食器洗い機用洗剤およびリンス補助剤による腸管上皮のバリアー損傷

食器洗い機用洗剤およびリンス補助剤による腸管上皮のバリアー損傷
イスマイル・オグルール博士
ヤギズ・パット医学博士
タマー・アイディン, BSc
Mubeccel Akdis、MD、PhD
Kari Nadeau、MD、PhD
Cezmi A. Akdis, MD（チェジミ・アクディス、医学博士
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オープンアクセス公開日：2022年12月01日DOI:https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.10.020
PlumX メトリクス

背景
腸管上皮バリアー漏出と関連する多くの慢性炎症性疾患の有病率が増加していることから、他の要因の中でも食器洗い機用洗剤の多用が果たす役割について調査することになった。
研究目的
業務用および家庭用食器洗浄機とリンス剤が、消化管上皮細胞の細胞毒性、バリア機能、トランスクリプトーム、タンパク質発現に及ぼす影響について調査することを目的とした。
研究方法
透過性支持体上に腸管液-液界面を構築し、細胞の直接細胞毒性、経上皮電気抵抗、細胞間フラックス、免疫蛍光染色、RNA-sequenceトランスクリプトーム、およびターゲットプロテオミクスを実施した。
結果
洗浄剤による毒性は、1:20,000 v/v希釈までの用量依存的な洗浄剤への曝露に起因することが確認された。液液界面培養、オルガノイド、ガットオンチップにおいて、特に洗浄剤による上皮バリアの破壊が観察され、経上皮電気抵抗の低下、細胞間フラックスの増加、不規則で不均一なタイトジャンクションの免疫染色が示された。洗浄剤の各成分を個別に調査したところ、アルコールエトキシレートは強い毒性とバリア破壊作用を示した。RNAシーケンスによるトランスクリプトームとプロテオミクスのデータから、上皮細胞の細胞死、シグナル伝達とコミュニケーション、発生、代謝、増殖、免疫と炎症反応におけるアップレギュレーションが明らかにされた。興味深いことに、業務用食器洗浄機の洗剤残渣から、洗浄した食器やそのまま使える食器に、細胞毒性および上皮バリアを損傷するリンス液が相当量残存していることが示された。
結論
業務用食器洗浄機で使用されている濃度のすすぎ剤により、細胞生存、上皮バリア、サイトカインシグナル、代謝に関わる遺伝子の発現が変化していた。すすぎ剤に含まれるアルコールエトキシレートが、上皮の炎症とバリアー障害を引き起こす原因物質であることが明らかになった。
キーワード
アルコールエトキシレート
Caco-2
細胞毒性
食器洗浄機用洗剤
上皮バリアー
炎症
リンス剤
使用した略語
AJ (Adherence junction), AP-1 (Activator protein 1), CLDN (Claudin), FITC (Fluorescein isothiocyanate), GO (Gene ontology), LDH (Lactate dehydrogenase), MAPK (Mitogen-activated protein kinase), NF-κB (Nuclear factor kappa B), NPX (Normalized protein expression), OCLN (Occludin), PF (Paracellular flux), RNA-seq (RNA-sequencing), SDS (Sodium dodecyl sulphate), TEER (Transepithelial electrical resistance), TJ (Tight junction), TSLP (Thymic stromal lymphopoietin), ZO (Zonula occluden)...
腸管上皮のバリアは、異物に対する強力な防御機能を持つと同時に、栄養、水分、電解質の吸収を調節している1,2。この分子の通過は、上皮細胞の頂膜領域にある細胞間タイトジャンクション（TJ）タンパク質によって制御されている。TJは、膜貫通タンパク質（例えば、オクルーディン（OCLN）、クローディン（CLDN）、接合部接着分子、トリセリン）と細胞内プラークタンパク質（例えば、ゾヌラ・オクルーデンス（ZO）、すなわちZO-1、ZO-2、ZO-3）からなる多細胞タンパク質複合体を形成する3,4。
最近提唱された「上皮バリア仮説」は、過去数十年間に観察されたアレルギー性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患の増加を、工業化・都市化社会における上皮バリア損傷物質への曝露の増加と関連付けている5,7。これらの上皮バリア障害物質には、洗濯や家庭用洗剤に含まれる有害物質、加工食品に含まれる界面活性剤、酵素、乳化剤、タバコの煙、粒子状物質、ディーゼル排気ガス、オゾン、ナノ粒子、マイクロプラスチック、歯磨き粉などがあります5,8,9。腸管バリアの透過性が高まると、自然免疫系および獲得免疫系が腸管内腔の炎症性成分や微生物叢に上皮下でより多くさらされるようになります。10 これらの炎症刺激および炎症性サイトカインは、腸管バリアのTJタンパク質発現を直接抑制します。11 多くの全身性疾患で示されているように、この損傷には上皮下への細菌の移動も伴っています12,13,14,15,16。 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 私たちの最近の研究では、洗濯用洗剤に含まれる陰イオン性界面活性剤にさらされると、非常に高い希釈率でも、ヒト皮膚および気管支上皮細胞の上皮バリア機能が損なわれることが実証されている20,21。さらに、すすぎ後の洗濯用洗剤の残留物は、気管支上皮細胞のTJバリア統合性に毒性と破壊的影響を与えることが明らかになっている20。
業務用食器洗浄機は、労働力を削減し、食器を確実に洗浄・消毒できるため、2000年代8以降、人気を博しています。現在では、特にレストラン、学校、軍の兵舎、ホテルなど、公共の食品消費地で日常的に使用されています。業務用食器洗浄機では、3～4Lの水を65℃以上に加熱し、洗剤を加えて、2～4気圧の圧力で最大60秒の洗浄サイクルを行います。その後、3～4Lの水と82℃に加熱されたすすぎ助剤で、すすぎと乾燥のサイクルが行われます。なお、すすぎ残しを除去するための洗浄は行わない。22,23 すすぎサイクル後に残る残留物は、食器洗浄機用洗剤では 1:250 から 1:667 の希釈率、すすぎ助剤では 1:2,000 から 1:10,000 の希釈率の間で変化します。業務用食器洗浄機で使用される洗剤やすすぎ助剤には、潜在的に有害な物質がいくつか含まれているが、消化管上皮細胞に対する毒性は十分に調べられていない。本研究では、洗剤やすすぎ剤の残留物を完全に除去せずに乾燥させると、食器表面に残留する可能性があると仮定した。そこで、業務用および家庭用食器洗浄機用洗剤とすすぎ剤、およびその各成分に暴露した場合の健康被害について調査しました。液液界面培養、オルガノイド、ガットオンチップ研究、腸管上皮細胞のトランスクリプトームおよび標的プロテオミクス解析により、洗剤やリンスエイドがアポトーシスや炎症を誘発し、腸管上皮バリアの損傷をもたらす用量と分子メカニズムに関する知見を得ました。これらの知見は、多くの慢性疾患における腸管上皮の障害と炎症反応の始まりを示すものであり、公衆衛生に重要な影響を与える可能性がある。
研究方法
細胞培養
Caco-2およびHT-29細胞は、American Type Culture Collection (ATCC HTB-37, Manassas, Va)から購入し、すべての実験において20-45期の細胞を使用した。細胞は、10% FBS (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo), 1% penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich), 1% nonessential amino acids (Sigma-Aldrich), 1% pyruvate sodium (Sigma-Aldrich) 添加のDulbecco modified Eagle medium (Gibco-BRL, Invitrogen, Carlsbad, Calif) で単層として、75 cm2 T-flask で37℃, 5% CO2で湿潤培養させた。液液界面培養は、24ウェルのトランスウェル培養プレート（孔径0.4μm；Corning, Inc, Corning, NY）にCaco-2細胞を8×104個/ウェルの密度で播き、2日ごとに培地を入れ替えた。予備実験の結果、3種類の市販洗剤とリンス補助剤で同様の効果があることがわかりました。その後、詳細な実験では、終始同じ洗剤とリンスエイドを使用して実験を行いました。洗剤およびリンス補助剤の暴露試験は、液-液界面において14日目から18日目の間に実施されました。OrganoReady Caco-2 プレート（Mimetas BV, Leiden, The Netherlands）を購入し、ガットオンチップに対する業務用食器洗浄機洗剤およびリンスエイドの影響を調査するために使用した。人工多能性幹細胞（iPSC）由来の腸管オルガノイドはDefiniGEN社（Cambridge, UK）から購入し、実験では2期と3期の間で使用した。細胞は、腸管サプリメントDefinitive A（DefiniGEN社）を添加した腸管回復・維持培地で、24ウェル／プレートにて、37℃、5％CO2の加湿インキュベーターで培養した。オルガノイドは、食器洗い機用洗剤またはリンス剤に、同濃度のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識デキストラン4kDを添加し、培養した。そして、24時間培養の最後に共焦点顕微鏡で傍細胞フラックス（PF）を評価した。
家庭用および業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドの希釈倍率
業務用食器洗浄機は、1サイクルあたり3.5 Lの水を使用して、1または2サイクルの洗浄とリンスを完了します。洗剤とすすぎ助剤は、それぞれ 1.5 ～ 4 mL/L、0.1 ～ 0.5 mL/L の濃度で水中に自動的に分注されます。この濃度では、すすぎ後の残留希釈倍率は、洗剤が1:250から1:667、すすぎ助剤が1:2,000から1:10,000の範囲となる。家庭用および業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドに使用されている化学物質と希釈倍率は、この記事のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の表E1に記載されています。
通常のカップと皿の洗浄プログラムにおける家庭用食器洗浄機用洗剤は、通常、合計12 Lの水を消費します。洗浄サイクルでは 4.8 L、中間すすぎサイクルでは 3.6 L、そして最終すすぎサイクルでは 3.6 L の水を消費します。洗浄サイクルとすすぎサイクルの間に、200mLの水が食器洗浄機内に残ります。したがって、20gのタブレット型洗剤1個の希釈倍率は1:80,000（w/v）です。
家庭用および業務用食器洗浄機用洗剤とリンス剤に含まれる有害化学物質への暴露
業務用食器洗浄機用洗剤またはリンスエイドを液液界面およびオルガン・オン・チップ培養物の頂部区画に添加し、以下のように希釈した（v/v）：洗剤、1：250、1：500、1：1，000、1：2，000、1：4，000；リンスエイド、1：2，500、1：5，000、1：10，000、1：20，000、1：40,000。腸管上皮細胞に対する異なる洗浄剤の影響を調べるために、Caco-2単層および液-液界面培養の頂膜区画にTriton X-100（シグマ-アルドリッチ）およびドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（シグマ-アルドリッチ）を加え、以下のように希釈した。1:5,000, 1:10,000, 1:20,000, 1:40,000, および 1:80,000 に希釈した。対照群では、アピカルコンパートメントに培養液のみを添加した。
業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドの相乗的な毒性作用があるかどうかを調べるために、2の混合物を異なる希釈率で0.3 mLのダルベッコ改変イーグル培地とともに3日以上、細胞の頂部区画に塗布した。さらに、0.6 mL のダルベッコ改変イーグル培地を底側コンパートメントにピペッティングした。
洗浄後に食器表面に残留する化学物質を調べるため、10個の磁器カップ（190 mLサイズ）を業務用（Winterhalter, GS501, ドイツ）および家庭用（AEG, GS60AV, ポーランド）の食器洗浄機で1回完全に洗浄・乾燥させ、そこに1 mLの培養液を添加した。振盪して5分間待った後、培養液をカップから回収してフィルター滅菌し、単層および分化細胞培養物に直接、または1:2、1:5、1:10で希釈して添加した。
すすぎ助剤の化学物質を調べるために、クエン酸（Fluka, St Louis, Mo）、クメンスルホン酸ナトリウム（Angene, Montlucon, France）、またはアルコールエトキシレート（C12-15）（BOC Sciences, Shirley, NY）をそれぞれPBSで10%（w/v）、3%（w/v）または15%（v/v）希釈したものを使用した。次に、これらを単独で、または混合物として、培養液中で1：10,000の最終希釈度で頂部コンパートメントに適用した。
バリア機能に対するエンドトキシンの影響を排除するため、業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドの異なる希釈液でエンドトキシンアッセイを実施した。エンドトキシンは、すべての洗剤およびリンスエイド混合物において、検出可能なレベル（<0.01 EU/mL）では検出されなかった。
細胞毒性測定
Caco-2細胞を96ウェルプレートに100 μLの培養液に1 × 104 cells/wellで播種し、単層培養を行った。細胞を70〜90％コンフルエントにまで増殖させた後、上記の濃度の業務用食器洗浄機用洗剤もしくはリンス剤、またはその混合物で24時間処理した。液液界面培養では、分化したCaco-2細胞を、同濃度の洗剤またはリンスエイド、あるいは混合物として72時間暴露した。CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay Kit（ThermoFisher, Rockford, Ill）を用いて、曝露後24時間または72時間に培養液中に放出される乳酸脱水素酵素（LDH）量を測定することにより、細胞毒性を評価した。簡単に説明すると、96ウェル透明底プレート中の上清50μLにLDH反応混合物50μLを加え、暗所で30分間インキュベートした。インキュベーション終了後、50μLの停止液を加え、490nmと680nmで吸光度を測定した。細胞毒性測定は3連で行った。LDH放出量（％）は、最大LDH放出量のコントロールを100％とし、未処理細胞のコントロールを0％として算出した。単層培養の位相差画像は、細胞毒性測定の直前に撮影した。結果を補完するために、第二の細胞株としてHT-29細胞を単独で使用した。
細胞死を検出するために、Annexin V/propidium iodide二重染色キット（Invitrogen）を製造者のプロトコールに従って使用した。2色フローサイトメトリー分析は、LSRFortessaフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, Calif）で行った。
経上皮電気抵抗およびPFの測定
経上皮電気抵抗（TEER）およびFITC標識4-kDaデキストラン（Sigma-Aldrich）の傍細胞通過を、上皮バリアの完全性の代用マーカーとして使用した。各実験の開始時（ベースライン値）、暴露後24、48、72時間後に、Millicell ERS-2 Voltohmmeter（Millipore, Temecula, Calif）を用いてTEERの測定を個別に実施した。完全に分化した Caco-2 細胞では、TEER の測定値は培養 14～18 日後に 500～700 Ω cm2 に到達した。OrganoReady Caco-2 プレートでは、TEER の測定は OrganoTEER 装置（Mimetas 社製）を用いて実施した。測定は、各ウェルについて3連で記録した。TEER値は、洗剤やリンスエイドを使用しないコントロールと比較した相対的な変化として与えた。
PF測定は、TEER実験の後に行った。簡単に言うと、2 mg/mL FITC標識デキストランをアピカルコンパートメントに24時間添加した。基底区画の蛍光強度をELISAリーダー（Mithras LB 940; Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany）を用いて480 nmで測定した。TEERとPFのグラフに示された各値は、未曝露の対照に対して正規化され、4～6回の別々の実験から算出された。各実験は少なくとも3反復で繰り返された。gut-on-a-chipモデルについては、Fijiソフトウェアを用いて頂膜部および底膜部の蛍光強度を測定した。デキストランの流出量は、基底側と先端側の蛍光強度の比として示した。
TJの免疫蛍光染色
OCLNとCLDN-1タンパク質の発現は、免疫蛍光顕微鏡で解析した。分化したCaco-2細胞を4%パラホルムアルデヒド（Fluka）で固定し、洗剤とリンスエイドまたは両者の混合物を72時間暴露した後、PBS中の0.1% Triton X-100 (Acros Organics, Geel, Belgium) と 0.02% SDS (Sigma-Aldrich) で透過化させた。10％ヤギ血清（Dako Cytomation, Glostrup, Denmark）と1％BSAの混合液（PBS）でブロッキングした後、分化した細胞をマウス抗OCLN（Invitrogen）、ウサギ抗CLDN1（Invitrogen）、ウサギ抗ZO-1（Invitrogen）で標識した。その後、二次抗体としてAlexa Fluor 635標識ヤギ抗マウス抗体とAlexa Fluor 546標識抗ウサギ抗体を加え、室温で45分間インキュベートした。サンプルは核の対比染色のために4',6-diamidino-2-phenylindoleを含むProLong Gold antifade reagent (Invitrogen) を用いてマウントした。マウントした膜の顕微鏡観察は、Zeiss LSM 780顕微鏡（Carl Zeiss Microscopy GmbH、Oberkochen、Germany）で実施した。
RNA 単離、RT-PCR、RNA-シークエンス、およびデータ解析
Caco-2 細胞 (4 × 104) を 12 ウェルプレートに播種し、70%から 90% のコンフルエントにまで増殖させた。次に、Caco-2モノレイヤーを、1:10,000（TEERおよびLDH放出実験で決定した毒性レベルに相当）および1:40,000（非毒性）希釈の業務用食器洗い機洗浄剤で24時間処理した。その後、タンパク質の定量化のために上清を回収し、Caco-2モノレイヤーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってRNeasy Plus Micro Kit（Qiagen, Hilden, Germany）でトータルRNAを抽出・精製した。サンプルの逆転写は、ランダムヘキサマーを含む RevertAid RT Kit (Thermo Fisher Scientific) を用いて行った。
定量的リアルタイムPCRは、iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif)を用いて、Bio-Rad iCyclerで製造者のプロトコールに従って実施した。定量的リアルタイムPCRに使用したプライマー配列は、この論文のオンラインリポジトリ（www.jacionline.org）の表E2に記載されている。データは、2-ΔΔCT値によって解析し、内部コントロールである伸長因子1α遺伝子発現レベルに対して正規化した後、遺伝子発現の倍数変化として提示した。
NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific）および2200 Tape Station Automated Electrophoresis System（Agilent Technologies, Santa Clara, Calif）を使用して、単離したRNAの量および質を決定した。RNA インテグリティナンバーが 9.4 以上の試料を配列決定に選んだ。RNA-sequencing（RNA-seq）は、TruSeq RNA Stranded Sample Prep Kit（イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてIllumina NovaSeq 6000で実施された。すべての配列決定データセットは、アクセッション番号GSE203549でNational Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusで一般に入手可能である。
タンパク質の定量
Caco-2単層培養の上清を、proximity extension assay (Olink) -targeted proteomics technology (Uppsala, Sweden)を用いて分析した。92種類の免疫反応関連タンパク質を測定する炎症パネルと、92種類の炎症関連タンパク質を測定する免疫反応パネルを、製造元のプロトコールに従って使用した。データは正規化タンパク質発現量（NPX）値で表示される。
統計学とバイオインフォマティクスによる解析
Wilcoxon signed-rank 検定を用いて、ペアのグループ間の差異を評価した。解析はGraphPad Prismソフトウェア（バージョン9.0；GraphPad Software, La Jolla, Calif）を用いて行い、Pが.05未満の場合を有意差とみなした。
RNA-seq データの品質管理を行い、低品質の readings と adaptters をそれぞれ FASTQC と Cutadapt ツールでトリミングした24,25 。得られたデータセットを、STAR aligner version 2.7.9a を用いて Ensembl genome reference, release 38 (GRCh38.p13) にアライメントした26。アライメント操作中、-sjdbOverhang は、注釈付きjunction周辺のゲノム配列長を指定し、100 と定義した。この長さは、RNA-seqデータ-1の平均配列長に等しいことが望ましい。遺伝子発現値は、Rsubreadソフトウェア（Bioconductor）に実装されたフィーチャーカウントにより定量化した27。微量発現遺伝子は、DESeq2バージョン1.32.0により評価した28。P値が.01未満、log2 fold changeが1以上または-1未満の遺伝子を本研究に組み入れた。Gene Ontology (GO) カテゴリーは、Bioconductor パッケージ goseq を用いて Wallenius 近似で行った29。
Olinkで生成されたデータは、プラットフォーム固有の「Olink NPX manager」ソフトウェアを用いて前処理および品質管理を行った。このソフトウェアは、すべてのサンプルを任意のNPXスケールでバックグラウンド補正、log2変換、および正規化する。2セットのサンプルの平均NPX値の差を、タンパク質濃度のlog2倍変化として使用した。修正P値が0.05未満で、絶対推定値が2以上のタンパク質を、有意に差のあるOlinkバイオマーカーとみなした。Olinkタンパク質の発現差解析は、RパッケージIimmaを使用して行った。Iimmaは、推定log-fold変化のSEを緩和するために、empirical Bayes法を使用します。Benjamini-Hochberg false discovery rate-corrected q valuesは、発現差異解析のすべての部分において多重検定を補正するために計算された。同定されたタンパク質の機能解析はGOアノテーションを用いて行われ、タンパク質はその生物学的プロセスに従って分類された。
結果
業務用食器洗浄機用すすぎ剤はCaco-2細胞に対して細胞毒性を示す
業務用食器洗浄機用洗剤およびリンス剤の細胞毒性を、細胞膜の完全性の指標であるLDHの漏出量を測定することにより、用量および時間依存的に評価した。単層および液液界面分化型Caco-2細胞を、段階的に希釈した洗剤およびリンスエイドでそれぞれ24時間および72時間処理した。
単層培養Caco-2細胞およびHT-29細胞に対して、1:250までのすべての希釈度で業務用食器洗い機用洗剤に24時間暴露しても、毒性効果は認められなかった（図1、A；本論文のオンラインレポジトリの図E1参照、www.jacionline.org）。Caco-2細胞およびHT-29細胞は、それぞれ1:20,000および1:10,000希釈からリンス液にさらされると、溶解が観察された（図1, A; 図E1参照）。細胞の位相差顕微鏡画像では、洗浄剤および未添加の対照細胞と比較して、洗浄剤曝露後にプレートからの剥離と細胞質膜の破壊が見られた（図1、B、図E1参照）。同様の結果が、リンスエイド単独または異なる希釈率で洗剤と組み合わせた暴露後のLDH細胞毒性アッセイおよび位相差顕微鏡画像から観察された（図1、AおよびB；図E1参照）。これらのデータは、細胞毒性がすすぎ助剤への曝露に大きく起因する可能性があることを実証した。フローサイトメトリー分析により、業務用食器洗い機用リンスエイドは、1:10,000、1:20,000、および1:40,000希釈で曝露した場合、単層培養Caco-2細胞において、初期（アネキシンV+）および後期（アネキシンV+およびヨウ化プロピジウム+）アポトーシス細胞の割合が大幅に増加し、アポトーシスを引き起こすことがわかった（この記事のオンラインリポジトリの図E2 www.jacionline.org を参照されたい）。
図サムネイルgr1
図1業務用食器洗浄機用洗剤およびリンスエイドに対するCaco-2細胞の用量依存的な細胞毒性。A、単層培養Caco-2細胞を、業務用食器洗い機用洗剤およびリンスエイド単独または混合物として、異なる希釈率で24時間処理した場合の細胞毒性。データは平均値±SDで示した（二重培養で各群n = 3）。B、業務用洗剤およびリンスエイド単独、または混合物として24時間処理した単層培養Caco-2細胞の代表的な位相コントラスト画像。希釈倍率は画像の上部に表示されている。3種類の業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドを使用しても同様の結果が得られた。v/v, 容量/容量。
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さらに、分化したCaco-2細胞の液液培養を行い、業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドの単独または併用で曝露した。リンス剤単独、および1:20,000希釈から始まる洗剤とリンス剤の混合物は、分化したCaco-2細胞に対して溶解作用を示した。しかし、72時間後の洗剤単独処理では、1:250希釈まで細胞の生存率は変わらなかった（本論文のオンラインレポジトリの図E3参照www.jacionline.org）。結論として、リンスエイドは単層培養細胞および分化したCaco-2細胞に対して同じ細胞毒性作用を発揮した。
一般的に使用されている3種類の家庭用食器洗い機用洗剤の細胞毒性作用を、単層培養Caco-2細胞を用いて異なる希釈度で検討した。1:80,000の希釈率は、一般的に家庭用食器洗浄機で使用され、水量と洗浄サイクルに従って計算される。洗剤Aと洗剤Bの両方に対して用量依存的な細胞毒性が認められ、いずれの場合も1:20,000の濃度の洗剤にさらされると溶解が観察された。家庭用食器洗い機用洗剤3種は、1:80,000の希釈でCaco-2細胞に細胞毒性を誘発しなかった（本論文のオンラインレポジトリの図E4参照、www.jacionline.org）。
業務用食器洗い機用洗浄剤は、分化したCaco-2細胞のバリア機能を破壊する
業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドの単独または混合物が腸管バリアの完全性を損なうかどうかを評価するため、分化させたCaco-2細胞でTEERとPFを測定した。洗剤単独では、72時間の培養期間中、1:250までのすべての希釈率でTEER測定（図2、A）およびFITCフラックス（図2、B）により判断すると、いかなる毒性も誘発されないことが判明した。一方、リンス液は、濃度および時間に依存したTEERの低下によって示されるように、バリアーの完全性を破壊した(Fig. 2, C)。TEERの急激な減少は、洗浄液を1:2,500で希釈した場合、24時間以内に観察された。しかし、1:5,000と1:10,000の希釈率では、最初の3日間で、TEERは有意に増加した。TEERの増加は、リンスエイドの上皮細胞に対する細胞毒性、隣接する細胞の膜の付着、および固定効果に起因すると考えられた。液液培養したCaco-2細胞の頂膜側にパラホルムアルデヒドを曝露した場合も、このような固定効果によりTEERが上昇することが確認された（本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E5を参照されたい）。後述するように、FITC-デキストランの通過量の増加は、それらの用量で明確に観察された。しかしながら、TEERの急激な減少も、これらの希釈液に5日間暴露した後に観察された。興味深いことに、1:20,000希釈のリンスエイドに暴露した後にも高いTEER値が観察された（図2、C）。
図2.Gr2
図2分化したCaco-2細胞において、リンスエイドはTEERを低下させ、PFを増加させた。A、C、およびE、洗剤とリンスエイドの単独または混合物で処理した細胞について、9日間、24時間ごとにTEERを測定した。B、D、およびF、PFは、洗浄剤およびリンスエイド単独または混合物として72時間暴露したことに応答して測定された。データは、平均値±SDで示される（n = 6、すべての希釈は3連で行われた）。同様の結果が、他の2つの市販の業務用食器洗い機用洗剤およびリンス用補助剤でも得られました。∗P < 0.05, Wilcoxon matched-pairs test.
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TEERの低下がバリア透過性の上昇に起因するかどうかを評価するために、分化したCaco-2細胞で頂膜から底膜へのPFも測定した。リンスエイドを1:20,000希釈からインキュベートしたところ、72時間後の時点で分化Caco-2細胞を通過するFITCフラックス速度が著しく増加した（図2、D）。同様の結果は、リンスエイド単独、または異なる希釈率で洗剤と混合して曝露した後のTEERおよびPF測定でも得られた（図2、C-F）。これらの結果は、洗浄剤が液-液界面細胞の接着を誘発し、TEER値を高くして、バリアー性が高いという誤った印象を与えている可能性を示唆している。液液界面の平行培養におけるLDH細胞毒性測定と共焦点染色により、1:20,000およびそれ以下の希釈率における上皮バリアの損傷が確認された（図E3参照；図3）。
図サムネイルgr3
図3分化したCaco-2細胞における、すすぎ助剤に反応したバリア保全の破壊。業務用洗剤およびリンスエイド単独または混合物として異なる希釈率で72時間暴露した液体培養Caco-2細胞のCLDN1（緑）およびOCLN（赤）の免疫蛍光染色の図。5種類の染色のうち、代表的なもの。
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食器洗い機用洗剤とリンス剤の短期的な効果を明らかにするため、ベースライン時と最初の6時間以内は1時間ごとに個別のTEER測定を実施しました。4時間以内に1:2,500希釈のリンス液でTEERの急激な減少が観察され、暴露直後から1:5,000および1:10,000希釈のリンス液でTEER値が増加し始めました。長期培養で観察されたように、洗剤だけではTEER値への影響は見られなかった（本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E6を参照）。
他の細胞株や洗剤との比較のために、HT-29細胞、Triton X-100、およびSDSを使用した。純粋なHT-29細胞におけるLDH細胞毒性アッセイ、TEER、およびCaco-2/HT-29細胞におけるPF測定により、上皮バリア破壊作用が確認された（図E1参照）。また、Triton X-100 および SDS は、Caco-2 細胞において明らかなバリア機能低下を示した（本論文のオンラインリポジトリ（www.jacionline.org）の図 E7 を参照）。
業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドの効果を確認するため、iPSC由来の腸内オルガノイド培養物の基底部側面に添加しました。Caco-2細胞の結果と同様に、リンスエイドは1:2,500の希釈で細胞崩壊を引き起こし、1:10,000の希釈に反応してオルガノイドは死滅した。1:20,000の希釈率でリンス液に暴露すると、内腔がほとんど消失したオルガノイドも観察された（本論文のオンラインレポジトリの図E8、www.jacionline.org を参照）。
業務用食器洗浄機の残留物は細胞毒性を発揮し、上皮のバリア機能を低下させる
我々は、完全な洗浄サイクルの後に、食器の表面に潜在的に危険な物質が存在するかどうかを調査した。洗浄終了時にコップ表面に付着した乾燥物質の細胞毒性およびバリア損傷能を、濃度を増加させながら評価した。振盪しながら培養液中に抽出し、室温で5分間インキュベートした後、上記と同様の実験を行った（本論文のオンラインレポジトリーの図E9参照 www.jacionline.org）。単層 Caco-2 細胞を用いた LDH 細胞毒性アッセイにより、業務用食器洗浄機で洗浄したカップに対して乾燥したリンスエイド残渣が及ぼす毒性は、1:10 希釈であっても依然として起こることがわかった（Fig E9, A を参照）。TEERとPFは、分化したCaco-2細胞でも測定され、リンスエイドにさらされた場合にも、同様の結果が観察されました。高濃度（1:2および1:5希釈）の残留物は、TEER値の低下で測定されるように、上皮バリア機能を著しく低下させた。1:10希釈では、コントロールと比較してほぼ同じTEER値が観察された。食器洗い機残留物とCaco-2細胞のインキュベーションも、1：5希釈から3日目にFITCフラックスの有意な増加を示した（図E9、BおよびCを参照）。一方、家庭用食器洗い機で洗剤Bを用いて洗浄したカップに残留した物質は、細胞毒性を発揮して上皮のバリア機能を損なうほどの高濃度では存在しなかった（図E9参照）。
すすぎ助剤にさらされると、細胞間TJが破壊される
食器洗い機用洗剤とリンスエイドによるTJタンパク質の損傷は、OCLNとCLDN1の免疫蛍光染色によって評価された。Caco-2細胞を洗剤に単独で暴露した場合、1:250から1:4,000までのすべての調査濃度において、細胞死やTJの欠陥は観察されなかった（図3）。一方、洗浄剤単独または洗浄剤との併用では、1:2500の希釈率で細胞死が誘発された。形態学的変化は、1:5000から1:20000の希釈でOCLNとCLDN1の不規則で不均一な染色で明らかになり、上皮バリアの完全性の障害を示唆した（Fig 3）。
業務用食器洗い乾燥機のすすぎ剤は、ガットオンチップモデルにおいて、上皮バリア機能を損ない、細胞間TJを破壊する。
分化したCaco-2細胞でこの結果を確認するために、我々はガットオンチップモデルを用いた。このモデルは、Caco-2細胞を器官様方向に培養することができる、様々な灌流可能なマイクロチャネルを提供する3次元的アプローチである。2次元のCaco-2トランスウェル実験で示したように、TEERとPFの測定および免疫蛍光染色で判断すると、洗剤単独では3次元ガットオンチップモデルのバリア機能を破壊した（本論文のオンラインレポジトリの図E10、A、B、E参照、www.jacionline.org）。しかし、TEER値は1:2,500および1:10,000希釈でリンス助剤により有意に減少し、PFの増加は1:20,000希釈まで観察された。このモデルでは、1:2,500希釈ですべての細胞が死滅した。1:10,000から1:20,000の希釈率では、激しい細胞破壊とOCLNおよびZO-1の不規則で不均一な染色を伴う形態学的変化が見られた（図E10、C、D、Eを参照）。これらの結果は、ガットオンチップモデルが、液体-液体界面培養で観察されたのと同様のリンスエイドによる上皮バリア破壊の結果を示した有用なモデルであることを示すものであった。
洗剤および/またはリンスエイドに曝された腸管上皮細胞のトランスクリプトーム解析
単層培養したCaco-2細胞をリンスエイドに24時間暴露した後、RNA-seqを行い、遺伝子発現の差異を解析した。細胞毒性、TEER、PF、共焦点顕微鏡の結果を考慮し、Caco-2細胞は、細胞毒性用量（1：10,000希釈）および毒性用量より1滴低い境界用量（1：40,000希釈）の2用量に曝露された。RNA-seqにより、457の異なる発現遺伝子が2つの異なる希釈度で同様に反応し、一方、4つの遺伝子は反対の反応を示した（図4、A）。さらに、1:10,000 と 1:40,000 の希釈率では、それぞれ 1893 と 152 の遺伝子が、コントロールと比較してリンスエイドに反応して異なる発現を示しました。この遺伝子解析は、2種類の濃度のリンス液に対するCaco-2細胞の反応の違いを示している。図4に示すように、高濃度（1:10,000）でCaco-2細胞は主にアポトーシス機構を誘導することがわかった。また、上皮細胞は、アポトーシスの他に、物質の発生や応答機構も引き起こされています。Caco-2細胞に対して直接細胞毒性を示さない低濃度（1:40,000）では、上皮細胞の発達と物質に対する応答機構が誘導されることがわかった。アポトーシス機構ではなく、上皮細胞の発達が誘導されることから、この濃度は高濃度と比較して細胞死を引き起こしにくいことがわかります。トランスクリプトーム解析の全容は、本論文のオンラインリポジトリ（www.jacionline.org）の表E3に掲載されています。全体として、差次的に発現する遺伝子の増加が見られ、変化の大きさ（log2比）は1:10,000希釈のリンスエイドに反応して高くなった（図4、B）。また、差次発現上位200遺伝子のヒートマップでは、1:10,000希釈で多くの遺伝子が関与していることがわかった（本論文のオンラインレポジトリの図E11参照 www.jacionline.org）。
図 サムネイル gr4
図4単層培養Caco-2細胞におけるリンスエイドに反応して発現する遺伝子の差分。A、ベン図は、24時間後の1:10,000（n = 5）および1:40,000（n = 5）希釈のリンスエイドに反応してRNA-seqを用いて検出された差次発現遺伝子数を示している。B, 2つの異なる希釈液のリンス液に反応して発現した遺伝子の差分を示すボルケーノプロット。アップレギュレートされた遺伝子は赤でマークされ、ダウンレギュレートされた遺伝子は青で示されている。C, 2種類の希釈液ですすぎ剤に反応して有意に発現が増加した遺伝子と減少した遺伝子について、GO生物学的プロセスに基づくパスウェイの濃縮を解析した。
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遺伝子発現の違いをGOタームエンリッチメントで解析し、リンスエイドの影響を受ける生物学的パスウェイを同定した。細胞死過程の制御は、1:10,000希釈のリンスエイドに反応して最も有意にアップレギュレートされたパスウェイの一つであった。同じ希釈率で有意にアップレギュレートされた他のパスウェイは、細胞移動、増殖、接着、および免疫・炎症反応であった。1:10,000および1:40,000希釈のいずれにおいても、物質に対する細胞応答、細胞シグナル伝達およびコミュニケーション、上皮細胞の発生プロセスが有意にアップレギュレートされた。一方、1:10,000希釈では、ダウンレギュレーションされた差次発現遺伝子は、主に酸、ステロイド、脂質、アルコールが関与する代謝過程に関連していた（図4, C）。これらの経路に関連する遺伝子のリストは、この論文のオンラインリポジトリ（www.jacionline.org）の表E4に記載されています。
リンス液は主要なTJタンパク質と接着結合タンパク質の遺伝子発現を変化させる
RNA-seqトランスクリプトーム解析により、1：10,000および1：40,000希釈のすすぎ剤に反応して、EPHA2、ESAM、MAGI2、PARD3、CLMP、CLDN1およびVASPなどのTJタンパク質をコードする遺伝子がアップレギュレーションし、CGN、APC、MAGI3、MARVELD3、ASH1LおよびCLDN19がダウンレギュレーションしたことが示された。1:10,000希釈のリンスエイドでは、PATJ、OCLN、CLDN4、CLDN12、CLDN23、MARVELD2などの一部の遺伝子も発現が上昇し、F11R、MAGI1、ATP7B、SYMPK、CLDN15は低下していた。1:10,000希釈ではリンスエイドに対する反応が変化したにもかかわらず、BVES、PARD38、TJP3、CLDN16、AMOTL1、EPPK1、およびCGNL1はアップレギュレートされ、1:40,000希釈ではTJAP1、CYTH2、PDCD6IP、LSR、RAPGEF2、TJP1およびUBN1がダウンレギュレートされていた (Fig 5, A).
RNA-seqデータを裏付けるために、膜封鎖タンパク質を発現する3つのmRNA（CLDN1、CLDN4、OCLN）、孔形成タンパク質を発現する2つのmRNA（CLDN2、CLDN15）、TJタンパク質を発現する2つのmRNA（TJP1、TJP2）について定量リアルタイムPCR分析を実施した。選択された7つのmRNAの発現は、RNA-seq解析の結果と一致しており、RNA-seqの結果を検証しています（本論文のオンラインレポジトリの図E12参照、www.jacionline.org）。
リンスエイドに反応したCaco-2トランスクリプトーム解析は、ESAM、CEACAM1、VEGFA、NOTCH1、およびPARD3などのいくつかのmRNAのアップレギュレーション、およびDLG1、LIMD1、POF1B、CDCA3、APC、およびSORBS1のダウンレギュレーションによって示される、接着結合部（AJ）の破壊を両方の希釈で支持した。両方の希釈液でリンスエイドに対する反応が変化したにもかかわらず、1:10,000または1:40,000希釈液では多くのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの遺伝子が見られた（図5, B）。これらのデータは、すすぎ助剤と細胞間結合の損傷に反応して、腸管上皮バリア分子の発現に強い有害な影響を与えることを実証している。
図のサムネイル gr5
図5すすぎ助剤は、主要なTJおよびAJ遺伝子のmRNA発現を変化させる。AとB、すすぎ剤に反応して、未暴露の場合と比較して有意に変化した遺伝子（log2比）。∗P < .05. ∗∗P < .01. ∗∗∗P < .001.
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リンス液は炎症性サイトカイン、パターン認識経路の発現を変化させる
上皮バリアの損傷に加えて、すすぎ剤への曝露は、自然免疫反応と炎症性経路を変化させました。どの遺伝子ファミリーが特異的に変化したかを調べるため、遺伝子を以下のグループに分類した：自然免疫反応、パターン認識受容体、核因子κB（NF-κB）とアダプタータンパク質-1（AP-1）、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）カスケードおよびサイトカイン（図6、AおよびB）。より広範な炎症性サイトカイン、特にCXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL10、およびCSF1が、1：10,000希釈のリンス液に反応して著しく発現を上昇させた。また、IL-11、IL-12A、cardiotrophin-like cytokine factor 1などの他の炎症性遺伝子もアップレギュレートされていた。さらに、IL10RA、PTGS2、F2RL1、TRIM29、TRAF4、LGALS3などの他の自然免疫応答遺伝子も1:10,000希釈で、CD55、TRIM8、CASP4、IFNGR1、ADA、NOD1、NOS2、APPはいずれの希釈でも顕著な発現上昇が確認できた（図6、A、B）。これらの結果から、リンス液にさらされた腸管上皮細胞は炎症反応を起こし、特に1:10,000希釈で顕著となり、1:40,000希釈では特定の遺伝子に用量反応が見られ、減少または消失することが示唆された。トランスクリプトーム解析の結果、パターン認識受容体TLR2、TLR5、MYD88、CD14が1:10,000希釈でダウンレギュレーション、IRF7とNOD1が両希釈で有意に上昇した（図6、AおよびB）。
図 サムネイル gr6
図6炎症反応遺伝子のmRNA発現に対するリンスエイドの効果。AおよびB、リンスエイドへの反応と未暴露の比較で有意に変化する遺伝子（log2比）。グループにキュレーションされたのは、自然免疫反応、パターン認識受容体、NF-κBとAP-1、MAPKカスケード、サイトカインである。バイオリンプロットは、1:10,000および1:40,000の希釈で見られる遺伝子発現を示す。∗P < .05. ∗∗P < .01. ∗∗∗P < .001.
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上皮性アラミン、胸腺間質性リンパポエチン（TSLP）（図6、A；この論文のオンラインレポジトリの図E13参照 www.jacionline.org）、CCL20、VEGFA、IL18、IL23Aなどのサイトカイン遺伝子の発現が1：10000希釈のリンス液に反応して上昇することが示された。さらに、サイトカインCCL22、CCL28、IL-15、およびCXCL16において、1:10,000希釈でアップレギュレーションが観察された。血管新生、炎症性、リモデリング分子であるVEGFA、CXCL16、IL-18、TGFB1も1:40,000希釈でアップレギュレートされていた。興味深いことに、IL-17RAは、両方の希釈率でリンス液に反応して有意に低下した唯一の遺伝子であった（図6、AおよびB）。
NF-κB、AP-1、MAPKシグナルカスケードに関与する遺伝子は、分化したCaco-2細胞において、RELBを含む両方の希釈液に反応して差次的に発現していた。NFKB2、NFKBIZ、JUN、JUND、DUSP5、DDIT3、DUSP1、DUSP8、FOSL1、MAPK6、MAP2K1、MAPKAPK3、DUSP16、TAB2、MAP2K2、CALM1、MAP2K3およびCALM3（図6、AおよびB）などがあった（図6）。
リンスエイドに反応する腸管上皮細胞のターゲットプロテオミクス
炎症および免疫反応パネルを用いて近接拡張アッセイを行い、2種類の希釈液でリンスエイドに24時間暴露した後のCaco-2細胞上のタンパク質発現の違いを解析した。炎症パネルでは、1:10,000希釈で35タンパク質、1:40,000希釈で19タンパク質が有意に変化した。また、免疫反応パネルでは、1:10,000希釈液で35種類、1:40,000希釈液で8種類のタンパク質がリンス液に反応して有意に変化した（図7、A、B）。アラミン、IL-1α、IL-25、およびIL-33のタンパク質検出は、同じ上清では不可能であった。制御されたタンパク質のヒートマップは、1:10,000 希釈で多数のタンパク質が活性化することを示した（本論文のオンラインレポジトリーの図 E14（www.jacionline.org） を参照）。
図 サムネイル gr7
図7上清単層培養Caco-2細胞におけるリンスエイドに反応して制御されるタンパク質の違い。AおよびB、ボルケーノプロットは、24時間後の1:10,000（n = 5）および1:40,000（n = 5）希釈の洗浄剤に反応して、炎症および免疫反応パネルを使用して検出された、異なる発現および発現低下したタンパク質を示している。アップレギュレートされた遺伝子は赤で表示され、ダウンレギュレートされた遺伝子は青で表示される。C, 1:10,000希釈で生物学的プロセスにグループ化されたGOタームで有意に濃縮されたタンパク質のヒストグラム。
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次に、リンスエイドの影響を受ける生物学的経路を特定するために、制御されたタンパク質のGOタームの濃縮を解析した。その結果、1万分の1希釈で、細胞増殖、細胞シグナル伝達とコミュニケーション、上皮の発達、免疫と炎症反応、細胞死の制御、物質への反応などがアップレギュレートされていることが示された。1:10,000および1:40,000希釈の2つのパネルでは、いずれもダウンレギュレートされた経路はなかった（Fig. 7, C）。
すすぎ剤に含まれるアルコールエトキシレートは、上皮バリアの統合性を乱す
業務用食器洗浄機用洗剤には、メタケイ酸ナトリウム/カリウム（推奨濃度：3%-10%、w/v）、水酸化カリウム（3%-10%、w/v）、炭酸カリウム（3%-10%、w/v）、次亜塩素酸ナトリウム（1%-3%、w/v）という4つの成分が含まれています。すすぎ助剤成分は、アルコールエトキシレート（10〜20％, w/v）、クエン酸（3〜10％, w/v）、クメンスルホン酸ナトリウム（1〜3％, w/v）であった。次に、上皮バリアー損傷の原因となるすすぎ剤中の主成分を特定することを追求した。この目的のため、業務用食器洗浄機で一般的に使用されている1:10,000の希釈率で実験を行った。
位相差顕微鏡の画像では、1:10,000希釈のアルコールエトキシレートに反応して、プレートからの剥離を伴う不規則な形態が見られた（図8、A）。Caco-2細胞を典型的な濃度（1:10,000希釈）のクメンスルホン酸ナトリウムおよびクエン酸に暴露しても、細胞毒性、TEER変化およびPFは生じなかった。アルコールエトキシレートは、一般的に提案されている1日15%用量の1:10,000希釈でTEERの著しい低下とFITCフラックスの増加によって観察されるように、細胞溶解を誘発した（図8、B-D）。また、すべての洗浄液成分を再構成して1万倍に希釈した場合、市販の洗浄液で観察されるのと同様の結果が得られた（図8）。これらの結果から、アルコールエトキシレートは、上皮バリアーに毒性と損傷を与える主な原因物質であることが示唆された。
図8.
図8アルコールエトキシレートによる上皮バリアーの破壊。A, 単層培養したCaco-2細胞を1:10;000希釈のアルコールエトキシレートで24時間処理したときの代表的な位相差画像。B, 単層培養Caco-2細胞をリンスエイドの成分単独または混合物として24時間処理した際の細胞毒性。データは平均値±SDで示した（重複培養でn = 3）。CおよびD、TEERは9日間24時間ごとに測定し、PFはリンスエイドの単独または混合物の成分に応答して72時間後に測定した。データは平均値±SDで示した（n = 6）。∗P < .05, Wilcoxon matched-pairs test.
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考察
近年、アレルギー疾患、特に食物アレルギーや好酸球性食道炎の有病率は、今世紀に入ってから驚くべき数値に達している。30,31 これらの疾患のかつてないほどの増加を説明するために「上皮バリア仮説」が提案され、上皮バリア機能を損傷する有害物質への曝露の増加を指摘している5,32 この傾向は特に腸管バリア障害や腸内細菌異常症と関連した疾患に顕著である。過去 20 年間、豊かな国々の公共食品消費施設では、日常的に業務用食器洗浄機が使用されています。これらの業務用食器洗浄機は、限られた水量で1〜2分以内に高温高圧に達するため、洗浄サイクル終了後に有毒な量のアルコールエトキシレートが残留する可能性がある。本研究では、業務用食器洗浄機のすすぎ剤による上皮細胞の直接毒性、TJの破壊、およびその分子メカニズムを、日常暴露濃度（1：10,000）で実証している。本研究の興味深い点は、これらの毒性作用の原因となるアルコールエトキシレートが、最近洗浄した食器から抽出されても、毒性を維持できることである。
初代腸管上皮細胞は数日以上培養できないため33 、本研究の実験は、最も確立された試験管内腸管上皮細胞の1つであるCaco-2細胞を用いて行われた。また、洗剤やリンス剤に含まれる化学物質の中には有害性が指摘されているものもあり、in vivo実験やマウスモデルの倫理的な許可は得られなかった。Caco-2細胞株は、液液界面の半透膜フィルター上で増殖する細胞で、2万件以上の論文発表があり、現在の腸管バリアモデル基準のスタンダードとなっています。この細胞は、腸管腸管細胞と同様に自発的に分化・増殖する。分化した Caco-2 細胞は、 刷子縁微絨毛構造を保持し、 細胞間 TJ を形成し、 腸管上皮に存在する様々な代謝酵素を生産します34,35。
LDHアッセイは、損傷した細胞のマーカーであるLDHの量を測定するため、細胞毒性または細胞生存率を決定するための便利で簡単な方法です36。しかし、業務用食器洗い機用洗剤は1:250希釈から腸上皮細胞に細胞毒性効果を示しません。家庭用食器洗い機洗剤にはラウリル硫酸ナトリウム、アルコールエトキシレート、漂白剤、酵素、香水などさまざまな有害物質の可能性があり、2万分の1希釈まで毒性を持っていたため、1:500の希釈を行った場合、その効果はありませんでした。内容物や投与量の違いが、その毒性の違いの理由と考えられる。その結果、Caco-2細胞にリンス助剤を作用させると、1：20,000希釈でも高いLDHの放出が確認された。これらの結果に伴い、RNA-seqトランスクリプトームおよびターゲットプロテオミクスにより、1：10,000希釈のリンスエイドに応答して、細胞死、物質への応答、細胞移動、細胞シグナルとコミュニケーション、上皮の発生と増殖、細胞接着、免疫と炎症反応の発現が増加することが確認されました。トランスクリプトーム解析により、細胞死と修復に関連する1138個の異なる発現遺伝子が関与していることが明らかになりました。これは、有害物質に対する一般的な細胞・組織反応である。最悪の場合、細胞死や炎症が起こりますが、特定の細胞では、生存や回復の遺伝子が活性化されるのです。この結果は、洗剤に含まれる化学物質（塩化ベンザルコニウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Triton X-100など）に反応して、角膜上皮細胞で同様の遺伝子ファミリーが活性化する37、腸管腸細胞でdeoxynivalenol、38ヒト肺細胞で銀ナノ粒子、39腎細胞でマイコトキシン（Ochratoxin A）、40およびHepG2細胞で発がん性物質のベンゾ［a］ピレンの活性化が見られる41という過去の報告どおりであった。しかし、RNA-seq の結果、有害化学物質への反応、上皮細胞の発達、細胞のシグナル伝達とコミュニケーションに関連する 427 の遺伝子の発現が増加した。これらの結果は、細胞を死滅させる量よりもはるかに少ない量のリンス液に慢性的に曝露され続けることが、曝露された細胞の必須経路に影響を与える可能性を示唆している。多くの研究により、認可されている食品用乳化剤の一部は、洗剤のように振る舞い、腸の透過性を高め、炎症性腸疾患、大腸炎、メタボリックシンドローム、肥満、がんなど多くの疾患を引き起こすことが報告されています42、43、44、45、46 Tang et al47 は、食事用乳化剤ポリソルベート-80が腸バリアの変化によってマウスに脳室奇形を引き起こす可能性があると報告しています。RNA-seq の結果と同様に、ターゲットプロテオミクスでは、4万分の1希釈のリンス液に反応して、細胞増殖、炎症および免疫反応、細胞移動、および細胞接着プロセスが活性化することが示唆された。
上皮バリア仮説が示唆するように、上皮バリアを損傷する因子は、上皮炎、上皮下空間への微生物叢の移動、およびディスバイオーシスによって特徴づけられる悪循環をもたらす。これらの有害因子によって引き起こされる病態の重症度は、物質の性質、曝露期間、投与量、影響を受ける組織の種類に依存する。これに伴い、多くのアレルギー性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患は、上皮バリアの損傷と関連しているとされている。このことは、主な日和見病原体である黄色ブドウ球菌に対する IgE 反応の発現と一致する7 。さらに、上皮炎時に増加するアラミン、すなわち IL-25, IL-33 および TSLP は、2 型免疫応答の誘導物質として知られている48 。
アラーミンの産生は、細胞の種類や刺激の特徴によって異なる。20,49,50 本研究においては、低レベルではあるが、TSLP と IL-33 の mRNA 発現がリンス液への曝露により増加することが観察された。Wang ら20 は、洗剤曝露後に TSLP と IL-33 の mRNA レベルが上昇することを報告しており、我々の知見と一致している。アラミン、IL-1α、IL-25、IL-33 のタンパク質の検出は、同じ上清では不可能であった。IL-33 は核内サイトカインであるため、培養上清中のタンパク質発現を測定することは容易ではない。51 これらの知見は、異なる洗剤曝露モデルにおいて、時間的な動態でアラーミンのタンパク質レベルを研究することの重要性を示唆するものであった。
消化管バリアは、上皮細胞の頂膜ドメイン周辺に存在する細胞間TJタンパク質によって構成されている52。TJタンパク質のうち、OCLNとCLDNは主に膜貫通タンパク質であり、ZO-1は膜貫通タンパク質と細胞骨格タンパク質の両方に作用している細胞内プラークタンパク質である4。本研究では、TEERの減少がTJタンパク質の局在の変化によって説明できるかどうかを評価するために、リンスエイドにさらされた細胞においてOCLNとCLDN1を免疫蛍光染色で分析した。実際、OCLNとCLDN1の染色が不規則かつ層状であることから、TJの完全性の著しい破壊が明らかになった。有害物質への上皮の暴露は、TJバリアを損傷することが繰り返し報告されている。我々の知る限り、業務用食器洗い機用洗剤に関する報告はないが、洗濯用洗剤と洗剤産業従事者の喘息、鼻炎、皮膚炎の発症との関連については、いたるところで研究されている53, 54, 55, 56, 57 および家庭内清掃労働者58, 59。洗剤の毒性は、界面活性剤、21 枯草菌酵素、56, 57 およびその他の微生物プロテアーゼ60が原因だと考えられてきた。界面活性剤は、洗剤の主な洗浄成分であり、水の表面張力を下げることで作用する。61 私たちの最近の研究から、陰イオン界面活性剤は、微量でもヒト皮膚や気管支上皮細胞の上皮バリアの完全性を損傷することが明らかになった。20, 21 TEERの低下と同時に、TJタンパク質の変化が観察され、バリア完全性の低下と細胞外透過性の上昇に関連している。AJは、細胞間接着を媒介する接着性膜タンパク質ファミリーであり、細胞の増殖、極性、形状、運動性、生存を制御している。トランスクリプトーム解析の結果、毒性量の洗浄剤が、CLDN1、OCLN、CLDN4、CLDN12、およびCLDN19などのTJと、上皮性カドヘリンをコードするCDH1、CDH6、CDH11、CTNNA1およびCTNNB1などのAJの完全性に影響を与えることが明らかにされた。本研究の結果は、すすぎ剤によるTJおよびAJの完全性の崩壊は、バリアー分子への直接的な影響、細胞障害、TJおよびAJタンパク質の一部のmRNA発現の変化から生じる可能性を示唆するものであった。これらの知見と並行して、リンス液は、細胞の移動、増殖、接着に関わる遺伝子の発現を上昇させる一方で、脂質およびステロイド代謝関連遺伝子は、特に毒性濃度で発現が低下していた。また、アルコールや酸の代謝過程に関与する遺伝子がダウンレギュレートされた。
アルコールエトキシレートは、洗剤やリンス剤に広く使用されている非イオン性界面活性剤である。63 この結果は、残留するアルコールエトキシレートが、バリアの完全性を破壊する原因物質であることを示唆している。クエン酸やクメンサルフォン酸ナトリウムなど、すすぎ剤に含まれる他の成分は、上皮細胞のバリア性に影響を与えなかった。アルコールエトキシレートは、家庭用品、パーソナルケア製品、農薬、塗料、コーティング剤、石油産業、工業用洗浄剤に含まれているため、私たちは常にアルコールエトキシレートにさらされています。64,65 Jardak ら66 も、アルコールエトキシレートが魚類、無脊椎動物、両生類の気管支装置膜の機能を破壊し、膨張と大量の粘液分泌を誘発することを報告している。
NF-κB は自然免疫反応のマスターレギュレーターであり、多くの炎症性サイトカインの放出に関与している。67 サイトカイン、ケモカイン、その受容体、補体調節因子の発現レベルは、1:10,000 希釈の洗浄剤に影響された。同様の効果は、重症コロナウイルス症2019、多臓器障害、中毒性肝炎、急性腎障害でも報告されている。68, 69, 70, 71, 72 転写因子NF-κBの変化に加え、AP-1とMAPキナーゼ経路が炎症性・自然免疫活性化の一部として変化していることが確認された。MAPキナーゼカスケードは、細胞のシグナル伝達を媒介する重要な役割を担っており、NF-κBとAP-1の活性化は、炎症性遺伝子の転写を引き起こします73。我々の結果は、気道上皮細胞における大気汚染粒子への曝露、74 ケラチノサイトにおける粒子状物質、75 ヒト胚性腎臓細胞における有機塩素への曝露に関する先行研究と同様に、リンス液が MAPK カスケードを調節しながら NF-κB 活性を調節し、腸上皮細胞において AP-1 転写因子を活性化することを示している76。これらのシグナルの誘導は、TH2促進因子TSLPおよびCXCL-1、CXCL-3、CXCL-8、CXCL-10、CSF1などのケモカインリガンドの発現に関して、腸上皮の炎症性活性の上昇につながる。
全体として、本研究は、業務用食器洗浄機用洗浄剤に反応する腸管上皮バリア損傷の基礎的なメカニズムについて新たな知見を提供するものである。我々は、アルコールエトキシレートが、腸管上皮バリアの完全性を破壊し、自然免疫反応と炎症性転写因子を活性化する、リンス液の原因成分であることを特定した。許容される希釈倍率は1:2,000から1:10,000であるにもかかわらず、1:40,000希釈でもこの点で多くの遺伝子やタンパク質に影響を及ぼしたのです。洗剤、すすぎ剤、その他の有害物質への慢性的な暴露は、上皮バリアを破壊する上で相乗的な効果をもたらす可能性がある。この結果は、異なるモデルや初代腸オルガノイドに基づいているが、本研究では in vivo データが不足している。ヒトにおいて同様のメカニズムが関与しているかどうかを実証するためには、さらなる研究が必要である。上皮バリアの欠陥がアレルゲンの侵入を促進し、多くの慢性炎症性疾患を発症または悪化させる炎症反応を誘発することを考えると、すすぎ剤に含まれる濃度のアルコールエトキシレートの健康被害をさらに評価し、安全な代替品を探索することが急務である。
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記事情報
出版年譜
オンラインで公開されました。2022年12月1日
受理されました。2022年10月20日
改訂版受理：2022年10月20日 2022年10月19日
2022年10月19日 2022年6月4日
掲載時期
インプレス誌 事前校正
脚注
C. A. Akdisは、スイス国立科学財団（スイス、ベルン）、CURE-Eubiosis Reinstatement Therapy（欧州連合）、Novartis Research Institutes（スイス、バーゼル）、Stanford University（カリフォルニア、レッドウッドシティ）、SciBase（スウェーデン、ストックホルム）から研究助成を受けました。K. Nadeauは、国立アレルギー・感染症研究所（米国）、国立心肺血液研究所（米国）、国立環境健康科学研究所（米国）、食物アレルギー研究・教育（米国）から助成金を、IgGenix（米国）、Seed Health（米国）、ClostraBio（米国）、ImmuneID（米国）からストックオプションを受けたことを報告しています。

潜在的な利益相反の開示 C. A. AkdisはEAACI Guidelines on Environmental Science in Allergic diseases and Asthmaの共同議長を務め、Sanofi/Regeneron, Novartis, Seed Health, GlaxoSmithKline (GSK), SciBaseの諮問委員を、またAllergyの編集長を務めています。K. Nadeauは、スタンフォードのWorld Allergy Organization Center of Excellenceのディレクター、Cour Pharmaのアドバイザー、Excellergy、Red Tree Ventures、Eli Lilly、Phylaxisのコンサルタント、Before Brands, Alladapt, Latitude, IgGenixの共同設立者、Immune Tolerance Network、National Institutes of Health臨床研究所でNational Scientific Committeeメンバーを務めているが、提出した仕事以外では、このような仕事をしている。特許には、「混合アレルゲン組成物およびその使用方法」、「免疫系障害の検出およびモニタリングのための顆粒球ベースの方法」、「免疫系障害における白血球の純粋な亜集団を検出および定量化するための方法およびアッセイ」が含まれる。 " R. ディールは、バイオテクノロジー企業であるシード社の共同設立者兼CEOです。ソコロフスカは、スイス国立科学財団、ノバルティス、GSKから研究助成金を受け、アストラゼネカから講演料を受け取り、欧州アレルギー・臨床免疫学会で指導力を発揮しています。基礎・臨床免疫学部門の理事会幹事。その他の著者は、関連する利益相反がないことを宣言している。

識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.10.020

著作権
© 2022 米国アレルギー・喘息・免疫学会を代表してエルゼビア・インクが発行。
ユーザーライセンス
クリエイティブ・コモンズ 表示 (CC BY 4.0) ｜ 情報アイコンを再利用する方法
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図
図のサムネイル gr1
図1業務用食器洗浄機用洗剤およびリンスエイドに対するCaco-2細胞の用量依存的な細胞毒性。A, 単層培養したCaco-2細胞を、業務用食器洗い機用洗剤およびリンスエイドの単独または混合物として、異なる希釈率で24時間処理した場合の細胞毒性。データは平均値±SDで示した（二重培養で各群n = 3）。B、業務用洗剤およびリンスエイド単独、または混合物として24時間処理した単層培養Caco-2細胞の代表的な位相コントラスト画像。希釈倍率は画像の上部に表示されている。3種類の業務用食器洗浄機用洗剤とリンスエイドを使用しても同様の結果が得られた。v/v, Volume/volume.
図 サムネイル gr2
図2分化したCaco-2細胞において、リンスエイドがTEERを低下させ、PFを増加させた。A, C, E, TEERは、洗浄剤とリンスエイドの単独または混合物で処理した細胞について、24時間ごとに9日間測定された。B、D、およびF、PFは、洗浄剤およびリンスエイド単独または混合物として72時間暴露したことに応答して測定された。データは、平均値±SDで示される（n = 6、すべての希釈は3連で行われた）。同様の結果が、他の2つの市販の業務用食器洗い機用洗剤およびリンス用補助剤でも得られました。∗P < .05, Wilcoxon matched-pairs test.
図3.gr3
図3分化したCaco-2細胞における、すすぎ剤に反応したバリアーの完全性の破壊。液体培養Caco-2細胞を、業務用洗剤およびリンスエイド単独、または異なる希釈倍率の混合液に72時間暴露した際のCLDN1（緑）およびOCLN（赤）の免疫蛍光染料による染色。5種類の染色のうち、代表的な画像。
図 サムネイル gr4
図4単層培養Caco-2細胞におけるリンスエイドに反応して発現する遺伝子の差分。A、24時間後の1:10,000（n = 5）および1:40,000（n = 5）希釈のリンスエイドに反応してRNA-seqを用いて検出された差次的発現遺伝子の数を示すベン図。B, 2つの異なる希釈液のリンス液に反応して発現した遺伝子の差分を示すボルケーノプロット。アップレギュレートされた遺伝子は赤でマークされ、ダウンレギュレートされた遺伝子は青で示されている。C, 2種類の希釈液のリンス液に反応して有意にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子は、GO生物学的プロセスに従ってパスウェイ濃縮のために分析された。
図 サムネイル gr5
図5リンスエイドは、主要なTJおよびAJ遺伝子のmRNAの発現を変化させる。AおよびB、すすぎ剤に反応して、未暴露の場合と比較して有意に変化する遺伝子（log2比）。∗P < .05. ∗∗P < .01. ∗∗∗P < .001.
図1.図2.図3.図4.図5.図6
図6炎症反応遺伝子のmRNA発現に及ぼすすすぎ剤の影響。AおよびB、すすぎ剤への反応と未暴露への反応で有意に変化する遺伝子（log2比）。グループにキュレーションされたのは、自然免疫反応、パターン認識受容体、NF-κBとAP-1、MAPKカスケード、サイトカインである。バイオリンプロットは、1:10,000および1:40,000の希釈で見られる遺伝子発現を示す。∗P < .05. ∗∗P < .01. ∗∗∗P < .001.
図 サムネイル gr7
図7単層培養Caco-2細胞上清に含まれるリンス液に反応して制御されるタンパク質の差異。AおよびB、ボルケーノプロットは、24時間後の1：10,000（n＝5）および1：40,000（n＝5）希釈の洗浄剤に反応して、炎症および免疫反応パネルを使用して検出された、異なるアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたタンパク質を示している。アップレギュレートされた遺伝子は赤で表示され、ダウンレギュレートされた遺伝子は青で表示される。C, 1:10,000希釈の生物学的プロセスでグループ化したGOタームで有意に濃縮されたタンパク質のヒストグラム。
図 サムネイル gr8
図8アルコールエトキシレートは、上皮バリアー完全性の破壊を誘発した。A, 単層培養したCaco-2細胞を1:10;000希釈のアルコールエトキシレートで24時間処理したときの代表的な位相差画像。B, 単層培養Caco-2細胞をリンスエイドの成分単独または混合物として24時間処理した際の細胞毒性。データは平均値±SDで示した（重複培養でn = 3）。CおよびD、TEERは9日間24時間ごとに測定し、PFはリンスエイドの単独または混合物の成分に応答して72時間後に測定した。データは平均値±SDで示した（n = 6）。∗P < 0.05, Wilcoxon matched-pairs test.