高乳酸血症糖尿病犬における乳酸関連糞便微生物群の変化について

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研究論文実験的研究
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高乳酸血症糖尿病犬における乳酸関連糞便微生物群の変化について
キム・ジヒョン、アン・ジュヒョン、イ・ジョンファ、パク・スミン、リム・ガヒョン、オ・イェイン、ソ・キョンウォン、ユン・ファヨン
In Vivo 2023年3月号, 37 (2) 696-701; DOI: https://doi.org/10.21873/invivo.13130
記事図表・データ情報・測定値PDF
アブストラクト
背景・目的：近年、腸内細菌叢と内分泌疾患の相関は、その病態の把握や臨床評価の重要な鍵として注目されている。本研究では、インスリン依存性糖尿病（IDDM）犬の血中乳酸値に関するマイクロバイオームを評価した。材料と方法 17名の被験者から糞便を採取し、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応判定を行い、乳酸産生菌とディスバイオシス指数関連菌の遺伝子発現量を定量化した。結果は以下の通り。血中乳酸濃度が高い患者において、乳酸産生菌であるLactobacillus属、Enterococcus属、Bifidobacterium属の発現量が確認された。糖尿病犬では、非糖尿病犬に比べ、EnterococcusとBifidobacteriumの存在量が高かった。血中乳酸濃度が高い場合、Bifidobacteriumの存在量も増加した。結論 血中乳酸濃度は、IDDMの犬の腸内細菌叢に影響を与える。本研究は、ヒトおよび獣医療における糖尿病との関連で腸内細菌叢を理解するのに役立つと思われる。

Key Words
糖尿病、インスリン依存性糖尿病、マイクロバイオタラクテート
マイクロバイオームのバランスが崩れた腸内環境異常は、代謝異常、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、炎症性腸疾患、免疫機能低下と関連しています（1）。最近の便中マイクロバイオームに関する研究は、糖尿病と腸内細菌叢との相互作用に着目し、世界中の科学者や医療従事者の注目を集めています（2）。

インスリン依存性糖尿病（IDDM）または1型糖尿病（T1D）は、犬で最も一般的な糖尿病タイプです（3）。糖尿病が持続すると、β細胞の消失、低インスリン血症により、ほとんどの細胞への循環グルコースの供給が不足し、肝の糖新生とグリコーゲン分解が促進されます(4)。近年、IDDMの病態とディスバイオシスの間に相関関係があることが示唆されています。しかし、これらの研究は依然として議論の余地があり、IDDMにおける腸内細菌叢のアンバランスを定義し、原因因子を特定するためにはさらなる研究が必要です（5）。

IDDMの患者さんは、特にコントロールが不十分な場合、過剰な肝グリコーゲンを蓄え、血漿乳酸値の上昇を示すことがあります（6）。血中乳酸値の上昇は、ヒトのIDDM患者において緊急の合併症を引き起こす可能性があります。これまでの研究で、腸内細菌異常と乳酸濃度の相関が報告されています(7)。しかし、IDDM患者における血中乳酸濃度の上昇と糞便微生物相の間の基礎的なメカニズムに焦点を当てた研究はこれまでありませんでした。

本研究では、非糖尿病犬および糖尿病犬の微生物群集を評価し、糖尿病犬の血中乳酸濃度が腸内細菌叢に影響を与える主要因であると仮定した。

材料と方法
動物たち 被験者を糖尿病犬と健康な（非糖尿病）犬に分類した。血中乳酸濃度に影響を与える可能性のある疾患を持つ犬は、本研究の対象外とした。犬の正常な循環乳酸値は、≦2.5mmol/lである（8）。糖尿病の犬は、血中乳酸濃度の基準により、正常範囲内と正常範囲以上の2群に分けられた。

サンプル採取 自然発生したIDDMの犬（n=11）および健康な犬（n=6）を、ソウル大学獣医学部教育病院の病院住民から登録した。また、IDDMの犬は、血中乳酸値が正常なもの（N-DM、n=5）と正常範囲以上のもの（L-DM、n=6）に分けられた。DMを持つ犬は、尿検査と臨床症状に基づいて診断された。すべての犬は、保護者からインフォームドコンセントを得た後、この研究に参加した。すべてのプロトコルは、事前にソウル大学機関動物ケアおよび使用委員会の承認を得ており、ガイドライン（SNU-200912-3）に準拠している。

サンプル分析 血液は、絶食状態の両群の犬から、頸静脈または頭静脈を用いた定型静脈穿刺により採取した。グルコース、ケトン（i-Sens, CareSens Dual, Seoul, Republic of Korea）、ヘモグロビンA1c（Hb1ac; Biattic, Aniscan, Gyeonggi-do, Republic of Korea）、乳酸（Nova biomedical, Stat Strip xpress lactate, Como, Italy）は新鮮全血で測定し、フルクトサミン（IDEXX, Catalast one, Jericho, NY, USA）は血清中で測定した。血清は採取後15分以内に素早く分離された。血液ガス分析用のサンプル（i-Sens, i-Smart, Seoul, Republic of Korea）は、ヘパリンコートされたシリンジで採取された。すべての犬は、サンプルを採取する前に少なくとも12時間絶食させた。フリーキャッチ尿を使用した。尿グルコースの存在は、尿試験紙（Combur-Test®; Roche, Basel, Switzerland）を用いて確認された。IDDMの犬の大半（n=8）には糖尿病用の処方食を与え、IDDMの犬3頭には市販の維持用飼料を与えた。対照犬はすべて市販の維持用飼料を与えていた。サンプル採取の6ヶ月以上前に抗生物質の投与歴がある犬はいなかった。また、糞便サンプルはフリーキャッシュし、すべてのサンプルが採取されるまで-80℃で保存した。

RNA抽出、cDNA合成、およびRT-qPCR。糞便RNAは、RNeasy Power Microbiome Kitを使用して、製造者の指示に従い抽出した（Qiagen, Hilden, Germany）。cDNAは、Cell Script cDNA MasterMix（セルセーフ）を使用して、製造者の指示に従いサンプルRNAを分離することにより合成した。合計10μlのcDNAを合成し、DEPCで希釈した。この実験では、合計7つの細菌をターゲットとし、RT-qPCR（StepOne™ Real-Time PCR System, ThermoFisher, Waltham, MA, USA）を用いて定量化しました。標的菌とプライマー配列は表Iに示す。比較のため、ユニバーサルcDNAを一緒に測定した。

インラインで見るパワーポイントをダウンロードする
表I．
本研究で微生物群の遺伝子発現を検出するために使用したプライマー配列。

統計解析。すべての実験は三重で行い、3回繰り返した。統計解析には、GraphPad prism (version 6.01) software (GraphPad, Inc., La Jolla, CA, USA)を使用した。2群以上の比較は、一元配置分散分析に続いて、ボンフェローニの多重比較検定を行った。結果は平均値±標準偏差で示した。p値＜0.05は統計的に有意とみなした。

結果
参加者の特徴 Signalment は表 II に記載されている。健康な犬には特に異常はなかった。乳酸値が正常であったIDDMの犬は、尿石症、気管虚脱、慢性心臓弁膜症、肥満細胞腫切除歴など、血中乳酸濃度に影響を及ぼす疾患を有していなかった。乳酸濃度が上昇したIDDMの2頭には副腎皮質機能亢進症があったが、他の犬には病気がなかった。糖尿病犬と健常犬の血中乳酸濃度の違いを評価した。2頭を除き、IDDMの犬は血糖値が正常値より高かった。健康な犬の血糖値は正常範囲内であった。糖尿病の犬も乳酸濃度が高かった。糖尿病犬はさらに高乳酸群と正常乳酸群に分けられた。3つのDMコントロール指標（空腹時グルコース、ケトン、Hb1ac、フルクトサミン）を測定しました（図1）。DM群は、乳酸値、血糖値、ケトン体、Hb1ac、フルクトサミン値が健常群より高かった。L-DM群はN-DM群に比べ、ケトン体濃度が有意に高かった。DM群は健常者群と比較して血中pHが高かったが、DM群間で有意差はなかった（図2）。pCO2およびpO2は、DM群と健常群との間に有意な差はなかった。重炭酸は、DM群が健常群に比べ低かった。

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表II．
本研究に参加した17頭の犬種、年齢、性別などの特徴。

図1.
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図1.
血中乳酸、グルコース、ケトン、フルクトサミン、Hb1Acの濃度。血中乳酸値によりグループを分け、各グループの結果値を比較した。H：健康（非糖尿病）犬群、N-DM：正常血中乳酸濃度糖尿病犬群、L-DM：正常範囲以上の血中乳酸濃度糖尿病犬群（*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001、one way ANOVAにより決定した）。

図2.
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図2.
糖尿病犬における静脈血ガス分析。血液ガス検査結果値は、各群で比較した。H：健康（非糖尿病）犬群、N-DM：糖尿病犬群の血中乳酸濃度が正常、L-DM：糖尿病犬群の血中乳酸濃度が正常範囲を超えている。(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, one-way ANOVAにより決定).

糞便中の細菌と血中乳酸濃度の相関性 全群で乳酸産生菌を調査した。ビフィドバクテリウムとエンテロコッカスは、DM両群で健常者群に比べ多く含まれていた。特にビフィドバクテリウムはN-DM群よりL-DM群で多かった。乳酸菌は、DM群で健常群より少なかった（図3）。

図3.
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図3.
IDDM犬の糞便中の乳酸産生菌の相対的mRNA発現量。健常犬および糖尿病犬におけるBifidobacterium、Enterococcus、Lactobacillusの相対的なmRNA発現量。各群の細菌mRNAを疾患犬と健常対照犬で比較した。H：健康（非糖尿病）犬群、N-DM：糖尿病犬群の血中乳酸濃度が正常、L-DM：糖尿病犬群の血中乳酸濃度が正常範囲を超えている。

ディスバイオシスと関連する糞便細菌 ディスバイオシスと関連する3つの細菌を評価した。Blautia mRNA発現量はDM群では健常群より低かったが、L-DM群ではN-DM群より低かった。ツリシバクターmRNAの発現はDM群で有意に低かった。乳酸値が上昇すると、Turicibactor mRNAの発現量は減少する傾向があった。FeacalibactorのmRNA発現量は、DM群では健常群に比べ低かった（図4）。

図4.
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図4.
ディスバイオシス指数関連菌の相対的mRNA発現量。Blautia、Turicibactor、Faecalibactorの相対的なmRNA発現量。各群の細菌mRNAを疾患者と健常者コントロールで比較した。H：健康（非糖尿病）犬群、N-DM：糖尿病犬群の血中乳酸濃度が正常、L-DM：糖尿病犬群の血中乳酸濃度が正常範囲を超えている。

考察
本研究では、IDDM患者の血中乳酸濃度と糞便微生物叢の変化には相関があると仮定した。血中乳酸濃度によるマイクロバイオームの変化を調べるため、ビフィドバクテリウム属菌、腸球菌属菌、乳酸菌属菌などの乳酸生成に関連する細菌を調べた（9）。その結果、糖尿病患者では健常者に比べてビフィドバクテリウム属菌と腸球菌属菌が増加し、乳酸菌属菌が減少する傾向があることが確認されました。これらの知見は、これまでに研究された腸内細菌叢と関連していることが注目される。

Brugmanらは、糞便のマイクロバイオームを調査し、T1DMのラットでは、糖尿病のないラットに比べてLactobacillusとBifidobacteriumの集団が低い微生物数を示すことを発見しました（10）。Yangらは、糞便中の腸球菌の割合がT1DMのマウスで高いことを発見した(11)。興味深いことに、Patersonらは、糖尿病の発症と進行に伴う腸内細菌叢の変化を調べ、T1DMの進行は乳酸産生菌（すなわち、LactobacillusとBifidobacterium）の増加と一致することを明らかにしました（12）。Barnettらは、糖尿病に伴う高乳酸血症は、疾患の時間的経過における初期のイベントである可能性を提唱した（13）。また、Brouwersらは、コントロール不良のT1DMと糖原性肝障害の患者における乳酸濃度の上昇を報告しており、血漿乳酸濃度の亢進がこれらの疾患の臨床スペクトルの一部であることを示唆している（6）。本研究では、糖尿病犬においても、血中乳酸濃度に応じて腸管糞便の細胞が変化することが確認された。糖尿病患者の腸内細菌叢に影響を与える要因についてはさらなる研究が必要ですが、乳酸値が上昇した糖尿病患者において、乳酸産生菌の変化を報告したのは本研究が初めてです。

また、乳酸産生菌は腸管内細菌叢の形成に大きな役割を果たすことが知られており、ディスバイオシスに関連するブラウティア、ターリシバクター、フェーカリバクターを特定することで、それが他の細菌叢にどのように影響するかを確認しました（9）。今回の結果は、糖尿病患者の腸内細菌叢が血中乳酸濃度に応じて変化することを示しており、血中乳酸濃度が糖尿病患者の腸内細菌叢異常の大きな指標となる可能性があることを意味しています。

腸内細菌叢は、消化を調節したり、免疫系をサポートしたりと、健康において重要な役割を果たしていることはよく知られている(14)。そのため、代謝性疾患、がん、炎症性腸疾患、自己免疫疾患などの慢性疾患の治療に腸内細菌を活用するための様々な研究が行われている(15)。特に、腸内細菌叢のバランスの崩れは、T1DM患者の免疫系に影響を与えることが知られており、腸の炎症を悪化させることが報告されています（16）。しかし、糖尿病患者における腸内細菌叢に関する研究はまだ不十分であり、腸内細菌叢を標的とした治療薬の開発や糖尿病患者への応用の可能性については、さらなる研究が必要である。

制限微生物菌の存在は確認できたが、糞便中にディスバイオシスが存在するかどうかについては、まだ判断できていない。また、DMで観察される微生物叢の変化が、疾患表現型の結果なのか、病態生理との因果関係があるのかについては、さらなる研究が必要である。しかし、今回の研究結果は、糖尿病犬の血中乳酸濃度の観点から糞便微生物叢の変化を確認した最初の研究であり、大きな価値がある。今回の結果は、獣医学およびヒトの医学において、糖尿病疾患におけるマイクロバイオームの理解をさらに深めるための重要な基礎データとなるものです。

血中乳酸濃度がIDDMの犬の糞便微生物叢の変化に影響を与える主要因であることを確認しました。これらの知見は、IDDM患者の腸内細菌叢の理解を深めるのに役立つものである。

脚注
著者の貢献度

JHK：データキュレーション、形式分析、調査、リソース、ライティング、オリジナルドラフト。JHA：概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、リソース、ライティング、オリジナルドラフト、ライティング・レビュー＆エディティング。JHL：データキュレーション、ライティング・レビュー＆エディティング。SMP：データキュレーション、ライティング、レビュー、編集。GHL: データキュレーション、ライティング・レビュー・編集。YIO: データキュレーション。KWS: データキュレーション、執筆・レビュー・編集 HYY: 概念化、データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、資源、ソフトウェア、監督、検証、可視化、執筆・レビュー・編集。

資金調達

本研究は、ソウル大学獣医科学研究院（大韓民国ソウル市）から一部支援を受けた。

利益相反

著者らは、本研究に関連して報告すべき利益相反はない。

2022年12月27日に受領。
2023年1月12日改訂版受領。
2023年1月13日に受理された。
著作権 © 2023, 国際抗がん剤研究所（ジョージ・J・デリナシオス博士）, 無断転載禁止
この記事は、Creative Commons Attribution (CC BY-NC-ND) 4.0 international license (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0) の条件に基づいて配布されたオープンアクセス記事です。

参考文献
↵Hooper LV, Littman DR and Macpherson AJ: Interactions between microbiota and the immune system. サイエンス 336(6086): 1268-1273, 2012. pmid: 22674334. DOI: 10.1126/science.1223490Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Paun A, Yau C and Danska JS: 1型糖尿病に対するマイクロバイオームの影響。J Immunol 198(2): 590-595, 2017. pmid: 28069754. DOI: 10.4049/jimmunol.1601519Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Rand JS, Fleeman LM, Farrow HA, Appleton DJ and Lederer R: Canine and feline diabetes mellitus: nature or nurture? J Nutr 134(8 Suppl): 2072s-2080s, 2004. pmid: 15284406. DOI: 10.1093/jn/134.8.2072sAbstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Nelson RW and Couto CG: Small animal internal medicine-e-book. エルゼビア・ヘルス・サイエンス, 2019.Google Scholar
Gilbert JA, Blaser MJ, Caporaso JG, Jansson JK, Lynch SV and Knight R: Current understanding of human microbiome. Nat Med 24(4): 392-400, 2018. pmid: 29634682. DOI: 10.1038/nm.4517CrossRefPubMedGoogle Scholar
⅛Brouwers MC, Ham JC, Wisse E, Misra S, Landewe S, Rosenthal M, Patel D, Oliver N, Bilo HJ and Murphy E: Elevated lactate levels in patients with poorly regulated type 1 diabetes and glycogenic hepatopathy: a new feature of Mauriac syndrome. Diabetes Care 38(2): e11-e12, 2015. pmid: 25614691. DOI: 10.2337/dc14-2205FREE Full TextGoogle Scholar
↵Venn EC、Barnes AJ、Hansen RJ、Boscan PL、Tuedt DC、Sullivan LA: パルボウイルス性腸炎の犬における血清D-乳酸濃度。J Vet Intern Med 34(2): 691-699, 2020. pmid: 31919893. DOI: 10.1111/jvim.15688CrossRefPubMedGoogle Scholar
Hughes D, Rozanski ER, Shofer FS, Laster LL and Drobatz KJ: Effect of sampling site, repeated sampling, pH, and PCO2 on plasma lactate concentration in healthy dogs. Am J Vet Res 60(4): 521-524, 1999. PMID: 10211699.PubMedGoogle Scholar
⅛Blake AB, Guard BC, Honneffer JB, Lidbury JA, Steiner JM and Suchodolski JS: Altered microbiota, fecal lactate, and fecal bile acids in dogs with gastrointestinal disease. PLoS One 14(10): e0224454, 2019. PMID: 31671166. DOI: 10.1371/journal.pone.0224454CrossRefPubMedGoogle Scholar
Brugman S, Klatter FA, Visser JT, Wildeboer-Veloo AC, Harmsen HJ, Rozing J and Bos NA: Bio-Breeding diabetes-prone ratにおいて、抗生物質の投与は1型糖尿病を部分的に予防する. 腸内細菌叢は1型糖尿病の発症に関与しているのだろうか？Diabetologia 49(9): 2105-2108, 2006. pmid: 16816951. DOI: 10.1007/s00125-006-0334-0CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Yang C, Fei Y, Qin Y, Luo D, Yang S, Kou X, Zi Y, Deng T and Jin M: Bacterial flora changes in conjunctiva of rats with streptozotocin-induced type I diabetes. PLoS One 10(7): e0133021, 2015. pmid: 26176548. DOI: 10.1371/journal.pone.0133021CrossRefPubMedGoogle Scholar
Patterson E, Marques TM, O'Sullivan O, Fitzgerald P, Fitzgerald GF, Cotter PD, Dinan TG, Cryan JF, Stanton C and Ross RP: Sprague-Dawley ratにおけるStreptozotocin誘発の1型糖尿病発症は腸内細菌叢構成の変化と多様性の減少と関連しています。微生物学（リーディング）161(Pt 1): 182-193, 2015. pmid: 25370749. DOI: 10.1099/mic.0.082610-0CrossRefPubMedGoogle Scholar
⅛Berhane F, Fite A, Daboul N, Al-Janabi W, Msallaty Z, Caruso M, Lewis MK, Yi Z, Diamond MP, Abou-Samra AB and Seyoum B: 血漿乳酸値は高インスリン血症ユグリセミッククランプと経口糖負荷試験で増加する。J Diabetes Res 2015: 102054, 2015. pmid: 25961050. DOI: 10.1155/2015/102054CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Liu W, Cheng M, Li J, Zhang P, Fan H, Hu Q, Han M, Su L, He H, Tong Y, Ning K and Long Y: Classification of gut microbiota during development of intensive care units of patients in sepsis and septic shock. ゲノミクス・プロテオミクス・バイオインフォマティクス 18(6): 696-707, 2020. pmid: 33607294. DOI: 10.1016/j.gpb.2020.06.011CrossRefPubMedGoogle Scholar
Dosoky NS, May-Zhang LS and Davies SS: Engineering gut microbiota to treat chronic diseases. Appl Microbiol Biotechnol 104(18): 7657-7671, 2020. pmid: 32696297. DOI: 10.1007/s00253-020-10771-0CrossRefPubMedGoogle Scholar
ȕZhang S, Cai Y, Meng C, Ding X, Huang J, Luo X, Cao Y, Gao F and Zou M: The role of the microbiome in diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract 172: 108645, 2021. pmid: 33359751. DOI: 10.1016/j.diabres.2020.108645CrossRefPubMedGoogle Scholar
Handl S, Dowd SE, Garcia-Mazcorro JF, Steiner JM and Suchodolski JS: Massive parallel 16S rRNA gene pyrosequencing reveals highly diverse fecal bacteria and fungal communities in healthy dogs and cats. FEMS Microbiol Ecol 76(2): 301-310, 2011. pmid: 21261668. DOI: 10.1111/j.1574-6941.2011.01058.xCrossRefPubMedGoogle Scholar
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37巻2号
2023年3月～4月
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Research ArticleExperimental Studies
Open Access

Changes in Lactate-related Fecal Microbiome in Hyperlactatemia Diabetic Dogs

JI-HYEON KIM, JU-HYUN AN, JEONG-HWA LEE, SU-MIN PARK, GA-HYUN LIM, YE-IN OH, KYEONG WON SEO and HWA-YOUNG YOUN
In Vivo March 2023, 37 (2) 696-701; DOI: https://doi.org/10.21873/invivo.13130

Abstract

Background/Aim: The correlation between the intestinal microbiome and endocrine disorders has recently been drawing attention as an important key for determining their pathology and clinical assessment. In this study, we evaluated the microbiome of dogs with insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) with respect to blood lactate. Materials and Methods: Fecal samples were obtained from 17 subjects and real-time quantitative polymerase chain reaction determinations were performed to quantify the gene expression levels of lactate-producing and dysbiosis index-related bacteria. Results: Expression levels of the lactate-producing bacteria Lactobacillus spp., Enterococcus spp., and Bifidobacterium spp., were confirmed in patients with high concentrations of lactate in the blood. The abundance of Enterococcus and Bifidobacterium was higher in diabetic dogs compared to that of non-diabetic dogs. When blood lactate concentrations were high, the abundance of Bifidobacterium also increased. Conclusion: Blood lactate levels influence the gut microbiome in dogs with IDDM. This study will help understand the gut microbiota in the context of diabetes in human and veterinary medicine.
Key Words:

Intestinal dysbiosis, an imbalance of the microbiome, is associated with metabolic disorders, obesity, insulin resistance, type 2 diabetes, inflammatory bowel disease, and impaired immune function (1). Recent research on the fecal microbiome has attracted the attention of scientists and healthcare workers worldwide, focusing on the interaction of diabetes with the gut microbiome (2).
Insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) or type 1 diabetes (T1D), is the most common type of diabetes mellitus in dogs (3). Persistent diabetes induces the loss of beta cells; hypoinsulinemia, which results in an insufficient supply of circulating glucose to most cells; and accelerated hepatic gluconeogenesis and glycogenolysis (4). Recent evidence suggests a correlation between dysbiosis and the pathogenesis of IDDM. However, these studies remain controversial, and further studies are needed to define a gut microbiome imbalance in IDDM and identify the causative factors (5).
Patients with IDDM, especially if poorly controlled, can store excess hepatic glycogen and exhibit increased plasma lactate levels (6). Elevated blood lactate levels can lead to emergency complications in human IDDM patients. Previous studies have reported a correlation between intestinal dysbiosis and lactate concentration (7). However, there has been no study focusing on the underlying mechanism between increased blood lactate concentrations and the fecal microbiome in patients with IDDM.
In this study, we assessed the microbial communities in non-diabetic and diabetic dogs and hypothesized that blood lactate concentrations in diabetic dogs are a major factor influencing the gut microbiota.

Materials and Methods

Animals. We categorized subjects into diabetic and healthy (non-diabetic) dogs. Dogs who had any diseases which could affect their blood lactate concentrations were not included in this study. The normal circulating lactic acid level in dogs is ≤2.5 mmol/l (8). Dogs with diabetes were divided into two groups according to their blood lactate concentration, within the normal range and above the normal range, according to the criteria.
Sample collection. Dogs with naturally occurring IDDM (n=11) and healthy dogs (n=6) were enrolled from the hospital population at the Veterinary Medical Teaching Hospital of Seoul National University. Also, dogs with IDDM were divided into two groups: those with normal blood lactate levels (N-DM, n=5) and those with levels above the normal range (L-DM, n=6). Dogs with DM were diagnosed based on urinalysis and clinical signs. All dogs participated in this study after informed consent was obtained from their guardians. All protocols were previously approved by Seoul National University Institutional Animal Care and Use Committee and adhered to the guidelines (SNU-200912-3).
Sample analysis. Blood was collected from both groups of dogs in a fasting state by routine venipuncture using the jugular or cephalic veins. Glucose, ketone (i-Sens, CareSens Dual, Seoul, Republic of Korea), hemoglobin A1c (Hb1ac; Biattic, Aniscan, Gyeonggi-do, Republic of Korea), and lactate (Nova biomedical, Stat Strip xpress lactate, Como, Italy) were measured in fresh whole blood, while fructosamine (IDEXX, Catalyst one, Jericho, NY, USA) was measured in serum. Serum was separated quickly within 15 min of collection. A sample for blood gas analysis (i-Sens, i-Smart, Seoul, Republic of Korea) was collected with a heparin-coated syringe. All dogs were fasted for at least 12 h before samples were obtained. Free catch urine was used. The presence of urine glucose was confirmed using urine test strips (Combur-Test®; Roche, Basel, Switzerland). The majority (n=8) of dogs with IDDM were fed a prescription diet for diabetes and three dogs with IDDM were fed commercial maintenance rations. All control dogs were fed commercial maintenance rations. No dogs had a history of antibiotic administration for at least six months prior to sample collection. Fecal samples were also free cached and stored at −80°C until all samples were collected.
RNA extraction, cDNA synthesis, and RT-qPCR. Fecal RNA was extracted using RNeasy Power Microbiome Kit following the manufacturer’s instruction (Qiagen, Hilden, Germany). cDNA was synthesized by isolating sample RNA using Cell Script cDNA MasterMix (Cell-Safe) according to the manufacturer’s instructions. A total of 10 μl of cDNA was synthesized and diluted with DEPC. In this experiment, a total of seven bacteria were targeted and quantified using RT-qPCR (StepOne™ Real-Time PCR System, ThermoFisher, Waltham, MA, USA). The target bacteria and primer sequences are shown in Table I. For comparison, universal cDNA was measured together.

Table I.
Primer sequences used to detect gene expression of microbiota in this study.
Statistical analysis. All experiments were performed in triplicate and repeated three times. GraphPad prism (version 6.01) software (GraphPad, Inc., La Jolla, CA, USA) was used for statistical analysis. Comparisons of more than two groups were performed using one-way analysis of variance followed by Bonferroni’s multiple comparison test. The results are presented as the means±standard deviations. p-Values <0.05 were considered statistically significant.

Results

Characteristics of participants. Signalment is described in Table II. Healthy dogs had no specific abnormalities. Dogs with IDDM who had normal lactate levels did not have any diseases that affected their blood lactate concentration such as urolithiasis, tracheal collapse, chronic valvular heart disease, or mast cell tumor resection history. Two dogs with IDDM who had increased lactate levels had hyperadrenocorticism, while the others had no diseases. We evaluated differences in the blood lactate concentration between diabetic and healthy dogs. Except for two dogs, dogs with IDDM had higher than normal blood glucose levels. The blood glucose of healthy dogs was within the normal range. Diabetic dogs also exhibited higher lactate concentrations. Diabetic dogs were further divided into high and normal lactate groups. We measured three DM control indicators (fasting glucose, ketone, Hb1ac, and fructosamine) (Figure 1). The DM groups had higher lactate, blood glucose, ketone, Hb1ac, and fructosamine levels than those in the healthy group. The L-DM group had significantly higher ketone levels than those in the N-DM group. The DM groups had a higher blood pH compared to that of the healthy group, but there was no significant difference between the DM groups (Figure 2). There was no significant difference in pCO2 and pO2 between the DM and healthy groups. Bicarbonate was lower in the DM groups compared to that in the healthy group.

Table II.
Characteristics, including breed, age, and sex, of the 17 dogs included in this study.

Figure 1.
Concentration of blood lactate, glucose, ketone, fructosamine, and Hb1Ac. Groups were divided according to blood lactate levels, and results values were compared for each group. H: Healthy (non-diabetes mellitus) dog group; N-DM: normal blood lactate concentration diabetes mellitus dog group; L-DM: blood lactate concentration above the normal range diabetes mellitus dog group (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, as determined by one-way ANOVA).

Figure 2.
Venous blood gas analysis in diabetes dogs. The blood gas test result values were compared for each group. H: Healthy (non-diabetes mellitus) dog group; N-DM: normal blood lactate concentration in diabetes mellitus dog group; L-DM: blood lactate concentration above the normal range in diabetes mellitus dog group. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, as determined by one-way ANOVA).
Correlation between fecal bacteria and blood lactate concentration. We investigated lactate-producing bacteria in all groups. Bifidobacterium and Enterococcus were more abundant in both DM groups than in the healthy group. Especially Bifidobacterium, was higher in the L-DM group than in the N-DM group. Lactobacillus was lower in the DM groups than that in the healthy group (Figure 3).

Figure 3.
Relative mRNA expression of lactate-producing bacteria in feces of IDDM dogs. Relative mRNA expression of Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus in healthy and diabetics dogs. Bacterial mRNA for each group was compared between diseased and healthy controls. H: Healthy (non-diabetes mellitus) dog group; N-DM: normal blood lactate concentration in diabetes mellitus dog group; L-DM: blood lactate concentration above the normal range in diabetes mellitus dog group.
Fecal bacteria associated with dysbiosis. We evaluated three bacteria associated with dysbiosis. Blautia mRNA expression was lower in the DM groups than that in the healthy group, however, it was lower in the L-DM group than that in the N-DM group. Turicibactor mRNA expression was significantly lower in the DM groups. When the lactate levels increased, the Turicibactor mRNA expression tended to decrease. The Feacalibactor mRNA expression was lower in the DM groups than that in the healthy group (Figure 4).

Figure 4.
Dysbiosis Index-related bacteria relative mRNA expression. Relative mRNA expression of Blautia, Turicibactor, and Faecalibactor. Bacterial mRNA for each group was compared between diseased and healthy controls. H: Healthy (non-diabetes mellitus) dog group; N-DM: normal blood lactate concentration in diabetes mellitus dog group, L-DM: blood lactate concentration above the normal range in diabetes mellitus dog group.

Discussion

In this study, we hypothesized that the blood concentration of lactic acid correlates with the changes in fecal microbiota of patients with IDDM. In order to investigate the changes in the microbiome according to blood lactate concentration, bacteria associated with lactate production, such as bifidobacterium spp., enterococcus spp., and lactobacillus spp., were examined (9). We confirmed that bifidobacterium spp. and enterococcus spp. tended to increase and lactobacillus spp. tended to decrease in diabetic patients compared to healthy counterparts. It is noteworthy that these findings are related to previously studied intestinal microbial flora.
Brugman et al. investigated the fecal microbiome and found that Lactobacillus and Bifidobacterium populations exhibited lower microbial counts in rats with T1DM than in rats without diabetes (10). Yang et al. found that the proportion of enterococci in the feces was higher in mice with T1DM (11). Interestingly, Paterson et al. studied the changes in intestinal microflora with diabetes onset and progression and found that T1DM progression coincided with an increase in lactate-producing bacteria (i.e., Lactobacillus and Bifidobacterium) (12). Barnett et al. proposed that diabetes-associated hyperlactatemia may be an early event in the time course of the disease (13). In addition, Brouwers et al. reported increased lactate levels in patients with poorly controlled T1DM and glycogenic hepatopathy, implying that enhanced plasma lactate concentrations are part of the clinical spectrum of these diseases (6). This study confirmed that even in diabetic dogs, the intestinal fecal cells changed according to the blood lactate concentration. Although further research is needed on the factors that affect the gut microbiota in diabetic patients, this is the first study to report changes in lactate-producing bacteria in diabetics with elevated lactate levels.
In addition, lactate-producing microbiomes are known to play a major role in the formation of microflora in the intestinal tract, and by identifying blautia, turicibacter, and faecalibactor related to dysbiosis, it was confirmed how it affects other flora (9). Our findings indicate that the intestinal flora of diabetic patients changed according to their blood lactate levels, which means that the blood lactate concentration could be a major indicator of intestinal dysbiosis in diabetic patients.
It is well-known that the intestinal microbiota plays an important role in health by regulating digestion and supporting the immune system (14). Therefore, various studies are being conducted to utilize intestinal bacteria in the treatment of chronic diseases such as metabolic diseases, cancer, inflammatory bowel disease, and autoimmune diseases (15). In particular, an imbalance of the intestinal microflora is known to affect the immune system of patients with T1DM, which has been reported to exacerbate intestinal inflammation (16). However, studies on the intestinal microflora in diabetic patients are still insufficient, and further research is necessary for the development of therapeutic agents that can target the intestinal microflora and their potential applications in diabetic patients.
While we have confirmed the presence of restrictive microbial bacteria, we have not been able to determine whether dysbiosis is present in the feces. In addition, further studies are needed to determine whether the changes in microbial flora observed in DM are a result of disease phenotype or have a causal relationship to pathophysiology. However, our findings are of great value as this was the first study to confirm changes in the fecal microbiota in terms of blood lactate concentration in diabetic dogs. Our results will provide important basic data to help further our understanding of the microbiome in diabetic diseases in both veterinary and human medicine.
We have confirmed that blood lactate levels are a major factor influencing changes in the fecal microflora of dogs with IDDM. These findings help further our understanding of the intestinal microflora of patients with IDDM.

Footnotes

  • Authors’ Contributions

    1. JHK: Data curation, formal analysis, investigation, resources, writing-original draft. JHA: Conceptualization, data curation, formal analysis, investigation, methodology, resources, writing-original draft, writing-review & editing. JHL: data curation, writing-review & editing. SMP: data curation, writing-review & editing. GHL: data curation, writing-review & editing. YIO: data curation. KWS: data curation, writing-review & editing HYY: Conceptualization, data curation, formal analysis, funding acquisition, investigation, methodology, resources, software, supervision, validation, visualization, writing-review & editing.

  • Funding

    1. This study was partially supported by the Research Institute for Veterinary Science, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea.

  • Conflicts of Interest

    1. The Authors have no conflicts of interest to report in relation to this study.

  • Received December 27, 2022.

  • Revision received January 12, 2023.

  • Accepted January 13, 2023.

  • Copyright © 2023, International Institute of Anticancer Research (Dr. George J. Delinasios), All rights reserved

This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY-NC-ND) 4.0 international license (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0).

References

  1. ↵

    1. Hooper LV,

    2. Littman DR and

    3. Macpherson AJ

    1. : Interactions between the microbiota and the immune system. Science 336(6086): 1268-1273, 2012. PMID: 22674334. DOI: 10.1126/science.1223490Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar

  2. ↵

    1. Paun A,

    2. Yau C and

    3. Danska JS

    1. : The influence of the microbiome on type 1 diabetes. J Immunol 198(2): 590-595, 2017. PMID: 28069754. DOI: 10.4049/jimmunol.1601519Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar

  3. ↵

    1. Rand JS,

    2. Fleeman LM,

    3. Farrow HA,

    4. Appleton DJ and

    5. Lederer R

    1. : Canine and feline diabetes mellitus: nature or nurture? J Nutr 134(8 Suppl): 2072S-2080S, 2004. PMID: 15284406. DOI: 10.1093/jn/134.8.2072sAbstract/FREE Full TextGoogle Scholar

  4. ↵

    1. Nelson RW and

    2. Couto CG

    1. : Small animal internal medicine-e-book. Elsevier Health Sciences, 2019.Google Scholar

  5. ↵

    1. Gilbert JA,

    2. Blaser MJ,

    3. Caporaso JG,

    4. Jansson JK,

    5. Lynch SV and

    6. Knight R

    1. : Current understanding of the human microbiome. Nat Med 24(4): 392-400, 2018. PMID: 29634682. DOI: 10.1038/nm.4517CrossRefPubMedGoogle Scholar

  6. ↵

    1. Brouwers MC,

    2. Ham JC,

    3. Wisse E,

    4. Misra S,

    5. Landewe S,

    6. Rosenthal M,

    7. Patel D,

    8. Oliver N,

    9. Bilo HJ and

    10. Murphy E

    1. : Elevated lactate levels in patients with poorly regulated type 1 diabetes and glycogenic hepatopathy: a new feature of Mauriac syndrome. Diabetes Care 38(2): e11-e12, 2015. PMID: 25614691. DOI: 10.2337/dc14-2205FREE Full TextGoogle Scholar

  7. ↵

    1. Venn EC,

    2. Barnes AJ,

    3. Hansen RJ,

    4. Boscan PL,

    5. Twedt DC and

    6. Sullivan LA

    1. : Serum D-lactate concentrations in dogs with parvoviral enteritis. J Vet Intern Med 34(2): 691-699, 2020. PMID: 31919893. DOI: 10.1111/jvim.15688CrossRefPubMedGoogle Scholar

  8. ↵

    1. Hughes D,

    2. Rozanski ER,

    3. Shofer FS,

    4. Laster LL and

    5. Drobatz KJ

    1. : Effect of sampling site, repeated sampling, pH, and PCO2 on plasma lactate concentration in healthy dogs. Am J Vet Res 60(4): 521-524, 1999. PMID: 10211699.PubMedGoogle Scholar

  9. ↵

    1. Blake AB,

    2. Guard BC,

    3. Honneffer JB,

    4. Lidbury JA,

    5. Steiner JM and

    6. Suchodolski JS

    1. : Altered microbiota, fecal lactate, and fecal bile acids in dogs with gastrointestinal disease. PLoS One 14(10): e0224454, 2019. PMID: 31671166. DOI: 10.1371/journal.pone.0224454CrossRefPubMedGoogle Scholar

  10. ↵

    1. Brugman S,

    2. Klatter FA,

    3. Visser JT,

    4. Wildeboer-Veloo AC,

    5. Harmsen HJ,

    6. Rozing J and

    7. Bos NA

    1. : Antibiotic treatment partially protects against type 1 diabetes in the Bio-Breeding diabetes-prone rat. Is the gut flora involved in the development of type 1 diabetes? Diabetologia 49(9): 2105-2108, 2006. PMID: 16816951. DOI: 10.1007/s00125-006-0334-0CrossRefPubMedGoogle Scholar

  11. ↵

    1. Yang C,

    2. Fei Y,

    3. Qin Y,

    4. Luo D,

    5. Yang S,

    6. Kou X,

    7. Zi Y,

    8. Deng T and

    9. Jin M

    1. : Bacterial flora changes in conjunctiva of rats with streptozotocin-induced type I diabetes. PLoS One 10(7): e0133021, 2015. PMID: 26176548. DOI: 10.1371/journal.pone.0133021CrossRefPubMedGoogle Scholar

  12. ↵

    1. Patterson E,

    2. Marques TM,

    3. O’Sullivan O,

    4. Fitzgerald P,

    5. Fitzgerald GF,

    6. Cotter PD,

    7. Dinan TG,

    8. Cryan JF,

    9. Stanton C and

    10. Ross RP

    1. : Streptozotocin-induced type-1-diabetes disease onset in Sprague-Dawley rats is associated with an altered intestinal microbiota composition and decreased diversity. Microbiology (Reading) 161(Pt 1): 182-193, 2015. PMID: 25370749. DOI: 10.1099/mic.0.082610-0CrossRefPubMedGoogle Scholar

  13. ↵

    1. Berhane F,

    2. Fite A,

    3. Daboul N,

    4. Al-Janabi W,

    5. Msallaty Z,

    6. Caruso M,

    7. Lewis MK,

    8. Yi Z,

    9. Diamond MP,

    10. Abou-Samra AB and

    11. Seyoum B

    1. : Plasma lactate levels increase during hyperinsulinemic euglycemic clamp and oral glucose tolerance test. J Diabetes Res 2015: 102054, 2015. PMID: 25961050. DOI: 10.1155/2015/102054CrossRefPubMedGoogle Scholar

  14. ↵

    1. Liu W,

    2. Cheng M,

    3. Li J,

    4. Zhang P,

    5. Fan H,

    6. Hu Q,

    7. Han M,

    8. Su L,

    9. He H,

    10. Tong Y,

    11. Ning K and

    12. Long Y

    1. : Classification of the gut microbiota of patients in intensive care units during development of sepsis and septic shock. Genomics Proteomics Bioinformatics 18(6): 696-707, 2020. PMID: 33607294. DOI: 10.1016/j.gpb.2020.06.011CrossRefPubMedGoogle Scholar

  15. ↵

    1. Dosoky NS,

    2. May-Zhang LS and

    3. Davies SS

    1. : Engineering the gut microbiota to treat chronic diseases. Appl Microbiol Biotechnol 104(18): 7657-7671, 2020. PMID: 32696297. DOI: 10.1007/s00253-020-10771-0CrossRefPubMedGoogle Scholar

  16. ↵

    1. Zhang S,

    2. Cai Y,

    3. Meng C,

    4. Ding X,

    5. Huang J,

    6. Luo X,

    7. Cao Y,

    8. Gao F and

    9. Zou M

    1. : The role of the microbiome in diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract 172: 108645, 2021. PMID: 33359751. DOI: 10.1016/j.diabres.2020.108645CrossRefPubMedGoogle Scholar

  17. Handl S,

    1. Dowd SE,

    2. Garcia-Mazcorro JF,

    3. Steiner JM and

    4. Suchodolski JS

    5. : Massive parallel 16S rRNA gene pyrosequencing reveals highly diverse fecal bacterial and fungal communities in healthy dogs and cats. FEMS Microbiol Ecol 76(2): 301-310, 2011. PMID: 21261668. DOI: 10.1111/j.1574-6941.2011.01058.x

    1. CrossRefPubMedGoogle Scholar

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