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ミツバチ作業員のマイクロバイオームと遺伝子発現は、花粉代替物を含む食事によって影響を受ける
ミツバチ作業員のマイクロバイオームと遺伝子発現は、花粉代替物を含む食事によって影響を受ける
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0286070
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J. イライジャ・パウエル、ピエール・ラウ、ジュリアナ・ランゲル、ライアン・アーノット、タイラー・デヨング、ナンシー・A・モラン
要旨
花粉はミツバチの主要な食物タンパク質源である。花粉の外皮には複雑な多糖類が含まれており、ミツバチはほとんど消化できないが、腸内細菌叢内の細菌種によって代謝されることができる。花粉の入手が困難な時期には、管理されたミツバチのコロニーに補助的なタンパク質源を供給することがよくある。これらの補助飼料に含まれる粗タンパク質は、通常、食品製造工程で生じる副産物であり、花粉に由来することはほとんどありません。私たちの実験では、さまざまな飼料が与える影響について検討した結果、花粉を含まない簡素な飼料で、花粉を含む一重構造の飼料と同じようなマクロ栄養素を摂取させると、微生物群集が大きくなり、多様性や均一性が低下し、巣に関連する有益なバクテリアのレベルが減少することがわかりました。さらに、花粉を含まない食事は、ミツバチの発達に重要な遺伝子の発現を急激に低下させた。その後の実験で、このような遺伝子発現の変化は、腸内細菌叢によるコロニー形成と関連している可能性があることを示しました。最後に、定義された腸内細菌叢を接種したミツバチについて、人工飼料で育てたものは、天然の花粉を与えたものに比べて、細菌性病原体の感染を抑制する能力が低いことを示しました。この結果は、花粉を含まない食事がミツバチの腸内細菌叢と遺伝子発現に大きな影響を与えることを示し、主要なタンパク質源として天然花粉が重要であることを示しています。
引用元 Powell JE, Lau P, Rangel J, Arnott R, De Jong T, Moran NA (2023) The microbiome and gene expression of honey bee workers are affected by a diet containing pollen substitutes. PLoS ONE 18(5): e0286070. doi:10.1371/journal.pone.0286070
編集者 中国・養蜂研究院 Kai Wang氏
Received: 2022年12月21日;受理された: 2023年5月8日; 公開された: 2023年5月19日
本論文はオープンアクセス論文であり、すべての著作権がなく、合法的な目的であれば、誰でも自由に複製、配布、送信、修正、構築、またはその他の方法で利用することができます。本作品は、クリエイティブ・コモンズのCC0パブリックドメイン献呈のもとで利用可能です。
データの利用可能性 プロットの作成に使用した最小限のデータは、Supporting Informationの表に記載されています。シーケンスデータは、Bioproject PRJNA911754のもと、NCBI sequence read archiveに寄託されています。
資金提供 N.A.M. United States Department of Agriculture, National Institute of Food and Agriculture award 2018-67013-27540 https://portal.nifa.usda.gov/web/crisprojectpages/1014854-the-role-of-the-gut-microbiota-in-honey-bee-health.html National Institutes of Healthへの助成金: 国立総合医療科学研究所賞 R35GM131738 https://www.nigms.nih.gov/ 資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成に関与していない。
競合する利益 著者らは、競合する利害関係が存在しないことを宣言している。
はじめに
ミツバチ(Apis mellifera)の栄養は、採餌者が花木から集める2つの資源、すなわち、タンパク質、脂質、および生理学的プロセスに関連するその他の栄養素(すなわち、ビタミン、ミネラル)を供給する花粉と、単純炭水化物の形で主なエネルギー源を供給する花蜜の摂取に基づいています [1, 2]. 各粒子は、タンパク質、炭水化物、ビタミンを主成分とする核となる細胞質でできており、その周囲を花粉キットと呼ばれる耐久性のある被膜が覆っている [3] 。この被膜は、不活性脂質とフェノール系バイオポリマーであるスポロポレニンからなる外皮層と、セルロース、ペクチン、その他の多糖類からなる内皮層で構成されています [4].
ミツバチのコロニーは、栄養価の低い飼料や季節的な欠乏により、花粉源が不十分な環境で管理されることが多い [5] 。養蜂家は、花粉の少ない時期を乗り切るため、あるいは春の増産に備えるため、花粉代用剤を使用することが多い。これらの代用品は主にタンパク質で構成され、ホエイ、大豆、酵母エキスなどの粗タンパク質単離物から調製されることがほとんどである [6]。これらのバルク栄養素を使用した食事は、多くのタンパク質を提供することができますが、脂質、アミノ酸、またはフェノール化合物のプロファイルなどの他の特性において大きく異なります[7、8]。そして重要なことは、これらの工業的なタンパク質源は、花粉粒の栄養的な複雑さを欠いているということです。
採集蜂は開花植物から花粉を集め、それを巣に運び、ブルードチャンバーの近くの櫛房に貯蔵する。この集めた花粉は、花蜜や働き蜂の腺分泌物と一緒になって、"ビーパン "として保存されます。ビーブレッドは、若いナースワーカーが自身の栄養需要を満たすために、また発育中のブルードを養うために下咽頭腺からタンパク質性の分泌物を作るために消費される [9] 。ミツバチは年齢を重ねるにつれて、花粉の摂取から蜜とその濃縮物である蜂蜜のみを摂取するようになる [10, 11]。これらの移行は、幼若ホルモン(JH)や主要なリポタンパク質であるビテロジェニン(Vg)などの主要な発達分子によって制御されている [12]。Vg の発現は、個体およびコロニーレベルで、ハチの発育、健康、社会的免疫、社会的調節に複数の影響を与える [13-15] 。また、働き蜂や巣箱の調査において、栄養状態を評価するバイオマーカーとしてよく利用されている [8, 16]。Vg レベルは JH と二重のリプレッサーモデルで作用し、ハチが育児から採餌へ、あるいは長寿の越冬ステージへ移行するのを先導する [13, 17] 。
働き蜂が花粉を食べた後、花粉粒は中腸で溶解され、細胞質の栄養素が急速に吸収される [10, 18] 。使用済みの花粉粒の難消化性成分はハチの後腸(回腸と直腸)に蓄積され、この区画の常駐微生物が引き続き消化する基質となる [19, 20]。溶解した花粉粒の難消化性スポロポレニン断片のマトリックスは、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンなどの単糖類や多糖類、ポリフェノールなどの植物二次化合物を幅広く含む腸層の材料に付着しています。
ミツバチの後腸に生息する微生物相は、特殊なコア分類群に加え、より散発的ないくつかの分類群から構成されている [21] 。哺乳類の小腸に相当する回腸は、プロテオバクテリアの仲間であるSnodgrassella alviと少なくとも2種のGilliamella(G. apisとG. apicola)による厚いバイオフィルムで覆われている。一方、直腸内ではグラム陽性乳酸菌(Lactobacillus nr. melliventrisとBombilactobacillus spp.、それぞれ旧Firm-5とFirm-4)および複数のBifidobacterium種からなる群集がほとんどである [22-24]. これらの細菌は、そしてこれらの細菌群内の菌株でさえも、花粉の被膜の特定の成分を代謝する異なる消化酵素のセットを持っている。例えば、G. apicolaのほとんどの株はペクチンを分解するペクチンリアーゼ遺伝子を持つが、G. apisは持たない[25-27]。ビフィドバクテリウム種は、異なる多糖類を消化できる異なるGHファミリーのグリコシドヒドロラーゼ(GH)酵素を可変数持っている [27]。このハチ腸内細菌叢の存在は、これまでに免疫機能の適切な発達 [28-30]、発育期の体重増加、および働き蜂の栄養プロファイルに関連している [19, 20]と言われています。
本研究では、花粉を含まないタンパク質豊富な人工飼料が、腸内細菌叢のサイズと組成、主要な発達遺伝子の発現、および日和見細菌病原体に対する働き蜂の感受性にどのように影響するかを解明するための実験を実施した。
材料と方法
腸内細菌叢および発生遺伝子発現に及ぼす食餌の影響
2020年7月にテキサス大学オースティン校(UT)、2020年10月にテキサス州カレッジステーションにあるテキサスA&M大学(TAMU)の2つの場所と季節で同じ実験を再現した。後期蛹を含むブルードフレームを取り出し、35℃、相対湿度(RH)で一晩保たれたインキュベーター内のフレームケージに入れたフィールドソースコロニーを使用しました。実験開始前にハチが餌にありつけないように、花餌を含まないブルードフレームを選択した。翌朝、数百匹の出現した働き蜂を集め、そのうちの 30 頭を 3 つの給餌条件 (対照花粉給餌蜂 (POL)、実験用人工飼料のみで給餌した蜂 (AD)、ヘミセルロースとペクチン成分を添加した飼料を給餌した蜂 (ADA) ) に属する 5 つのカップケージにそれぞれ入れた。また、すべてのカップケージには、ハチが自由摂取できるように滅菌したスクロース溶液を用意した。
これらの<24 時間齢>のハチに、出現したハチを入手したソースハイブから採取した成虫の内臓から細菌を接種した。先行研究 [31, 32] と同様の方法を用いたが、花粉成分が試験群に与えられる可能性を低くするため、ろ過のステップを追加した。この接種液は、50 匹のナースから後腸を解剖し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液中でペストルを用いてホモジナイズすることで調製しました。ホモジネートとペストルとチューブのリンス液の合計量を10mLにした。この懸濁液を短時間ボルテックスした後、3,000 x gで1分間遠心分離し、大きな花粉粒をペレット化した。上清を100μm、70μm、40μmのナイロンフィルター(Millipore, Burlington, MA, USA)で段階的に濾過した。得られた濾液に滅菌ショ糖シロップを加え、250μLを使用して、すべてのカップケージのフィーダー内のタンパク質のボーラスをコーティングした。接種したハチのカップケージを 35°C 85% RH で実験期間中保管した。必要に応じて、追加のタンパク質飼料 (花粉または実験用) を毎日すべてのカップケージに追加した。飼料を入れたカップは 2 日ごとに交換し、TAMU 試験での消費量を測定するために重量を測定した。消費前と消費後の体重を測定する前に、カップは24時間実験室の周囲湿度レベルになるようにし、[33]のように餌を部屋の周囲湿度レベルに平衡させた。また、死亡率を評価し、死んだハチを毎日取り除いた。接種後 7 日目と 14 日目に各ケージから 10 匹のハチを回収し、核酸を処理するまで -80°C で保管した。カップが定着してから 14 日後に実験を終了した。
花粉源には、A. mellifera の採餌蜂が頻繁に訪れるモノカルチャーであるため、照射した単花ナタネ (Brassica rapa) 花粉を使用しました。本研究で使用したアブラナ科花粉の栄養組成の詳細は、Lauら(2022)[34]に記載されています。実験飼料には、タンパク質と脂質の比率が30:20で、ショ糖、セルロース、ビタミンを50%混合した、ナタネ花粉のマクロ栄養素プロファイルをシミュレートした処方を用いた(レシピはS1 Fileに記載)。添加物入り人工飼料(ADA)の調合には、全飼料1kgあたり以下の成分をそれぞれ100mg添加した(ヘミセルロース成分を模擬するため):βグルカン、アラビナン、ペクチンガラクタン、およびキシログルカン。最後に、ペクチン骨格を付加するために、ポリガラクツロン酸(Sigma, St.Louis, MO, USA)を使用した。すべての飼料は、使用前に-20℃で保存した。実験セットアップをFig 1Aにまとめ、サンプル情報をS1 Tableに記載した。
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図1. 微生物叢と食餌の影響に関する実験デザイン。
(A) ミツバチの腸内細菌叢と遺伝子発現に対する食餌の影響。働き蜂を一晩フレームから出現させ、従来のミツバチの腸内細菌叢を接種した。カップケージに入れ、花粉(POL)、人工飼料(AD)、ヘミセルロースとペクチンの添加物を含む人工飼料(ADA)のいずれかを食べさせた。14 日後にハチの腹部を解剖し、1 ヶ所あたり 1 条件につき 4 個のカップから採取した 7 頭の働き蜂から DNA と RNA を抽出した。これらの核酸を用いて、16S rRNA 遺伝子または分類群特異的遺伝子の塩基配列決定、および 16S rRNA 遺伝子の総コピーの定量ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を実施しました。RNAを用いてcDNAを作成し、qPCRを用いて発生・食餌遺伝子の転写量を調べた。(B) 発達遺伝子の発現に及ぼす食餌中の割合花粉の影響。ハチを一晩ブルードフレーム上に出現させた後、成虫から調製した腸内ホモジネートを与えて慣行化した。ハチをカップケージに入れ、各カップに異なる割合の花粉を混ぜた人工飼料を与えた (カップ内の花粉の割合 = 100%、50%、25%、または 0%)。14日後にハチの腹部を解剖し、上記と同様にRNA抽出と発生遺伝子アッセイを行った(各条件につきn = 8匹)。(C) 発達遺伝子の発現に対する微生物叢の影響。後期蛹をブルードフレームから引き抜き、無菌状態で成虫として出現させた。この無菌状態の働き蜂に、成虫の腸内ホモジネートを接種するか(従来型=CV)、共培養した腸内細菌分離株を接種するか(定義型コミュニティ=DC)、接種せずにおくか(マイクロバイオータ欠損=MD)した。ミツバチを滅菌した花粉とシュガーシロップを入れたカップケージに 14 日間入れました。その後、腹部を解剖して RNA を抽出し、これを用いて cDNA を合成して qPCR を実行し、発達期の遺伝子発現を調べた。この実験は、CV群が1回目で死亡したため、2回行った(1条件につき2カップからn = 8匹のハチ、2回繰り返し)。(D) 細菌病原体に対する感受性に及ぼす食餌の影響。(C) と同様に無菌のワーカーを生成し、20 匹のワーカーを 2 個のカップに入れ、腸内細菌の共培養定義コミュニティを植え付けた。カップの一方に花粉を、もう一方に人工飼料を与えた。14 日後、カナマイシン耐性マーカーでタグ付けした Serratia marcescens (KZ11 株) の OD600 = 1 懸濁液を各ハチに 5 μL 与えた。これらのハチを 72 時間維持し、内臓を解剖した後、ホモジネートの希釈液を kan+ プレートにプレーティングした。得られたコロニーの数を数えた (n = 各条件につき 15 匹のハチ)。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.g001
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花粉の割合が発生遺伝子発現に及ぼす影響
後期蛹(目が黒いがまだ動いていない)をフレームから引き抜き、以前の実験と同様に無菌アリーナで食入させた[31]。脱皮後 24 時間以内に、これらの微生物相のない新しく出現した働き蜂を 25 匹のグループに分け、4 つのカップに分けた。各カップには、アブラナ科の花粉と人工飼料を異なる割合で配合した餌を与えた。a) 花粉 100% / 人工飼料 0%, b) 花粉 50% / 人工飼料 50%, c) 花粉 25% / 人工飼料 75%, または d) 花粉 0% / 人工飼料 100%。花粉/飼料混合物には、上記と同様にPBSに浸したミツバチの内臓を接種した。ハチには滅菌スクロース溶液を自由摂取させ、カップケージを 35℃、85%RH で 14 日間維持した。ハチを解剖し、頭部と腹部から RNA を分離する前に、-80℃に置いた。要約は図 1B を参照。
発育期の遺伝子発現に対する微生物叢の影響
ビテロジェニンおよび幼若ホルモンエステラーゼレベルの維持に対するハチの腸内細菌叢の影響を調べるため、2 つの試験を実施した (Fig. 1C を参照)。そのために、上記のマイクロバイオータ効果実験と同様に、ハチの蛹を引き抜いて出頭させた。この微生物叢を持たない新出現の働き蜂を25匹のグループに分け、滅菌した多花粉とショ糖の溶液が入った3つのカップに入れました。従来型 (CV) の微生物相を持つハチを作るため、3 匹の巣箱の働き蜂の後腸を 300 μL の PBS で乳棒で破砕したホモジネートを花粉の上に置いて、ケージに入れた。別のケージには、コロンビア血液寒天培地(CBA)プレートから600nmの光学濃度が3程度になるように掻き出した定義コミュニティ(DC)グループのPBS懸濁液300μLを用いた。この定義コミュニティには、ギリアメラ(wkB1、wkB7)、スノグラセラ(wkB2)、ビフィドバクテリア(LCep5)、ラクトバシラス・メリベントリス(wkB8、wkB10)を共培養分離したものを含む。3つ目のカップは接種せず、微生物叢欠損(MD)対照群とした。カップケージを 35℃、85%RH で 14 日間維持し、解剖して頭部と腹部から RNA を分離する前に、-80℃に置いておいた。最初の試行では CV 群のハチがすべて死亡したため、実験を繰り返した。
微生物叢と発生遺伝子発現の特徴付けのための核酸調製
UT と TAMU の 2 拠点で、3 つの給餌条件 (POL, AD, ADA) ごとに、4 カップから 7 サンプルを調製した。まず、実験サンプルの核酸を調製するために、ハチを氷上で解凍した。次にハチの腹部を解剖し、Zymo Quick RNA Miniprep kit (Zymo, Irvine, CA, USA) の RNA lysis buffer 600 μL を入れた清潔な乳棒チューブに入れ た。腹部を30秒間ホモジナイズし、この混合物を500μLの0.1mmシリカジルコニアビーズ(Biospec、Bartlesville、OK、USA)を含むビーズチューブに入れた。サンプルを1分間ビーズビートした後、Zymoキットを製造者の指示通りに使用して、100μLのRNAを調製した。RNAの調製からgDNA除去カラムを保持することにより、これらの同じサンプルからDNAを分離した。次に、Qiagen Dneasy kit(Qiagen, Germantown, MD, USA)のQiagen wash 1および2バッファー500μLでDNAカラムを洗浄し、分子グレード水100μLでDNAを溶出した。
Nanodrop Lite分光光度計(Thermo, Waltham, MA, USA)を用いてRNAの純度を定量・検査し、すべてのRNAサンプルを25 ng/μLの濃度に調整した。50ngのRNAを用い、Takara PrimeScript kit (Takara Bio Inc, Shiga, Japan)を用いてcDNAを作成した。得られたcDNAを10倍に希釈し、その後の3重の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)には1反応あたり1μLを使用した。この精製とcDNA合成の戦略は、花粉率摂食実験と微生物有無実験の両方で、頭部と腹部からRNAだけを抽出する際に使用した。Qubit dsDNA broad range kitでDNAを定量し、その後のエンドポイント・定量PCRのために100倍に希釈した。
微生物叢の相対的なコミュニティ組成を推定するためのメタバーコードの使用
我々は、全体的な細菌群集組成の多くの研究で使用されるものと同様の技術およびプライマーを使用し、我々の研究室からの以前のメタバーコードライブラリーの仕様に従うことによって、16S rRNA遺伝子のV4領域のメタバーコードを行った[35-37]。追加情報は、S1ファイルにまとめられています。Giliamella(遺伝子rimMを使用)およびBifidobacterium(遺伝子groELを使用)系統内の菌株変異を調べるために、他の研究[37-39]と同様の分類群特異的な単一コピー遺伝子戦略を使用した。どちらの方式でも、最初のPCR反応で目的の標的遺伝子を増幅し、磁気ビーズ(Axygen, Union City, CA, USA)でアンプリコンを洗浄し、2回目のPCRでイルミナ特有のアダプター(Illumina Nextera dual indexes)とバーコードを追加しました。得られたアンプリコンを洗浄し、16S rRNA遺伝子サンプルにはiSeq100、シングルコピー遺伝子解析にはmiSeq(Illumina, Hayward, CA, USA)を用いて塩基配列を決定しました。プライマー配列、反応条件、およびシーケンス情報はS2 Tableに含まれる。
メタバーコードからの配列リードの処理と解析
Qiime2を用いてアンプリコン配列データを解析し、品質管理およびリード処理のステップを含む、組成および多様性解析を行った(詳細はS1ファイル参照)。2つの地点の実験では、地点のコミュニティ間に十分な組成の違いがあったため、別々に解析を行った(すなわち、サンプリング地点間で見ると、Beta多様性が有意な差を示したのである)。サンプルのα多様性(例:シャノン指数値から有効種数を算出[40]、サンプルの系統的多様性、種の均等性[41])を見て、各サイトの摂餌グループ間の差異を調べた。グループ間の差は、Rでpgirmessパッケージのkruskal.mcコマンドを用いたKruskal-Wallis順位和検定とポストホック多重比較検定 [42] 、RパッケージPMCMR [43] の独立サンプルのTukey分布近似によるTukey and Kramer(Nemenyi)検定を用いて、比較しました。Rでggplot2 [44]を用いてグラフを描きました。重み付きUniFrac距離行列を用い、PERMANOVA検定で有意性を検定することで、グループ間のβ多様性を比較した。
アンプリコン配列変異(ASV)表で分類群の分析により判明した相対存在量を用いて、細菌系統の絶対存在量を算出した。qPCRから推定された16S rRNA遺伝子コピーの総数を各分類群の相対存在比率で割り、[32]で行ったようにゲノムあたりのrRNAオペロン数で補正しました。これらのデータはS1 Tableに含まれています。統計解析と表現の目的で、絶対量表のすべてのエントリに数字を1つ追加しました。これは、多くの系統が絶対量がゼロのサンプルのエントリーを持ち、これらは対数解析では数学的に定義できないため、このようにしました。その後、各系統の絶対存在量をKruskal-Wallis順位和検定と上述のポストホック検定で比較した。
GilliamellaおよびBifidobacterium系統内の系統ダイナミクスを解析するための分類群特異的シングルコピー遺伝子実験では、シングルコピー遺伝子ターゲットからの高スループットリードを使用して、グループ内の有効種数を見た。次に、それらの分類群に関連するqPCR/16S解析からのスプリットリードに相対的な割合量を用いて、絶対量解析を行いました。この種のアッセイと解析の実施方法に関する詳細は、S1ファイルに記載されています。
全細菌量を定量化するためのqPCRの使用
既出の方法[31]を用いて、単離した腸内DNAの1μL中のコピーの絶対数を定量化するためにqPCRを使用し、総16S rRNA遺伝子コピー数を評価した。簡単に言うと、16S rRNA遺伝子の標的セグメントを有するプラスミドpGemTの規定濃度の希釈液を標準曲線として使用した。プライマー27F/355Rを用いて、全サンプルの3重反応でこの配列を増幅し、標準曲線を用いてコピー数濃度を求めた。これらのカウントを希釈のために補正した。これらの総存在量の値を用いて、上述のように絶対存在量を計算した。
発生系遺伝子の発現を調べるためのqPCRの使用
qPCRには、50 ng RNAから生成したcDNAの1対10希釈液1 μLの3重反応を使用した。これは、ハウスキーピング遺伝子RPS5a [46]に対する発生遺伝子ビテロジェニン(Vg)および若年性ホルモンエステラーゼ(JHE) [45]の遺伝子発現の違いを調べるために使用しました。また、インスリン受容体遺伝子AmInR1およびAmInR2について、食事効果摂食実験および微生物叢効果摂食実験のサンプルのサブセットを微生物叢あり/なしで試験しました[20]。使用したqPCRプライマー配列と増幅プログラムはS2 Tableに記載した。
相対的な遺伝子発現を解析するために、2-ΔΔCT[47]法を用い、コントロール群と治療群の間のfold-changeの差を調査した。まず2-ΔΔCT値をlog2変換し、次に四分位から四分位のヒストグラムを見たり、Shapiro-Wilk検定で正規性を検定したりして、データセットの正規性を分析した。正規分布が得られないセットや、複製数が少なく十分な評価ができないセットもあったため、ノンパラメトリック検定を使用して、統計的な差異があるかどうかをグループで検討した。2群間の検定にはMann-Whitney-Wilcoxon順位和検定を用い、3群間の検定には前述のようにKruskal-Wallisとポストホックテストを使用しました。対照群(1回目の試験ではDC、2回目の試験ではCV)と実験群の間の有意な交互作用のみを報告する。
病原体感受性に対する食餌の影響
ハチをブルードフレームから出現させ、単花粉または実験飼料のみ (飼料 AD) を入れたカップケージに入れました。その後、上記と同様に濾過したナースガットホモジネートを接種した。各グループをカップケージで5日間維持した後、カナマイシン耐性S. marcescens KZ11(もともとミツバチから分離された株[48])をTn5統合により改変したOD600〜1μLを各グループに5μLずつ与えた[49]。72時間後に取り出し、100μLのPBS中でその内臓をホモジナイズした。その後、10倍希釈を行い、1希釈あたり10μLをカナマイシンを50μg/mLとしたCBAプレートにスポットした。35℃で一晩インキュベートした後、感染レベルを測定するためにコロニーを列挙した。図1Dの実験計画を参照してください。この生物を選んだのは、ミツバチの日和見病原体として知られており、腸内細菌の異常と関連していると考えられ、実験的に扱いやすく、成虫に死亡をもたらすことがあるからである [24, 48-50] 。
結果
全体的な食餌消費量はすべてのグループで時間の経過とともに減少したが、AD および ADA グループと比較して POL ハチでは減少率が顕著だった (S1 Fig)(実験 1 は Fig 1A に要約)。
消費の鈍化の結果、POL ハチは実験期間中に消費した餌が少なくなり (40.1 mg ± 2.2 mg SD)、AD ハチ (47.8 mg ± 3.1 mg SD) よりも有意に少なかった (S2 Fig)。生存率は各処理グループを通して高く、すべての飼料で実験終了時に 89% 以上の個体が生存していた (S3 Fig)。
人工飼料を使用することで腸内細菌叢のサイズが全体的に大きくなった
TAMU で実施した実験では、POL ハチの絶対細菌数 (POL 絶対細菌数平均 = 4.1e6 ± 4.2e5 SEM per μL) は、人工飼料を投与したいずれのグループ (AD 平均 = 1.3e7 ± 4.2e5 SEM per μL, ADA = 1.5e7 ± 2.2e6 SEM per μL) と比べて小さかった (H(2) = 24.1, P = 5.9e-6, Kruskal-Wallis). UT実験では、POL群(平均3.8e6 ± 4.2e5 SEM/μL)の微生物相は、AD群(平均8.2e6 ± 1.3e6 SEM/μL)よりも小さく(H(2) = 12.1, P = 0.0023, Kruskal-Wallis )、ADA蜂(平均6.1e6 ± 7.4e5 SEM/μL)と同様だった(図2a)。
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図2. 微生物叢に対する食事の影響。
花粉を与えたハチ (POL) と人工飼料 (AD) または添加物入り人工飼料 (ADA) を比較した場合の腸内細菌叢への影響 2 ヶ所 (TAMU および UT、n = 28 ハチ/条件/サイト) で述べた。(A-B) 1μL のハチ腸 DNA あたりの総腸内細菌の絶対量をプロットしたもの。総腸内絶対存在量は、サンプル内の全分類群の絶対存在量の合計値である。16S rRNA遺伝子の総コピー数は、qPCRにより分類群の相対存在量で分割して推定し、ゲノムあたりのrRNAオペロン数で補正した。(C-D) 有効種数で評価した種の豊かさのプロット。(E-F) Pielouの均等性指数で示される種の均等性のプロット。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Kruskal-Wallisに続く独立サンプルのTukey分布近似によるTukey and Kramer (Nemenyi) testによるポストホック2種比較。ダイヤモンドは、本図および以下の図の各ボックスプロットの平均値を示す。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.g002
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タンパク質代替物の使用により、花粉を与えたハチの微生物相と比較して、種の多様性と均等性が低い腸内微生物相となった
AD 群と ADA 群のハチは、有効種数 (ESN) で測定したアルファ多様性が POL 群のハチよりも低かった (図 2B) 。この多様性の低下は、TAMU (H(2) = 22.4, P = 1.4e-05, Kruskal-Wallis) と UT (H(2) = 28.9, P = 5.3e-07, Kruskal-Wallis) 両実験において AD と ADA グループの両方で有意であった。POL給餌群の平均ESN値はTAMUで22.4、UTで23.0であったのに対し、人工飼料群は両地点とも12~14の範囲にあった。同様に、どちらの人工飼料群も、両サイトで POL ハチよりも均等性指数 (Pielou) が有意に低かった (TAMU, H(2) = 22.4, P = 1.4e-05, Kruskal-Wallis) (UT, H(2) = 24.0, P = 6.2e-06, Kruskal-Wallis) (Fig 2C).
花粉を与えたハチは、花や巣の環境に関連するバクテリアの個体数が多かった。
POL 群のハチは、人工飼料を与えたハチと比較して、花粉、花蜜、巣の環境に関連する細菌の個体数がより多かった。特に、Bombella apis (以前は Parasaccharibacter apium および Saccharibacter sp. と呼ばれ、以前の文献では Alpha 2.2 [51, 52] と呼ばれていた) は、両サイトの POL ハチで有意により多く見られた (Fig 3A および 3B)。TAMU と UT の POL ハチでは、各サイト 28 サンプル中、B. apis が検出されたのは 16 と 14 でしたが、実験グループでは TAMU で 1 サンプル、UT で 4 サンプル、ADA グループではそれぞれ 0 と 4 サンプルしか検出されませんでした。B. apisの平均絶対量は、両サイトともPOLグループで高く、TAMUでは3.4e+03 ± 1.3e+03 SEM per μL、UTでは2.6e+04 ± 1. UT では 2.6e+04 ± 1.5e+04 SEM/μL となり、実験グループの個体数が大幅に減少した (TAMU, H(2) = 34.23, P = 3.69e-08, Kruskal-Wallis) (UT, H(2) = 16.3, P = 0.00029, Kruskal-Wallis) と比較しています。同様に、POL のハチには巣関連または環境関連乳酸菌が多く、その大部分は多様なハチ種、花、巣の環境と関連する種である Apilactobacillus kunkeei (Fig 3C and 3D) で構成されていた [53, 54] 。その他の環境関連菌は、サイト間で偏った分布パターンを示した。例えば、TAMU サイトの POL ハチでは、人工飼料を与えられたハチよりも「その他の」細菌 (主に連鎖球菌とブドウ球菌に関連する ASV) の発生率が低かった (POL の 4 サンプルに存在、AD と ADA グループの 21 と 22 サンプルに存在)。絶対量は散発的だったが、TAMU の POL 群ではいずれの実験群よりも有意に少なかった (H(2) = 24.3, P = 5.2e-06, Kruskal-Wallis).UTサイトのPOLハチも、これらの系統の出現率が低く(9サンプルでの存在に対し、ADグループとADAグループでは20と13)、AD食よりも絶対量が有意に低かった(H(2) = 8.1, P = 0.0173, Kruskal-Wallis)(S4 Fig)。
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Fig 3. TAMU および UT において、ハチに花粉 (POL) を与えた場合と人工飼料 (AD) または添加物入り人工飼料 (ADA) を与えた場合の、ハチの腸から得た巣関連細菌分類群の絶対量に与える影響。
(A-B) ボンベラ属の絶対量のプロット。(C-D) 環境または巣に関連する乳酸菌の絶対量のプロット。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Kruskal-Wallisに続く独立サンプルのTukey分布近似によるTukey and Kramer(Nemenyi)検定によるポストホックペアワイズ比較.
doi:10.1371/journal.pone.0286070.g003
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複数のコア分類群に対する細菌の絶対存在量の差は、一方のサイトで他方のサイトよりも顕著であった
TAMUとUTのPOLグループは、Bartonella apis、Bombilactobacillus spp.(TAMUのみ)、Lactobacillus melliventris、Bifidobacterium sppなどの分類群について、AD fedグループよりも複数の系統の絶対量が有意に低かった。 TAMU POLグループもこれらの分類群についてADAグループより少なかった。どちらのサイトでも、AD または ADA の飼料を与えたハチと比較して、POL 群のハチの S. alvi 量は有意に少なかった (S5A-S5J 図)。
分析に十分な Gilliamella シングルコピーリードを持つサンプルの割合は、人工飼料を与えたハチでは低くなった
割合の分析は、a) rimM シングルコピー遺伝子プライマーでサンプルが全く増幅されなかったか、b) もし増幅されたとしても、Frischella リード汚染を除去した後に Gilliamella 関連のリードが 500 以上残っているかどうかに基づいて行いました。このリードカットオフは、アルファ多様性解析の結果、サンプルの多様性を捉え、最大サンプル数を維持するための最小リード深度であることが示されたため決定した。両サイトのAD群とADA群では多くのサンプルが脱落したが、POLのサンプルはほとんど保持された。これらの割合を片側フィッシャーの正確検定で分析したところ、十分なリード数を持つサンプルの割合が、TAMUでは両方の実験グループ(ADとADA)、UTではADグループのハチについて、有意に低いことがわかった(表1)。
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表1. 品質管理フィルタリング後の解析に十分なGilliamella rimMのリードを持つ処理ごとのサンプル数(給餌グループごとに各サイトでn = 14)。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.t001
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ギリアメーラ属の絶対量と菌株多様性は、食餌によってほとんど変化しなかった
16S rRNA遺伝子アンプリコンに基づくすべてのGilliamella関連リードの絶対存在量の推定値は、両サイトの食事間で統計的に類似しており、TAMUサイトではADA食事のみが減少を示した(S6AおよびS6B Fig)。rimMアンプリコンに基づく解析の検出力は、十分なリードを生成したADまたはADAサンプルが少なかったため、低かった。有効種数は、UTサイトのADAグループでより少なかった(S6CおよびS6D Fig)。rimMに基づく絶対数は、どちらのサイトでもG. apisとG. apicolaで差がなかった(S6EとS6F Fig)。これらの結果は、Gilliamellaの数が少ないサンプルが解析から除外されたため、偏りがあり、違いを覆い隠している可能性がある。
ビフィドバクテリウム属の有効種数については、いずれのサイトでも、花粉を与えたグループと食事を与えたグループの間に有意な差は見られなかった
ビフィドバクテリウムのシングルコピー遺伝子解析 (groEL) のアルファ多様性指標では、実験食を与えたハチがビフィドバクテリウム属の絶対量が多いという観察にもかかわらず (S7 Fig) 、食餌間の多様性に大きな変化は見られなかった (S5G および S5H Fig)。
ビテロジェニン (Vg) と幼若ホルモンエステラーゼ (JHE) をコードする遺伝子の転写物は、花粉を与えられたハチと比較して、人工飼料を与えられたハチでは非常に少なかった。
初期飼料給与実験に使用したハチの腹部で、参照遺伝子 (RPS5a) に対する Vg と JHE の転写産物数を調査した。いずれの部位でも、人工飼料を与えたハチの全グループで、両遺伝子の転写産物が有意に低かった (Fig. 4A-4D) 。興味深いことに、Vg の相対発現量は TAMU のサンプルと比較して、UT サイトの実験グループで非常に少なかった。UTのグループでは、ADとADAのグループのlog 2(2-ΔΔCT)値が-4.85±0.41SEMと-4.79±0.30SEMだったのに対し、TAMUのこれらのグループでは-1.28±0.32SEMと-2.02±0.45 SEMである。これらのサンプルの統計的検定の追加結果は、S1 Tableに記載されています。
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図4. 発育遺伝子に対する食餌の影響。
TAMU と UT のミツバチの腹部において、花粉 (POL) と人工飼料 (AD) または添加物入り人工飼料 (ADA) が、参照遺伝子 RPS5a に対する発育遺伝子発現に与える影響。 (A-B) ビテロジェニン (Vg) をコードする遺伝子の mRNA 相対発現。(C-D) 幼若ホルモンの代用品である幼若ホルモンエステラーゼ (JHE) の相対的 mRNA 発現;n = 7 ハチ、各サイトの条件ごとに 4 カップのもの。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Kruskal-Wallis に続く独立サンプルの Tukey 分布近似による Tukey and Kramer (Nemenyi) テストを用いたポストホックペアワイズ比較.
doi:10.1371/journal.pone.0286070.g004
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頭部と腹部におけるこれらの遺伝子の発現に及ぼす食餌花粉の割合の影響に関する実験(図1Bにまとめた実験2)により、この結果が検証された。頭部と腹部におけるこれらの遺伝子の発現は、食餌中の花粉の減少に伴い、ほぼ段階的に減少する傾向を示している。花粉が100%のサンプルと0%のサンプルの比較では、頭部と腹部の両方で両遺伝子が有意に異なっていた(図5A-5D)。
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図5. 飼料中の花粉の割合が発生系遺伝子の相対発現に与える影響。
従来の腸内細菌叢を持つ14日齢のミツバチワーカーの頭部と腹部における遺伝子発現。(A) 頭部におけるVg。(B)腹部のVg。(C) 頭部におけるJHE。(D) 腹部のJHE (n = 7 サンプル/条件/組織)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Kruskal-Wallisに続く独立標本のTukey分布近似によるTukey and Kramer (Nemenyi) testを用いたポストホックペアワイズ比較.
doi:10.1371/journal.pone.0286070.g005
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ビテロジェニン(Vg)と幼若ホルモンエステラーゼ(JHE)の転写物に対する腸内細菌の影響を調べる実験では、あいまいな結果が得られた(図1Cに要約した実験3)。
成虫の腸内ホモジネートを与えて慣用化したハチは、最初の微生物相存在/不在実験で死亡した。これはホモジネート中に病原体が存在する可能性があるため。したがって、この最初の実験では、腸内分離株の培養定義コミュニティを与えたハチのコホート (DC) と、微生物叢欠乏のハチ (MD) のみを対象としました。この分析では、DC 群を発現コントロール群として使用しました。微生物叢欠乏症のハチは両方の遺伝子で発現レベルが低い傾向にあったが、腹部サンプルの JHE 相対発現 (Fig 6F) を除いて、差は有意ではなかった (Fig 6A, 6B and 6E) 。発現コントロール群として慣行化されたハチを含む 2 番目の実験ラウンドでは、ハチの頭部 (Fig 6C および 6G) および腹部 (Fig 6D および 6H) で Vg および JHE の両方で DC 群の転写レベルが高くなった (CV コントロールより有意には高くないものの)。CV 型のハチは、腹部組織において Vg と JHE の遺伝子発現レベルが MD 型のハチと同程度で、DC 型のハチより有意に低かった (Fig. 6G と 6H)。統計的比較の結果は S2 ファイルでご覧いただけます。
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図6. 腸内細菌叢の存在が発生系遺伝子の発現に及ぼす影響。
花粉食を与えた14日齢の働き蜂の頭部と腹部におけるVgまたはJHE。MD = 微生物欠乏症のハチ、CV = 従来の微生物叢でコロニー形成されたハチ、DC = 養殖ハチ腸内分離株の定義されたコミュニティを与えたハチ。(A-B) DC と MD のハチの頭部と腹部における Vg の相対的な発現を示す最初の実験トライアル (n = 7/条件/組織)。(C-D) CV、DC、および MD のハチの頭部と腹部における Vg の相対的な発現を示す第 2 の実験的試行である。(E-F) サンプリングしたハチの頭部 (第 1 試行のみ) と腹部から得られた JHE の相対的な発現。(G-H) サンプリングしたハチの頭部(第2試験のみ)と腹部のJHEの相対的発現量。各ボックスプロットは、各組織の条件ごとにn = 7サンプルを表している。*p < 0.05, **p < 0.01, **p < 0.001, Mann- Whitney Wilcoxon test for 2 category test and for 3 category test: Tukey and Kramer (Nemenyi) test with Tukey distribution approximation for independent samples after hoc pairwise comparison followed Kruskal-Wallis.
doi:10.1371/journal.pone.0286070.g006
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微生物叢を持たないミツバチは、定義されたコミュニティを持つミツバチよりもインスリン受容体遺伝子の転写レベルが高かった
これらの差は、腹部サンプルではAmInR1とAmInR2の両方で、頭部サンプルではAmInR1で有意であった(S8 Fig)。
インスリン受容体遺伝子の相対発現データは、UTとTAMUのサンプルで異なる結果が得られた。
AmInR1およびAmInR2の転写物は、UTサイトではAD給餌群で有意に高かったが、TAMUサンプルでは有意差は示さなかった(S9 Fig)。
花粉飼料で飼育したハチは、人工飼料で飼育したハチよりも日和見菌病原体への感染に強い(図 1D にまとめた実験 4)。
花粉を与えた 14 日齢のハチと人工飼料を与えた 14 日齢のハチの感染後 72 時間に、病原体 Serratia marcescens KZ11 (Kan 耐性マーカーで標識) の存在量を計測しました。その結果、人工飼料を与えたハチの方が病原体レベルがはるかに高いことがわかりました (Fig. 7)。両群とも多くのサンプルはまったく感染していなかったが、AD 群では花粉群よりも KZ11 の生菌数が多く (15 個中 9 個が AD 陽性、15 個中 4 個が POL 陽性)、KZ11 の濃度が高かった (W = 62, p = 0.02187, Mann-Whitney Wilcoxon)。給餌条件ごとに 1 つのカップケージを使用し、ハチが頻繁に餌を共有するため、各グループ内のハチは独立していない。
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図 7. 日和見病原体に対する食餌の影響。
花粉 (POL) または人工飼料 (AD) を与え、従来の微生物相を持つハチから得たハチ腸をプレーティングした際の、細菌病原体 Serratia marcescens KZ11 株 (カナマイシン耐性に修正) の log10 CFU を示すボックスプロット。腸は、14 日齢の成虫に OD600 = 1 の細菌懸濁液 5 μL を経口接種した 72 時間後にプレーティングした (n = 15/グループ)。, p < 0.05, Mann-Whitney Wilcoxon.
doi:10.1371/journal.pone.0286070.g007
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ディスカッション
本研究では、ミツバチに花粉の代用品を提供することで、たとえ天然の花粉源のマクロ栄養素プロファイルと同じになるように配合されたものであっても、ミツバチの腸内細菌叢の組成にわずかな変化が生じ、制御・発達遺伝子の発現と日和見病原体の抑制能力にはるかに大きな変化が生じたことが示された。
多くのシステムでの研究から、食事が腸内細菌叢の構成に大きな影響を与える可能性があり、特に、多様な植物性多糖類を含む食事は、より多様な腸内細菌叢を好むことが示されている [55] 。この効果は、哺乳類を宿主とする場合に最もよく立証されている。例えば、より多様な植物性飼料を与えたウッドラットは、より高い腸内細菌叢の多様性を示す[56]。また、ヒトのマイクロバイオームに関する多くの研究が、食物繊維を追加すると、コミュニティの多様性と抗炎症性代謝物の増加をもたらすことを示している[57]。本研究では、人工飼料に含まれる植物性多糖類の種類が少ないと予想され、有効種数や群集の分類学的均等性の低下によって評価されるように、微生物叢全体の多様性が低下する結果となった。驚くことではないが、花粉を与えたハチでは、実験飼料を与えたハチと比較して、花粉に関連する細菌種の絶対量が多いことが確認された。これらの結果は、ハチに与えるスクロース溶液にファイトケミカルを加えると、腸内コミュニティの多様性が高まるという知見と一致している [58] 。このようなファイトケミカルは花粉に含まれているが、私たちがハチに与えた人工飼料には含まれていない。
主な給餌実験では、マイクロバイオーム組成に関する結果は 2 つの施設間で多少異なっていた。個々の細菌分類群の存在量における食餌に関連した差異については、TAMU サイトのサンプルは UT サイトのサンプルよりも一般的に、花粉と人工飼料グループ間で大きな差異を示した。このようなサイトの違いは、両サイトのハチが異なる供給源から来たものであることから、初期の微生物叢組成の違い、環境の違いによる宿主の状態、または宿主の遺伝を反映していると考えられる。また、カリフォルニア大学での実験が 7 月に行われたのに対し、TAMU での実験は 10 月に行われたため、マイクロバイオームやハチの状態の季節変動も関係した可能性がある [59, 60] 。とはいえ、多くの観察結果はサイト間で一貫していた。
飼料が宿主の発育遺伝子発現に与える影響について、花粉を与えたハチは、人工飼料を与えたハチと比較して、腹部で Vg と JHE の発現が非常に高いことが示された。この効果は両地点で観察された。ビテロジェニンと幼若ホルモンはともに、社会性昆虫の行動を制御することが実証されている [13, 61]。通常のハチの発達では、生後 1 ~ 2 週間は Vg レベルが上昇し、その後 JH レベルが上昇し始めると減少する [17] 。このような変化は、巣に閉じこもった状態から採餌へと、働き蜂の発達の移行を促します。この発達の変化は消費データにも反映されており、ハチは時間の経過とともに食事の消費量が減少していくことが予想される。
興味深いことに、人工飼料を与えられたハチは、自然の花粉を与えられたハチと比較して、時間の経過とともにより多くの飼料を消費した。この観察にはいくつかの可能性がある。まず、人工飼料を与えられたハチは、花粉に含まれるが人工飼料では不足する他の栄養素の閾値を満たすために、食餌消費量を増やした可能性がある [7, 62] 。天然の花粉飼料を与えられたハチは、実験の早い段階でより多くの飼料を消費したため、最初の数日間で必要な栄養を十分に満たした可能性がある。逆に、ある栄養素が特定の閾値を超えないようにするために、ハチが消費を制限することもある。例えば、この研究で使用したアブラナ科の花粉には高濃度のカリウムが含まれている [34]。もうひとつの可能性は、花粉と人工飼料では消化率が異なるということである。ハチが人工飼料から摂取したタンパク質を消化する効果は、天然の花粉の半分程度にとどまる可能性があり [63, 64]、花粉と同様の閾値を満たすためには、より多くの人工飼料を摂取する必要がある。また、蒸発速度の違いにより、人工飼料は異なる速度で質量を失う可能性がある。この問題に対処するため、給餌と計量の前に給餌カップを周囲湿度に平衡させたが、蒸発量の差は依然として潜在的な問題である [33]。
ビテロジェニンをコードする Vg と幼若ホルモンエステラーゼをコードする JHE の両方が、花粉を与えられたハチにより多く発現された。ビテロジェニンは腹部の脂肪体で、JH は脳の後ろに位置するアラタ体部で産生されるが [65]、このホルモンは全身を循環して効果を発揮する [66] 。循環するJHのレベルを調節するJHEは、腹部の脂肪体に発現している[45, 67]。花粉を代用したハチにおける Vg の転写物の減少は以前から観察されていたが [8, 68, 69]、JHE の発現が同時に減少したことは新しい結果である。JH を直接測定していないため、JH 力価に対する食事の影響は不明だが、人工飼料を与えたハチ の JHE 転写物が大幅に減少したことから、食事が血球中の JH の循環レベルに下流から影響することが示唆さ れた。
アフリカ化ミツバチの血液リンパにおけるビテロジェニンと JH の力価を調べた以前の研究 [70] では、花粉代用食を与えた場合の方が、花粉食を与えた場合よりも JH レベルに影響がないことがわかった。しかし、この研究は成虫になってから6日目までの働き蜂を追跡したに過ぎず、JHレベルは通常、発生後15日目以降に増加する [17] 。発達中の働き蜂の食事に花粉が含まれていないことが、初飛行年齢、育児蜂の下咽頭腺サイズ、味覚反応、脂肪体代謝、血球形成 [71] 、または採餌行動 [17] に反映される、育児から採餌への移行時期を変えるかどうかはまだ明らかではない。
ビテロジェニンはまた、A. mellifera コロニー内の世代を超えた免疫プライミングのメカニズムにも関与している [72]。例えば、育児蜂は巣に関連する業務中に細菌性病原体にさらされ、その際、細菌の細胞成分の断片がビテロジェニンに付着する。これらの免疫複合体は女王蜂に与えられ、発育中の卵の免疫系はこれらのシグナルに対してプライミングされる。このように、ビテロジェニンが減少すると、個々の働き蜂だけでなく、コロニー全体が広範囲かつ長期的に免疫不全に陥る可能性があります。
我々の実験では、飼料中の花粉の割合が高くなると、頭部と腹部の両方でVgとJHEの発現が増加した。中核となる腸内細菌叢の存在がこのパターンに寄与しているかは不明である。以前の研究では、生後 7 日目における CV 型と MD 型のハチの間で Vg の転写レベルに大きな差があった [20] が、我々は CV 型と MD 型のハチの間で Vg レベルに有意差は見られなかった。しかし、我々の研究のハチは 14 日齢でアッセイされたため、[20] で観察された差は成虫の年齢とともに失われている可能性がある。さらに、未特性の糞便移植 (すなわち CV ハチ) による微生物の導入は、移植を受けた人を不注意に病原体にさらす可能性を含む、潜在的なばらつきをもたらす可能性があります。栄養については、制限的な栄養成分(例えば、特定のアミノ酸)を欠く人工飼料を使用すると、このホルモン(JH)またはリポタンパク質(Vg)の調節に干渉する可能性がある。スピルリナをプレバイオティクスとしてミツバチの飼料に使用することを検討した以前の研究 [73] では、ショ糖のみを与えたミツバチは花粉で飼育したミツバチよりも Vg のレベルがはるかに低いことが判明した。また、同じ研究では、市販の花粉代用品で育てたハチが、花粉を与えたハチと比較して Vg のレベルが高いことも判明しており、我々の結果とは異なっている。製品名は特定されていないため、花粉の代用品によって発生遺伝子の発現に与える影響が異なる可能性がある。
腸内細菌叢の存在も、インスリン受容体遺伝子の発現に影響を与えるようです。先行研究では、微生物群集の存在が、生後 7 日目に採取したハチの腹部におけるインスリン受容体遺伝子 AmInR1 と AmInR2 の転写を上昇させた [20] 。逆に、生後 14 日目にハチをサンプリングした私たちの研究では、微生物群集が明確なハチの腹部では、微生物相が欠損したハチと比較して、インスリン受容体遺伝子 AmInR1 と AmInR2 の転写レベルが低いことがわかりました (S9 図)。この違いは、InR1 と InR2 のレベルが高いことが頻繁に観察される、ハチが巣の中での作業から採餌に移行することと関係があるかもしれません [74] 。この観察は、標準的な微生物相を持たないハチが、通常よりも早く採餌の役割に移行することを示す可能性がある。また、最初の給餌実験では、人工飼料を与えたグループと比較して、花粉を与えたグループ (UT 部位で有意) で受容体遺伝子の転写レベルが低いことが観察された (S8 図)。これは、栄養によって影響を受ける発達スケジュールの乱れを反映していると考えられる。
日和見菌に対する感受性の実験から、人工飼料が宿主の免疫能力を阻害する可能性が示唆された。通常の腸内細菌叢を持つハチを用いた接種・回収実験では、日和見細菌病原体 Serratia marcescens の KZ11 株の生菌数が、病原体チャレンジから 3 日後に花粉を与えたハチから回収されたハチより少ないことを発見した。私たちの人工飼料は、使用したブラシカ花粉の全体的なタンパク質および脂質プロファイルと一致していますが、ブラシカ花粉には多様で複雑な脂質および脂肪酸が含まれており、病原性細菌の増殖抑制に寄与すると考えられます [75-77]。また、花粉粒の物理的な構造も、腸内病原菌の感染抑制に関与している可能性がある[78]。
興味深いことに、シングルコピー遺伝子メタバーコードで調査したGilliamella属とBifidobacterium属では、食事に起因する菌株構成の大きな変化は見られませんでした。さらに、AD群では、両分類群のα多様性が低下することが予想された。また、AD群ではペクチンの不足によりG. apicolaの生息数が減少し、ADA群では複合食材の添加により回復することが予想されました。シングルコピー遺伝子のデータを調べたところ、ADA群ではUTサイトのGilliamella total alphaの多様性が小さいながらも有意に低下していることが確認されたが(S3 Fig)、その他のシフトは明らかでなかった。2種のGilliamellaの絶対量のシフトは、特にTAMUサイトにおいて、使用可能な観察数(表1)が少ないために不明瞭であった可能性がある。
ミツバチの成虫の健康について、栄養と腸内細菌群集の個々の寄与を解析することは困難であるが、この 2 つは密接に関連している [63, 79, 80] ことを考えると。ミツバチの宿主によって利用・処理される栄養素の種類と量は、腸内微生物が利用できる基質を決定する [27, 81]。同様に、腸内細菌叢の代謝物が処理されると、宿主の健康に影響を及ぼす [19] 。食事の違いはハチの腸内細菌叢の変化と関連しており、成虫の蓄積脂肪レベルや宿主の体重に影響を与える [82] 。例えば、ハチの幼虫では、微生物を含まない花粉を与えると、コロニー化した花粉を与えた幼虫と比較して、平均体重が低くなる [83]。ハチに人工花粉の代用品または炭水化物のみを与えると、発達や免疫に関連する遺伝子の発現が変化することが示されている [68].同様に、細菌の組成や存在量の変化は、体重増加、発育ホルモンの発現 [20, 69]、免疫因子 [28, 29, 69]、病原体に対する抵抗性に影響を与えることが示されている [32, 37, 49, 69].栄養と微生物叢の相互作用による相加効果は、宿主の健康に影響を及ぼす可能性が高いが、この相互作用の効果については、まだ解明されていない。
予想外なことに、人工飼料にヘミセルロースとペクチン成分を添加しても、腸内細菌叢の組成や遺伝子発現に検出可能な影響はなかった。おそらく、人工飼料にこれらの成分を十分に添加しなかったために、微生物叢から反応が得られなかったのでしょう。逆に、添加した成分が、花粉の被膜の基質の複雑さを捉えるのに十分でなかったのかもしれない[84]。
花粉成分の不在によって微生物群集の組成が最小限の影響を受けるという発見は、予想外のものであった。花粉を与えたハチと人工飼料を与えたハチの間で中心的な系統が失われることはなかったが、総微生物多様 性は花粉飼料処理と比較して、2 つの人工飼料処理で顕著に低かった。この多様性の欠如のほとんどは、中核となる腸内細菌叢ではなく、巣やその他の環境に通常関連する非中核分類群によるものであった。一方または両方のサイトにおいて、全コミュニティの絶対サイズといくつかの系統(Bifidobacterium spp.やS. alviなど)が拡大したのは、おそらく人工飼料中の消化の良い成分が、後腸コンパートメントの細菌の基質になるくらい過剰に供給された結果である。これらの結果は、飼料中の脂質組成に関して微生物群集に大きな影響を与えることを示した先行研究 [82] と合わせて考えると、ミツバチのマイクロバイオームは、アミノ酸や脂質など食品の高分子組成の変化よりも、花粉のタンパク質やヘミセルロース成分の複雑さの変化に強いことがわかるかもしれない。確かに、花粉には、私たちの人工的な製剤に欠けている多くの成分がさらに含まれています。その中には、ポリフェノールやフラボノイドのような生物活性化合物も含まれており、抗菌作用や抗酸化作用によって細菌の多様性を調節する可能性があります[85-87]。このように、花粉の複雑な性質を非花粉成分でシミュレートすることは、とらえどころのない目標です。
結論として、我々の最も顕著な発見は、花粉代替物が発生遺伝子発現と感染に対する抵抗性に大きな影響を与えることであった。私たちの総合的な知見は、花粉をある程度の割合で含む巣箱を補う栄養戦略では、マイクロバイオームがより正常で強固になり、遺伝子発現と免疫プロファイルがより正常になることを示しています。さらに研究を進めることで、天然花粉を含まない食事がもたらす宿主関連の影響、例えば、働き蜂が巣内作業から採餌に移行するタイミングや、コロニーの健康維持に不可欠な遺伝子の発現への影響などが明らかになるかもしれません。
参考資料
S1 図:TAMUにおける食事タイプごとの一人当たりの平均食料消費量の経時変化。
POLの消費量は実験食に比べて有意に遅くなった(***p< 0.0001, ANOVA Repeated Measures Mixed Model Analysis)。データはS3 Tableに掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s001
(TIF)である。
S2 図:TAMUにおける食事グループ別の累積消費量。
POLグループのハチの消費量は他の2グループのハチよりも少なく、ADグループのハチよりも有意に少なかった。*p < 0.05, Kruskal-Wallis に続く独立標本に対する Tukey 分布近似を用いた Tukey and Kramer (Nemenyi) テストを用いたポストホックペアワイズ比較。データはS3 Tableに掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s002
(TIF)である。
S3 図:TAMU のハチについて、食餌タイプ別の経時的な死亡率。
すべてのグループが 93% 以上の生存率を示し、Cox 比例ハザード検定に基づくと、生存率が有意に向上または低下したものはなかった。データは S4 表に掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s003
(TIF)である。
S4 図:花粉(POL)と人工飼料(AD)または添加物入り人工飼料(ADA)が、非定型的な環境細菌(ASVs)の絶対量に及ぼす影響(「その他」としてビン分け)。
TAMU(A)およびUT(B)のハチの腸から。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Kruskal-Wallisに続く独立サンプルのTukey分布近似によるTukey and Kramer (Nemenyi) testを用いたポストホックペアワイズコンパレンス。データはS1 Tableに掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s004
(TIF)である。
S5 図:TAMU および UT のハチの腸から採取した細菌系統の絶対量に対する花粉(POL)対人工飼料(AD)または 添加物入り人工飼料(ADA)の影響。
(A-B) Bombella apis, (C-D) Bombilactobacillus spp., (E-F) Lactobacillus melliventris, (G-H) Bifidobacterium spp., (I-J) Snodgrassella alvi. p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Kruskal-Wallis 後独立サンプルの Tukey distribution approximation による Tukey and Kramer (Nemenyi) test でポストホック二種比較した。データはS1 Tableに掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s005
(TIF)に示す。
S6 図:TAMU および UT におけるハチの腸内の Gillliamella 個体数に対する花粉 (POL) 対人工飼料 (AD) または添加物入り人工飼料 (ADA) の影響。
TAMU (A) と UT (B) で採取したハチの腸内の 16S rRNA 遺伝子アンプリコンに基づく、関連するすべてのギリアメラ ASV の絶対量。TAMU (C) と UT (D) で採取した単一遺伝子 (rimM) コピーアンプリコンに基づき、有効種数 (ESN) として測定した Gilliamella 菌株のアルファ多様性。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, Kruskal-Wallisに続く独立サンプルのTukey分布近似によるTukey and Kramer (Nemenyi) testを用いたポストホックペアワイズ比較.データはS1 Tableに掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s006
(TIF)である。
S7 図:ビフィズス菌のα多様性に及ぼす花粉(POL)対人工飼料(AD)または添加物入り人工飼料(ADA)の影響。
ESNは、TAMUサイト(A)とUTサイト(B)のハチの腸からサンプリングしたシングルコピー遺伝子groELのASVを用いて評価した。食事グループ間で有意差は認められなかった。データはS1 Tableに記載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s007
(TIF)である。
S8 図:生後14日目の働き蜂の頭部および腹部におけるインスリン受容体遺伝子inR1およびinR2(参照遺伝子RPS5aに対する)の遺伝子発現に対する従来の腸内細菌叢の存在または不在の影響。
ミツバチは花粉を食べて育てた(n = 7 サンプル/条件/組織)。DC=培養分離株の定義されたコミュニティを与えられたハチ、MD=ブルードセルから一晩浮上させたが腸内細菌叢を接種しなかった微生物叢欠損のハチである。(A)ハチの頭部と(B)腹部における inR1 の相対的発現。(C)ハチの頭部と(D)腹部におけるinR2の相対的発現。(Mann-Whitney Wilcoxon. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). データはS5 Tableに掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s008
(TIF)である。
S9 図:TAMU および UT のハチの腹部における参照遺伝子 RPS5a に対するインスリン受容体遺伝子の発現に対する花粉 (POL) 対人工飼料 (AD) または添加物入り人工飼料 (ADA) の影響。
(A-B) inR1遺伝子の相対的mRNA発現量。(C-D) inR2 の相対的 mRNA 発現。n = 各サイトの条件ごとに 2 カップから 7 匹のハチ。対照群と処理群の間の差は、Kruskal-Wallisに続き、独立標本に対するTukey分布近似を用いたTukey and Kramer (Nemenyi) テストによるポストホック一対比較で検証した。データはS1 Tableに掲載。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s009
(TIF)
S1ファイル。補足資料と方法。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s010
(DOCX)
S2ファイル。統計検定結果のまとめ。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s011
(TXT)
S1 表。2サイト食実験データ。
この表には、サンプルに関連するメタデータ、細菌系統の絶対量データ、アルファ多様性メトリクス、シングルコピー遺伝子データ、遺伝子発現データが含まれる。このテーブルのデータは、以下の図に関連する: 図2-4, S4-S7, S9 Figs)。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s012
(XLSX)
S2表。プライマーとPCRプロトコルのリスト。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s013
(XLSX)
S3表。TAMUの消費データ。
この表のデータは、S1およびS2 Figsに関連しています。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s014
(XLSX)
S4表。TAMUの死亡率データ。
この表のデータは、S3 Fig.に関連するものです。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s015
(XLSX)を参照してください。
S5 表。in vivo ± BGM実験による相対的遺伝子発現データ。
この表のデータは、Fig.6とS8 Fig.に関連しています。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s016
(XLSX)
S6 表。花粉混入率実験による相対的な遺伝子発現データ。
この表のデータは、Fig.5に関連するものである。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s017
(XLSX)
S7 表。感染したハチの腸から回収したSerratia marcescens KZ11株(KAN+)のCFU。
この表のデータは図7に関連するものである。
doi:10.1371/journal.pone.0286070.s018
(XLSX)
謝辞
Kim HammondとMisha Dawnには図案の作成に、Howard Ochmanには統計処理にご協力いただいたことに感謝したい。
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