カバークロップの分解を改善するために有効な微生物で改良した場合、生物学的および化学的土壌特性には影響しない

哉百名

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応用土壌生態学
第197巻 2024年5月 105358号
カバークロップの分解を改善するために有効な微生物で改良した場合、生物学的および化学的土壌特性には影響しない

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139324000891

著者リンク オーバーレイパネルを開くSimon Oberholzer a, Christa Herrmann a, Natacha Bodenhausen b, Hans-Martin Krause b, Adrien Mestrot a c, Chinwe Ifejika Speranza a, Klaus A. Jarosch a c d
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https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2024.105358
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概要
輪作作物へのカバークロップの導入は、より持続可能な土壌管理に貢献する。被覆作物残渣の分解を改善するために、市販の接種剤Effective Microorganisms®（EM）の適用が増加している。EMは広く応用されているにもかかわらず、EM施用が土壌プロセスに及ぼす影響に関する包括的な研究は不足している。なぜなら、EM効果（生きたEMが直接引き起こす）と基質効果（付随するEM基質が引き起こす）の明確な区別がなされることはほとんどないからである。土壌へのカバークロップ施用後のEM施用による潜在的な影響を明らかにするため、温帯気候の春に似た条件下で実験室での培養実験を行い、推奨用量と推奨用量の100倍のEMを、裸土壌上または土壌組み込み前のカバークロップ上に施用した。対照群には、EMを添加しない処理と、滅菌したEM溶液を推奨用量の100倍で散布した処理があった。28日間のモニタリング期間中、EMを推奨用量で施用した場合、土壌呼吸、微生物が結合した炭素や窒素、土壌pH、過マンガン酸酸化性炭素、水抽出可能な栄養素や微量要素に一貫した影響は見られなかった。推奨用量の100倍を投与した処理で観察された効果は、生きたEMそのものではなく、EM溶液とともに導入された基質に起因するものであった。アンプリコンシークエンシングの結果、ある種のEM分類群がEM散布後の土壌から低存在量で検出されることがわかったが、これはEMを推奨量の100倍散布した場合のみであった。EMの散布は、土壌の生物学的・化学的性質に明確な影響を与えず、カバークロップの分解プロセスにも影響を与えなかったと結論づけた。

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キーワード
土壌培養メタバーコーディング土壌呼吸微量元素植物成長促進根粒菌微生物バイオマス

  1. はじめに
    持続可能な農業生態系は、土壌の肥沃度を高く維持し、外部からの投入を最小限に抑えることを目指している。そのためには、土壌がむき出しになる期間を避けるべきである。なぜなら、土壌がむき出しになる期間 は、養分の損失、土壌浸食、土壌有機物の損失を招き、土壌肥沃度の低下につながるからである（Daryanto et al.） カバークロップは，2つの主要作物間の中断時間を埋めるものであり，したがって土壌肥沃度と養分管理において重要な要素である（Thorup-Kristensenら，2003）。しかし，特に耕起を減らした有機農業システムでは，カバークロップを浅く組み込むか土壌表面に残すため，カバークロップの管理は大きな課題に直面する。播種床を適切に準備するためには、取り込まれたカバークロップの残渣が速やかに分解されることが重要である（Gollnerら、2020；Vincent-Caboudら、2017）。しかし、温帯気候の春によく起こるように、環境条件が寒冷で湿潤な場合、土壌表面のカバークロップ資材は適切に分解されず、ぬるぬるして悪臭を放つようになることが多い。これは、播種床の準備や後続作物の生育に大きく影響する。理想的には、ほとんどのカバークロップ資材は10日以内に細かく分解され、残渣が後続の換金作物の播種を妨げないようにすべきである。

作付後間もないカバークロップ資材の分解を促進する方法として、微生物接種剤の利用が増加している。この目的で最も利用されている微生物接種剤はEffective Microorganisms®（EM）であり、1980年代に開発され、日本イーエムロが商標登録した製品である（2023年）。市販のEM製品は、液体培養の中で共存する最大80種の天然由来の好気性微生物と嫌気性微生物の混合物から構成されている（比嘉、1991）。正確な組成は生産者により公表されていないが、これまでの分析によると、EM溶液は主に乳酸菌（Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、Streptococcus lactis）と酵母（Saccharomyces cerevisiae、 Candida utilis）、光合成細菌（Rhodopseudomonas palustris, Rhodobacter sphaeroides）、放線菌（Streptomyces albus, Streptomyces griseus）、発酵菌（Aspergillus oryzae； Ahn et al. , 2014; Xu, 2000）。他の植物成長促進根粒菌（PGPR）と同様に、EMは作物にとってより好ましい生育条件に向けて土壌微生物群を変化させるために施用される（Gouda et al.） 実際、EM施用に期待されることは、土壌肥沃度の向上、作物の収量と品質の向上、有機肥料や改良資材の養分利用効率の向上、土壌物理特性の改善、病原菌防除の向上などである（Balogun et al.） 浅層施肥の前にEMを被覆作物に施用することで、農家は分解プロセスの促進、養分循環の改善、土壌有機物の形成が期待できる（EM Schweiz, 2023）。

EMが土壌中のカバークロップのバイオマスやその他の有機物の分解にどのような影響を及ぼすかについては、アジアで広く行われている嫌気性発酵による食品保存や生ゴミの処理に類似したメカニズムが示唆されている。嫌気性発酵では、製品にダメージを与え、悪臭や有害な代謝産物を発生させる可能性のある腐敗菌よりも、発酵微生物が優勢であることが最も重要である（Rhee et al.） 腐敗は、アンモニア、メタン、窒素（N）酸化物の排出に関連し、少なくとも部分的には無酸素条件下で起こる。効果的な微生物は、酸素の利用可能性が低い期間や場所では腐敗を回避し、代謝経路を発酵や有機物の安定化にシフトさせると考えられている（Higa and Parr, 1994）。ほとんどの耕地土壌は主に酸化的条件下にあるが、十分に通気された土壌にも無酸素性微小サイトが常に存在する（Keiluweit et al.） 従って、EMは、かなり酸化的な条件の通気性の良い土壌でも、有機物の分解に有益であると宣言されている（Huら、2018；Javaid、2011）。EMコンソーシアムの主要なグループである乳酸菌と酵母は通性嫌気性であり、酸素のある環境でも生存できるため、自然の土壌にも存在する（Lamont et al.） したがって、有機物の分解を促進するためのEMの応用は、第一に、接種されたEMが土壌系に定着できること、第二に、EMが分解プロセスにおいて支配的な役割を果たすことを前提としている。

これまで、土壌呼吸（Fatunbi and Ncube, 2009; Schenck zu Schweinsberg-Mickan and Müller, 2009; Valarini et al., 2003）や栄養塩の利用可能性（Hu et al.） 他の研究では、EM施用による有機物の分解促進が微量栄養素の利用可能性の増加（Daur, 2016）や潜在的有毒微量元素（PTTE）の減少（Zhou et al.） 残念なことに、EMを試験した研究の多くは、i) EM効果（植菌液に含まれる実際の生きたEMによって誘発される効果）とii) 基質効果（EM植菌液と組み合わせて供給される栄養素、炭素源、その他の化合物によって誘発される効果）の区別に失敗している。これら2つの効果を区別しないことで、誤解を招くような結論に達することは容易であるが、これらの重要な対照を含めることで、必要なサンプル数はすぐに増加する。

EMの実際の効果に関する予想と実際の科学的証拠との間に大きな食い違いがあることから、我々は実験室での培養試験を実施し、カバークロップの分解中の土壌特性に対するEMによる効果と基質による効果を厳密に区別した。有機減耕システムにおけるカバークロップの実践を妨げている主な課題として、適切な代替手段の欠如が指摘されているためである（Vincent-Caboud et al.） EM施用が土壌プロセスに及ぼす潜在的な効果について力学的に理解するために、温帯気候の春に似た圃場条件を模倣した土壌培養実験を行った。土壌は単独で、またはカバークロップの植物体と組み合わせて培養し、典型的な施用量または典型的な施用量の100倍で改良した。対照処理として、EM効果と基質効果を厳密に区別するため、EM溶液を施用前に滅菌した。土壌生物学的および生化学的な土壌特性を 28 日間にわたり追跡調査し、EM 施用による土壌特性への即時的または中期的な影響を調べた。

  1. 方法
    2.1. 土壌とカバークロップバイオマスのサンプリングと準備
    土壌と被覆作物バイオマスは、スイスのトゥールガウ州ディーセンホーフェン（Diessenhofen）の標高414mの温帯気候に位置する農地から採取した。この農家は過去5年間、EM施用によるカバークロップの浅層施肥を実践しており、土壌構造と作物収量に関して肯定的な経験を報告している。サンプリングは2020年5月5日、カバークロップが十分に定着し、浅く取り込まれようとしている時に実施された。1.3haの圃場で、オーガー（直径2.5cm）を用いて約200の土壌コア（0～10cm）を無作為に採取した。カバークロップの地上部バイオマスは、代表的な50×50cmの正方形で同日に刈り取った。播種したカバークロップは購入したもの（Wintergrün, Camena Samen, Germany）で、霜に強い5種を含んでいた： 62%はウインターライ麦（Secale cereale L.）、26%はハンガリアンベッチ（Vicia pannonica CRANTZ.）、10%はクリムソンクローバー（Trifolium incarnatum L.）、1%はウインターナタネ（Brassica napus L.）、1%はウインターカブ（Brassica rapa L.）である。植物サンプルでは、ウインターライ麦、ハンガリアンベッチ、クリムソンクローバーのみを採取した。収穫し乾燥させたカバークロップの炭素（C）濃度は42.2％、C/N比は17.7であった。

サンプリングした土壌（約15 kg）を室温で3日間風乾した後、ふるいにかけた（2 mm）。残った大きな有機物は手作業で取り除いた。採取したカバークロップのバイオマスは、40℃の乾燥オーブンに1週間入れ、その後小片に切断した。

2.2. 有効微生物群
この実験では、特にカバークロップの浅層施肥をサポートするために開発された、Rottelenker（EM Schweiz、スイス）という市販のEM製品を使用した。製品の品質を確保するため、液剤は散布の5日前に購入した。EM Rottelenkerは、気温が8 °Cを超えたときに100 L ha-1の量で散布し、適切かつ均等に散布できる量の水で希釈することを推奨している（EM Schweiz, 2023）。実際には、散布方法に応じて希釈倍率を1～10倍とする。生きたEMの効果と純粋な基質効果を区別するために、滅菌したEMを用いた処理を行った。滅菌処理では、培養開始の1日前に元の容器からEM溶液を取り出し、24時間以内に121℃で20分間のオートクレーブ処理を2回行った。購入したEM溶液の生きた状態と滅菌の両方を調べるために、コロニー形成単位分析（CFU）を行った。このために、培養実験開始後24時間以内に、原液と滅菌したEM液をそれぞれTSB（Trypticase Soy Broth）培地と殺菌剤シクロヘキシミドを添加したTSB培地にプレーティングした。希釈列は1～10-5の5段階とし、各試料につき5反復した後、プレートを室温で3日間培養した。CFU分析の結果、購入した溶液には生きた微生物が存在し、滅菌したEM溶液には2種類のTSB培地のいずれにも生きた微生物は存在しなかった（詳細は補足資料のFig.）

2.3. 実験デザイン
28日間の土壌培養実験を、カバークロップとEMレベルの2つの要因で行った。28日間という期間は、浅いカバークロップの導入から春 作の播種までの期間（約10日間）と、春作の開始時期を捉えるために選んだ。EM無施用（EM0）、農業実践で推奨されるEM（100 L ha-1；EM1）、100倍の量（EM100）、100倍の量の滅菌EM（EM100st）の4つの異なるEM施用レベルを試験した。完全直交計画では、これら4つのEMレベルをカバークロップの因子と組み合わせ、カバークロップを投入する4つの処理（CC-EM0、CC-EM1、CC-EM100、CC-EM100st）と、カバークロップを投入せずEMのみを散布する4つの処理（NCC-EM0、NCC-EM1、NCC-EM100、NCC-EM100st；図1）とした。被覆作物の地上部バイオマスを5 t ha-1、表土（0～3 cm）の嵩密度を1.3 g cm-3とし、土壌1 kgあたり12.82 gの乾物投入量に相当する被覆作物バイオマスを投入して、圃場でのプロセスを模倣した。EM散布量100 L ha-1は、EM1レベルでは土壌1 kgあたり0.256 mL、EM100レベルでは土壌1 kgあたり25.6 mLに相当する（表2）。

図1
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図1. 4つのEMレベルと2つのカバークロップレベルからなる実験デザイン。

2.4. 土壌培養
土壌サンプリングの3日後、風乾しふるいにかけた土壌を、重量含水率（GWC）0.16 g H2O g-1 soilまでわずかに再湿潤させた後、基礎呼吸を再確立するため、実験開始の7日前にプレインキュベーションを行った。プレインキュベーションは、実験開始前に土壌のふるい分けによって微生物呼吸がピークに達するのを防ぐため、温度16℃、湿度80%で行った。

8種類の土壌処理は、培養開始日（0日目）に調製した。培養前の土壌は、コンタミネーションを避けるため、ビニールの手袋を着用し、手で絶えず土壌を混ぜながら、ミリQ水を上から静かに噴霧して、約0.2 g H2O g-1 soilのGWCにした。その後、湿った土壌を密封可能な3Lのビニール袋に分けた。異なるレベルのEMとカバークロップバイオマスを加え、EM0レベルには同量の水を与えた。カバークロップ・バイオマスを添加する場合は、圃場で行われているカバークロップの投入を模倣するため、土壌に添加する前に植物体に注意深く液体を振りかけた。その後、各袋を密封し、均質な混合液になるまで数分間手で注意深く混合し、培養実験用のプラスチック製ビーカーに移した。培養は12℃、湿度80%で行った。培養土の最終的なGWCは0.23 g H2O g-1 soilであり、これは土壌の最大保水力の64 %に相当する。混合土壌試料は、土壌呼吸（別々のガラス瓶）、POXC（別々のコーニングチューブ）、その他の分析用に3つの異なるグループに分け、75 gの湿った土壌をプラスチックビーカーに入れ、時点（3）および処理（8）ごとに4反復し、インキュベーター内でのガス交換を可能にし、水分の損失を避けるために紙ティッシュで覆った。それぞれのサンプリング日に開封し、土壌を各容量のビーカーに分け、さらに分析を行った。培養期間中、土壌表面に乾燥した凝集体の形跡は目視で確認できなかった。時間軸と測定間隔の概要は、補足資料の表S1にある。

2.5. 土壌生物学的パラメータの評価
土壌呼吸は、（Alef, 1995）のプロトコルに従って測定した。簡単に説明すると、1Lの密閉可能なガラス瓶に2つの小さなプラスチックカップを入れ、1つのカップには乾燥土壌換算で40gを入れ、もう1つのカップには生成されたCO2を捕捉するために0.2M NaOHを10mL入れた。36個の密閉可能なガラス瓶（8処理*4反復+4ブランク）を使用し、13時点で478回の測定を行った。各測定時点で瓶を開け、約4mL（過剰）の1M BaCl2と数滴のフェノールフタレインをNaOH溶液に加え、捕捉されたCO2を0.1M HClによる滴定で測定した。溶解したCO2 1モルあたり2モルのH+が生成し、式1に従って2モルのOH-を中和した：
(1)

微生物のC（Cmic）とN（Nmic）は、（Vanceら、1987）のプロトコールに従って測定した。10gの乾物に相当する湿った土壌を秤量し、40mLの0.5M K2SO4を抽出に用いた。抽出液中の溶存CとNは、TOC分析装置（DIMATOC® 2100, DIMATEC Analysetechnik GmbH, Germany）を用いて測定した。CmicとNmicはクロロホルム可溶CとNとして報告し、不完全な抽出効率を考慮した換算係数は使用していない。

EM溶液および培養土壌中の微生物群集の分析は、 実験7日目にカバークロップを添加した処理区（CC-EM0、 CC-EM1、CC-EM100、CC-EM100st）で行った。その際、純粋なEM溶液と約0.45 gの土壌サンプルから、"NucleoSpin® 96 Soil "キット（Macherey- Nagel, Düren, Germany）を用い、溶解バッファーSL2とエンハンサーSXを用いて、製造者の指示に従ってDNAを抽出した。抽出されたDNAは、プレートリーダーInfinite M Nano+（Tecan, Maennedorf, Switzerland）とQubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）を用いて蛍光定量した。細菌群集は、Loriら（2022）と同様のプロトコルを用いて、16S rRNAアンプリコンシークエンシングを用いて特徴付けた。簡単に説明すると、プライマー314Fおよび806R（Frey et al., 2016）を、Kapa Sybr fast qPCR kit Master Mix（Kapa Biosystems, Wilmington, USA）と各プライマー200nMを用いて最初のPCRに用いた。サンプルは濃度に応じて原液、1:5、1:10、1:50のいずれかを使用した。サイクリング・プログラムは、95 °Cで3分間の初期変性、95 °Cで20秒間の変性、58 °Cで20秒間のアニーリング、72 °Cで40秒間の伸長を38サイクル行い、その後10分間の最終伸長を行った。アンプリコンを自家製の磁気ビーズ溶液（SpeedBead Magnetic Carboxylate Modified Particles、GE Healthcare）で精製し、検証のためにアガロースゲルで可視化した。サンプルをバーコード化する2回目のPCRとMiSeqシーケンシングは、Genome Quebec Innovation Center（カナダ、モントリオール）で実施した。

Bodenhausenら（2019）に従い、PacBioによるITSアンプリコンシークエンシングを用いて真菌コミュニティを特徴付けた。M13タグ付きプライマーITS1FおよびITS4は、HiFi HotStart Ready Mix（Kapa Biosystems, Roche, Basel, Switzerland）と各プライマー300 nMを用いて最初のPCRに使用した。最初のサイクリングプログラムは、95 °Cで3分間の初期変性、98 °Cで20秒間の変性、60 °Cで20秒間のアニーリング、72 °Cで60秒間の伸長を25サイクル行い、その後5分間の最終伸長を行った。最初のPCRの3 ulを鋳型として、M13タグ付きバーコードを用いた2回目のPCR反応を行った。最初の2サイクルの後、アニーリング温度を65℃に上げ、総サイクル数を22サイクルとした以外は、2回目のサイクリングプログラムは上記と同様であった。自家製磁気ビーズ溶液で洗浄後、PCR産物をNanoQuant (Tecan, Maennedorf, Switzerland)で定量し、等モルでプールした。ネガティブコントロールも含め、他のサンプルと一緒に配列決定した。ライブラリーは、ベルン大学のNext Sequencing PlatformのSequel II装置で、同社の標準プロトコールに従ってPacbioで配列決定した。生配列はNCBI Short Read Archive (PRJNA1026363)に寄託された。

MiSeqリードはシーケンス施設によりデマルチプレックスされた。MiSeqデータのバイオインフォマティクス解析はETH ZurichのScientifc Computer Cluster Eulerで行った。簡単に説明すると、USEARCH v11.0.667（Edgar, 2013）を使用してリードをマージし、プライマー配列を除去した。PRINSEQ-lite 0.20.4は品質フィルターに使用した（Schmieder and Edwards, 2011）。UPARSE (Edgar, 2013)でキメラを除去した後、UNOISE3 (Edgar, 2016)でリードをゼロ半径操作分類単位(ZOTU)にクラスタリングした。ZOTUはさらにUPARSE（Edgar, 2013）を用いて類似度97%でクラスタリングした。最後に、SINTAX v11.0.667 (Robert, 2016)とSILVAデータベース、SILVA138_RESCRIPt.fasta (Quast et al., 2013)を用いて分類学を割り当てた。PacBioデータのバイオインフォマティクス解析は、demultiplexingにlima 2.7.1（https://lima.how）を使用し、UNITEデータベース、UNITE_v83_AllEukaryotes_10.05.2021.fasta（Abarenkov et al.、2010）を用いて分類学的割り当てを行った以外は同様であった。

50カウントを超える純粋なEM溶液からのOTUの相対的なシェアは、ターゲットEM分類群となり、土壌培養中に追跡された。

2.6. 化学パラメータの評価
易酸化性炭素の動態を測定するため、培養のいくつかの時点で過マン ガン酸酸化性炭素（POXC）を測定した。そのために、5 gの湿った土壌を50 mLのコーニングチューブに入れ、ガス交換ができるように、かつインキュベーター内での水分損失を避けるために、ペーパーティッシュで覆った。処理とサンプリング時点ごとに4つの複製を用意し（n = 488 = 256）、サンプリング日が来たら蓋をして分析まで凍結した。その後、Weilら（2003）のプロトコールに従って、0.2 M KMnO4を反応剤としてPOXCを1回で測定し、分光光度計（UV-1800、島津製作所）を用いて550 nmの吸光度を測定した。

水溶性イオンの測定 水溶性イオンの測定は，0，7，14，28日目に，集合ビーカーから乾燥 土壌8 g相当量をMilli-Q水40 mLで1時間抽出した。これらの試料を遠心分離（3000 rpm、15分間）し、上清5 mLをシリンジろ過（親水性、0.45 μm）し、5℃で保存した。イオンクロマトグラフ（IC）は、フッ化物（F-）、塩化物（Cl-）、硝酸塩（NO3-）、リン酸塩（PO43-）、硫酸塩（SO42-）の陰イオン、ナトリウム（Na+）、カリウム（K+）、マグネシウム（Mg2+）、カルシウム（Ca2+）の陽イオンの濃度を測定するために、培養終了2週間後にDionex Aquion™（Thermo Fisher Scientific Inc.）

水溶性元素の分析には、水溶性イオン測定と同じ上澄み液25mLを用いた。液中に分散した粘土粒子を除去するため、1 M MgCl2 1 mLを加え、激しく振とうした後、遠心分離した（3000 rpm、15分間）。この溶液から9.8 mLをろ過し（親水性、0.45 μm）、0.2 mLの硝酸（HNO3、69 %）と混合し、1 %のHNO3を含む10 mLの試料を得た。これらのサンプルを5℃で保存し、インキュベーション実験終了1ヵ月後に、Agilent Technologies（Santa Clara、 の7700× ICP-MSで、ヒ素（As）、鉛（Pb）、カドミウム（Cd）、クロ ム（Cr）、ニッケル（Ni）、銀（Ag）、アルミニウム（Al）、リン （P）、バナジウム（V）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、銅（Cu）、 亜鉛（Zn）、ウラン（U）の濃度を測定した。）

土壌、カバークロップのバイオマス、およびEM溶液の元素組成を特徴付けるために、3連複で全多元素分析を実施した。そのために、0.2 gの土壌、0.2 gのカバークロップバイオマス、および0.2 mLの121倍に希釈したEM原液を、8 mLの69 % HNO3および2 mLの37 % H2O2と混合し、CEM MARS 6マイクロ波で消化した（第1段階：120 °Cで10分間、第2段階：170 °Cで40分間）。その後、冷却した試料をMilli-Qで50 mLの容量にし、遠心分離（2500 rpm、5分間）し、上記のICP-MSで分析した。EM溶液の濁りのため、IC分析による含有イオンの分析はできなかった。

2.7. 統計
真菌と細菌のリッチネスとシャノン多様性は、vegan Rパッケージ（Oksanen et al.） さらに、Bray-Curties非類似度行列に基づき、10^4個の並べ替えによるPERMANOVAを用いて、真菌と細菌の群集組成の差異を検定した。他のすべてのパラメータは、正規性（Shapiro-Wilk検定）および同次性（Levenes検定）の要件をほぼ満たすか、わずかな逸脱を示すだけであった。したがって、我々はパラメトリック検定を用いることにした。土壌呼吸、微生物バイオマス、pH、POXC、水抽出可能なイオンと元素について、カバークロップとEMレベルを因子とする乗法分散分析（ANOVA）を検定した。異なるEMレベルまたは異なる処理間の有意差を評価するために、Tukey HSDをポストホック検定として用いた。累積呼吸量だけは、カバークロップを添加した処理と添加しない処理で大きな差があったため、CC処理とNCC処理で別々のTukey-HSD検定を用いた。他の応答変数については、ANOVAが有意な交互作用を示さなかった場合、EMレベルの主効果のみを議論した。それ以外の交互作用が有意であった場合は、CC-EM0とCC-EM1、NCC-EM0とNCC-EM1、CC-EM100とCC-EM100st、NCC-EM100とNCC-EM100stの比較のみを論じる。すべての解析はRバージョン4.2.2（R Core Team, 2020）で行った。

  1. 結果
    3.1. 土壌呼吸
    培養実験は、20.2±0.3 mg C kg-1 d-1 の基礎呼吸量で開始され（0 日目）、NCC-EM0 および NCC-EM1 処理区では、土壌培養の期間中、同様のレベルに維持された（図 2a）。生きたEMまたは滅菌したEMを裸地（NCC-EM100および NCC-EM100st）に高用量で添加すると、土壌呼吸は1日目に 159 ± 10 mg C kg-1 d-1まで増加し、4日目には再び基本的な土壌呼吸に達 した。被覆作物バイオマスの添加は、土壌呼吸に最も強い影響を与え、CC-EM100st では 1 日目に 647 ± 8 mg C kg-1 d-1 でピークに達した。その後、土壌呼吸速度は継続的に低下したが、CC処理区は全培養期間中、基本的な土壌呼吸速度に達しなかった。EMレベルの違いによる差異は、主に最初の4日間に生じた。28日間の培養期間中の累積呼吸量は、NCC処理区では0.42±0.01～0.7±0.04g C kg-1、CC処理区では4.09±0.9～4.57±0.08g C kg-1であった（図2bおよびc）。カバークロップのバイオマス添加とEMの高投与量添加（図2d）は、累積呼吸放散Cを増加させた。しかし、カバークロップとEM施用レベルの組み合わせによる累積呼吸放散Cへの影響は見られなかった（カバークロップとEMレベルの要因間の乗法ANOVAでは有意な交互作用は見られなかった、p値=0.13、補足資料の表S2参照）。EMレベル間の蓄積呼吸されたCの差は、CC処理区（図2c）よりもNCC処理区（図2b）で顕著であった。また、NCC処理区における一対比較でも、NCC-EM100stの累積呼吸量はNCC-EM100よりも有意に高いことが示された（図2b）。EMを推奨用量で添加しても、EM1レベルとEM0レベルとの間に有意な差が見られなかったことから、EMは土壌呼吸に影響を及ぼさなかった。

図2
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図2 a) 毎日の呼吸率。1日目のCC-EM100の値は、1つの複製にのみ基づいている。他の3つの複製では、NaOHトラップはすでに完全に飽和していたため、この処理では全体的な呼吸率がさらに高いことが示唆される。c) 覆土作物を添加した処理区の培養28日後の土壌呼吸の累積平均値 d) 培養終了時（28日目）の呼吸の累積値を応答変数とする二元配置分散分析における因子EM-levelの95 %信頼区間を伴うTukeyの平均差。パネルa、b、cは4反復の平均を示し、エラーバーは標準誤差を示す。

3.2. 微生物バイオマス
培養実験開始時（0日目）の土壌微生物バイオマスは、342 ± 5 mg C kg-1 および 67 ± 1 mg N kg-1 であった（図 3a）。NCC処理区では、微生物CとNの経時変化はわずかで、NCC-EM100st処理区（366±14 mg C kg-1および68±2 mg N kg-1）が最も高い値を示し、NCC-EM100処理区がそれに続いた。対照的に、微生物のCとNはすべてのCC処理でほぼ倍増し、CC-EM100st処理で最高値（810±34 mg C kg-1および134±6 mg N kg-1）を示し、次いでCC-EM100処理であった。応答変数CmicとNmicについて、カバークロップとEMレベルの2つの要因間には、どの日においても有意な交互作用は見られなかった（交互作用項の最小p値は、28日目のNmicでp = 0.33）。カバークロップの投入量とは無関係に、EMを高用量で施用すると、CmicとNmicがわずかに高くなったが、EM100stレベルのみが、EM1またはEM0レベルよりもCmicとNmicが有意に高くなった日があった（図3b）。カバークロップの添加とは無関係に、EM1レベルとEM0レベルとの間に有意差がなかったことから、推奨用量でのEM添加の影響は存在しなかった。

図3
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図3 a) 28日間の培養実験における微生物CとN。b)微生物C（またはN）∼カバークロップ* EM-levelのANOVAにおけるEM-level間のTukeyの平均差。EM-levelの効果が有意であった日のみを示す。平均差は 95 % 信頼区間（CI）で示され、有意性は α = 0.05 に基づいてマークされている。

3.3. EM分類群の同定と追跡
適用されたEM溶液内の細菌および真菌分類群の分類学的同定は、真菌OTUの90％以上を占め、Saccharomycetales目に割り当てられたOTU5による真菌分類群の支配を示した。EM溶液中で同定された他の真菌分類群には、Mortierellales目、Filobasidiales目、Hypocreales目に属するOTUが含まれるが、これらは接種された真菌群集のごく一部に過ぎない（表3）。EM溶液中のBactria分類群は、Lactobacillus属に属するOTUで占められていた。この属の5つの異なるOTUが観察され、共同で適用された細菌OTUの99％以上を占めた。酢酸菌科（Acetobacteraceae）とクロストリジウム科（Clostridiaceae）はごくわずかであった。細菌OTU 4440と4994が最も多く、適用された細菌OTUの72.6%と16.4%を占めた（表3）。7 日間の培養後、土壌細菌群集と微生物群集の構造をパーマノバで比較したところ、Bray-Curties 非類似度行列に基づき、細菌群集構造には弱い影響（p = 0.046）、真菌群集構造には影響（p = 0.816）がないことが明らかになった。細菌群集については、ペアワイズ・パーマノバにより、CC-EM0とCC-EM100の間に有意差があることがさらに明らかになったが（p = 0.032）、他の処理ペアでは有意差は認められなかった。細菌群集構造は主に放線菌とプロテオバクテ リアが支配的であり、真菌群集は主にモルティエレルマイコータで構成され ていた（図4）。培養7日後の真菌類と細菌のリッチネスとシャノン多様性は、いずれも実験処理による有意な影響を示さなかった（補足資料の表S3）。

図4
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図4. 7日間培養後の細菌（a）と真菌（b）の相対存在量。

EM溶液内で同定されたOTUは、同定された細菌群集と真菌群集の中で追跡された（図5）。EM の推奨適用量では、接種された EM 分類群の観察可能な増加は見られなかったが、bOTU4440 と bOTU4994 については、推奨適用量の 100 倍でわずかな増加が検出された。しかし、これらの OTUS の相対存在量は 1 % 未満であった。真菌類群集については、推奨施用量でfOTU5が増加したCC-EM1処理を除き、処理による影響は見られなかった（Fig.）

図5
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図5. 培養開始から7日後にカバークロップを添加した4つの処理区のbOTU4440乳酸桿菌、bOTU4994、fOTU5 Saccharomycetalesの相対存在量。平均値、標準誤差、および各処理ごとの4反復の値を示す。

3.4. 土壌pH
土壌の初期 pH は 7.12 ± 0.02 であったが、各処理により影響を受けた。EM1（pH=3.98）、EM100（pH=3.55）および EM100st（pH=3.58）の酸性溶液の添加は、カバークロップの投入と組み合わ せて添加した場合のみ、土壌 pH を低下させた（図 6）。28日目には、NCC-EM0（7.04±0.06）処理区を除き、すべての処理区で土壌pHは約7.2まで上昇し、NCC-EM100およびNCC-EM100st処理区よりも有意に低かった。

図6
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図6. 28日間の培養実験における土壌pH。数値は4反復の平均値を示す（各処置につき2反復のみの4日目を除く）。エラーバーは標準誤差を示す。

3.5. 過マンガン酸酸化性C
POXCの濃度は、培養実験の初日には544 ± 3 mg kg-1から445 ～ 510 mg kg-1に減少し、7日目以降は安定した値を示した（Fig.） CC-EM100st処理は、最初の4日間でより大きな減少を示したが、7日目以降も他の処理と同じ範囲で安定した。POXCについては、14日目と28日目を除くすべての測定日において、カバークロップとEMレベルの要因が有意な交互作用を示した。とはいえ、Tukey検定で示された有意差のある処理は、経時的に一貫していなかった。

3.6. 水溶性イオン
分析した水溶性イオンの濃度は、EMとカバークロップの添加に影響され た（図7および対応する統計量は補足資料の表S4に掲載）。F-、Cl-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+については、カバークロップのバイオマスを投入した処理区で有意に高い濃度が観察された。この影響は、全般的に培養開始時（7日目）に明瞭で、培養終了時（28日目）に減少した。Cl-、SO42-、Na+、Mg2+およびCa2+は、EM0およびEM1レベルよりもEM100およびEM100stレベルの方が有意に高いことが多かった。EM1レベルとEM0レベルの間にはわずかな差異しか観察されなかったことから、推奨用量でのEM散布は水溶性イオンの濃度に影響を及ぼさないことが示唆された。しかし、CC-EM1はCC-EM0よりも7日目のMg2+濃度が高かったが、28日目のK+濃度は低かった。より一貫していたのは、EM100とEM100stレベルの差であった。CC-EM100st処理は、F-、Cl-およびSO42-について、少なくとも1つの時点で、CC-EM100処理よりも高いイオン濃度を示した。Cl-については、この効果はNCC処理でも観察され、NCC-EM100stはNCC-EM100よりも有意に高い濃度を示した。NO3-については、NCC-EM0およびNCC-EM1処理で、他のすべての処理よりも高い濃度が認められた。

図7
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図7. 図7. 4つの測定時点を持つ28日間の培養実験において、EMレベルの有意な主効果を示した水溶性イオン（塩化物、硝酸塩、硫酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム）の濃度（μg/kg土壌）。数値は4反復の平均値、エラーバーは標準誤差を示す。

3.7. 水溶性元素
被覆作物バイオマスまたはEM添加による水溶性元素の投入量 は、表4に絶対数および土壌中の初期水溶性濃度に対する相対値で 示されている。すべての分析対象元素について、被覆作物バイオマス経由の投入量は、EM添加経由の投入量よりも多かった。分析した水溶性元素の濃度は、4 回の測定時点のうち少なくとも 1 回は、EM とカバークロップの添加に影響された（図 8、および補足資料の表 S5 に対応する統計量）。カバークロップの投入は、少なくとも1つの時点において、NCC処理と比較して水溶性Pb、Cd、Cr、Ni、Al、Ag、Mn、Fe、Cu、Zn、Uの濃度を有意に増加させた。EM濃度間の水溶性元素濃度の測定値には、体系的でないわずかな差しかみられず、その差はカバークロップを添加した処理でのみ発生した。EMの高用量施用（EM100、EM100st）は、土壌培養実験中の水溶性元素濃度に一貫した影響を与えなかった。EM0と比較したEM1の効果で統計的に有意であったのは7日目のみで、CC-EM1処理はCC-EM0処理よりもAsとPの濃度が高かった。滅菌したEMと生きたEMの比較では、少なくとも1つの時点で、CC-EM100処理ではCC-EM100st処理と比較して、Cd、Ni、Ag、P、Cu、Uの濃度が有意に高かった。NCC処理では、NCC-EM1とNCC-EM0、NCC-EM100とNCC-EM100stの間に有意差は確認されなかった。

図8
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図8. 4つの測定時点からなる28日間の培養実験における、EMレベルの有意な主効果を示した水溶性元素（ヒ素、カドミウム、ニッケル、銀、リン、バナジウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、ウラン）の濃度（μgまたはmg kg-1土壌）。エラーバーは標準誤差を示す。

  1. 考察
    4.1. 推奨用量でのEM散布（EM1）
    推奨用量での EM 施用（EM1）は、CC および NCC のいずれにおいても、対照処理（EM0）と 比較して、土壌呼吸（図 2）や微生物バイオマスの発達（図 3）のような重要な土壌 特性に影響を及ぼさなかった。これは、Schenck zu Schweinsberg-Mickan and Müller（2009）の知見と一致している。CC-EM1処理区では、4反復中1反復だけが、CC-EM0処理区よりもbOTU4440（Lactobacillus）とfOTU5（Saccheromycetales）の相対存在量がわずかに高かったことから、観察された結果の欠如は、土壌中の痕跡EM-taxaの不在によって確認された。水溶性イオンと元素の統計的に有意な差は、培養実験中の特定の時点でわずかに見られたが、経時的には一貫性がなかった。他の研究では、(Hu et al., 2018)はEM-堆肥でより高い利用可能なリンとカリウム含量を観察し、他の研究では、従来の堆肥と比較してEM-堆肥のN含量がわずかに高いと報告している(Daur, 2016; Jusoh et al., 2013; Van Fan et al., 2018; Zhong et al., 2018)が、これらの調査は土壌についてはこれまで欠落していた。さらに、培養実験を通してPOXCに一貫した変化は観察されなかったことから、EM添加は、PTTEの栄養素をさらに放出させる可能性のある、土壌中に既に存在する不安定な土壌有機物には影響を及ぼさなかったことが示唆される。同様に、最近の総説（Safwat and Matta, 2021）でも、有機物の堆肥化に対するEMの有益な効果を確認する証拠はほとんど見つかっていない。

土壌の培養は、温帯気候の春のような圃場条件（12℃、0.2 g H2O g-1土壌）を模倣したもので、EM施用によるカバークロップの分解促進に関連すると思われる。とはいえ、春季の土壌温度、水分、間隙水量は通常、非常に変動が大きい。その結果、EMの定着にも影響を及ぼし、EMの定着には非常に特殊な条件が必要になる可能性がある。圃場規模では、主に亜熱帯気候のもとで、緑肥、農地堆肥、化学肥料をEMと組み合わせて施用した場合、収量と養分効率が高くなることがいくつかの実験で報告されている（Hu and Qi, 2013; Hussain et al., 1999; Javaid and Bajwa, 2011; Khaliq et al.） しかし、温帯気候の地域では、EMの土壌施用が作物収量や土壌品質に及ぼす影響について、現存する数少ない実地研究では明らかにできなかった（Mayerら、2010；Pranagalら、2020）。このことは、一般的な施用率でのEM添加が土壌特性に影響を与えないことを示した我々の研究結果からも裏付けられた。

4.2. EMの高用量施用（EM100、EM100st）
推奨量の100倍以上のEMを添加した場合、土壌呼吸（図2）や微生物C（図3）など、土壌特性に何らかの影響が見られた。しかし、これらの変化は、溶液が滅菌され ているか（EM100st）、滅菌されていないか（EM100）に関係なく起こっ ており、実際のEM効果ではなく、基質効果であることが明らかである。EM100とEM100stの施用レベルで添加された炭素量は、土壌1kgあたり約0.2g Cであった（表2）。これは、CC および NCC の両処理区で、EM0 レベルと比較した累積呼吸 C の差とほぼ一致した（図 2b）。EM溶液は酸性であったため（pH 3.6；表1）、放出されたCO2の一部は、アルカリ性土壌中の炭酸塩の溶解に由来する可能性がある。しかし、EM溶液に添加された酸がすべてCaCO3によって緩衝され、CO2として放出されたと仮定すると、Cの放出量はわずか1.6 mg C kg-1土壌に相当し、基礎的な土壌呼吸と比較すると無視できる量である（図2a）。EM100処理で添加されたCの量（土壌1kgあたり0.2g C）は、カバークロップのバイオマスで添加されたC（土壌1kgあたり5.4g C）よりもはるかに少なかった。また、カバークロップの添加によって微生物バイオマスがわずかに増加し、NO3-が固定化された可能性が高いことから、高用量EMやカバークロップバイオマスを添加していない処理区（NCC-EM0およびNCC-EM1；図7および表S4参照）のNO3-濃度が有意に高かったことが説明できる。さらに、ある時点では、カバークロップの投入量に関係なく、EM100およびEM100stレベルでは、EM1およびEM0レベルと比較して、Cl-、SO42-、Na+、Mg2+、およびCa2+の高濃度が観察され（図7、表S4）、これらのイオンがEM溶液の一部であったことが示唆された。このことは、これらの水溶性イオンの濃度が高いことも基質効果の結果であることを示唆している。ただし、EM原液は有機不純物が多く、これらの水溶性イオンを分析できなかったため、完全には確認できない。一方，EM原液を分析した結果（表4），広範囲の水溶性元素が検出され，100倍施用レベルでは，カバークロップのバイオマスによる投入量に比べ，これらの投入量はまだわずかであることがわかった。したがって，EM 溶液から土壌系への有害な可能 性のある元素の投入は否定できる。

表 1. 本研究で使用した耕地土壌の特性。平均値と標準偏差を示す。

単位 値（SD）
砂† 質量 % 50
シルト† mass % 29
粘土† mass % 21
最大保水力‡ g water per g soil 0.36
pH (CaCl2) 7.12 (0.09)
総 C§ g C kg-1 soil 28.6 (0.1)
無機態C§ g C kg-1 土壌 9.04 (0.19)
有機物C§ g C kg-1 土壌 19.5 (0.3)
過マンガン酸酸化性C# mg C kg-1土壌 543 (12)
微生物C† mg C kg-1土壌 342 (18)
全窒素§ g N kg-1 土壌 2.12 (0.01)
微生物 N† mg N kg-1 土壌
マグネシウム‡ g kg-1 土壌 6.02 (0.16)
アルミニウム‡‡ g kg-1 土壌 9.44 (0.63)
リン‡ g kg-1 土壌 1.32 (0.66)
マンガン‡ g kg-1 土壌 0.88 (0.02)
鉄‡ g kg-1 土壌 17.8 (0.9)
銅‡ mg kg-1 土壌 43.2 (0.8)
亜鉛‡ mg kg-1 土壌 69.9 (2.7)
鉛‡ mg kg-1 土壌 38.6 (1.5)
†
改良型積分懸濁圧法（ISP+）（Durner and Iden, 2021）。

‡
最大保水量は、水飽和試料がすべての重力水を失った後に重量法で測定した。

§
CNS分析装置による乾式燃焼。無機Cの測定のため、試料はまず550 °Cで点火された。


(Weil et al., 2003)のプロトコルによる。

††
(Vance et al., 1987)のプロトコルによるクロロホルム燻蒸。

‡‡
硝酸マイクロウェーブ消化で土壌から抽出し、誘導結合プラズマ質量分析計で測定。

表2. 表2.完全直交実験計画に組み入れられたカバークロップ（CC, NCC）とEMレベル（EM0, EM1, EM100, EM100st）のレベルの説明。

レベル 投入量
g (kg soil)-1 C投入量
g (kg soil)-1 N投入量
mg (kg soil)-1 希釈倍率 pH 備考
CC 12.8 (乾物) 5.4 300 乾燥後、2 mm に切断したもの
NCC 0 0 0
EM0 0 0 0 水のみ 7.00
EM1 0.256 0.002 0.075 1: 121 3.98 EMを推奨用量で散布
EM100 25.6 0.2 7.5 1: 1.21 3.55 生きたEMを推奨線量の100倍の量で散布したもの
EM100st 25.6 0.2 7.5 1: 1.21 3.58 滅菌EMを推奨線量の100倍の量で投与
表3. 適用したEM溶液中の真菌および細菌OTUの分類と相対的シェア。

平均相対存在量 (%) SE
fZOTU5 真菌類 子嚢菌門 子嚢菌綱 93.3 0.8
fZOTU375 真菌類 モルティエレル菌門 モルティエレル亜目 モルティエレル科 NA 1.9 0.3
ffZOTU1425未同定 1.3 0.1
fZOTU9 未同定 0.7 0.0
fZOTU1533 真菌類 モルティエレル菌門 モルティエレル亜目 0.6 0.1
fZOTU66 真菌類担子菌門 真菌類フィロバシジアル科 ピスクロジマ属 Solicoccozyma 0.5 0.2
fZOTU23 真菌類子嚢菌門放線菌亜目ネクトリア科ギベレラ属 0.5 0.1
fZOTU941 真菌類 モルティエレル菌綱 モルティエレル目 モルティエレル科 0.4 0.1
fZOTU1975 真菌類子嚢菌門 Sordariomycetes 0.4 0.0
fZOTU2087 真菌 0.3 0.0
bZOTU4440 Bacteria Firmicutes 硬菌類 Lactobacillales 乳酸桿菌科 Lactobacillus 72.6 0.0
bZOTU4994 Bacteria Firmicutes Bacilli Lactobacillales Lactobacillaceae 乳酸桿菌 16.4 1.9
bZOTU3653 Bacteria Firmicutes Bacilli Lactobacillales Lactobacillaceae 乳酸桿菌 5.8 1.2
bZOTU3325 Bacteria Firmicutes Bacilli Lactobacillales Lactobacillaceae 乳酸桿菌 3.9 1.0
bZOTU2664 Bacteria Proteobacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Acetobacterales Acetobacteraceae アセトバクター 0.6 0.2
bZOTU7663 Bacteria Firmicutes 硬菌類 Lactobacillales Lactobacillaceae 乳酸桿菌 0.5 0.0
bZOTU2304 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridium_sensu_stricto_1 0.2 0.1
表4. 被覆作物バイオマスおよび有効微生物中の水溶性元素濃度と、培養実験における適用濃度を絶対数および土壌中の初期水溶性濃度に対するパーセンテージで示した（括弧内は3回測定の標準偏差）。

空細胞 カバー作物 有効微生物
乾物中の濃度 土壌への添加濃度 土壌中の初期水溶性濃度（0日目）に対する添加濃度 購入液中の濃度 EM1レベルの土壌への添加濃度 EM100レベルの土壌への添加濃度 土壌中の初期水溶性濃度（0日目）に対するEM100の添加濃度
単位[mg kg-1] [μg kg-1] [%] [μg L-1] [ng kg-1] [ng kg-1] [%] [0
As 0.044 (0.005) 0.558 (0.06) 4.1 (0.4) 2.69 (0.04) 0.687 (0.011) 68.7 (1.1) 0.5 (7.8)
Pb 0.204 (0.007) 2.62 (0.08) 241.4 (7.7) 検出限界以下
Cd 0.011 (0.000) 0.146 (0.003) 165.1 (3.82) 検出限界以下
Cr 4.31 (0.16) 55.2 (2) 2429.1 (89.5) 7.5 (0.25) 1.91 (0.07) 191.9 (6.5) 8.5 (0.3)
Ni 0.635 (0.03) 8.15 (0.38) 132.4 (6.2) 12.7 (1.4) 3.26 (0.36) 326 (36) 5.3 (0.6)
銀 0.013 (0.000) 0.163 (0.000) 211.6 (0.1) 2.94 (0.09) 0.751 (0.024) 75.1 (2.4) 97.3 (3.1)
アルミニウム 35.4 (2.1) 454 (27) 18.4 (1.1) 173 (33) 44.3 (8.3) 4430 (833) 0.18 (0.03)
P 未測定
V 0.079 (0.002) 1.01 (0.02) 1.7 (0.0) 7.05 (0.23) 1.80 (0.05) 181 (6) 0.3 (0.01)
Mn 35.2 (0.7) 451 (9) 2056.3 (39.8) 96.3 (1.5) 24.7 (0.4) 2466 (38) 11.2 (0.2)
Fe 測定せず
銅 7.7 (0.24) 99 (3) 184.8 (5.7) 11.9 (0.5) 3.05 (0.13) 305.0 (13) 0.57 (0.02)
Zn 未測定
U 0.003 (0.001) 0.036 (0.009) 47.0 (12.3) 0.704 (0.017) 0.180 (0.004) 18.0 (0.4) 23.5 (0.6)
4.3. 土壌への添加による土壌中の微生物組成と定着性
EMを高用量で散布し、滅菌した対照区を設けることで、生きた微生物による潜在的な影響を同定し、基質による影響と区別することができた。我々の研究では、EM溶液から3つの主要な生物が追跡・同定された。その中で、2つのLactobacillus-taxa（bOTU4440とbOTU4994）は、CC-EM100処理において相対的な存在量が非常に高く、生きたEMを含まない処理では見られなかった。しかし、これらの存在は全細菌群集の1%未満であった。

有効な微生物は世界中に分布し、増殖し、様々な添加物を用いて様々な最終製品に加工されている。このようなばらつきは、さまざまなEM研究を比較する際の課題となる。我々の研究では、EM溶液を分類学的マーカー遺伝子のアンプリコンシークエンシングによって解析した結果、細菌と真菌のOTUが明らかになり、細菌はLactobacillus属に、真菌はSaccheromycetales目に分類された。しかし、光合成細菌や多量に存在する子嚢菌は、EMコンソーシアムの一部として報告されていたが（Ahn et al.） とはいえ、Lactobacillus属とSaccharomycetales属は嫌気性発酵を行う可能性があり、これはEMが有機物の分解に影響を与える主なメカニズムとして示唆されている（Higa and Parr, 1994）ため、本研究では代表的な製品を試験したと結論づけた。

  1. 結論
    被覆作物バイオマスの有無にかかわらず、EM を土壌に推奨施用量（EM1）添加しても、モニ ターした生物学的・化学的土壌特性のいずれにも一貫した影響は認められなかった。推奨施用量の 100 倍（EM100）を施用した場合、土壌呼吸と微生物バイオマスの増加が観察された が、同様の効果は滅菌処理した対照区（EM100st）でも観察されたため、基質による効果で十分 説明できる。土壌微生物群集は、EM添加後もほとんど影響を受けなかった。10種類の水溶性イオンを分析した結果、EM溶液の添加による有機物の無機化や栄養塩の放出への有意な影響は認められなかった。さらに、14種類の水溶性栄養素および元素を分析した結果、EM溶液に含まれる分析対象化合物は、いずれも推奨用量で施用した場合に有害な濃度で存在しないことが示された。しかし、土壌中の特定の化合物を動員または固定化する有意な効果も見られなかった。したがって、添加したEM溶液そのものは、カバークロップの分解や、EM溶液と一緒に添加した炭素、栄養素、その他の物質以外の土壌プロセスを変化させなかったと結論づけた。

資金提供
本研究は、公的、営利、非営利のいずれの分野の助成機関からも特定の助成を受けていない。Klaus A. Jaroschは、欧州連合Horizon 2020研究・イノベーションプログラムEJP SOIL（助成金契約番号862695）、サブプロジェクトARTEMISから資金援助を受けている。

CRediT著者貢献声明
Simon Oberholzer: 執筆 - 査読と編集, 執筆 - 原案, 可視化, 検証, 方法論, 形式分析, データキュレーション, 概念化. Christa Herrmann：執筆-校閲・編集、検証、方法論、調査、形式分析、データキュレーション、概念化。Natacha Bodenhausen: 執筆 - レビューと編集, 方法論, 調査, データキュレーション. ハンス＝マルティン・クラウス 執筆-校閲・編集、方法論、調査、データキュレーション。アドリアン・メストロ 執筆-校閲・編集、監督、プロジェクト管理。チンウェ・イフェジカ・スペランザ 執筆-校閲・編集、監督、資金獲得。クラウス・A・ヤロッシュ 執筆-校閲・編集、バリデーション、スーパービジョン、プロジェクト管理、方法論、調査、形式分析、データキュレーション、概念化。

利益相反宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる競合する金銭的利益や個人的関係はないことを宣言する。

謝辞
本研究は、共同作業によってのみ完成させることができた。したがって、Daniela Fischer博士、Maarika Bischoff博士、Patrick Neuhaus博士、Lisa Thönen博士、Fabia Lüthi博士の専門知識と集中的な研究室でのサポートに感謝したい。塩基配列決定のためのアンプリコンライブラリーを準備してくれたSonja Reinhardと、バイオインフォマティクスのサポートをしてくれたETH遺伝的多様性センターのJean-Claude Walserに感謝する。研究デザインと統計的評価をサポートしてくれたMarkus SteffensとEric Pintoに感謝する。さらに、原稿の草稿に批判的なフィードバックと有益な示唆を与えてくれたAstrid Obersonに感謝する。また、2名の匿名査読者の建設的な意見に感謝する。さらに、実験の実施を許可し、カバークロップとEM散布に関する経験を共有してくれた協力農家に感謝したい。

付録A. 補足データ
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補足資料

データの入手
データはご要望に応じて提供いたします。

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