [46%]）に特異的な被験者の割合が高く、これはFエピトープが、試験した他のRSV抗原のエピトープよりもCD4+ T細胞にとって免疫優位であることを示唆している。さらに、個々の被験者によるLLoQ以上のRSV-A特異的およびRSV-B特異的CD4+ T細胞頻度は、感染がRSV-AによるものかRSV-Bによるものかにかかわらず、正の相関があり（r=0.91）、これらのCD4+ T細胞によって認識されるエピトープは、RSV AとRSV Bの間で保存されていることが示唆された（図1B）。CD4＋ T細胞よりは低いものの、LLoQ以上のRSV特異的CD8＋ T細胞頻度を有する被験者の割合も、RSVシーズン前（Visit 1）からRSV-ARTIを報告した時点（Visit 2）およびその2週間後（Visit 2c）まで増加した、 特に、M2-1特異的CD8+ T細胞（0/23[0%]→5/22[23%]→7/24[29%]）、N特異的CD8+ T細胞（1/24[4%]→5/21[24%]→8/24[33%]）； 表1、図1A）。

症候性RSV感染はまた、RSV特異的（F特異的）CD4+ T細胞およびRSV特異的（N特異的）CD8+ T細胞の表現型が、エフェクターから多機能性メモリーへ移行することと関連していた（図2）。さらに、ほとんどすべてのT細胞表現型は、IL-13とIL-17の二重陰性であった（したがって、これらのマーカーは図2に示されていない）。症候性RSV感染が報告された時（Visit 2）にピークを示したCD4+ T細胞表現型は、（i）IFN-γ+、（ii）IFN-γ+＋CD40L+または4-1BB+、および（iii）IFN-γ+、CD40L+、および4-1BB+を含む、IFN-γ産生が支配的であった。回復期時点（Visit 2c）でピークに達した顕著なCD4+ T細胞表現型は、(i)IFN-γ+、TNF-α+、CD40L+、IL-2+および4-1BB+、および(ii)CD40L+プラスIL-2、IFN-γ、またはTNF-αの二重または三重陽性であった。Visit2およびVisit2cにおける顕著なCD8+ T細胞の表現型は、IFN-γ+と(i) 4-1BB+、および(ii) 4-1BB+ TNF-αであった。

図2
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図2 症候性RSV感染に対するT細胞応答はIFN-γ発現が支配的である。RSV-ARTI群における表現型別および時点別のT細胞頻度をバックグラウンドで差し引いたもの。T細胞頻度は、RSVシーズン前（Visit 1; CD4+、N=27; CD8+、N=24）、症候性RSV-ARTIが報告された時点（Visit 2; CD4+、N=24; CD8+、N=21）、および約2週間後の回復期（Visit 2c; CD4+、N=28; CD8+、N=24）に示した。表現型は、4-1BB、CD40L、IL-2、IL-13、IL-17、IFN-γ、およびTNF-αのうち少なくとも1つの免疫マーカーに対する陽性染色によって決定した。(A)F特異的CD4+ T細胞頻度（CD4+ T細胞100万個当たり）と(B)N特異的CD8+ T細胞頻度（CD8+ T細胞100万個当たり）を示す（すべての表現型はIL-13とIL-17で陰性であった）。ヒストグラムのバーは頻度の中央値を示し、ひげは25～75パーセンタイルの区間を示す。ポリ陽性レベルで解析した場合の定量下限（LLoQ）以下の値を含め、すべての値を示した。40LはCD40L、IL2はIL-2、TNFはTNF-α、IFNはIFN-γ、1BBは4-1BB（CD137）。

3.2 RSVシーズン前のT細胞頻度と症候性感染に対する感受性の評価
RSVシーズン前、RSV-A特異的およびRSV-B特異的ポリ陽性CD4+ T細胞頻度がLLoQを上回った被験者の割合は、RSV-無症候性群（N=12）のRSV-ARTI-4Xサブセット（N=11；補足図1）で観察された割合と同様であった。また、RSV-無症候性グループとRSV-ARTI-4Xサブセットの個々の被験者におけるLLoQ以上のRSV-A特異的およびRSV-B特異的CD4+ T細胞頻度は、正の相関があった（r=0.91）。したがって、RSV特異的ポリ陽性CD4+ T細胞の頻度や、それらのT細胞が示すA型とB型に対する交差反応性の可能性の程度は、症候性RSV感染に対する防御とは関連していないようであった。

しかし、RSV-無症候性群とRSV-ARTI-4Xサブセットの間で、RSVシーズン前（Visit 1）にRSV特異的CD4+およびCD8+ T細胞頻度の差が、全てのT細胞データを考慮した単変量ポアソン回帰分析を用いて同定された（すなわち、発現した免疫マーカーの全ての可能な組み合わせを含み、ポリ陽性頻度がLLoQ以下であるか以上であるかに関係なく；図3）。全体として、8つのCD4+表現型と25のCD8+表現型が、調整P値≦0.05を閾値として用いた場合、RSV-無症候性グループ（それぞれN=11と9）とRSV-ARTI-4Xサブセット（それぞれN=11と10；補足表1）の間で有意に異なっていた。上位5位のCD4+表現型との最も高い倍数差は、RSV-ATI-4XサブセットよりもRSV-無症候性グループの方が9.2倍から2.7倍高い頻度であった。5つの表現型はすべてF特異的で、IFN-γ産生が優勢で、IL-13とIL-17は陰性であった。上位5位のCD8+表現型との最も高い倍数差は、まず、9.4高い頻度（F-特異的、IFN-γ+、4-1BB+）であり、次に、RSV-ARTI-4Xサブセット（F-またはM2-1-またはN-特異的、一般にCD40L陽性、IFN-γ、TNF-α、IL-13およびIL-17陰性）よりもRSV-無症候性グループの頻度が8.4から7.1低い範囲であった。従って、RSV-ARTI-4XサブセットよりもRSV-無症候性群で高値を示したT細胞表現型は、F-特異的、エフェクター/エフェクター記憶表現型に相当する。

図3
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図3 症候性RSV感染に関連する細胞媒介免疫（CMI）の特徴。データ前処理後のすべての細胞媒介免疫（CMI）特徴に関するポアソン回帰分析により、RSV-無症候性グループ（Asympt.）とRSV-ARTI-4Xサブセット（Sympt.）の間で異なる豊富さを示した8つのCD4+と25のCD8+ T細胞集団が同定された。A）CD4+T細胞、（B）CD8+T細胞について、絶対倍数差の大きい上位5つの細胞集団を示す。CD4＋（N=11 と 11、それぞれグループ別）または CD8＋（N=10 と 9、それぞれグループ別）の T 細胞データを持つ被験者のみが、回帰分析に用いられた。倍差は、症候性被験者の値と無症候性被験者の値の平均値の比として計算した。未調整のP値も示したが、調整P値≦0.05は、これらの比率をランキングに含めるための閾値とした（補足表1参照）。RSV-ARTI 4Xサブセットには、RSV-ARTI群のうち、RSVシーズン中にRSV特異的抗体価が4倍以上上昇した被験者が含まれる。40LはCD40L、IL2はIL-2、TNFはTNF-α、IFNはIFN-γ、IL13はIL-13、IL17はIL-17、1BBは4-1BB（CD137）。丸い記号は個々の値を表し、横線は平均値を表す。

3.3 RSVシーズン前の機能的抗体と症候性感染に対する感受性の評価
RSV-無症候性グループとRSV-ARTI-4Xサブセットの間で、抗体の種類と機能によって分類されるF型特異的抗体血清レベルの差は、単変量Studentのt検定によっても同定されたが（図4、補足表2）、未調整のP値≦0.05を閾値とした場合のみであった。全体として、3つの機能的特徴は、RSV-ARTI-4Xサブセット（N=16）よりもRSV-無症候性グループ（N=16）の方が少ない。これらには、(i)IP-10シグナル伝達につながるDCによる抗体依存性貪食（ADP）、(ii)好中球によるADP、および(iii)IL-8シグナル伝達につながるDCによるADPが含まれる。

図4
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図4 症候性RSV感染に関連する抗体の機能的特徴。スチューデントのt検定により、RSV-ATI-4X群（Sympt.N=16）とRSV-無症候群（Asympt.N=16）の間で異なる3つの機能的抗体特徴が同定された。Fold差は、症候性被験者の値と無症候性被験者の値の平均値の比として計算され、未調整のP値≦0.05が、ランキングに含めるこれらの比の閾値に設定された。3つの機能特徴は、(i)IL-8シグナル伝達につながるDCによるADP（ADDCP - IL8）、(ii)IP-10シグナル伝達につながるDCによる抗体依存性貪食（ADP）（ADDCP - IP10）、および(iii)好中球によるADP（ADNP - 貪食）である。調整P値（Benjamini-Hochberg多重検定補正を使用）は、(i)0.2、(ii)0.1、(iii)0.1であった。丸い記号は個々の値を表し、横線は平均値を表す。

3.4 T細胞および抗体データに基づく症候性疾患感受性の予測モデル
MLを用いて、RSVシーズン前のデータから症候性RSV感染に対する防御を予測できるモデルを同定した（図5）。これらのモデルでは、RSV-無症候性サブセットとRSV-ARTI-4Xサブセットを識別する特徴（すなわち、T細胞の特異性や表現型、または抗体の機能）が選択された。次に、これらのモデルの出力予測値に対して積層モデルを学習させた。最良のT細胞データモデルの予測能力は、最良の抗体データモデルよりも高く、これは受信者動作特性曲線下面積（AUROC；99％対76％）が大きく、2つのグループからデータポイントを分離する能力が向上していることからも示される。積層MLモデルは、最良のT細胞データモデルと同様の予測能力（AUROC、95％）を有していた。さらに、T細胞データモデルと抗体データモデルによって選択された特徴に関連するデータの主成分分析（PCA）（補足表2）は、最初の2つの主成分のプロットにおいて、2つのグループを明確に識別した（図5）。

図5
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図5 症候性RSV感染の予測モデル。RSVシーズン前に採取した検体からRSV ARTIに対する感受性を予測することができた。(A）T細胞データのみ（x軸）または血清学データのみ（y軸）で学習させた機械学習（ML）モデルによる予測値のグラフ化。予測値0は無症状の予測を示し、予測値1は有症状の予測を示す。積層MLモデルは、前の2つのMLモデルの出力予測値（その決定境界[曲線]で表される）で学習された。予測は、200回の5重クロスバリデーションで各テストセットに対して行われた。したがって、各被験者について200の予測値が示されている。T細胞データと抗体データの両方を持つ被験者のデータのみが、トレーニングとテストに使用された（N=26）。(B）ROC（Receiver Operating Characteristic）曲線は、スタックされていないMLモデルとスタックされたMLモデルの性能を示す。真陽性率と偽陽性率は、T細胞データと機能的抗体データの両方を持つ26人の被験者について、200回の5重クロスバリデーション設定で行われた予測について計算された。ROC曲線下面積（AUC）は、最良の血清学モデルとCMIモデル、およびスタックモデルについて示されている。(C)非積層MLモデルによって選択された特徴の主成分(PC)分析は、PC1とPC2でプロットした場合、無症候性(Asympt.)と症候性(Sympt.)の被験者(N=26)の分離を示す。データのばらつきに対するPCの寄与率は、軸ラベルに示されている。

4 考察
我々は、RESCEU高齢成人コホート(8, 10)の末梢血サンプル中のRSV特異的T細胞をRSV自然感染の経過にわたってモニターし、症候性RSV感染とRSVシーズン前のRSVに対するT細胞応答との関係を明らかにした。また、RSV感染による呼吸器症状発症のしやすさは、RSVシーズン前のT細胞データによって予測できる可能性が示唆された。機能的抗体データは、RSV感染による症状発症のしやすさをある程度予測することができたが、機能的抗体データとT細胞データを組み合わせても、T細胞データのみで構築されたモデルの予測値をそれ以上向上させることはできなかった。その後のRSV感染が症候性ではなく無症候性であった患者において、RSVシーズン前に高かったT細胞表現型は、RSV-ARTIからの回復期に同定された顕著で潜在的な記憶表現型（例えば、CD4+、CD40L+、IFN-γ+、TNF-α+、およびCD8+ IFN-γ+、4-1BB+）と重複していた。IFN-γの産生もまた、感染中に動員されたCD4+ T細胞の表現型の顕著な特徴であった。我々の知る限り、これはRSV自然感染経過におけるT細胞の機能プロファイルの変化を記述した最初の報告である。感染過程におけるT細胞の関与は、細胞性適応免疫が感染を制御する役割を担っていることを示唆しており、実験的RSVチャレンジモデル(14)の結果と一致している。

この結果の解釈には、解析母集団が少数であること、粘膜ではなく末梢血からしかサンプルが得られていないこと（13）、統計モデルが独立したデータセットで検証されていないことなど、研究の限界に注意する必要がある。さらに、高齢者では以前にも報告されているように（15）、高齢者の末梢血におけるRSV特異的T細胞の頻度は、特に特定の表現型サブセットでは一般的に低かった。さらに、我々のモデリング解析はデータ駆動型であったため、データ作成に使用したアッセイの性質に依存していた（すなわち、細胞媒介解析ではT細胞サブセットのRSV特異的頻度、機能的特徴で分類したプレF特異的抗体のレベル）。T細胞の他の機能的側面（サイトカイン産生、脱顆粒、疲弊の程度）や、他の抗原に対する抗体の特異性に焦点を当てたアッセイでは、無症候性感染と症候性感染において、さらなるカテゴリーが同定されたかもしれない。データの解釈を形成する可能性のあるバイアスは他にもある。無症候性症例の選択基準には、RSVシーズン中の抗体価の4倍上昇が用いられ、モデル化ではこの基準が症候性症例にも適用された。このため、RSVシーズン前の抗体価が高い患者は除外される傾向があった(10)。しかし、より低い閾値（〜1.5倍）を用いて無症候群への組み入れを決定した場合、F結合抗体価や中和抗体価については、無症候群と症候群との間に差は確認されなかった(10)。PCRのような免疫マーカーの測定に依存しない無症候性感染の検出方法は、全参加者の追跡調査期間を通じてサンプリングを頻繁に行う必要があったため、実施されなかった。

症候性RSV感染に対するCD4+ T細胞反応は、IFN-γ産生を目的としたエフェクター細胞によって支配されているように見えたが、回復期に検出された優勢な亜集団は、エフェクター記憶表現型と一致する4～5個の免疫マーカーを発現する多機能性であった。興味深いことに、完全に多機能な表現型（5つの免疫マーカーを発現）は、RSVシーズン前に検出された主な表現型であった。おそらく、このRSVシーズン前の表現型は、研究参加者全員からF特異的抗体が検出されたことから、以前にRSVに暴露されたことを反映していると考えられる(10)。

RSVシーズン前、CD4+ T細胞によって認識された主なエピトープはRSV Fではなく、おそらくRSV溶解液中のRSV Gタンパク質であったようである。それにもかかわらず、RSV流行前のLLoQ以下ではあるが、F特異的ポリ陽性CD4+ T細胞が検出された。一部のポリ陽性サブセット（主にIFN-γ産生T細胞）は、症候性RSV感染症に移行した被験者では、無症候性感染症に移行した被験者よりも頻度が低かった。同様に、F特異的エフェクターCD8+ T細胞（IFN-γ産生4-1BB+ T細胞）の頻度も低く、RSV自然感染の制御におけるF特異的T細胞免疫の役割を示唆している。これらの結果は、別の呼吸器系ウイルスであるインフルエンザで観察された結果と同程度であり、感染後に症状を発症した成人では、多機能性CD4+ T細胞とIFN-γ産生CD8+ T細胞の頻度が低いことが確認された(20)。対照的に、CD40Lを発現しているCD8+ T細胞（しかし、他のマーカーは検査していない）は、無症候性RSV感染者よりも有症候性RSV感染者の方が頻度が高かった。このCD8+ T細胞サブセットの性質と役割は不明であった。CD40L+の表現型はCD8+ T細胞には珍しく、通常はCD4+ T細胞に限定される。CD8+T細胞はLCMV感染マウスのCD8+メモリーコンパートメントで報告されているが、これらの細胞は刺激によりさらにサイトカインを発現した(21)。したがって、これらの細胞の機能と症候性感染への感受性との関連性を解明するためには、さらなる調査が必要である。

T細胞ほど強くはないが、RSVシーズン前の血清抗体機能的特徴とRSV感染による症状発症のしやすさとの間に、統計的モデリングから関連が確認された。しかし、P値を多重比較で調整した場合、個々の抗体機能的特徴の存在量差分析では関連は確認されなかった。正の）倍数差で上位にランクされた3つの機能の1つは、好中球の貪食誘導を含み、これはRSV-challengeで同定された好中球炎症と症候性RSV感染への感受性との関連と一致する(22)。対照的に、抗体介在性細胞貪食作用は、RSVチャレンジ研究において感染予防に関連する特徴であり、この特徴はFコード前アデノウイルスワクチン候補で強化された(11)。RSVチャレンジ研究では、感染の予防（すなわち、鼻腔ぬぐい液に生きたウイルスが含まれないこと）を評価したのに対し（11, 12, 23）、我々の研究では、RSV無症状の被験者が感染している可能性があるため、感染による呼吸器系症状の予防を（間接的に）評価した（したがって、RSV特異的抗体が4倍以上増加した）。したがって、我々の予測モデリングは、初期感染そのものを予防または制限する因子（典型的な抗体媒介因子）よりも、症候性疾患への感染の進行を予防する因子を同定することに偏っていた。

結論として、RSVシーズン中の数多くの免疫学的パラメータの評価と統計的モデリングは、高齢者におけるRSV感染症の症状発現を予防する上で、細胞性免疫が主要な役割を果たすことを示唆している。したがって、症候性感染の予防に関連する特定のF特異的T細胞エフェクター記憶集団の同定は、高齢者におけるRSVに対する自然免疫を理解し、市販間近のRSVワクチン候補に対するT細胞応答の誘導（および持続性）を評価する上で有用なマーカーとなる。

データの利用可能性
本論文の結論を裏付ける生データは、著者らにより、過度の留保なく入手可能である。

倫理声明
RESCEU研究は、ベルギー、オランダ、イギリスの施設審査委員会の承認を得ており、参加者は研究に参加する前にインフォームドコンセントを行った [8, 10]。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。参加者は、本研究への参加について書面によるインフォームド・コンセントを行った。

著者貢献
BS：執筆-原案、執筆-校閲・編集。JD：執筆-原案、執筆-校閲・編集。CV： 執筆-原案、執筆-校閲・編集。AM： 執筆-原案、執筆-校閲・編集。DÖ： 執筆 - 原案, 執筆 - 校閲・編集. AB: 原稿執筆、校閲・編集。MJ: 原稿執筆、校閲・編集。SB-J: 原稿執筆、校閲・編集。JA: 原稿執筆、校閲・編集。CL: 原稿執筆、校閲・編集。SC: 執筆-校閲・編集。CB: 原稿執筆、校閲・編集 SD: 原稿執筆、校閲・編集。JW: 原稿執筆、校閲・編集。AP： 執筆-原案、執筆-校閲・編集。PO: 原稿執筆、校閲・編集。LB：執筆-原案、執筆-校閲・編集。

資金援助
著者らは、本論文の研究、執筆、および/または出版のために金銭的支援を受けたことを表明する。本研究はRESCEUコンソーシアム（RESpiratory Syncytial virus Consortium in Europe）の支援を受け、Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertakingより助成金契約116019を受けた。本共同事業は、欧州連合（EU）のHorizon 2020 Research and Innovationプログラムおよび欧州製薬団体連合会（European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations）の支援を受けている。

謝辞
RESCEU（REspiratory Syncytial virus Consortium in Europe）による臨床研究の参加者に感謝する。著者らは、Todd Suscovitch（残念ながら原稿完成前に逝去）、Jishnu Das、Lenny Moiseを含むSeromYxの共同研究者に感謝する。Matthew Morgan（MG Science Communications、ベルギー）が科学的執筆を、Yuwen Gu（Akkodis 、ベルギー、GSKの代理）が編集協力と原稿調整を行った。

利益相反
著者CVとAMは、本試験の実施中にサノフィ社に雇用され、同社のストックオプションを保有していた。著者SB-J、AB、JA、DÖはJanssen Pharmaceutica NVに雇用されていた。著者SB-J、AB、JAはJohnson & Johnson社の株式を所有している。著者MJ、BS、CL、JDはGSK社に勤務しており、BSとCLは同社の株式を所有している。著者CLは、SARS-COV2に対する免疫反応を改善するための組成物および方法に関する特許を出願していた。この間、GSKの代表としてAdventitious Virus Detection Technologies Interest Groups AVDTIGのサブグループの共同リーダーを務めた。著者のSDは、アストラゼネカ、メルク、ファイザー、バルネバ、イリアド、サノフィ、ヤンセンなどの製薬会社でワクチンや抗菌薬の臨床試験の治験責任医師を務め、以前はサノフィとメルクのRSV諮問委員会の委員を務めた。著者のJWはヤンセンとサノフィの諮問委員会のメンバーであった。また、著者のLBと密接に協力し、LBが助成金を受けた多くのプロジェクトや臨床研究を行った。著者APは、ゲイツ、ウェルカム、MRC、NIHR、欧州委員会IMI RESCEUから助成金を受けた。この間、研究室のアッセイはGSK社から提供された。著者APは、オックスフォード大学イノベーションがアストラゼネカにライセンスした知的財産の貢献者である。また、塩野義製薬からコンサルティング料を受領。2022年までDHSCのJoint Committee on Vaccination and Immunisationの議長を務め、WHOのSAGEメンバーでもある。著者POはRESCEU EU IMI賞を受賞し、GSK、Moderna、Janssen、Sequirus、Pfizerからコンサルティング料を受け取った。また、Moderna社、Medscape社から支払いや謝礼を受け、Moderna社の会議に出席するための支援を受けた。このプロジェクト期間中、サマセット州シドコットの学校ガバナーも務めた。UKRIおよびMRC EMINENTから助成を受けた。著者のLBは、製薬会社やその他の産業界のパートナーとの定期的な交流がある。UMCUは、AbbVie、MedImmune、AstraZeneca、Sanofi、Janssen、Pfizer、MSD、MeMed Diagnosticsから医師主導治験の資金援助を受けている。UMCUは、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団からRSV GOLD試験に対する資金援助を受けている。UMCUは、GSK、Novavax、Janssen、AstraZeneca、Pfizer、Sanofiと共同で、IMIが資金を提供したRESCEUおよびPROMISEプロジェクトの一環として資金提供を受けている。UMCUは、MedImmune社およびファイザー社が主催する臨床研究への参加に対し、Julius Clinical社から資金援助を受けている。UMCUはAbbVie、MedImmune、Ablynx、Bavaria Nordic、MabXience、GSK、Novavax、Pfizer、Moderna、Astrazeneca、MSD、Sanofi、Genzyme、Janssenからコンサルテーションおよび招待講演のための資金提供を受けている。著者のLBはReSViNET財団の設立委員長である。

残りの著者は、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言している。

発行者注
本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1260146/full#supplementary-material に掲載されている。

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キーワード：呼吸器合胞体ウイルス、細胞媒介免疫、防御相関、インターフェロンγ、T細胞記憶、CD4＋T細胞、抗体機能、機械学習

引用 Salaun B, De Smedt J, Vernhes C, Moureau A, Öner D, Bastian AR, Janssens M, Balla-Jhagjhoorsingh S, Aerssens J, Lambert C, Coenen S, Butler CC, Drysdale SB, Wildenbeest JG, Pollard AJ, Openshaw PJM and Bont L (2023) 高齢者における呼吸器合胞体ウイルス感染から発症する症状を、抗体よりもT細胞が予防する可能性がある。Front. Immunol. 14:1260146.

受理された： 2023年7月17日；受理：2023年9月25日；
発行：2023年10月13日

編集者

ヘリベルト・シュトイバー、インスブルック医科大学、オーストリア
査読者

テイラー・エデンズ（ピッツバーグ小児病院、米国
Tesfaye Gelanew、アーマウアー・ハンセン研究所（AHRI）、エチオピア
Teun Guichelaar, 国立公衆衛生・環境研究所（オランダ）、オランダ
Copyright © 2023 Salaun, De Smedt, Vernhes, Moureau, Öner, Bastian, Janssens, Balla-Jhagjhoorsingh, Aerssens, Lambert, Coenen, Butler, Drysdale, Wildenbeest, Pollard, Openshaw and Bont. 本記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 ブルーノ・サラウン、bruno.x.salaun@gsk.com

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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