宇宙飛行士の健康のバイオマーカーとなりうる無細胞ミトコンドリアDNAの発見

2023年4月24日 13:40

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/JAHA.121.022055

マリク・ビセリエ
,
サンタナム・シャンムガプリーヤ
,
アミット・クマール・ライ
,
カロリーナ・ゴンザレス
,
アグニェシュカ・ブロヤコウスカ
,
ヴェンカタ・ナーガ・スリカンス・ガリキパティ
,
ムニスワミ・マデシュ
,
ポール・J・ミルズ
,
ケネス・ウォルシュ
,
アルセン・アラケリャン
,
ラジ・キショール
,
ラフアリア・ハドリ
と
デビッド・A・グーカシオン
Originally published20 Oct 2021https://doi.org/10.1161/JAHA.121.022055Journal of the American Heart Association. 2021;10:e022055
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アブストラクト
背景
国際宇宙ステーションでの短期・長期滞在を終えた宇宙飛行士には、微小重力や放射線被曝などの宇宙旅行に関連したストレス要因が報告されています。リスク軽減のための戦略にもかかわらず、健康への悪影響は依然として懸念されている。そのため、生理的ストレスの早期発見を可能にする新しい診断ツールの開発が求められている。
方法と結果
14名の宇宙飛行士を対象に、打ち上げ10日前、着陸当日、帰還3日後の血漿中の遊離細胞ミトコンドリアDNA濃度を測定した。その結果、着陸当日と帰還3日後の血漿中の無細胞ミトコンドリアDNAは、宇宙飛行士間で2～355倍もの大きなばらつきがあり、有意に増加することがわかった。また、末梢血単核細胞の遺伝子発現解析では、炎症、酸化ストレス、DNA損傷のマーカーが有意に増加した。
結論
本研究は、無細胞ミトコンドリア DNA 量が、宇宙飛行中の微小重力、放射線、その他の環境要因に関連するストレスや免疫反応のバイオマーカーになる可能性を示唆している。
1960年代初頭の地球低軌道への最初の有人宇宙飛行から、現在の国際宇宙ステーションでの長期ミッションに至るまで、様々な健康への悪影響が報告されています1。これらの悪影響には、体液の再分布、筋肉の萎縮、免疫反応の低下、マイクロバイオームの変化、神経前庭障害、有害な心血管イベントなどがありますがこれだけに限りません2。アポロ宇宙飛行士は、非飛行宇宙飛行士や地球低軌道宇宙飛行士と比較して、心血管機能障害に関連した高い罹患率/死亡率を示したことから、これらの影響は、将来の探査型宇宙ミッションにおいて著しく増加する可能性があります3 月と火星のミッションでは、健康への悪影響の頻度と深刻さは、離陸時と着陸時にそれぞれ地球の重力の約16％と約37％を再び受けることになり、増加すると考えられます。したがって、深宇宙探査では健康への悪影響のリスクが高く、新しい予測バイオマーカーを含む効果的でタイムリーな診断戦略を開発する必要がある。
深宇宙探査に関連するストレス要因（放射線、微小重力など）は、細胞の完全性を損傷し、細胞内コンテンツを細胞外環境に放出する可能性があります。この内容物は、損傷関連分子パターンまたはアラームインと呼ばれるストレスシグナルとして作用することがある4。損傷関連分子パターンには、DNA、高移動度グループボックス1、および様々な疾患に関与する熱ショックタンパク質が含まれている4。損傷関連分子パターンの発生源は、核、細胞膜、細胞内タンパク質の成分ですが、ミトコンドリアも機能不全に陥り、活性酸素の産生を促進することがあります5。様々なミトコンドリア損傷関連分子パターンのうち、ミトコンドリアDNA（mtDNA）は細胞外に存在し、短いDNA断片として循環したり小胞に包まれたりしています6。実際、米国航空宇宙局（National Aeronautics and Space Administration）の双子研究では、cf-mtDNAが長期間の宇宙飛行と相関していることが報告されています10。地上での双子と比較して、飛行中にミトコンドリア遺伝子の発現が増加し、酸化ストレスの2つの尿中マーカー（8-ヒドロキシ-2′-デオキシグアノシン［8-OHdG］および血小板由来成長因子2-α）が増加することが確認されました11。
本報告では、この解析を、5日から13日の比較的短いミッションに参加した14人の宇宙飛行士に拡大し、(1)すべての宇宙飛行士の血漿中のcf-mtDNAが帰還日（R-0）に著しく増加し、帰還3日後（R+3）も増加することを明らかにした； (2) cf-mtDNAの増加は、宇宙飛行士間で2倍から355倍という大きなばらつきがあり、宇宙飛行士の細胞ストレスに対する個人の感受性について、レトロスペクティブおよびプロスペクティブな研究が必要であることを意味している； (3) cf-mtDNAのミトコンドリアからの放出は、炎症、酸化ストレス、DNA損傷に関連する複数の経路の活性化と関連している。 (4) 宇宙飛行士から遡及的に（20年以上）収集した多数の血液サンプル（血漿および細胞）をさらなる解析に用いることの有用性を示すものである。
方法
この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。本研究は、米国航空宇宙局およびIcahn School of Medicine at Mount SinaiのInstitutional Review Board（それぞれMOD00001074およびHSM19-00367）により承認されている。すべての研究参加者は、サンプル採取時に書面によるインフォームドコンセントを行った。
1998年から2001年にかけて、国際宇宙ステーションの短期ミッション（～5～13日間）に参加した14人の宇宙飛行士の血漿中のcf-mtDNA濃度を測定しました。血液は3つの異なる時点で採取されました： mtDNAと核DNAの量は、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により測定した。核DNAの正規化には、ヒトβ-グロビンプライマーを使用した。
また、各時点の3人の宇宙飛行士の血漿から、ExoQuick法を用いて細胞外小胞（EV）を分離した。EVは、ナノ粒子追跡分析（Nanosight）によって特徴づけられた。EVの集団はさらにExo-Check Exosome Antibody Arrayを用いて検証し、EV-mtDNAはミトコンドリアがコードするチトクロームC酸化酵素I（MT-CO1）とミトコンドリアがコードするチトクロームC酸化酵素III（MT-CO3）の特異プライマーによるqPCRにより評価した。精製したエクソソームRNAをsmall RNA sequencingで解析した。
さらに、L-10、R-0、R+3の6人の宇宙飛行士の末梢血単核細胞（PBMC）から全RNAを分離し、炎症、酸化ストレス、DNA損傷マーカーをコードする遺伝子の発現を測定した。さらに、DNA/RNA酸化損傷のマーカーとして3種類の酸化グアニン種を検出できる高感度DNA/RNA酸化損傷ELISAキット（Cayman Chemical）を用いて8-OHdGレベルを測定し、DNA/RNA酸化損傷を解析した。このキットでは、DNA由来の8-ヒドロキシ-2′-デオキシグアノシン（8-OHdG）とRNA由来の8-ヒドロキシグアノシン、DNAとRNAどちらからでも酸化8-ヒドロキシグアニンの検出ができる。このアッセイは、30 pg/mLという高い感度を有しています。分析は、L-10、R-0、R+3の宇宙飛行士のPBMCを使用して実施した。データS1の拡張された方法論を参照。
結果および考察
無細胞核DNAに対するcf-mtDNA画分を分析したところ、R+3でcf-mtDNAが有意に増加し、飛行後の両サンプルで大きな変動があった（図1Aおよび1D）。この宇宙飛行士間のばらつきを考慮して、各宇宙飛行士について、L-10での値に対するR-0とR+3のcf-mtDNAの個々の増加倍率を計算しました。その結果、飛行後のサンプルにおけるcf-mtDNAの増加は、飛行前のレベルと比較して2倍から355倍であることがわかった（図1B、1C、1E、および1F）。
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図1. 宇宙飛行後、14人の宇宙飛行士の血漿中のcf-mtDNA量が増加した。Caption
ほとんどの細胞は様々なEVを分泌し、細胞間でタンパク質や核酸を運ぶことでコミュニケーションビークルとして機能する。さらに、EVの含有量は、ストレス下でのmtDNAの濃縮の有無を明らかにする可能性がある。そこで、3人の宇宙飛行士の血漿から3つの異なる時点（L-10、R-0、R+3）でEVを分離し、mtDNAの濃縮度を定量化しました。ナノサイトによる粒子径と濃度の分析により、EVの分離が確認された（図2A）。さらに、エクソソーム特異的抗体アレイを用いてタンパク質マーカーの存在を検出することで、EVの特徴を明らかにした（図2Bおよび図2C）。GM130コントロールは、エクソソーム調製物における細胞汚染が限られており、バックグラウンド以上のシグナルしか示さなかった。次に、EVからmt-DNAを分離し、qPCRによってMT-CO1およびMT-CO3の存在量を定量化した。
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図2. EV中のmt-DNAとmt-RNAの存在量の解析。Caption
MT-CO1は検出されなかったが、MT-CO3レベルは飛行後の両時点で、これら3人の宇宙飛行士に有意な変化はなかった（図2）。以上のことから、mt-DNA（MT-CO1およびMT-CO3）レベルは、EV-mtDNAではなく、血漿中のcf-mtDNAとしてのみ増加することが示唆されました。さらに、各時点で同じ宇宙飛行士を対象に、宇宙飛行に関連するトランスクリプトームの変化をsmall RNA sequencingで評価しました。RNAシーケンスのデータセットを解析した結果、R-0とR+3でmtDNA量が減少したことが示唆され（図2E）、さらに宇宙飛行士間での遺伝子発現パターンの変化が確認された（図2F）。MT-CO1およびMT-CO3 mtRNA発現の転写レベルは、有意に変化しなかった（図2G）。検出可能なすべてのmtDNAコード化遺伝子の発現は、表S1に示す。
これまでの研究で、ミトコンドリアからのmtDNA放出は、炎症、酸化ストレス、DNA損傷に関連する複数の経路を誘発することが示されている12。そこで、これらの経路に関連する様々なマーカーの転写レベルを分析した（図3）。その結果、R+3日でTNF-α、IL-1α、IL-1βの遺伝子発現レベルが有意に上昇することがわかった（図3A）。統計的には有意ではなかったが、IL-6のmRNA発現量はR+3日で上昇傾向を示し、IL-8はR-0では有意に上昇したがR+3日では上昇しなかった（図3A)。酸化ストレス遺伝子であるSOD1とGPX1は飛行後の両時点で有意に上昇したが、APOEはR-0とR+3で有意に下降した。注目すべきは、APOE欠損は酸化ストレスを促進し、脳組織における抗酸化酵素の代償的増加をもたらすことが報告されていることである13HMOX1転写レベルは、R-0で有意に減少し、R+3で有意に増加した（図3B）。SOD2、NOS2、PRDX3はR-0でのみ有意に上昇し、NOX4、SERPINE1、DUOX1のレベルはR+3でのみ有意に上昇した（図3B）。CAT1 mRNAの発現は、R+3と比較してR-0で有意に増加した。DNA損傷遺伝子OGG1は飛行後の両時点で有意に発現が上昇したが、GADD45aおよびPARP1はR+3日においてのみ有意に発現が上昇した（図3C）。しかし、GADD153とDNA-PKのmRNAレベルは、R+3で上昇傾向を示すのみであった。
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図3. 宇宙飛行士6名のPBMCにおけるストレスマーカーの転写レベルCaption
PBMCのDNA/RNA酸化損傷を直接測定したところ、R-0およびR+3において8-OHdGレベルが有意に上昇し（図3D）、飛行後にDNA/RNA酸化損傷が増加することが示唆されました。これらの結果は、酸化ストレス酵素の遺伝子発現プロファイルと一致し、宇宙飛行士のPBMCにおいて、宇宙飛行後に酸化ストレスが増加することをさらに裏付けるものである。宇宙飛行士間のばらつきを考慮し、PBMCが入手できた3人の宇宙飛行士のcf-mtDNAとmRNA転写物レベルとの関連も調べた（図S1）。その結果、飛行後のIL-1α、IL-1β、TNFα、OGG1のレベルは、3人の宇宙飛行士すべてにおいて、cf-mtDNAと同様の上昇傾向を示した（図S1、薄い緑の網掛け）。さらに、これら3人の宇宙飛行士のうち2人は、飛行後の時点の少なくとも1つにおいて、IL-6、IL-8、SOD1、SOD2、GPX1、NOX4、GADD45、CAT1、DNA-PK、およびPARP1のレベルが上昇していた（図S1、濃淡水色）。GADD153は、3つの時点すべてで変化がなかった。
ミトコンドリア機能障害は、拡張型心筋症や心不全の発症と進行に強く関連している14。ここでは、比較的短いミッションで飛行した14人の宇宙飛行士において、血漿中のcf-mtDNAが上昇したことを報告する。着陸時にcf-mtDNAレベルが上昇しただけでなく、着陸3日後にもレベルが上昇し続けた。このデータは、cf-mtDNAが、宇宙旅行に関連したミトコンドリア機能障害の検出とフォローアップのための予後バイオマーカーとして機能する可能性を示唆している。この上昇がどの程度継続するかは、さらなる評価が必要である。また、これまでの報告と同様に、宇宙旅行は抗酸化酵素、DNA損傷マーカー、炎症反応の発現の上昇と関連していることが示された。このように、mtDNAの放出はストレス応答を増強する可能性があるが、因果関係を定義するにはさらなる研究が必要である。特に、これらの測定値は、DNA損傷、免疫反応、RNA制御の変化を示し、アポトーシスや壊死を起こした細胞の起源を明らかにする生来の能力を持つ可能性がある。
本研究では、遺伝子発現プロファイルが個々のクルーによって若干異なるという制約がある。これは、このようなサンプルを入手できるのが例外的にまれであったため、研究規模が小さかったことが一因であると考えられる。さらに、乗組員のおおよその年齢はほぼ同じであったが、宇宙飛行期間には異質なものがあったことが指摘されている。これは、サンプル数が少ないことと、宇宙飛行を経験していない年齢を一致させた宇宙飛行士を入手できなかったため、適切な対照が得られなかったことに起因すると思われます。さらに、利用できる血漿の量が少ないため、EVはExoQuick法を用いてのみ単離することができた。しかし、EVの分離方法は、収率や純度が異なる。例えば、超遠心分離法は、より高い純度でエクソソームを分離するために最も広く使用されているが、より多くのサンプル投入が必要である。10 したがって、EV中のmtDNA/RNA量をさらに評価するために、高純度の分離方法を使用した今後の研究を検討する必要がある。最後に、cf-mtDNAは、1998年から2001年にかけて国際宇宙ステーションの短期ミッション（～5～13日間）に参加した宇宙飛行士の血漿から分離され、これらのサンプルは非特定化されていることに言及する価値がある。そのため、これらの宇宙飛行士の心血管系機能に関する臨床データから、飛行後の短期的な相関の可能性を推定することはできず、さらに重要なことは、長期の追跡調査もできないことである。したがって、宇宙放射線や微小重力などの宇宙環境の複数のストレス要因を実験的に再現する制御された環境を用いて、有害な健康リスクに対するcf-mtDNAの役割をよりよく理解するための機能研究を追加することができるだろう。
資金提供元
本研究は、Translational Research Institute for Space Health award FIP0005（Goukassian博士へ）、National Aeronautics and Space Administration grant 80NSSC21K0549（Goukassian博士とWalsh博士へ）、American Heart Association Career Development Award 18CDA34110277、Ohio State University Medical Centerからのスタートアップ資金（Garikipati博士へ）の支援を受けました、 National Institutes of Health grant R01 HL133554 and American Heart Association 18IPA34170321 (to Dr Hadri), National Institutes of Health 5T32HL007824-22, and the Cardiovascular Medical Research and Education Fund (to Dr. Hadri and Bisserier).
開示事項
なし。
謝辞
RNA シーケンスとデータ解析に協力してくれた Sankar Addya 博士（Kimmel Cancer Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA）と Siras Hakobyan 博士（Group of Bioinformatics, Institute of Molecular Biology NAS RA）に感謝いたします。
著者の貢献 Bisserier博士、Garikipati博士、Shanmughapriya博士、Mills博士、Goukassian博士は研究を設計し、Bisserier博士、Shanmughapriya博士、Rai博士、Garikipati博士、Mills博士、Brojakowska博士、Gonzalez博士は実験を行い、Garikipati博士、Shanmughapriya博士、Bisserier博士、Rai博士、Arakelyan博士、Goukassian博士はデータの分析を行いました； Garikipati、Shanmughapriya、Bisserier、Mills、Madesh、Walsh、Kishore、Hadri、Goukassian、およびBrojakowska博士は記事を書き、Goukassian博士はプロジェクトの管理および資金調達を行った。また、Goukassian博士はプロジェクトの管理および資金調達を行った。
脚注

通信欄 David A. Goukassian, MD, PhD, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, One Gustave L. Levy Place, Box 1030, New York, NY 10029. 電子メール： david.goukassian@mssm.edu
*M. BisserierとS. Shanmughapriyaは同等に貢献し、共同筆頭著者である。
本論文の補足資料は、https://www.ahajournals.org/doi/suppl/10.1161/JAHA.121.022055 でご覧いただけます。
資金源と開示事項については、7ページをご覧ください。
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