SARS_COV_2:血小板と血栓と

社会の毒

略語

COVID-19コロナウイルス病2019
CRP C反応性タンパク質
FA ホルムアルデヒド
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PPP血小板減少型血漿
SARS-CoV-2 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型
SEM 走査電子顕微鏡法
ThT チオフラビンT
T2DM 2型糖尿病
VWF フォンウィルブランドファクター
WB 全血

SARS-CoV-2スパイク蛋白質S1はフィブリン溶解に抵抗性のフィブリン（オージェン）を誘導する：COVID-19のマイクロクロット形成への影響

Lize M. Grobbelaar、サンプル分析、視覚化、執筆-原案、Chantelle Venter、データキュレーション、プロジェクト管理、...、Etheresia Pretorius、概念化、リソース、形式的分析、監督、資金獲得、検証、調査、視覚化、方法論、プロジェクト管理、執筆-レビューと編集

追加記事情報

関連データ

データの利用可能性に関する声明
概要

コロナウイルス感染症2019（COVID-19）の原因である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-Cov-2）誘発感染は，これまでにない臨床病態を特徴とする．最も重要な病態の1つ、それは患者の肺における凝固亢進と微小血栓である。ここでは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質S1サブユニットが潜在的な炎症誘発物質としてどのような影響を及ぼすかを研究している。走査型電子顕微鏡、蛍光顕微鏡、質量分析計を用いて、この炎症物質が血小板やフィブリン（抗原）と直接相互作用して血液凝固亢進を引き起こす可能性を調査した。血小板の少ない血漿（PPP）を用いて、スパイクタンパク質が血流を阻害する可能性があることを示す。また、健康なPPPにスパイクプロテインS1を添加すると、β、γフィブリン（オージェン）、補体3、プロトロンビンに構造変化をもたらすことを質量分析により明らかにした。これらのタンパク質は、スパイクプロテインS1の存在下では、トリプシン化に対して実質的に抵抗性であった。このことから、COVID-19陽性患者においては、循環中のスパイク蛋白の存在が凝固亢進の一因となり、線溶の実質的な障害を引き起こしている可能性があることが示唆された。このような溶血障害は、今回および以前にCOVID-19患者の血漿サンプルで観察された持続的な大きな微小血栓をもたらすと考えられる。この観察は、COVID-19患者の凝固性亢進の治療において、臨床的に重要な意味を持つかもしれない。

キーワードCOVID-19、電子顕微鏡、フィブリン（オーゲン）、蛍光顕微鏡、マイクロクロット、スパイク蛋白質Sa

はじめに

コロナウイルス症2019（COVID-19）の原因である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-Cov-2）誘発感染は、これまでにない臨床病態が特徴的である。表現型の血管特性は、出血と血小板減少または凝固亢進と血栓症のいずれかを引き起こす様々な凝固異常と強く関連しています[1,2]。フィブリン（オーゲン）、Dダイマー、P-セレクチン、von Willebrand Factor（VWF）、CRP、各種サイトカインなど、循環している様々な炎症性凝固バイオマーカーは、直接内皮受容体に結合します。したがって、エンドセリオパシーはこの疾患の重要な臨床的特徴である[3,4]。COVID-19の様々なステージの進行中、ウイルス複製のマーカー、ならびにDダイマー値の上昇を伴うVWFおよびフィブリノゲン枯渇、P-セレクチン値の調節異常、それに続くサイトカインストームは、予後不良を示すと思われます[5-8]。この予後不良は、肺での微小血栓の実質的な沈着とともに、さらに悪化する[9-11]。COVID-19患者の血漿もまた、形成前のアミロイド凝塊を大量に抱えており[5]、赤血球[12-14]、血小板へのダメージや炎症性バイオマーカーの調節異常についても多くの報告がある[5-8]。

病原体の毒性は、その膜タンパク質と密接な関係がある。COVID-19ウイルスに見られるそのようなタンパク質の一つに、膜糖タンパクであるスパイクタンパク質があります。スパイクタンパク質は、アンジオテンシン変換2（ACE2）表面受容体と結合するため、ウイルスが標的細胞に付着するための重要な因子である[15]。スパイクタンパク質は、クラスIのウイルス融合タンパク質である[16]。ウイルス表面に突出したホモトリマーとして存在し、ウイルスの標的宿主細胞への侵入を媒介する[17]。スパイクタンパク質の大きさは180〜200kDaで、細胞外のN-末端、ウイルス膜に固定された膜貫通ドメイン、細胞内の短いC-末端セグメントを含んでいます [16,18]．スパイクタンパク質は、カモフラージュの役割を果たす多糖類分子で覆われている。これは、侵入時に宿主免疫系による監視を回避するのに役立つ[18]。S1サブユニットは受容体との結合を担い[19]、カルボキシル末端のサブユニット2（S2）は、ウイルスの融合と侵入を担う[20]（図1参照）。

SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質の模式図
21]より引用した。略語。HR1: ヘプタッドリピート1; HR2: ヘプタッドリピート2; S1: サブユニット1; S2: サブユニット2.この画像は BioRender (https://biorender.com/) で作成された。

レセプター結合は確かに細胞を介した病態に関与しているが、それ自体で凝固異常を説明できるわけではない。しかし、スパイクタンパク質は排出されることがあり、尿路を含む様々な臓器で検出されています [22]。S1タンパク質は血液脳関門を通過することもできます [23]。遊離したS1粒子もまた、本疾患の病因に関与している可能性があります [24,25]。遊離のスパイクタンパク質は、ウイルス表面のSタンパク質三量体の自発的な「発火」によって放出される可能性があり、感染細胞は、レセプター結合ドメインを含む遊離のS1粒子を放出します[24]。

ここでは、単離された SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 S1 サブユニットが炎症促進性炎症物質としてどのような影響を及ぼすかを研究している。この炎症誘発物質が血小板やフィブリン（オージェン）と直接相互作用し、フィブリン（オージェン）タンパク質の変化や血液凝固促進を引き起こす可能性を検討した。また、スパイクタンパク質を添加したナイーブな健康血小板乏血漿（PPP）サンプルと、COVID-19陽性患者のPPPサンプル（治療前）を比較し、スパイクタンパク質が血流を阻害する可能性を明らかにします。その結果、スパイクタンパク質は細胞に取り込まれることなく、直接的に病態に影響を与える可能性があることがわかりました。このことは、ワクチンや抗体を介してであれ、スパイクタンパク質を直接標的とすることが、治療上有益である可能性が高いことを示すさらなる証拠となる。

材料と方法

サンプルの属性と留意点

対照となる健康なボランティア（n=11、男性3名、女性8名、平均年齢43.4±11.7歳）から血液を採取した。喫煙者、心血管疾患、凝固障害、炎症性疾患（例：2型糖尿病（T2DM）、関節リウマチ、結核、喘息など）の患者は、コントロールボランティアになることができなかった。さらに、妊娠、授乳、ホルモン療法、経口避妊薬の使用、および抗凝固剤の使用も除外要因となった。喫煙は、凝固、線溶、および止血過程を損なうことが証明されているため、除外された[26]。マイクロ流体解析では、2人のCOVID-19陽性患者のPPPサンプルを用いて、初診日および治療前の予備的解析を行った。両者とも中等度から重度のCOVID-19症状と診断された（男性1名，女性1名，平均年齢：78.5±7.7歳）．

血液サンプルの採取

有資格の瀉血専門医または開業医のいずれかが、標準的な無菌プロトコルに沿って静脈穿刺によりボランティア（コントロール）の血液を採取した。血液サンプルは、2～3本の4.5mlクエン酸ナトリウム（3.2%）チューブ（BD Vacutainer®、369714）に保存された。数回穏やかに反転させた後、採取したクエン酸塩チューブを最低30分間室温で休ませ、十分な抗凝固剤のアマルガムを行った後、サンプル調製を開始した。全血（WB）を3000×gで15分間、室温で遠心分離し、赤血球を分離した。上清（PPP）を回収し、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れ、実験に必要な時まで-80℃で保存した。

スパイクタンパク質の調製

SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike protein S1 Subunit, mFcTagは、Sino Biological (Beijing, China) から購入し（カタログ番号40591-V05H1）、提供された指示に従い、二重蒸留水を用いて調製した。100 µg のスパイクタンパク質に合計 400 µl の希釈剤（エンドトキシンを含まない水）を加え、0.25 mg.ml-1 のストック溶液 (A) を作成した。このストック溶液を希釈してワーキングソリューションとした。血液の粘弾性特性に有意な、しかし、生理学的効果をもたらすのに十分な高濃度のスパイクタンパク質の必要濃度を決定するために、PPP中の異なる濃度のスパイクタンパク質を、蛍光顕微鏡で評価した。健康なコントロールの血液サンプルを4本の1.5mlエッペンドルフチューブに分け、PPP中のスパイクタンパク質の最終曝露濃度を100、50、10、1 ng.ml-1とした。PPPサンプルは、室温で30分間、様々なスパイクタンパク質濃度とともにインキュベートされた。

精製フィブリノゲンおよびPPPのトロンビン有無の蛍光顕微鏡観察

濃度の検証 どのスパイクタンパク質濃度が有効かを検証するために、蛍光アミロイド色素であるチオフラビンT（ThT）（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）を室温で30分間暴露した後、異なるスパイクタンパク質濃度のPPP5μlをスライドグラス上に配置した。調製したすべてのサンプルのThTの最終濃度は0.005 mMであった。スパイクタンパク質濃度を変化させたサンプルを評価した結果、最終暴露濃度1 ng.ml-1で十分であることがわかり、以降の研究に使用した。
アミロイド蛋白と PPP 試料における異常凝固性 ナイーブな健常 PPP 試料において、スパイク蛋白の存在下でのフィブリン（オジン）の自発的異常凝固性を調べるために、1 ng.ml-1 （最終濃度）のスパイク蛋白に曝露した 5 μl PPP をスライドグラス上に塗布し、カバースリップで覆った。これは、蛍光アミロイド色素ThT（最終濃度：0.005 mM）（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, U.S.A.) に室温で30分間暴露した後に行われた。また、5μlのPPPに2.5μlのトロンビン（7 U.ml-1, South African National Blood Service）を加えて、スパイクタンパク質を含む、含まない、ThTに曝露した後のフィブリンPPP凝塊を調製し、スライドグラス上に置いてカバースリップでカバーした。ThTの励起波長を450〜488nm、発光を499〜529nmとし、処理したサンプルをPlan-Apochromat 63×/1.4 Oil DIC M27対物レンズを備えたZeiss Axio Observer 7蛍光顕微鏡で観察した（カールツァイス顕微鏡、ミュンヘン、ドイツ）。

スパイクタンパク質を含む健常PPPと含まないPPPの蛍光顕微鏡画像は、Fiji®（Java 1.6_0 24 [64-bit]）を使用して解析し、画像を数値化した。蛍光粒子または異常凝固（アミロイド色素ThTで識別）[27-29]の総面積は、Fiji®の閾値アルゴリズムを用いて決定されました。画像はまず、蛍光顕微鏡で使用したレンズの倍率に応じて Fiji® でスケールを設定し、次に、画像の前景をできるだけ考慮し、背景をできるだけ無視するように適切な閾値を選択しました。閾値を設定する画像の量を最適化するため、画像群を同時に解析するプログラムをJavaで作成した（補足資料参照）。各画像の異常血栓の合計割合を算出し，サンプルごとの全画像の平均を算出した．これらの平均値を統計解析に使用した。

精製フィブリン(ogen)凝固モデル スパイクタンパク質が精製フィブリノゲンに変化をもたらすかどうかを調べるため、Alexa Fluor™ 488 (Thermo Fisher, F13191) と結合した蛍光性フィブリノゲンを精製フィブリン(ogen) 凝固モデルとして選択した。最終濃度2 mg.ml-1 のフィブリノゲンをエンドトキシンフリー水で調製し、1 ng.ml-1 （最終濃度）のスパイクタンパク質を室温で30分間曝露した。精製したフィブリノゲンを合計5μl、トロンビンを2.5μl、スライドグラスに載せた。我々の蛍光フィブリノゲンモデルの励起波長を450-488nm、発光を499-529nmに設定し、処理したサンプルをPlan-Apochromat 63×/1.4 Oil DIC M27対物レンズを備えたZeiss Axio Observer 7蛍光顕微鏡（カールツァイス顕微鏡、ミュンヘン、ドイツ）で観察した。
WB（ヘマトクリット） ヘマトクリットを最終曝露濃度1 ng.ml-1 スパイクタンパク質に曝露した。血小板の活性化を調べるために、蛍光マーカーであるCD62P（血小板表面P-セレクチン）をヘマトクリットに添加した。CD62Pは血小板の膜上に存在し、その後、血小板膜表面に転移してくる。この転座は、血小板の活性化の際に、血小板のP-セレクチンが細胞顆粒から遊離した後に起こる[5,7]。合計4μlのCD62P（PE-conjugated）（IM1759U, Beckman Coulter, Brea, CA, U.S.A.) を20μlのWB（ナイーブまたはスパイクタンパク質とインキュベートしたもの）に添加した。マーカーにさらされたヘマトクリットを室温で30分間インキュベートした（光から保護された）。CD62Pの励起波長は540-570 nm、発光は577-607 nmであった。また、処理したサンプルは、Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil DIC M27対物レンズを備えたZeiss Axio Observer 7蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy, Munich, Germany）を用いて観察された。

WBサンプルの走査型電子顕微鏡観察

走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて、スパイクタンパク質を添加した場合と添加しない場合の健全なWB試料を観察した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH = 7.4）（Thermo Fisher Scientific、11594516）で 20 分間洗浄することから始め、合計 10 μl の WB をガラスカバースリップ上に置き、既報の SEM 準備方法 [30,31] に従って準備した。固定は、スライドを4%ホルムアルデヒド（FA）で30分間コーティングし、その後、PBSで3回洗浄することにより行った。各洗浄の際、PBSは3分間放置した後、取り除いて再度洗浄する。四酸化オスミウム（OsO4）（Sigma-Aldrich、75632）を15分間加え、スライドをPBSで3回、もう一度それぞれ3分間ずつ洗浄した。次に、エタノールでスライドを順次脱水し、ヘキサメチルジシラザン (HMDS) (Sigma-Aldrich, 379212) で乾燥させた。サンプルはスライドグラスにマウントされ、カーボンでコーティングされた。スライドは、InLens 検出器を備えた Zeiss MERLIN FE-SEM で、1 kV で観察した (Carl Zeiss Microscopy, Munich, Germany)。

マイクロフルイディクス

健常者PPPおよび健常者プールPPPサンプル（プールPPP3サンプル）、スパイクタンパク質あり・なし、COVID-19 PPP2サンプルを用いてマイクロ流体解析を実施した。プールされたサンプルは、この実験に必要な体積のために使用されました。

ハードウェア 流体条件下での血栓の成長をシミュレートし調査するために、マイクロ流体セットアップを使用した。Cellix microfluidic syringe pump (Cellix Ltd, Dublin, Ireland) を用いて、8本の直線状マイクロ流路からなるCellix Vena8 Fluoro+ biochips (Cellix Ltd, Dublin, Ireland) を、以下のパラグラフで指定する流速で通過するように流れを駆動した。単一のマイクロ流路は、幅400μm、高さ100μm（等価直径207μm）、長さ2.8cmを有していた。マイクロチャネルの寸法は，微小血管のいくつかの血管と同じオーダー，すなわち300μm以下であった[32]．血栓の進展をリアルタイムで観察するために，バイオチップを10×/0.25対物レンズ付きのZeiss Axio Observer 7蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy, Munich, Germany）の下に設置した．
フロー条件 ランニングごとに新しいフローチャネルを使用した。流路には蒸留水を1ml.min-1の流速で1分間流した。5分後、トロンビンを50μl.min-1の流速で90秒間マイクロチャネルに注入した（図2）。さらに5分間放置した後、サンプル（コントロール、スパイク付きコントロール、COVID-19）を流速10μl.min-1で5分間注入し、チャンネルをビデオで記録した（図2）。その後、5分後にフローを停止し、チャネルを横切る一連の顕微鏡写真を撮影した。その後、さらに5分間放置し、さらなる変化が起こるかどうかを確認した(Figure 2)。この流量は、せん断速度γ≈250 s-1、レイノルズ数Re≤1に相当する。一貫したせん断速度とレイノルズ数を達成しようとする際の主な課題の1つは、サンプルごとに粘度が異なることであった。さらに、微小血管を流れる血液は非ニュートン的な挙動を示すことが知られており、1つの試料内で粘度が変動するという複雑な問題がある。そこで、試料間の標準化を図るため、一定の流速を用いることにした。

マイクロ流体システムで血栓を成長させる実験プロトコル

プロテオミクス

健康なPPPサンプル4個をスパイクタンパク質の添加前と添加後に分析した。サンプルは10mM重炭酸アンモニウムで1mg.ml-1に希釈された。合計1μgのトリプシン (New England Biosystems) を、酵素と基質の比率が1:50になるように血漿に添加しました。還元やアルキル化は行わなかった。

液体クロマトグラフィー
Dionex nano-RSLC 液体クロマトグラフィーは、5 mm × 300 µm C18 トラップカラム (Thermo Scientific) と CSH 25 cm × 75 µm, 1.7 μm particle size C18 column (Waters) analytical column を備えた Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC で実施しました。溶媒系はloadingを採用した。溶媒は2%アセトニトリル:水; 0.1%FA; 溶媒A: 2% アセトニトリル:水; 0.1%FA および溶媒B: 100% アセトニトリル:水としました。7ºCに設定した温度制御オートサンプラーから2 µl/minの流速でローディング溶媒を用いてトラップカラムに試料をロードしました。ローディングは5分間行った後、分析カラムに試料を溶出させました。流速は300 nl/minとし、グラジエントは以下のように設定した。60分間に5.0-30%B、60-80分間に30-50%Bのグラジエントを設定しました。クロマトグラフィーは45℃で行われ、流出液は質量分析計に送られた。
質量分析 Nanospray Flexイオン化源を装備したThermo Scientific Fusion質量分析計を使用して質量分析を行った。スパイクタンパク質添加前と添加後の血漿サンプル（最終暴露濃度1 ng.ml-1）、コントロールサンプルのうち4つをこの方法で分析しました。サンプルは、ステンレス製のナノボアエミッターから導入した。スプレー電圧は1.8 kV、イオン導入キャピラリーは275℃に設定し、ポジティブモードでデータを収集した。スペクトルは、m/z = 445.12003のポリシロキサンイオンで内部校正されました。MS1スキャンは、スキャン範囲375-1500で分解能120000に設定したオービトラップ検出器を用い、AGCターゲットを4 E5、最大注入時間50msで実行した。データはプロファイルモードで取得された。MS2の取得は、電荷+2〜+7のイオンのモノアイソトピックプリカーサー選択で行い、誤差を±10ppmに設定した。プリカーサーイオンは、60秒間、フラグメントから除外された。プリカーサーイオンは、HCDエネルギーを30％に設定した四重極質量分析計を用いて、HCDモードでフラグメントに選択された。フラグメントイオンは、30000分解能に設定したOrbitrap質量分析計で検出した。AGCターゲットは5E4に設定し、最大注入時間は100msに設定した。データはセントロイドモードで取得した。
統計解析

データ解析：血漿サンプル 作成したデータの統計解析は、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン9.0.0）を用いて行った。データの正規性はShapiro-Wilk正規性検定を用いて評価した。2群間のデータの解析には、パラメトリックデータの統計的有意性を評価するために、対のt検定（未処理対照群と処理対照群のデータ間の対の統計比較）および非対t検定（非対の統計比較）を行い、ノンパラメトリックデータの統計的有意性の検定にはマン-ホイットニー検定、対のパラメトリックデータの有意性にはウィルコクソン検定を利用した。3つ以上の実験群を比較する場合は、Kruskal-Wallis検定（ノンパラメトリックデータ）または一元配置分散分析（パラメトリックデータ）検定を適用し、統計的有意性を検定した。P 値が 0.05 未満の場合は、統計的に有意であるとみなした。パラメトリックデータは平均値および標準偏差（SD）として、ノンパラメトリックデータは中央値および四分位範囲（IQR）として提示した。

質量分析計のデータ解析 質量分析計で生成した生ファイルをProteome Discoverer v1.4（Thermo Scientific）に取り込み、SequestとAmandaアルゴリズムを用いて処理した。データベース照会は、2019-nCOVpFASTA1データベースに対して行った。2回のミス切断を伴うセミトリプティック切断が許容された。プリカーサーの質量公差は10ppm、フラグメントの質量公差は0.02Daに設定された。動的修飾として、脱アミド化(NQ)、酸化(M)が許容されます。ペプチドのバリデーションはTarget-Decoy PSM validator nodeを使用して行いました。検索結果はScaffold Q+にインポートされ、さらなる検証(www.proteomesoftware.com)と統計テストに使用されました。データセットに対してt検定を実施し、emPAI定量法を用いて比較を行いました。
補足資料と生データ

すべての補足資料と生データは、ここからアクセスできます: https://1drv.ms/u/s!AgoCOmY3bkKHisg5J0nb6wqsBzzWAQ?e=lmObMy

研究成果

精製フィブリノゲンとPPPの蛍光顕微鏡観察

蛍光顕微鏡を用いて、蛍光フィブリノゲンモデルに存在する自発的に形成された異常血栓、およびスパイクタンパク質を含むまたは含まない健康なPPPの蛍光アミロイドシグナルを可視化した。予備調査として、健常者1名のPPPを様々なスパイクタンパク質濃度で30分間インキュベートし、次にThTで30分間インキュベートし、最後に観察用に準備しました。最終的に1 ng.ml-1の曝露濃度で十分であることがわかり、残りの研究に使用した（他の曝露濃度の顕微鏡写真は補足生データを参照のこと）。

図3A,Bは、トロンビンを添加した精製蛍光（Alexa Fluor™488）フィブリノーゲンと1 ng.ml-1スパイクタンパク質に曝露した後の代表的な顕微鏡写真を示しています。スパイクタンパク質の存在下では、より高密度なフィブリン塊が形成された（図3B）。PPPでは、トロンビンの有無にかかわらず、緑色蛍光のThTシグナルがアミロイド沈着形成の領域を示している。ThTはタンパク質中の開いた疎水性領域に結合することが知られており、これらはアミロイドの性質を持っている[27,33-35]。図4A,Dは、健康なPPP塗抹標本の代表的な顕微鏡写真で、トロンビンあり、なし、ThT添加で、わずかに異常な凝固が見られる。一方、スパイクタンパク質をPPPに添加した場合、トロンビンの有無にかかわらず、アミロイド性を有する高密度の異常凝固沈着物の大幅な増加が認められた（アミロイド沈着と呼ぶ）（図4B,D）。Fiji®を使用して、トロンビン有無の顕微鏡写真に閾値アルゴリズムを適用し、各微小写真におけるアミロイド沈着の総面積を算出した（合計320枚の顕微鏡写真を解析した）。この方法を用いて、グループごとのアミロイド沈着の平均合計割合を算出した（ナイーブ健常者PPP、ナイーブ健常者PPP＋トロンビン、1 ng.ml-1 スパイクタンパク質とインキュベートしたPPP、トロンビンを加えたものと加えないもの）（表1参照）。しかし、スパイク蛋白添加前後のPPPでは、PPP塗抹標本とフィブリン凝集塊（トロンビン添加）の両方で、アミロイド沈着面積の%に有意な増加がみられた（表1）。

精製した蛍光（Alexa Fluor™ 88）フィブリノゲン（ThTを添加していないことに注意）にトロンビンを添加して広範なフィブリン凝塊を形成した代表的な蛍光顕微鏡写真
(A）トロンビンを添加した蛍光性フィブリノーゲン、（B）スパイクタンパク質（最終暴露濃度1 ng.ml-1）とトロンビンを添加した蛍光性フィブリノーゲン。

ThT添加後の健常者PPPの代表的な蛍光顕微鏡写真（緑色蛍光シグナル）。
(A)PPPの塗抹標本。(B) スパイクタンパク質を含むPPP。(C) PPPにトロンビンを添加し、広範なフィブリン凝塊を形成したもの。(D) PPPにスパイクタンパク質を接触させ、その後トロンビンを添加した。スパイクタンパク質の最終濃度は1 ng.ml-1であった。

表1

スパイク蛋白の有無、
トロンビンの有無によるPPPの平均アミロイド面積の割合
ナイーブ健常者PPP vs ナイーブ健常者PPP + トロンビン添加 (n=10)
P値（Wilcoxonの検定、中央値[Q1 - Q3]で表される一対のノンパラメトリックデータ） 0.2
ナイーブ健常者サンプルの中央値 0.3% [0.1-0.8%] 0.2
ナイーブコントロール（＋トロンビン）の中央値 0.9％［0.3-1.5］
ナイーブ健常者PPP＋スパイク蛋白（1 ng.ml-1） vs 健常者PPP＋スパイク蛋白（1 ng.ml-1）＋ トロンビン添加）（n=10)
P値（正規分布のデータ；paired t test） 0.3
健常者＋スパイクの平均アミロイド率 1.9% (±1.2%)
健常者サンプルの平均アミロイド率＋スパイク（＋トロンビン） 2.4%（±1.3%)
ナイーブ健常者PPP vs スパイク蛋白（1 ng.ml-1）健常者PPP (n=10)
P値（Wilcoxonの検定、中央値[Q1 - Q3]で表される一対のノンパラメトリックデータ） 0.004 (*)
健常者サンプルの中央値 0.3% [0.1～0.8%] （単位：百万円
健常者サンプルの中央値＋スパイク 1.9％［1.2-2.4］
ナイーブ健常者PPP＋トロンビン添加 vs 健常者PPP＋スパイクタンパク質（1 ng.ml-1）＋トロンビン添加）（n=10)
P値（正規分布のデータ；paired t test） 0.0036 (*)
コントロールサンプルの平均アミロイド率（＋トロンビン） 0.9%（±0.6%)
対照試料＋スパイク（＋トロンビン）の平均アミロイド率 2.4% (1.3%)

血小板活性

蛍光顕微鏡を用いて、ナイーブな健常者のヘマトクリットおよびスパイクタンパク質（最終濃度1 ng.ml-1）とインキュベートしたヘマトクリットにおける血小板活性化を可視化した。サンプルは、血小板マーカーであるCD62P-PEとインキュベートした。図5Aはナイーブコントロールのサンプルの代表的な血小板を示し、図5Bはスパイクタンパク質インキュベーション後の顕微鏡写真である。スパイクタンパク質は、血小板の過活性化の増加を引き起こした（図5B矢印）。

スパイク蛋白質への曝露前後の血小板の蛍光顕微鏡顕微鏡写真
(A) 蛍光マーカーCD62P-PEとインキュベートしたヘマトクリットからの代表的な血小板。(B)スパイク蛋白に暴露した後の活性化血小板を示す代表的な顕微鏡写真。白い矢印は、過活性化した活性化血小板を指す。白い矢印は過活性化した血小板が固まっている様子を示している。

WBのSEM

スパイクプロテイン（最終濃度1 ng.ml-1）処理後の赤血球および血小板の超微細構造を評価するためにSEMを使用した。図6A,Bは健康なWBサンプルの顕微鏡写真、図6C-Hはスパイクタンパク質とインキュベートした後のWBの顕微鏡写真である。健康な未処理対照者からの赤血球の大部分は正常細胞（規則正しい形）であり［図6A（矢印）］、特徴的な円盤状の形状の滑らかで規則正しい膜表面を備えていた。接触活性化によりわずかな血小板の活性化が見られる（図6B）。スパイク蛋白とインキュベートしたWBは、スパイク蛋白の濃度が非常に低いにもかかわらず、赤血球の凝集を示した。スパイクタンパク質の曝露により、血小板の過活性化、膜の拡散（図6C,D）、血小板由来の微小粒子形成の増加が認められた。トロンビンを添加せずにスパイク蛋白とインキュベートしたすべての試料で、アミロイド性を有する自発的な異常フィブリン（オージェン）沈着の形成が顕著であった［図6E-H（矢印）］。

健康なボランティアの全血サンプル、スパイク蛋白質への曝露前と曝露後
(A-H）スパイクタンパク質を含む、または含まない、健康なコントロールWBの代表的な走査型電子顕微鏡写真。(A,B) 健常者WBの塗抹標本。矢印は正常な赤血球の超微細構造を示す。(C-H) スパイクタンパク質（最終濃度1 ng.ml-1）に暴露した健常者WB。(C,D)は活性化血小板を示し（矢印）、(E,F)は自然に形成されたフィブリンネットワークを、(G,H)はアミロイド状の異常な沈着を示す（矢印）（スケールバー：以下同じ）。(E) 20 μm; (A) 10 μm; (F,G) 5 μm; (H) 2 μm; (C) 1 μm; (B,D) 500 nm).

マイクロフルイディクス

図7は、実験開始5分後にフローチャンバー内に形成された血栓を示したものである。図7Aに見られるように、健常PPPは流路の底面に沿って小さな凝塊を形成していた。健常血漿では、血栓形成は比較的ゆっくりとした緩やかなプロセスで、適度な血栓が形成された（補足の健常PPP動画S1参照）。健常PPPで形成された血栓は比較的小さく、流路の壁面に限定されていた。血栓は整然とした層になっており、流路の中心を通る流れを乱すことはなかった。予想通り、血栓形成の頻度も他の試料に比べ少なかった（図7B）。スパイクタンパク質を添加したPPPでは、繊維状の層状血栓と無秩序な血栓塊の組み合わせが見られた（図7E,F）（補足の健康なスパイクタンパク質添加PPP動画S2参照）。COVID-19 PPPでは、無秩序な塊が流路の大部分を覆い、しばしば流路の中心部に突出して流れを乱す（図7C,D）。COVID-19 PPPでは、トロンビンとPPPの反応が急速に起こり、約90秒後に大きな凝塊ができた（補足のプールされたCOVID-19患者PPPビデオS3参照）。興味深いことに、これらの血栓は最初のバースト後はあまり伝播せず、トロンビンの大部分が短時間で消費されたことを示している。スパイクタンパク質を加えたPPPでも血栓は形成されたが、COVID-19 PPPの血栓ほどには破壊的ではなかった。

興味深いのは、健常なPPPの血栓は、流路に1 ml.min-1 (0.42 m.s-1) の速度で水を流すと簡単に外れるということである。同様に、スパイクタンパク質を添加した健常PPPの凝血塊も、同様の方法で外すことができた。一方、COVID-19の血栓は、小さな流路で高速水流の力を受けても、ずれたり外れたりせず、無傷のままであった。この観察は、すべてのCOVID-19サンプルで一貫していた。

質量分析による解析

図8は、質量分析の結果である。質量分析の結果、健常なPPPにスパイクタンパク質を添加すると、βおよびγフィブリン（ogen）、補体3、プロトロンビンに構造変化が生じることがわかった。これらのタンパク質は、スパイクタンパク質の存在下で、トリプシン化に対して実質的に抵抗性を示した（配列データについては、補足ファイルを参照）。

スパイクタンパク質を添加した4つのサンプルと添加しないサンプルのPPPを示す質量分析結果
スパイクプロテインは、βおよびγフィブリン（オジン）、補体3、プロトロンビンに構造変化をもたらす。

ディスカッション

この研究室での分析で、スパイク蛋白がCOVID-19患者に見られる凝固亢進に実際に主要な役割を演じていることを証明した。精製した蛍光性フィブリノゲンでも、健常者のPPPでも異常な凝固を引き起こし、その凝固の性質はアミロイドであることが示されました（アミロイド色素としてThTを選択しました）。興味深いのは、これらの高密度な沈着は、スパイクタンパク質を塗抹した場合と、トロンビンを加えた場合の両方で認められたことです。トロンビンを添加すると、精製（Alexa Fluor™ 488）フィブリノーゲンが重合してフィブリンネットワークになります。通常、これらのネットワークは網目状です（図3A）。スパイクタンパク質の存在下では、構造が変化し、高密度の血栓が形成されました（図3B）。これらの沈着は、我々の蛍光フィブリン(ogen)モデルやスパイク蛋白に暴露された健常者のPPPで見られた。スパイク蛋白に暴露した後、ThTとインキュベートした健常者PPPでは、健常者PPPと比較して、アミロイド性を有する異常な血栓が有意に増加した（図4D）。今回の論文では、他の患者コホート、例えば細菌性肺炎や他の急性ウイルス性疾患の患者の血液サンプルとPPPの凝固傾向は解析していない。しかし、我々のグループ（および他のグループ）は、以前にHIV患者の血液を調査し、この患者コホートにおける著しい凝固亢進を指摘した[36-39]。また、最近、長期のCOVID/PASCに罹患した患者における有意な凝固亢進を報告しています[40]。

スパイク蛋白はWBにおいても大きな超微細構造変化を引き起こし（SEMで見た）、血小板の過活性化が認められた（図6C,D）。自発的に形成されたフィブリンネットワークの増加、および異常な血栓形成もSEM顕微鏡写真で観察された（図6E-H）。興味深いことに、トロンビンを添加しなくても、広範な自発的フィブリンネットワークの形成が認められた。これは最近発表された、COVID-19陽性患者の血液塗抹標本で同様の超微細構造を示した結果と一致する。これらの患者では、血小板の過活性化、アミロイドシグナルを伴う異常凝固、自発的なフィブリン繊維形成も観察されました[6,7]。

マイクロ流体フローシステムでは、マイクロ流路全体にトロンビンを注入して血栓を形成し、内皮の損傷が大きい凝固亢進状態を模擬した。流路は全体がプラスチックでできており、内皮細胞は一切存在しないことから、調査対象の主成分はPPP（主にフィブリノゲンタンパク）そのものであり、COVID-19サンプルの場合、この疾患の特徴である高凝固性状態を生じさせる何らかの内皮の変化の下流効果を含んでいた可能性があります。本研究で使用したフロー設定は、内皮の変化を直接説明することはできなかったが、それでもCOVID-19がPPPの凝固プロファイルに変化をもたらすことは実証された。これは、COVID-19血栓におけるトロンビン消費とフィブリン形成の急速な速度、また形成されたPPP血栓の性質に明らかであった。

スパイクタンパク質を添加した健常PPPで観察された血栓は、健常PPP血栓とCOVID-19血栓の橋渡しをするものとして、特に興味深いものであった。結果」の項で述べたように、健常なPPPの凝塊は比較的小さく整然としているのに対し、COVID-19 PPPの凝塊は大きく無秩序な塊で、急速に形成されて流路内のPPPの流れを阻害した。スパイクタンパク質を添加した健常PPP凝集塊は、両者の組み合わせで、層状の繊維状PPP凝集塊（健常PPP凝集塊より大きい）と共存する、無秩序な凝集塊領域を示した。この中間状態は、フローセットアップにはなかった他の生物学的作用因子の相互作用やスパイクタンパク質の曝露時間など、多くの要因から生じる可能性がある。スパイクタンパク質の存在下で変化する凝固メカニズムを理解するためには、さらなる調査が必要である。

高速水流（＝機械的手段）で流路を洗浄しようとして、うっかり観察してしまった明らかな違いの1つは、健常PPPとスパイクタンパク質を添加した健常PPPの血栓溶解のしやすさであった。しかし、COVID-19 PPPの凝塊を流路から外したり、邪魔したりすることは完全に失敗した。血栓溶解が生化学的および生物物理学的要因の間の複雑な相互作用であることを考えると、異なる治療薬の効果を調査することでこの現象を解明できる可能性がある[41]。本研究で用いたフロープロトコルは、臨床応用のための様々な治療法をテストするための有用なプラットフォームとなるであろう。この研究のさらなる限界は、微小血管系に適したスケールで血栓形成を調査する際にPPPを使用することである。このプロトコルは、COVID-19で注目されているフィブリン微小血栓の研究を可能にする一方で、そのスケールでの血液の非ニュートン流挙動に大きな影響を与えることが知られている赤血球の影響を排除するものである[42]。この除外と粘性の変動から生じる流況の不正確さは、結果に誤差をもたらす。それでも，適切な空間スケールの流れを含めることで，動的な条件下で，空間と時間にわたってCOVID-19 PPP血栓形成を観察することができ，他の方法では得ることが困難であることが証明される洞察を得ることができた．

さらに検討すべきことは、急性感染症に起因する急性炎症反応を持つ他の患者の血栓の安定性と除去を調べることである。Longstaffと共同研究者は、急性感染症に起因する炎症状態において、線溶抵抗性が増大することを見出した[43]。この現象を我々のマイクロ流体セットアップで検討することは有益であろう。

微小血栓が微小毛細血管を塞ぎ、それによって酸素交換を阻害する可能性があることから、我々は最近、Long COVID/PASC, T2DM, with acute COVID-19 のプロテオミクス結果を用いて血漿サンプルも研究し、健常者の血漿サンプルと結果を比較しました。興味深いことに、T2DMと健常者の血漿は、最初のトリプシン化ステップの後、すぐに完全に消化されましたが、Long COVID/PASCと急性COVID-19の血漿サンプルには、まだ大きな異常（アミロイド）沈着（マイクロクロット）が残存していました[40]。2回目のトリプシン処理の後、しつこいペレット沈着物が可溶化された。我々は、対照試料とT2DMの等量の完全消化液に対して、急性COVID-19と長期COVID/PASCの上清と可溶化ペレット沈着物の両方に、大幅に増加する様々な炎症性分子を検出した[40]。特に興味深いのは、急性COVID-19およびLong COVID/PASC消化微小塊の両方で、α(2)-アンチプラスミン（α2AP）、様々なフィブリノーゲン鎖が大幅に増加していたことです。健常血漿と急性COVID-19可溶化血栓の比較では、凝固第XIII因子A鎖、VWF補体成分C7およびCRPの有意な増加も見られました[40]。

今回の研究では、スパイクタンパク質がβおよびγフィブリン(ogen)、補体3、プロトロンビンに構造変化を起こすことが質量分析により確認された。これらのタンパク質はトリプシン化に対する抵抗性が弱くなり、コンフォメーションが変化し、スパイクタンパク質の添加前後でペプチド構造に大きな違いがあることが確認された。したがって、今回の結果は、私たちが最近行ったプロテオミクス解析[40]で見出した結果を裏付けるものである。

最近のデータでは、急性期のCOVID-19と長期のCOVIDの両方で微小塊の内部に（2）-アンチプラスミンが増加していることが示唆され、フィブリノーゲン鎖の病態にも注目している。今回の論文では、健康な血漿にスパイク蛋白を添加し、フィブリノゲン鎖の病態を誘導することができました。急性期COVID-19や長期COVID/PASCの患者において、α2-アンチプラスミンやVWF（その他）などの分子を増加させるためには、多くの生理学的経路が活性化される必要があります。凝固経路の視覚的表現とS1によって影響を受ける可能性のある場所については、図9（[40, 44-46]から調整）を参照されたい。

健常時と病的時の凝固過程の簡略図
(1A）内在性経路と（1B）外来性経路は、（1C）共通経路に収束する。これらの経路は、トロンビンの触媒作用により、可溶性フィブリノーゲンから不溶性フィブリンへの変換をもたらす。(2）組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する。健全な線溶系は、凝固経路を制御し、不溶性フィブリン凝塊の溶解を成功させることを支援する。(3）プラスミンはフィブリンを切断し、Dダイマーなどのフィブリン分解産物（FDP）を生成する。(プロテインCとトロンボモジュリンはともに凝固を調節する。トロンビンはその受容体であるトロンボモジュリンに結合し、活性化プロテインC（APC）を生じる。）APCはVa、VIIIaを阻害する。(5) 制御不能な炎症性分子は、組織因子（TF）の発現を阻害する可能性があります。(6) 制御不能な炎症性分子はトロンボモジュリンの発現を低下させ、VaおよびVIIIaの活性が十分に調節されないため、凝固亢進を引き起こす可能性があります。(私たちの研究室では、健常血漿にスパイクプロテインS1を添加しました。その結果、プロトロンビン鎖とフィブリノーゲン鎖の両方に病態が認められました。(8)血中の炎症性分子の異常は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1（PAI-1）の活性化を介して、線溶系を阻害することが知られている。PAI-Iのアップレギュレーションは、tPAの機能を阻害し、最終的に凝固システムの調節不全を引き起こします。(9）α2APはプラスミンを阻害し、最終的に十分な線溶が起こらなくなる。(図はBiorender.comで作成)。

結論

走査型電子顕微鏡および蛍光顕微鏡により、スパイクタンパク質を添加した健常者のWBおよびPPPにおいて、大きく密な異常塊とアミロイド塊が観察された。質量分析により、スパイクタンパク質をPPPに添加すると、血漿タンパク質と相互作用し、フィブリン（オージェン）、プロトロンビンなどの凝固に関連するタンパク質がトリプシン化に対して大幅に抵抗性となり、フラグメントが少なくなることが確認された。血流解析の結果、微小血栓は血流を阻害する可能性があることが確認された。ここでは、COVID-19陽性患者における凝固亢進の一因として、循環中のスパイク蛋白S1の存在が示唆され、線維素溶解の深刻な障害を引き起こしている可能性があることが示された。また、S2の影響も考えられるので、今後調査する必要があります。また、急性期COVID-19では、凝固病変が中心であることが認められている[47-52]。いくつかの剖検結果では、肺全体に微小血栓があり、心臓の右室拡張を伴うことも確認されている。最近、Ackermannと共同研究者は、COVID-19患者の肺血管の組織学的分析が微小血管症を伴う広範囲の血栓症を示すことを報告した[4]。著者らはまた，肺胞毛細血管微小血栓が，COVID-19患者ではインフルエンザ患者の9倍も多いことを示した（P<0.001）．したがって、線溶系の障害が、今回SEMや蛍光顕微鏡で、また以前にはCOVID-19患者の血漿サンプルで観察された大きな微小血栓の直接的な原因である可能性がある[6,7]。したがって，COVID-19急性感染症における凝固病態は，線溶系機能をサポートするために抗凝固療法を継続することが有効である可能性がある[40]．

略語

COVID-19コロナウイルス病2019
CRP C反応性タンパク質
FA ホルムアルデヒド
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PPP血小板減少型血漿
SARS-CoV-2 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型
SEM 走査電子顕微鏡法
ThT チオフラビンT
T2DM 2型糖尿病
VWF フォンウィルブランドファクター
WB 全血

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