宿主細胞の転写を標的とするToxoplasma gondiiエフェクタータンパク質のハイスループット同定

メインコンテンツへスキップ
広告

細胞宿主微生物
ログイン

検索...

リソース|第31巻、第10号、P1748-1762.e8、2023年10月11日

全号ダウンロード
宿主細胞の転写を標的とするToxoplasma gondiiエフェクタータンパク質のハイスループット同定

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(23)00370-0

サイモン・バターワース
クリスティナ・コルドバ
サンバマーシー・チャンドラセカラン
ロバート・ゴールドストーン
アニタ・A・コーシー
モリッツ・トレック 7
すべての著者を表示する

脚注を表示オープンアクセスDOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.09.003

ハイライト

宿主と病原体の二重単一細胞トランスクリプトームリードアウトによるプールCRISPRスクリーニング

宿主の転写を標的とするToxoplasma gondiiエフェクタータンパク質の同定

TgGRA59は緻密顆粒エフェクターの宿主細胞への輸送に寄与する

TgSOS1は持続的な宿主STAT6シグナル伝達に必要である。
まとめ
細胞内病原体や他の内部共生体は、免疫応答を抑制し、生合成経路を再調整するために、宿主細胞の転写を再プログラムする。この再プログラミングは、感染やコロニー形成の結果を決定する上で重要である。このような転写相互作用の分子メディエーターを同定するために、プールされたCRISPRノックアウト・スクリーニングと、宿主と微生物の二重単一細胞RNA配列決定（dual perturb-seqと呼ぶ）を組み合わせた。細胞内病原体Toxoplasma gondiiにdual perturb-seqを適用することで、これまで同定されていなかったエフェクタータンパク質を同定し、トランスクリプトームデータからその機能を直接推測することができた。TgGRA59が寄生虫から宿主細胞への他のエフェクタータンパク質の輸送に寄与していることを示し、宿主のSTAT6シグナル伝達の持続に必要なエフェクターであるTgSOS1を同定し、それによって寄生虫の免疫回避と持続に寄与していることを明らかにした。この研究成果は、宿主と微生物の転写相互作用を解明し、感染と免疫回避のメカニズムを明らかにするために広く応用できるツールであることを示している。
図解抄録
図サムネイルfx1
大きな画像を見るダウンロード 高解像度画像
キーワード
宿主-病原体相互作用
perturb-seq法
シングルセルRNAシーケンス
CRISPRスクリーニング
トキソプラズマ・ゴンディ
エフェクタータンパク質
STAT6
免疫回避
宿主-微生物相互作用
はじめに
ある生物が他の生物の細胞内に存在する現象である「内部共生」は、生命のあらゆる領域に広がっており、相互に有益なものから病原性のあるものまで様々である1。内部共生の確立には一般的に、免疫応答をダウンレギュレートし、内部共生にとって好ましい環境を維持するために、宿主細胞の転写リプログラミングが関与する2。
単細胞の真核寄生生物であるトキソプラズマ・ゴンディは、宿主細胞の転写を標的とするエフェクタータンパク質の同定数と、この再プログラミングの幅の両面で傑出している。細菌のエフェクターが分子分泌系を通じて細胞質から排出されるのに対し、トキソプラズマ・ゴンディは2種類の分泌器官、ロプトリーと濃密顆粒から宿主細胞内にエフェクタータンパク質を送り込む。ロプトリータンパク質は、寄生虫が宿主細胞に侵入する際に宿主細胞質に直接注入される。濃顆粒タンパク質は、宿主細胞への侵入後、T. gondiiが存在する寄生体液胞に分泌される。これらのタンパク質のほとんどは、細胞内寄生虫のApicomplexa門またはそのサブグループにのみ見られる新規オルソログ群である。そのため、T. gondiが宿主細胞内で誘導する転写応答と特定のエフェクタータンパク質との関連付けは非常に困難である。さらに、T. gondiiにおける既存の競合増殖ベースのプールノックアウト・スクリーニングでは、寄生虫の病原性において重要な役割を担っているにもかかわらず、宿主細胞の転写を標的とすることが知られているエフェクタータンパク質を同定することができなかったことから、別の方法論が必要であることが示されている7,8,9,10。
ここでは、細胞内病原体の遺伝子ノックアウトが感染宿主細胞に与える影響を測定するために、プールされたCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニングと単一細胞トランスクリプトーム読み出しの方法を適応させ、dual perturb-seqと名付けた。我々は、mRNAとsgRNAの両方を直接捕捉できるプラスミドベクターを用いて、この方法をT. gondiiで実証した。遺伝的に摂動された寄生虫に感染した宿主細胞のシングルセル・トランスクリプトーム・プロファイルは、バルクRNAシーケンス＝確立されたエフェクター・タンパク質の表現型を正確に再現した。T.gondiiのセクレトームによる宿主細胞のリプログラミングをシステムレベルで捉えるために、分泌されるロプトリータンパク質と濃顆粒タンパク質をコードする256の寄生虫遺伝子を標的とした1,000を超えるsgRNAのライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングにより、宿主細胞の転写を調節する既知のエフェクタータンパク質がすべて同定され、さらなるエフェクター候補も同定された。このような2つのエフェクターについてperturb-seqによる二重表現型を検証し、GRA59が濃顆粒エフェクターの宿主細胞への輸送に寄与していること、および未知のエフェクターであるSOS1が持続的なSTAT6シグナル伝達と感染細胞のM2極性化に必須であることを示した。
研究結果
T. gondii用直接捕捉perturb-seqベクターの最適化
シングルセルCRISPRスクリーニング法では、各細胞に摂動IDを割り当てるためにsgRNAプロトスペーサー配列を同定する必要がある。直接捕捉perturb-seqでは、「捕捉配列」を挿入することで、液滴ベースの細胞分割と分子バーコードに続いて、ポリアデニル化mRNAトランスクリプトームに加えて、sgRNA転写産物の直接シーケンスが可能になります11。
T.gondiiにおける直接捕捉perturb-seqを可能にするため、既存のCas9-sgRNAプラスミドベクター7を改変し、2つの有効なsgRNA-捕捉配列構成、CS1およびCS211のいずれかを導入した（図1A）。これらのベクターをエレクトロポレーションによって T. gondii にトランスフェクションした後、毒性ヌクレオシドアナログである 5-フルオロデオキシウリジン12に対するノックアウト誘導耐性を測定したところ、いずれの sgRNA でも非必須 T. gondii UPRT 遺伝子のノックアウト効率に未修飾 sgRNA との有意差は認められなかった（図 1B）。sgRNA-CS2はsgRNA-CS1よりも平均ノックアウト効率が高かったため、最初の検証実験にはこの構成を用いた。
図サムネイルgr1
図1デュアルperturb-seq転写プロファイルは既知のT. gondiiエフェクターの表現型を再現する
キャプション
大きな画像を見るダウンロード 高解像度画像
しかし、この研究の一環として行ったすべての実験において、sgRNA-CS1の捕捉率は、いずれかのsgRNAが検出された細胞の割合（図1C）および検出されたsgRNAユニーク分子識別子（UMI）の数（図1D）の点で、sgRNA-CS2よりも有意に優れていることがわかりました。したがって、後の実験では、sgRNA-CS1を用いて、同定可能なノックアウトを持つ回収細胞数を最大にした。
デュアルperturb-seq転写プロファイルは既知のT. gondiiエフェクターの表現型を再現する
perturb-seqはこれまで哺乳類以外の系では試みられていなかったので、T. gondii変異体に感染した宿主細胞のperturb-seq転写プロファイルを二重に検証するために2つの実験を行った。まず、ネガティブコントロールとしてT. gondii UPRT遺伝子を、ポジティブコントロールとしてMYR1遺伝子を標的とした。MYR1は濃顆粒エフェクターの宿主細胞内への輸送に必須であり、MYR1をノックアウトするとT. gondii15,16によって誘導される宿主細胞の転写変化の大部分が消失することが示されている（図1E）。T. gondii RHΔHXGPRT寄生虫をUPRTまたはMYR1のいずれかを標的とするperturb-seqプラスミドベクターでトランスフェクトし、ヒト包皮線維芽細胞（HFFs）に0.1の感染多重度（MOI）で24時間感染させた（図1F）。感染細胞を細胞内寄生体のCas9-GFP発現に基づいて選別し、10x Genomics Chromiumプラットフォームを用いたシングルセルRNA-seq（scRNA-seq）のためにプールした。
シーケンスリードは、H. sapiensとT. gondiiの2つのリファレンスにアライメントし、単一のsgRNA種が検出された感染細胞のみを保持するように細胞バーコードをフィルターした（図S1およびS2A）。これらの単一細胞トランスクリプトームを、宿主細胞遺伝子発現のみを用いた一様多様体近似投影法（UMAP）により検査したところ、MYR1標的sgRNAを発現する細胞はUPRT標的sgRNAを発現する細胞とは異なるクラスターを形成していることが観察され、細胞内寄生体におけるこれらの遺伝子のノックアウトにより、宿主細胞における転写プロファイルが異なることが示された（図1G）。1,234 個の宿主細胞遺伝子が、MYR1 標的 sgRNA と UPRT 標的 sgRNA を発現させた細胞間で 0.5 を超える対数 2 倍の変化を示し、MYR116 に依存することが以前に示された多くの遺伝子を含む、有意に異なる発現を示しました（図 1G および S2B、表 S1A）。
それぞれの感染宿主細胞において、同期している細胞内寄生虫のトランスクリプトームを解析することもできた。T.gondii遺伝子の発現を用いてUMAPで細胞を投影すると、トランスクリプトームは寄生虫の細胞周期を再現する円形構造に分解されることがわかった（図1H）。MYR1 標的 sgRNA と UPRT 標的 sgRNA を発現する細胞間で発現が異なる T. gondii 遺伝子はごくわずかであり、これらの遺伝子をノックアウトしても、寄生虫のトランスクリプトームに広範な変化は生じないことが示された（図 S2C; 表 S1B）。
T.gondiiエフェクタータンパク質を同定するためのこの二重perturb-seqアプローチをさらに検証するために、宿主細胞の転写に影響を与えることが示されている12種類のエフェクタータンパク質と、宿主細胞のトランスクリプトームが解析されていない10種類のロプトリータンパク質および濃顆粒タンパク質を標的とする22種類のベクターのパネルを作製した。私たちはT. gondii RHΔHXGPRTを22の新しいベクターとMYR1およびUPRT標的ベクターで別々にトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントを単一の混合集団にプールした。この寄生体プールを用いてHFFを24時間感染させ、その後感染細胞を蛍光活性化セルソーティング（FACS）により濃縮し、前回と同様にscRNA-seqを行った（図1I）。各sgRNAについて10～72個の単一細胞トランスクリプトームを回収した（図S1D）。異なるsgRNAを発現している細胞は、宿主遺伝子発現のUMAPにおいて異なるクラスターに分離しなかったが、異なるsgRNAは大きなメインクラスターの異なる領域に濃縮された（図S2EおよびS2F）。
この実験に用いた強毒性I型T. gondii RH株で検証された10種類のエフェクタータンパク質のうち、7種類で発現が異なる宿主遺伝子を同定した： MYR1、16 HCE1/TEEGR、17,18 IST、19,20 GRA16、21 GRA24、22 GRA28,23,24およびROP1625である（図1J；表S2）。各エフェクターで差次的に発現した遺伝子の数は比較的少なく、標的ごとに回収されたトランスクリプトームが100個未満であると統計的検出力が低下すること、また遺伝子レベルではなくパスウェイレベルの解析がより適している可能性があることを示している。エフェクターGRA6,26、GRA7,27、またはROP18で有意に差次的に発現された遺伝子は見つからなかった28。これらは最も少ない単一細胞トランスクリプトームを回収した遺伝子の一つであるため、統計的検出力が低い。予想通り、II型T. gondii株特異的エフェクターであるGRA15,29やGRA1830、GRA25で発現が異なる宿主遺伝子はなかった31。この実験に含まれる未特性遺伝子のうち、発現が異なる宿主遺伝子を同定したのはGRA59のみであった。
T. gondiiノックアウト株に感染した宿主細胞と野生型に感染した宿主細胞のトランスクリプトームデータセットは、差次的に発現した遺伝子を同定できる7つのタイプIエフェクターについては利用可能であるが、GRA6、GRA7、ROP18については利用できない（STAR Methods参照）。この二重perturb-seq実験から得られた宿主細胞の表現型がこれらのデータセットと一致しているかどうかを調べるために、VISIONパッケージを用いて、これらの先行研究で同定されたマーカー遺伝子の発現について単一細胞のトランスクリプトームをスコア化した32。これら7つのエフェクター（MYR1、HCE1、IST、GRA16、GRA24、GRA28、およびROP16）のそれぞれを標的とするsgRNAを発現する細胞は、sg（UPRT）発現細胞と比較して、同族バルクトランスクリプトームシグネチャーのスコアが有意に高かった（図1K）。このように、デュアルperturb-seqは、異なるT. gondiiノックアウトプールに感染した宿主細胞の表現型をデコンボリューションすることができ、その結果得られたトランスクリプトームプロファイルは、利用可能なすべての先行データセットと一致することが示された。
デュアルperturb-seqスクリーニングによる宿主細胞の転写を変化させるT. gondii遺伝子の同定
デュアルperturb-seqワークフローを検証した後、宿主細胞の転写を標的とするすべてのT. gondiiエフェクターを同定するためにノックアウトスクリーニングをセットアップした。空間プロテオミクスデータ6とコミュニティアノテーション33に基づいて、T. gondiiエフェクトームを構成する256のホプトリーおよび濃顆粒局在タンパク質を選択した。これらの遺伝子のそれぞれを標的とする5つのプロトスペーサー配列をアレイ化ライブラリー7から選択し、プールギブソンアセンブリーによってT. gondii perturb-seqベクターに組み込んだ（表S3）。このプラスミドプールをT. gondii RHΔHXGPRTにトランスフェクトし、得られたノックアウト寄生虫プールを用いてHFFを感染させた（図2A）。IFNγ刺激遺伝子の発現を調節するエフェクタータンパク質を同定するために、非刺激およびインターフェロンγ（IFNγ）刺激HFFの両方でデュアルperturb-seqスクリーニングを実施した19,20,34。
図サムネイルgr2
図2A dual-perturb-seqスクリーニングにより宿主細胞の転写を標的とするT. gondiiエフェクターが同定される
キャプション
大きな画像を見るダウンロード 高解像度画像
T.gondii変異体プールに感染したHFFの合計25,185個の単一細胞トランスクリプトーム（非刺激15,920個、IFNγ刺激9,265個）を回収した（図S3AおよびS3B）。すべての単細胞トランスクリプトームにおいて、1,119 個の sgRNA が同定され、1 個の sgRNA につき 11 個のトランスクリプトームが同定された（図 S3E）。256のT. gondii標的遺伝子のすべてが、少なくとも1つのsgRNAによって表された。与えられた遺伝子を標的とするすべてのsgRNAを集約すると、遺伝子あたり71トランスクリプトームのカバレッジ中央値となった（図S3F）。ほとんどの標的遺伝子は 5 種類の sgRNA で表され、93% の標的遺伝子は少なくとも 3 種類の sgRNA で表された（図 S3G）。個々のsgRNAレベルでも、標的遺伝子別に集計した場合でも、回収された単一細胞トランスクリプトームの数は、バルクシーケンスで評価したperturb-seqプラスミドプールにおけるsgRNAの発現量に正比例していた（表S3）が、強く負のフィットネス表現型35を持つ遺伝子を標的とするsgRNAは、発現量が少ない傾向があった（図S3HおよびS3I）。
宿主細胞のトランスクリプトームを変化させるT. gondii遺伝子のノックアウトを単一の指標を用いて同定するために、主成分分析（PCA）によって単細胞トランスクリプトームを分析し、スチューデントのt検定36を多変量に一般化したHotellingのt2検定を用いて、PCA空間における単細胞トランスクリプトームの分布がバックグラウンド分布と異なるかどうかを各標的遺伝子について検定した（図S3J）。非刺激細胞およびIFNγ刺激細胞の両方から得られたデータを組み合わせると、14個のコントロール全てを含む、宿主細胞のトランスクリプトームを有意に変化させる22個のT. gondii遺伝子が同定された（図2B；表S4）。また、非刺激細胞とIFNγ刺激細胞のデータを別々に解析したが、コントロールのIST19,20とPPM3C37を除けば、IFNγ刺激条件に特異的な有意な遺伝子は同定されなかった（図S3KとS3L；表S4）。GRA7とGRA25については、先のパイロット実験ではこれらのノックアウトについてDEGが同定されなかったにもかかわらず、有意な摂動が同定された。おそらく、今回のメイン・スクリーニングでは、単一細胞のトランスクリプトーム数という点でカバー率が高く、各ターゲットに対して複数のsgRNAを使用することで、より微妙な表現型を同定することができたのだろう。最も興味深かったのは、宿主転写のリプログラミングにこれまで関与していなかった以下の6つの遺伝子について、有意な摂動が確認されたことである： TGGT1_222100、GRA57、ROP9、GRA59、GRA3、GRA70である。
次に、T. gondiiのトランスクリプトームを用いた単一細胞PCA埋め込みにHotellingのt2検定を適用し、寄生虫エフェクターの欠失が寄生虫遺伝子の転写を変化させるかどうかを検証した。その結果、GRA3にのみ有意な変動が認められた（図S4B；表S5）。sg(GRA3)発現細胞で差次的に制御される遺伝子を調べた結果、この摂動は主にGRA3自体のダウンレギュレーションによって引き起こされ、他のlog2-fold変化は0.11を上回らなかった（図S4C；表S6）。いくつかの例外を除いて、このスクリーニングで標的とした他のほとんどのT. gondii遺伝子の実質的なダウンレギュレーションは、コグネートsgRNAを発現する細胞では観察されなかった（図S4D；表S7）。
デュアルperturb-seqデータから推定されるエフェクタータンパク質の機能が明らかになる
これらの推定エフェクタータンパク質をさらに調べるために、少なくとも30個の細胞で表されるすべての標的遺伝子（標的遺伝子の25パーセンタイルに相当）について、Z変換した正規化UMIカウントを平均化することにより、擬似バルクトランスクリプトームを作成した。PCAを用いると、これらの擬似バルクトランスクリプトーム間の分散の大部分は、既知の寄生虫エフェクタータンパク質によって駆動されていることがわかった（図2C）。例えば、第一主成分には輸出に必要なすべての既知の分泌型T. gondiiの濃密顆粒エフェクター（MYR1-4,15,16,39,40 ROP17,41 GRA45,9,40およびPPM3C37；GRA44も必要であるが、非常に強い陰性増殖表現型を持つため、解析に十分な細胞を回収できなかった40,42）の輸出に必要なすべての既知の分泌遺伝子のクラスターを同定した。一方、第3主成分では、濃密顆粒エフェクターGRA16およびHCE1とGRA24を分離し、これらのエフェクターが宿主細胞内で相反する転写応答を駆動している可能性を示した。
これらの機能的に関連するエフェクタータンパク質の明らかなクラスターを正式に同定するために、宿主細胞の遺伝子発現を有意に擾乱するエフェクターの擬似バルクトランスクリプトーム間のピアソン相関係数を計算した（図2D）。これらの相関係数に基づく階層的クラスタリングにより、エフェクタータンパク質の4つの大まかなクラスターが同定された。相関の強い擬似バルクトランスクリプトームのクラスターには、濃密顆粒エフェクターの輸出に必須であることが示されており、「コア」輸出機構を構成していると思われる6つのタンパク質が含まれていた： MYR1-4、ROP17、およびGRA45.9,15,39,40,41 密顆粒タンパク質の追加クラスター（GRA59、GRA57、MAF1B、GRA25、PPM3C、およびGRA70から成る）は、必須輸出タンパク質のクラスターと中程度の相関があり、表現型に何らかの類似性または重複があることを示していると考えられた。第3の5つの遺伝子クラスターには、ROP9、GRA7、GRA3が含まれ、宿主の細胞周期と代謝に影響を与えることが示されているエフェクターHCE1とGRA16も含まれていた17,18,21。最後に、「免疫制御因子」と解釈される5つの遺伝子クラスターを同定した： GRA28は、クロマチンリモデラーとの相互作用を通じて宿主細胞の運動性とサイトカイン発現を制御する23,24 GRA24は、p38αマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）を活性化する22 IST、 転写因子STAT3とSTAT6を直接リン酸化して活性化するROP16、25,43,44、そして未特定の遺伝子であるTGGT1_222100である。
これらのエフェクタータンパク質によってどの宿主細胞経路が異なって制御されるかを決定するために、VISION32を用いてPathway Interaction Database（PID）45,46から196の遺伝子セットの発現について単細胞トランスクリプトームをスコア化し、シグネチャースコアのWilcoxon順位和検定によって、推定エフェクタータンパク質ごとにこれらの経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを検定した（図2EとS5、表S8）。この解析により、例えばGRAによるc-Myc経路のアップレギュレーション16,47、GRAによるp38α MAPKの活性化24,22、ISTによるインターフェロン応答の抑制19,20など、特徴的なエフェクタータンパク質の既知の表現型の多くが再確認された。さらに、制御された経路の違いから、ROP9によるE2F経路の活性化、TGGT1_222100によるインターロイキン-4（IL-4）様応答の誘導など、今回新たに同定された推定エフェクタータンパク質の機能が示唆された。少なくとも1つのエフェクターによって有意に制御される159の経路の平均シグネチャースコアを用いたエフェクターの階層的クラスタリングでは、ピアソン相関係数を用いたクラスタリングと同様の結果が得られた。
まとめると、dual perturb-seqにより、細胞内T. gondii寄生虫の200を超える未特性遺伝子をスクリーニングし、哺乳類宿主細胞のトランスクリプトームへの影響を調べることができた。1回の統計的検定で、宿主の転写を標的とする現在知られているすべてのエフェクタータンパク質を同定し、さらに6つのエフェクター候補を同定した。PCAとエフェクター間相関による擬似バルクトランスクリプトームの検査により、機能的に関連するエフェクタータンパク質のクラスターを同定した。最後に、それぞれのエフェクタータンパク質によって制御される宿主細胞の経路を決定し、その機能を確立するための第一歩とした。
GRA59は濃顆粒エフェクターの輸送に寄与する
デュアルperturb-seqスクリーニングのトップヒットの一つは、濃顆粒タンパク質GRA59（TGGT1_313440）であった（図2B）。sg(GRA59)発現細胞についてΔMYR1様シグネチャーのスコアリングを行ったところ、これらの細胞はsg(MYR1)発現細胞と比較して中間の表現型を持つことがわかった（図3A）。
図サムネイルgr3
図3GRA59（TGGT1_313440）は濃顆粒エフェクタータンパク質の輸送に寄与する
キャプション
大きな画像を見るダウンロード 高解像度画像
我々はGRA59をC末端に1つのHAエピトープでタグ付けし（Figure S6A and S6B）、寄生体液胞48への事前の免疫蛍光局在を確認した（Figure S6C-S6E）。完全に透過化した細胞では、GRA59は液胞内腔タンパク質GRA1および液胞内ネットワーク（IVN）常在GRA2と共局在化した（図3B、S6C、S6D）。しかし、サポニンで部分的に透過化すると、宿主細胞の形質膜は破壊されるが、寄生体液胞膜（PVM）はほとんど無傷のままである。抗HA染色が検出され、PVMマーカーGRA3と部分的に共局在化したことから、GRA59のC末端は宿主細胞の細胞質に露出している可能性が示された（図S6E）。この所見を裏付けるように、GRA59は宿主細胞に局在するビオチンリガーゼにアクセス可能であることが最近示された49。そこで我々は、GRA59がPVMにおける輸出複合体の構成要素である可能性を仮定した（図3C）。
RHΔKU80バックグラウンドでGRA59ノックアウトおよび相補細胞株を作製し（図S7）、感染したHFFの核c-Myc免疫蛍光を定量することにより、濃顆粒エフェクターの輸出を測定した。T. gondiiによる宿主c-Mycのアップレギュレーションは、完全にMYR1依存性のエクスポート15に依存し、部分的にエクスポートされたエフェクターGRA16に依存する47。親株RHΔKU80は宿主c-Mycを強く誘導し、MYR1のノックアウトはこのアップレギュレーションを完全に消失させたが、予想通り、GRA59のノックアウトは中間の表現型をもたらし、相補化によって回復した（図3D）。この表現型は、GRA16に加えて、あるいはGRA16と共同して、エフェクター輸送におけるGRA59の役割、あるいはc-Mycを直接アップレギュレートする役割のいずれかと一致する。そこで私たちは、MYR依存的に輸出されるエフェクタータンパク質の宿主細胞表現型をさらに3つ測定した：GRA24によるp38 MAPKのリン酸化と核移行22、HCE1/TEEGRによるEZH2のアップレギュレーション17,18、およびISTによるIFNγ誘導IRF1発現の阻害19,20。p38リン酸化とEZH2アップレギュレーションの両方において、GRA59のノックアウトは、c-Mycアップレギュレーションと同様に、親株RHΔKU80とRHΔMYR1の中間の表現型をもたらした（図3Dおよび3E）。これらの結果は、GRA59が複数のエフェクタータンパク質の輸出に寄与しているが、MYR1の場合のように、ノックアウトによって輸出が完全になくなるわけではないことを示している。対照的に、IFNγを介したIRF1誘導の抑制はGRA59の影響を受けなかったことから、エフェクタータンパク質ISTの正常な輸出が示唆された（図3G）。
エフェクターの輸送がGRA59によって影響を受けるかどうかを直接調べるために、GRA16またはISTのHAタグ付き変異体をRHΔKU80、RHΔGRA59、およびRHΔMYR1株に導入した（図S8）。宿主細胞への輸送後、GRA16とISTはともに宿主細胞の核に局在する。そこで、GRA16-HAとIST-HAの輸送を、感染後24時間（hpi）の液胞に残存するシグナルと比較した宿主細胞核内の抗HA免疫蛍光シグナルの比率として定量した。c-Mycの表現型に従って、RHΔKU80およびRHΔMYR1と比較して、RHΔGRA59株によるGRA16-HAの輸出の中間的な減少が観察された（図3H）。驚くべきことに、IRF1の抑制は影響を受けなかったが、IST-HAの輸出もRHΔGRA59株で減少した（図3I）。さらに、RHΔKU80ではほとんど見られなかったIST-HAシグナルの蓄積が、RHΔGRA59株とRHΔMYR1株では液胞内に存在することに気づいた（図3J）。これらのIST-HA蓄積を含む液胞の割合は、宿主細胞核への輸送の減少を反映しており、輸送が制限されたときにIST-HAが液胞内に保持されることを示している。RHΔKU80を含むほぼすべての液胞は、GRA16-HAの蓄積を含んでいた。したがって、同じ方法でGRA16-HAの保持を定量することはできなかった。
これらのデータを合わせると、perturb-seq二重スクリーニングにおけるGRA59の明らかな表現型が確認された： GRA59はMYR1のような表現型を持ち、濃顆粒タンパク質の液胞から宿主細胞への輸送に貢献している。しかし、MYR1とは異なり、GRA59をノックアウトしても輸送は完全には阻害されない。その代わりに、GRA16とISTの輸出が中間的に減少し、GRA24とHCE1の輸出も同様に影響を受けることが示唆された。
GRA59とともに、この推定エフェクターのクラスター（図2D）には、密顆粒タンパク質GRA57とGRA70が含まれており、これらは最近、HFFsにおける自然免疫制限に対する寄生虫抵抗性に関与する複合体の一部を形成していることが、私たちや他の研究者によって示された50,51。GRA59とは対照的に、GRA57は宿主細胞内へのGRA16輸送の代用である宿主細胞c-Mycの誘導に影響を与えないことが示されているからである（ただし、GRA70については調査されていない）。 50 GRA57とGRA70の両方が、sgRNAのオフターゲット効果による、このスクリーニングでの偽陽性ヒットである可能性もあるが、明らかに類似した表現型を持つ複合体の2つのメンバーが同定されたことは、宿主細胞の初期化における役割の可能性について、さらなる調査が正当化されるかもしれないことを示している。
SOS1は持続的なSTAT6シグナル伝達に必要である
確立されたエフェクターは別として、スクリーニングで最も摂動スコアが高かった遺伝子は、未特性遺伝子TGGT1_222100（図2B）であった。sg(SOS1)発現細胞の擬似バルクトランスクリプトームは、STAT3とSTAT6を直接リン酸化して下流の転写プログラムを活性化することが示されているロップトリーエフェクターキナーゼROP16（図2D）と最も強く相関していた43,44。これに対応して、sg(SOS1)発現細胞で最も強くダウンレギュレートされた遺伝子はCCL11とCCL26であった。CCL11とCCL26はともにSTAT652,53によって制御されることが示されており、RH野生型感染HFF44と比較して、T. gondii RHΔROP16感染HFFで最も強くダウンレギュレートされた遺伝子の中に以前同定されていた（図4A；表S9）。同様に、これらの細胞で最も強くダウンレギュレートされた経路は、STAT6シグナル伝達の正統的活性化因子であるIL-4に対する応答であった54,55,56,57（図4B；表S8）。興味深いことに、SOS1のノックアウトはROP16のノックアウトよりも、より多くの宿主細胞経路を有意に障害するようであった（表S8）。これはスクリーニング方法のアーチファクトかもしれないが、SOS1がROP16よりも広範な機能を持つことを示唆している可能性もある。
図のサムネイルgr4
図4SOS1（TGGT1_222100）は感染細胞におけるSTAT6シグナルの持続に必要である
キャプション
大きな画像を見るダウンロード 高解像度画像
SOS1はホップトリー球マーカーROP1と共局在する（図4C）。SOS1の予想分子量は128 kDaで、ほぼ中間で切断され、タグのついたC末端断片は70 kDaで移動するようである（図S9B）。このプロセシングは、ゴルジ常在アスパルチル・プロテアーゼASP358の阻害剤である低分子49cで阻害することができた（図S9D）。この結果は、シグナルペプチドが見かけ上ないにもかかわらず、SOS1は分泌経路内にあり、ホプトリー球の内腔に含まれていることを示している。この推定ASP3切断部位は、2つの未特性ドメイン間の予測される柔軟なリンカー内にある（図S9E）。ホプトリータンパク質としては珍しく、予測されるC末端ドメインはApicomplexa全体で保存されているが、N末端ドメインはコクシジウムでのみ認識される。
sg(SOS1)発現細胞はsg(ROP16)発現細胞と明らかに類似していることから、SOS1のノックアウトはROP16のノックアウトと同様に宿主のSTAT6リン酸化を消失させるという仮説を立てた。RHΔSOS1およびRHΔROP16ノックアウト細胞株を作製し、SOS1のHAタグ付きコピーを挿入することでRHΔSOS1を相補し（図S10）、これらの株でHFFを感染させ、phospho-STAT6免疫蛍光を測定した。驚くべきことに、RHΔSOS1では、RHΔKU80と比較して、1 hpiでのSTAT6リン酸化に違いは見られなかった。しかしながら、dual perturb-seqデータが収集されたのと同じ時点である24 hpiでは、STAT6シグナル伝達がRHΔSOS1感染細胞で完全に消失し、相補化によって救済されることがわかった。従って、ROP16はSTAT6の最初のリン酸化には十分であるが、感染を通してSTAT6シグナルを維持するにはSOS1が必要である。従って、この遺伝子を(TGGT1_222100) Sustainer Of STAT signaling 1と命名した。
ROP16によるSTAT6シグナルの活性化は、T. gondii感染マクロファージのM2分極化を誘導することが示されている59。分極化とは、マクロファージが特定の刺激に応答して異なる機能的表現型を産生するように活性化される過程であり、M2分極化はサイトカインIL-4とIL-13によって正規に誘導され、抗炎症表現型と関連している60。SOS1依存性の持続的なSTAT6リン酸化がM2極性化に重要であるかどうかを調べるために、マウス骨髄由来マクロファージ（BMDM）を感染させ、M2極性化の特徴であるアルギナーゼ活性を測定した62。アルギナーゼ活性はRHΔKU80の感染によって強く誘導されたが、ROP16またはSOS1のいずれかのノックアウトによって、感染していない細胞のレベルに近いレベルまで減少した（図4E）。これらの結果は、持続的な宿主細胞の初期化にはロップトリーキナーゼROP16だけでは不十分であり、これまで知られていなかったエフェクタータンパク質であるSOS1が必要であることを明らかにしている。ROP16はSTAT6の最初のリン酸化に必要であるが、SOS1はこのシグナル伝達を持続させ、それによって感染マクロファージの耐久性のあるM2偏極を促進するのに必要である（図4F）。
SOS1は神経細胞における効率的なブラジゾアイト嚢子形成を維持する
生体内での急性感染症の間、T. gondii tactyzoiteのごく一部はブラディゾイトに分化し、抗寄生虫薬や宿主免疫系によるクリアランスに非常に抵抗性のある組織嚢胞を形成する。ブラジゾイトのシストは宿主の寿命まで持続することができ、ネコ科動物の宿主に感染するためのT. gondiiのライフサイクルにおいて不可欠である63。さらに、ブラジゾイトのシストは、免疫不全個体における再出現感染源として臨床的に重要である64。ROP16依存性のSTAT6シグナル伝達は、in vivoおよびin vitroでブラジゾイトのシスト形成を促進することが以前に示されているが、関与する下流の宿主細胞経路は依然として不明である。
本研究で使用したT. gondii RH株は、これまでブラジゾアイトへの分化率が非常に低いことから67、シスト形成におけるSOS1の役割を調べるために、III型T. gondii CEP株でSOS1ノックアウト株を作製した（図S11）。RH株と同様に、CEPΔSOS1をHFFに感染させると、最初のROP16依存的なSTAT6シグナルのバーストが誘導されたが、24時間後には消失した（図5A）。T. gondiiはin vivoでは主に神経細胞と骨格筋にブラジゾイトのシストを形成するので、感染したマウス初代神経細胞におけるSTAT6リン酸化も測定した。その結果、CEPΔSOS1に感染した神経細胞では、HFFで観察されたのと同じように、24時間後に親株と比較してSTAT6リン酸化が消失していることが観察され、この表現型が宿主細胞の種類に依存しないことが確認された（図5B）。
図のサムネイルgr5
図5SOS1は神経細胞において効率的なブラジゾアイト嚢子形成を維持する
キャプション
大きな画像を見るダウンロード 高解像度画像
SOS1がROP16と同様に効率的なシスト形成に必要であるかどうかを調べるため、ハイコンテントイメージングと自動画像解析を用いて、マウス初代神経細胞における寄生虫のタキゾアイトからブラジゾアイトへの分化を定量化した66。タキゾアイト液胞からブラジゾアイトシストへの転換は、シスト壁をDolichos bisflorus agglutinin（DBA）で染色することによって決定した（図5C）。24 hpiの時点では、DBA陽性の液胞の割合に親株CEPとCEPΔSOS1の間に差はなかった。しかし、それ以降の時点では、CEPΔSOS1株におけるブラジゾアイト転換率は減少し、72 hpiの時点でDBA陽性液胞の割合は親CEP株と比較して有意に減少し、CEPΔROP16と区別できなくなった。これらの所見は、持続的なSTAT6シグナル伝達とM2分極がSOS1に依存していることを反映しており、SOS1が効率的な嚢胞形成を維持するためにも重要であることを示している（図5D）。
考察
本研究では、宿主細胞の遺伝子発現を操作するT. gondiiエフェクタータンパク質の同定における以前の課題を克服するために、プールしたノックアウトスクリーニングとマルチモーダルscRNA-seqを組み合わせた。この二重perturb-seqは、CRISPR-Casシステムを用いた遺伝子操作が可能な宿主-病原体モデルまたは宿主-共生体モデルにおける転写相互作用を調べる方法として提案する。例えば、ここでは機能喪失変異を誘導するために非相同末端結合に頼っているが、これは多くの原虫寄生体にはない経路である。しかし、perturb-seqベクターのCas9をCRISPRi用の触媒活性のないCas9、またはRNA転写物を標的とするCas13に置き換えることで、この要件を回避することができる。さらに、sgRNAは通常レンチウイルス導入によって導入されるが、我々はプラスミドベクターによるエレクトロポレーションによってCas9とsgRNAの両方を同時に導入し、多様な非哺乳類細胞におけるperturb-seqの実現可能性を強調した。
この論文が査読中であった間に、細胞内細菌の突然変異が宿主細胞のトランスクリプトームに与える影響を解析するための概念的に類似した方法が発表され、著者らはこれをscPAIR-seqと命名した68。プールされたscRNA-seqデータで各変異体を同定するために、野生型および以前に作製された24の変異サルモネラ株69を、ユニークなバーコードを含むポリアデニル化GFP転写産物を発現するように操作した。これは、プールされたフォーマットでCas9-sgRNAプラスミドライブラリーをトランスフェクションすることによって遺伝子破壊とバーコード化を同時に行うdual perturb-seqとは対照的である。scPAIR-seqは細菌トランスクリプトームを回収しないが、サルモネラ感染マクロファージにおける宿主と細菌のデュアルscRNA-seqの先行実証は、将来的にこれがscPAIR-seqに組み込まれる可能性を示唆している70。したがってscPAIR-seqは、現時点ではdual perturb-seqよりも柔軟性やスループットで劣るが、真核微生物-宿主間の相互作用にdual perturb-seqが適用できるように、細菌-宿主間の転写相互作用を解明するための重要な補完的ツールとなる可能性が高い。
ユビキタスで臨床的に重要な病原体であるT. gondiiについて、我々はdual perturb-seqデータを用いて、これまで未解明であった遺伝子の機能を新規に、また確立されたエフェクタータンパク質との関連において推測することができた。7,8,9,10これは、宿主免疫の調節におけるこれらのエフェクターの主な役割が、プール感染で救済されるためと考えられる。この現象から、デュアルperturb-seqを用いて、T. gondii遺伝子のノックアウトが宿主細胞のトランスクリプトームに与える影響を、ハイスループットかつ偏りのない方法で直接測定する必要があった。
我々は、GRA59が他の濃密顆粒エフェクターの宿主細胞への輸送に寄与していることを示すことで、GRA59のdual perturb-seq表現型を検証した。これらの表現型に加え、GRA59の局在とトポロジーから、GRA59は宿主細胞内への効率的なエフェクター輸送を促進する、輸送複合体のアクセサリーあるいは制御コンポーネントである可能性が示唆された。興味深いことに、MYR1-4、ROP17、GRA45からなるコアクラスター以外に、エフェクターの輸出を完全に阻害する変異体は確認されなかった。このように、タンパク質の輸出に必要な構成要素をすべて明らかにしたことで、現在ほとんど解明されていないにもかかわらず、T. gondiiの病原性にとって重要なこの経路の詳細な機構と構造に関する研究に道が開かれた5,15。
さらに我々は、ROP16キナーゼによって開始されるSTAT6シグナル伝達を延長する、これまで認識されていなかった作用様式で働くエフェクタータンパク質SOS1を同定した。組換えROP16はin vitroでSTAT6をリン酸化するのに十分であることから、このような発見は予想外であった43,44。細胞内では、SOS1はROP16の活性や安定性を制御したり、STAT6活性をダウンレギュレートするフィードバック機構を破壊したりする可能性がある。我々はここで、持続的なSTAT6シグナル伝達が、T. gondi感染マクロファージのM2偏極と、神経細胞における効率的なブラジゾアイト嚢胞形成に必要であることを示した。これらの表現型を通して、SOS1はin vivoにおける寄生虫の免疫回避と感染に関与している。
デュアルperturb-seqにより、エフェクタータンパク質をハイスループットかつシステマティックに同定し、エフェクターを介した宿主細胞のリプログラミングのメカニズムを明らかにすることができる。Dual perturb-seqは、異なる株や宿主細胞タイプにわたるT. gondiiエフェクタータンパク質の研究を加速し、他の宿主-微生物相互作用における転写リモデリングの分子メディエーターを同定するための強力なツールとなるであろう。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
ヤギポリクローナル抗マウスAlexa Fluor 488コンジュゲート ThermoFisher Scientific Cat#A-11001; RRID: AB_2534069
ヤギポリクローナル抗マウス Alexa Fluor 647 コンジュゲート ThermoFisher Scientific Cat#A-21235; RRID: AB_2535804
ヤギポリクローナル抗マウス IRDye 680LT コンジュゲート LI-COR Biosciences Cat#925-68020; RRID: AB_2687826
ヤギポリクローナル抗ウサギ Alexa Fluor 488 コンジュゲート ThermoFisher Scientific Cat#A-11008; RRID: AB_143165
ヤギポリクローナル抗ウサギ Alexa Fluor 647 コンジュゲート ThermoFisher Scientific Cat#A-21244; RRID: AB_2535812
ヤギポリクローナル抗ラット Alexa Fluor 594 コンジュゲート ThermoFisher Scientific Cat#A-11007; RRID: AB_10561522
ヤギポリクローナル抗ラット IRDye 800CW 複合体 LI-COR Biosciences Cat#925-32219; RRID: AB_2721932
マウスモノクローナル抗 ROP1 Abnova Cat#MAB17504
マウスモノクローナル抗 T. gondii Santa Cruz Biotechnology Cat#sc-52255; RRID: AB_630350
マウスモノクローナル抗 EZH2 BD Cat#612666; RRID: AB_2102429
マウスモノクローナル抗β-アクチン Cell Signaling Technology Cat#3700; RRID: AB_2242334
マウスポリクローナル抗 GRA1 Laboratory of Jean-Francois Dubremetz N/A
マウスポリクローナル抗 GRA2 Laboratory of Jean-Francois Dubremetz N/A
マウスポリクローナル抗SAG1 John Boothroydの研究室 N/A
ウサギモノクローナル抗 cMyc Cell Signaling Technology Cat#5605; RRID: AB_1903938
ウサギモノクローナル抗IRF1 Cell Signaling Technology Cat#8478; RRID: AB_10949108
ウサギ モノクローナル抗ホスホ-p38 Cell Signaling Technology Cat#4511; RRID: AB_2139682
ウサギモノクローナル抗ホスホ-STAT6 Cell Signaling Technology Cat#56554; RRID: AB_2799514
ウサギモノクローナル抗STAT6 Cell Signaling Technology Cat#5397; RRID: AB_11220421
ウサギ ポリクローナル抗 GRA3 Jean-Francois Dubremetz 研究所 N/A
ウサギ ポリクローナル抗 T. gondii Abcam Cat#ab138698
ウサギポリクローナル抗 T. gondii ThermoFisher Scientific Cat#PA1-7252; RRID: AB_561769
ラットモノクローナル抗HA Sigma-Aldrich Cat#11867423001; RRID: AB_390918
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
16% ホルムアルデヒド（w/v）、メタノールフリー ThermoFisher Scientific Cat#28908
2-メルカプトエタノール Sigma-Aldrich Cat#M3701
5-フルオロ-2′-デオキシウリジン Sigma-Aldrich Cat#F0503
AgeI-HF NEB Cat#R3552L
シュウ酸アンモニウム Sigma-Aldrich Cat#221716
B-27 サプリメント ThermoFisher Scientific Cat#17504001
ベンゾナーゼヌクレアーゼ Sigma-Aldrich Cat#E1014
ウシ血清アルブミン Sigma-Aldrich Cat#A9647
cOmplete, Mini, EDTA フリープロテアーゼ阻害剤カクテル Sigma-Aldrich Cat#11836170001
クリスタルバイオレット Sigma-Aldrich Cat#C6158
グルタル酸ジスクシンイミジル ThermoFisher Scientific Cat#20593
DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）、高グルコース、 GlutaMAX™ サプリメント ThermoFisher Scientific Cat#10566016
DMEM、高グルコース、グルタミン無添加、フェノールレッド無添加 ThermoFisher Scientific Cat#31053028
Dolichos bisflorus agglutinin (DBA)、ビオチン化 Vector Laboratories Cat#B-1035-5
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 Sigma-Aldrich Cat#D8537
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil ThermoFisher Scientific Cat#10500064
Fluoromount-G マウンティングメディウム ThermoFisher Scientific Cat#00-4958-02
グリシン Sigma-Aldrich Cat#50046
KpnI-HF NEB Cat#R3142L
L929 細胞調整培地 Cell Services Science Technology Platform, Francis Crick Institute N/A
MEM（最小必須培地） ThermoFisher Scientific Cat#11095080
ミコフェノール酸 Sigma-Aldrich Cat#475913
NciI NEB Cat#R0196L
神経基底培地 ThermoFisher Scientific Cat#21103049
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン（100X） ThermoFisher Scientific Cat#10378016
ホスファターゼ阻害剤カクテル 2 Sigma-Aldrich Cat#P5726
Pierce 抗HAアガロース ThermoFisher Scientific Cat#26181
Pierce RIPA バッファー ThermoFisher Scientific Cat#89900
プロテアーゼ阻害剤カクテル Sigma-Aldrich Cat#P8340
組み換えヒト IFN-γタンパク質 Bio-Techne Cat#285-IF-100/CF
RPMI 1640 培地（ATCC 改変） ThermoFisher Scientific Cat#A1049101
ScaI-HF NEB Cat#R3122L
ストレプトアビジン Alexa Fluor 647 コンジュゲート ThermoFisher Scientific Cat#S21374
トリトン X-100 溶液 Sigma-Aldrich Cat#93443
TrypLE Express Enzyme（1X）、フェノールレッドなし ThermoFisher Scientific Cat#12604013
キサンチン Sigma-Aldrich Cat#X7375
重要な市販アッセイ
アルギナーゼ活性アッセイキット（比色） Abcam Cat#ab180877
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns 10x Genomics Cat#PN-1000127
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns 10x Genomics Cat#PN-1000121
Chromium Single Cell 3ʹフィーチャーバーコードライブラリーキット、16 x 10 x Genomics Cat#PN-1000079
DNeasy 血液および組織キット Qiagen Cat#69506
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit S Lonza Cat#V4XP-3032
Pierce BCA タンパク質アッセイキット ThermoFisher Scientific Cat#23227
寄託データ
シングルセルRNAシーケンスデータ 本論文 Gene Expression Omnibus： GSE229505
実験モデル 細胞株
ヒト包皮線維芽細胞 ATCC SCRC-1041
実験モデル 生物／株
Mus musculus C57BL/6J Jackson Laboratory Cat#000664; RRID:IMSR_JAX:000664
Mus musculus B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J (Ai6 Creレポーター) Jackson Laboratory Cat#007906; RRID:IMSR_JAX:007906
Toxoplasma gondii RHΔHXGPRT Donaldら71 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔKU80 Huynh and Carruthers72 N/A
Toxoplasma gondii RHΔKU80 GRA59-HA この論文 該当なし
トキソプラズマ・ゴンディRHΔKU80 SOS1-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔMYR1 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔGRA59 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔGRA59::GRA59-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔKU80::GRA16-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔMYR1::GRA16-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔGRA59::GRA16-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔKU80::IST-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔMYR1::IST-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔGRA59::IST-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔROP16 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔSOS1 この論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディRHΔSOS1::SOS1-HA 本論文 N/A
トキソプラズマ・ゴンディ CEPΔHXGPRT ジョン・ブースロイド研究室 N/A
Toxoplasma gondii CEPΔROP16 Tuladharら65 N/A
Toxoplasma gondii CEPΔSOS1 この論文 N/A
オリゴヌクレオチド
表S10参照 本論文 N/A
組換えDNA
本論文で作製したプラスミドについては表S11を参照のこと 本論文 N/A
pCas9-GFP-T2A-HXGPRT::sgRNA(PacI-NcoI) Young et al.7 N/A
pCas9-GFP::sgRNA(UPRT) Shenら.38 Addgene Plasmid #54467
pUPRT Shenら.38 Addgene プラスミド #58528
pProGRA1-mCherry-T2A-HXGPRT-TerGRA2 Young et al.7 N/A
pHA-TerGRA2::ProDHFR-HXGPRT-TerDHFR Butterworth et al.10 N/A
pTKO2 Rosowski et al.29 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
Cell Ranger v3.0.2 10x Genomics 10xgenomics.com
Cell Ranger v.6.1.2 10x Genomics 10xgenomics.com
Harmony PerkinElmer perkinelmer.com/uk/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Hotelling v1.0-8 Curran and Hersh CRAN.R-project.org/package=Hotelling
Image Studio v5.2 LI-COR Biosciences licor.com/bio/image-studio/ ImageJ v1.53c
ImageJ v1.53c Schneider et al.73 imagej.net
R v4.3.1 Rコアチーム r-project.org
RStudio 2023.06.0 Build 421 Posit posit.co
Seurat v4.3.0.1 Hafemeister and Satija74; Choudhary and Satija75 satijalab.org/seurat
VISION v3.0.1 DeTomaso et al.32 github.com/YosefLab/VISION
新しいタブで表を開く
リソースの有無
リードコンタクト
さらなる情報や試薬のリクエストは、リードコンタクトであるMoritz Treeck (moritz.treeck@crick.ac.uk; mtreeck@igc.pt)までご連絡ください。
材料の入手可能性
本研究で作製したすべてのプラスミドおよびT. gondii細胞株は、リクエストに応じて入手可能である。
実験モデルと被験者の詳細
マウス
野生型C57BL/6Jマウスは、1986年英国内務省動物（科学的手続き）法および欧州連合指令2010/63/EUに従い、フランシス・クリック研究所の生物学的研究施設で飼育され、病原体のない条件下で飼育された。本研究において、フランシス・クリック研究所で生きた動物に対して規制された処置は行われなかった。
Ai6 Creレポーターマウス76は、アリゾナ大学動物飼育施設において、14時間/10時間の明暗サイクル、周囲温度68°～75°F、湿度30～70%の特異的病原体フリー条件下で飼育された。すべての手順と実験は、Public Health Service Policy on Human Care and Use of Laboratory Animalsに従って行われ、アリゾナ大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（#12-391）の承認を得た。
細胞培養
HFF
ヒト包皮線維芽細胞（ATCC, SCRC-1041）は、4.5g/LグルコースとGlutaMAX（Gibco）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）に10％熱不活性化ウシ胎児血清（Gibco）を加え、37℃、5％CO2で培養した。
BMDM
6～12週齢の雄C57BL6/Jマウスの骨髄から単離した単球を、70％RPMI1640 ATCC改変培地（ギブコ）、20％L929細胞調整培地（フランシス・クリック研究所Cell Services Science Technology Platform提供）、10％熱不活性化FBS（ギブコ）、100U/mLペニシリン-ストレプトマイシン（ギブコ）、50μM 2-メルカプトエタノール（シグマ）中で6日間マクロファージに分化させた。分化後、培地から2-メルカプトエタノールを除去した。
初代ニューロン
初代マウス神経細胞培養は、Ai6 Creレポーターマウスから、以前に記載された方法で得た77。簡単に言えば、皮質ニューロンをE17胚から剥離し、解離した後、D-グルコース、L-グルタミン、5％FBSを添加したMinimal Essential Medium（Thermo社製）中で、ポリ-L-リジンでコートした96ウェル、透明底、黒壁のプレートに、1ウェル当たり20,000個の細胞密度で播種した。4時間後、培地をB-27サプリメント（Thermo）、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したニューロバサル培地（Thermo）に変えた。試験管内で4日間培養した後、ニューロンは、グリアの増殖を防ぐために5μMのシトシンアラビノシドを添加した完全なニューロバサル培地で半量の培地交換を受けた。その後、3-4日ごとに完全ニューロバサル培地と3分の1量の培地交換を行った。実験は、10-12日間のin vitro培養後のニューロンを用いて行った。
トキソプラズマ・ゴンディ
トキソプラズマ・ゴンディ(T. gondii)は、HFFで2-3日ごとに継代継代して維持し、27ゲージの針を通し、5μmのフィルターを通すことで実験用に単離した。本研究で使用した親株は、RHΔHXGPRT,71 RHΔKU80,72およびCEPΔHXGPRTである。
方法の詳細
perturb-seqベクターの作製
キャプチャー配列1および2を、プライマー1-4（表S9）を用いた逆PCRによってpCas9-sgRNAベクター7に挿入した。個々のperturb-seqベクターを作製するために、プライマー5-29を用いたインバースPCRによってプロトスペーサーを改変した（表S9）。スクリーニングに用いたperturb-seqベクターのプールを作製するために、プロトスペーサー配列をコードするssDNAオリゴヌクレオチドを、Echo 550 Acoustic Liquid Handler（Labcyte社製）を用いてアレイ化ライブラリー7から選択した。オリゴヌクレオチドは、冷凍ストックの不完全な解凍やプレートの位置ずれによる損失を減らすため、3つの異なる日に3回ずつ分注した。プールしたオリゴヌクレオチドを、以前に記載したようにギブソンアセンブリーによってpCas9-sgRNA-CS1ベクターに組み込んだ7。得られたプラスミドプールからイルミナシーケンスライブラリーを調製し、プライマー30-33（表S9）を用いたネステッドPCRによってプロトスペーサー配列の組み込みを確認した。得られたライブラリーをHiSeq 4000プラットフォーム（Illumina）で100bpペアエンドリードで3000万リードの深さまで配列決定した（表S3）。各プロトスペーサー配列にマッチするリードの数は、カスタムperlスクリプトを用いてカウントした。
デュアルperturb-seq実験
T. gondii RHΔHXGPRTを、Amaxa 4D Nucleofectorシステム（Lonza）を用い、バッファーP3およびパルスコードEO-115を用いたエレクトロポレーションにより、KpnI-HF消化（NEB）perturb-seqベクターでトランスフェクトした。個々のperturb-seqベクターについては、4D Nucleofector X Unit 16ウェルストリップの1ウェルに15μgのプラスミドを入れ、少なくとも107匹の寄生虫をトランスフェクトした。perturb-seqプラスミドプールでは、16ウェルストリップの8ウェルに分割した120μgのプラスミドで少なくとも108匹の寄生虫をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、25μg/mLのミコフェノール酸（シグマ社製）と50μg/mLのキサンチン（シグマ社製）を寄生虫に添加し、線状化perturb-seqベクターのゲノムへの統合を少なくとも7日間選択した。
感染の24時間前に、HFF培地を4.5g/LのグルコースとGlutaMAXを添加し、2%の熱不活性化FBSを加えたダルベッコ変法イーグル培地に変更した。HFFにトランスフェクトした寄生虫をMOI 0.1で感染させた。1時間後に培地を交換し、細胞外に残った寄生虫を除去した。IFNγ刺激を用いる場合、組換えヒトIFNγ（BioTechne社製）を感染後21時間目に最終濃度5ng/mL（約10U/mL）となるように感染細胞に添加した。
感染24時間後、TrypLE Express（ギブコ）を用いてHFFを解離させ、氷上で5μg/mLのDAPI（シグマ）で5分間染色した。細胞を300×g、5分間、4℃で遠心分離してペレット化し、フェノールレッドを含まない2％FBS DMEMに再懸濁し、30μmのフィルターに通した。感染細胞をFACSAria IIIセルソーター（BD）を用いてCas9-GFP発現に基づいて濃縮した。
ソートされた細胞は、300 x g、5分間、4℃で遠心分離して濃縮し、0.04% w/v BSA（シグマ）を含むDPBS（シグマ）に再懸濁した。Chromium Controller（10x Genomics社製）とSingle Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1（10x Genomics社製）を用いて、製造元の指示に従い、1チャンネルあたり10,000細胞を目標回収量として、逆転写用のゲルビーズインエマルジョン液滴に細胞を分割した。ゲルビーズ・イン・エマルジョン液滴内での逆転写により、16 bpの細胞バーコード（各液滴にユニーク）と12 bpのユニーク分子識別子（UMI、各転写物にユニーク）が各cDNAに組み込まれる。3'mRNAおよびCRISPR sgRNAシーケンスライブラリーは、追加のChromium Single Cell 3ʹフィーチャーバーコードライブラリーキットを用いて、CRISPRスクリーニングのためのフィーチャーバーコード技術を用いた3'遺伝子発現のためのメーカーのプロトコールに従って構築した。ライブラリーはHiSeq 4000プラットフォーム（Illumina）で、3'mRNAライブラリーはセルあたり50,000リード、CRISPR sgRNAライブラリーはセルあたり5,000リードを目標深度としてシーケンスした。
T. gondii細胞株の作製
C末端エピトープタギング
GRA59およびSOS1の3'UTRを標的とするCas9-sgRNAプラスミド（HXGPRTなし）38を、プライマー5、34、および35を用いたインバースPCRによって作製した（表S10およびS11）。インフレームHA-TerGRA2::ProDHFR-HXGPRT-TerDHFR修復コンストラクトは、GRA59とSOS1の3'UTRに40bpの相同性アームを導入するために、プライマー36-39を用いてプラスミドテンプレート10から増幅した。各株について、15μgのCas9-sgRNAプラスミドと修復構築物を、上記のようにエレクトロポレーションによってT. gondii RHΔKU80に共導入した。トランスフェクションの24時間後、25μg/mLのミコフェノール酸（シグマ社製）と50μg/mLのキサンチン（シグマ社製）を少なくとも7日間培地に添加し、修復構築物のゲノムへの統合を選択した後、限界希釈によりクローン細胞株を得た。ゲノムへの修復構築物の組み込みは、DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）を用いて抽出した寄生虫ゲノムDNAを用い、プライマー40-43を用いた診断用PCRで確認した。
ノックアウト（T. gondii RH株）
プライマー5および44-47を用いたインバースPCRにより、標的遺伝子のコード配列を標的とするCas9-sgRNAプラスミド（HXGPRTを含まない）を作製した（表S10およびS11）。ProGRA1-mCherry-T2A-HXGPRT-TerGRA2修復構築物を、標的遺伝子の5'および3'UTRに40bpの相同性アームを導入するためにプライマー48-55を用いて鋳型プラスミドから増幅した。各標的遺伝子について、15μgのCas9-sgRNAプラスミドと修復構築物を、上記のようにエレクトロポレーションによってT. gondii RHΔKU80に共導入した。トランスフェクションの24時間後、25μg/mLのミコフェノール酸（Sigma）と50μg/mLのキサンチン（Sigma）を培養液に少なくとも7日間添加し、修復構築物のゲノムへの統合を選択した後、限界希釈によりクローン細胞株を得た。ゲノムへの修復コンストラクトの組み込みは、プライマー56-63を用いた診断PCRで確認した。
ノックアウト（T. gondii CEP株）
SOS1の5'および3'UTRを標的とする2つのsgRNAを有するCas9-sgRNA（HXGPRTなし）を、インバースPCRによってプロトスペーサー配列を導入するためにプライマー77-80を用いて、以前に記載された79と同様に作製した（表S10およびS11）。SOS1のコード配列をHXGPRT-mCherry構築物で置換する修復プラスミドを、プライマー81-84を用いてSOS1の5'および3'UTR（Cas9-sgRNAプラスミド中のプロトスペーサーに隣接）を増幅し、得られた断片をIn-Fusionクローニング（Takara）によりpTKO2プラスミド29に挿入することにより作製した。寄生虫をCas9-sgRNAプラスミドとpTKO2プラスミドの両方で共導入し、ミコフェノール酸とキサンチンで選択し、上記のようにして得られたクローン細胞株とした。SOS1 CDSの欠失は、プライマー85-86を用いた抽出ゲノムDNAの診断PCRによって確認し、プライマー87-88を用いたSAG1 CDSの増幅をコントロールとして用いた。アクチンmRNAに対するSOS1 mRNA発現の欠損は、プライマー89-92を用いた定量的リアルタイムPCRで確認した。
相補性
標的遺伝子のコード配列および開始コドンの上流1000-1500bpを、プライマー64-71（表S10およびS11）を用いてRHΔKU80ゲノムDNAから増幅し、ギブソンアセンブリーによりpUPRTプラスミド38に組み込んだ。15μgのpUPRTプラスミドをAgeI-HF（NEB）（GRA59、SOS1、IST）またはScaI-HF（NEB）（GRA16）で直鎖化し、UPRT遺伝子座を標的とする15μgのCas9-sgRNAプラスミド（HXGPRTなし）と共トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、5μMの5-フルオロデオキシウリジンを培養液に少なくとも7日間添加し、UPRT遺伝子座へのpUPRTベクターの統合を選択した。UPRT遺伝子座へのpUPRTベクターの組み込みは、プライマー72-76を用いた診断用PCRで確認した。
ウェスタンブロット
HAタグ付き寄生虫細胞株
寄生虫はシリンジ溶解、濾過、DPBSでの洗浄により単離し、cOmplete Mini EDTAフリーのプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)と2 U/mLのベンゾナーゼヌクレアーゼ(Sigma)を加えたRIPAバッファー(Thermo)で氷上30分間溶解した。タンパク質濃度は、Pierce BCA protein assay kit (Thermo)を用いて定量した。サンプルを15,000 x g、4 ˚Cで5分間遠心し、ペレットを捨てた。サンプルあたり10μgのタンパク質を、サンプルローディングバッファー中で95℃、5分間加熱し、Mini-PROTEAN電気泳動システム（Bio-Rad）を用いてSDS-PAGEで分離した。タンパク質をTrans-Blot Turbo transfer system（Bio-Rad）を用いてニトロセルロースメンブレンに転写し、2% w/v skim milk powder, 0.1% v/v Tween 20 in PBSで1時間室温でブロッキングした。膜を1:1000ラット抗HA（Sigma）または1:200マウス抗T. gondii（Santa Cruz）で室温で1時間インキュベートした後、1:10,000ヤギ抗ラットIRDye 800CW（LI-COR）または1:10,000ヤギ抗マウスIRDye 680LT（LI-COR）で室温で1時間インキュベートした。画像はOdyssey赤外線イメージングシステム（LI-COR）を用いて取得した。
初代神経細胞におけるSTAT6リン酸化
一次ニューロンを24時間感染させ、Protease Inhibitor Cocktail（シグマ）とPhosphatase Inhibitor Cocktail 2（シグマ）を添加したRIPA緩衝液中で超音波処理によりタンパク質を抽出した。膜をウサギ抗STAT6（Cell Signaling）またはウサギ抗ホスホSTAT6（Cell Signaling）とマウス抗-α-アクチン（Cell Signaling）で染色した。ブロットをOdyssey赤外線イメージングシステム（LI-COR）を用いて画像化し、Image Studio v5.2（LI-COR）で全シグナル強度を定量し、抗STAT6シグナルに対する抗phospho-STAT6シグナルの比率を算出した。生物学的複製は3回行った。リン酸化 STAT6/STAT6 比の株間差は、ボンフェローニ補正を用いた両側 t 検定で検定した。
プラークアッセイ
コンフルエントになったHFFのT25フラスコに100匹の寄生虫を接種し、10日間放置した。フラスコを0.5% w/vクリスタルバイオレット（シグマ社製）、0.9% w/vシュウ酸アンモニウム（シグマ社製）、蒸留水中20% v/vメタノールで15分間染色した後、DPBSで洗浄した。ノックアウト効率を測定するため、5μMの5-フルオロデオキシウリジンを添加したフラスコのプラーク数を、3生物学的複製で未処理のフラスコと比較してカウントした。ノックアウト効率のパーセンテージの差は、ボンフェローニ調整による両側t検定で検定した。プラークサイズを測定するために、GelDoc Go System（Bio-Rad）を用いて画像を撮影し、ImageJ v1.53cを用いてプラーク面積を定量した。
免疫蛍光アッセイ
GRA59とSOS1の局在
8ウェルチャンバースライド（Ibidi）にコンフルエントになったHFFをT. gondii株で24時間感染させ、PBSで洗浄した後、4% w/vホルムアルデヒド（Sigma）で15分間固定した。細胞を0.2% Triton X-100（Sigma）で15分間透過処理し、2% w/v BSA（Sigma）で1時間ブロッキングした。次に、細胞を1:200マウス抗T. gondii（Santa Cruz）または1:1000ウサギ抗T. gondii（Abcam）と1:1000マウス抗GRA1（Dubremetz lab）または1:1000マウス抗GRA2（Dubremetz lab）または1:1000ウサギ抗GRA3（Dubremetz lab）または1:500マウス抗ROP1（Abnova）で染色した。最後に、マウス抗T. gondii一次抗体を用いた場合は、5μg/mL DAPIと1:1000ヤギ抗マウスAlexa 647（Thermo社製）と1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 488（Thermo社製）、またはウサギ抗T. gondii一次抗体を用いた場合は、1:1000ヤギ抗マウスAlexa 488（Thermo社製）と1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 647（Thermo社製）で細胞を濾過した。すべての抗体のインキュベーションは室温で1時間行った。画像は、Nikon Ti-E 倒立広視野蛍光顕微鏡に Nikon CFI APO TIRF 100x/1.49 対物レンズを装着し、NIS Elements (Nikon) を搭載した Hamamatsu C11440 ORCA Flash 4.0 カメラで取得した。
c-Myc
HFFを24時間血清飢餓（0.1％FBS）した後、24時間感染させ、固定、透過化し、上記のようにブロックした。細胞を1:800ウサギ抗cMyc（Cell Signaling）および1:200マウス抗T. gondii（Santa Cruz）で1時間染色し、続いて1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 488（Thermo）、1:1000ヤギ抗マウスAlexa 647（Thermo）、および5μg/mL DAPIで1時間染色した。各サンプルについて、Nikon Plan APO 40x/0.95対物レンズを用い、上記のように3x3のタイル画像を取得した。cMyc蛍光強度はImageJで定量した。DAPIシグナルを用いて各宿主核のマスクを作成し、感染細胞の各核におけるcMyc強度の中央値をバックグラウンド（非核）強度の中央値を差し引いた値で測定した。サンプルあたりの核シグナルの中央値を複製を代表するものとし、RHΔKU80＝1AUにスケーリングして正規化した。別々に調製したHFFを用い、異なる日に感染させた5つの生物学的複製を実施した。株間の差は、ボンフェローニ補正を用いた両側ウィルコクソン順位和検定で検定した。
EZH2
HFFを24時間感染させ、固定、透過化し、上記のようにブロックした。細胞を1:200マウス抗EZH2（BD）および1:1000ウサギ抗T. gondii（Abcam）で4℃で一晩染色し、続いて1:1000ヤギ抗マウスAlexa 488（Thermo）、1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 647（Thermo）、および5μg/mL DAPIで1時間染色した。画像を取得し、感染細胞における核EZH2蛍光をcMycについて上記と同様に定量した。別々に調製し、異なる日に感染させたHFFを用いて、5回の生物学的複製を行った。株間差は、Bonferroni補正をかけた両側Wilcoxon順位和検定で検定した。
リン酸化p38
HFFを24時間感染させ、固定、透過化し、上記のようにブロックした。細胞を1:800ウサギ抗phospho-p38（Cell Signaling社製）および1:200マウス抗T. gondii（Santa Cruz社製）で4℃で一晩染色し、次いで1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 488（Thermo社製）、1:1000ヤギ抗マウスAlexa 647（Thermo社製）、および5μg/mL DAPIで1時間染色した。画像を取得し、感染細胞の核内phospho-p38蛍光をcMycについて上記と同様に定量した。別々に調製し、異なる日に感染させたHFFを用いて、5回の生物学的複製を行った。株間差は、Bonferroni補正を加えた両側Wilcoxon順位和検定で検定した。
IRF1
HFFを感染させ、50 ng/mL (∼100 U/mL)の組換えヒトIFNγを1 hpi添加した。24時間後に細胞を固定し、透過化し、上記のようにブロックした。1:200ウサギ抗IRF1（Cell Signaling社製）および1:200マウス抗T. gondii（Santa Cruz社製）で4℃で一晩染色した後、1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 488（Thermo社製）、1:1000ヤギ抗マウスAlexa 647（Thermo社製）、および5μg/mL DAPIで1時間染色した。別々に調製したHFFを用い、異なる日に感染させ、5回の生物学的複製を行った。株間の差は、Bonferroni補正を加えた両側Wilcoxon順位和検定で検定した。
リン酸化STAT6
HFFを1時間または24時間感染させ、1時間後に細胞外に残った寄生虫を洗い流した。細胞を100%メタノールで15分間固定し、2% w/v BSAで1時間ブロックした。細胞を1:200ウサギ抗phospho-STAT6（Cell Signaling）と1:200マウス抗T. gondii（Santa Cruz）または1:10,000マウス抗SAG1（Laboratory of John Boothroyd）で4℃で一晩染色し、続いて1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 488（Thermo）、1:1000ヤギ抗マウスAlexa 647（Thermo）、および5μg/mL DAPIで1時間染色した。異なる日に感染させ、別々に調製したHFFを用いて、各タイムポイントについて5回の生物学的複製を行った。株間の差は、ボンフェローニ補正を用いた両側ウィルコクソン順位和検定により検定した。
GRA16-HA/IST-HAの輸出
HFFを24時間感染させ、ホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、上記のようにブロックした。細胞を1:500ラット抗HA（Sigma）、次いで1:1000ヤギ抗ラットAlexa 594（Thermo）、次いで1:1000ウサギ抗T. gondii（Abcam）、次いで1:1000ヤギ抗ウサギAlexa 647（Thermo）で染色した。各サンプルについて、Nikon Plan APO 40x/0.95対物レンズを用い、上記のように3x3のタイリング画像を取得した。ImageJを用いて、エクスポートされたGRA16-HA/IST-HAの割合を定量した。DAPIシグナルを用いて各宿主核のマスクを作成し、抗T. gondiiシグナルを用いて各液胞のマスクを作成した。バックグラウンド（非核および非液胞）の抗HAシグナルの中央値を画像全体にわたって差し引き、宿主核および液胞の総抗HAシグナルを測定した。宿主核におけるGRA16-HA/IST-HA免疫蛍光シグナルの量と、液胞に残存するシグナルの量を比較して、エクスポート比を算出した。IST-HAが蓄積している液胞の割合を決定するために、画像を盲検化し、IST-HA蓄積の有無について液胞を手動でスコア化した。別々に調製したHFFを用い、異なる日に感染させ、5回の生物学的複製を行った。株間差は、Bonferroni補正を加えた両側t検定で検定した。
アルギナーゼ活性アッセイ
サンプルあたり106個のBMDMをT. gondii寄生虫にMOI 1で36時間感染させ、細胞溶解液中のアルギナーゼ活性を比色測定法（Abcam）を用いて測定した。異なる日に調製・感染させたBMDMを用いて、生物学的複製を2回実施し、各生物学的複製で各菌株について3回ずつ感染させた。株間の差は、Bonferroni補正を用いた両側Wilcoxon順位和検定で検定した。
タンパク質ホモログの同定
SOS1 (TGGT1_222100) の AlphaFold 構造予測は、AlphaFold/EMBL-EBI データベースバージョン 2022-11-01 からアクセスした81,82。SOS1 のホモログは、UniProtKB 参照プロテオームを用いて、E 値カットオフ 0.01 で HMMER83 を用いて同定した。Apicomplexa以外では有意なヒットは見つからなかった。VEuPathDBを介したBLASTにより、40％以上の類似領域（BLOSUM62）が同定された33。Clustal Omegaにより、選択された相同遺伝子の系統樹が作成された84。
in vitro シスト形成アッセイ
シスト形成アッセイは、以前に記載されたとおりに実施した。66 簡単に言うと、初代ニューロンを96ウェルの透明底黒壁プレートで培養し、0.1のMOIで示されたT. gondii株に感染させた。感染後1、2、3日目に、細胞を4% w/vホルムアルデヒドで15分間固定し、同時に透過処理し、0.1% v/v Triton X-100と3% w/vヤギ血清でブロックした。細胞を1:10,000ウサギ抗T. gondii（Thermo社製）および1:500ビオチン化Dolichos bisflorus agglutinin（DBA）で1時間染色し、続いて1:500ストレプトアビジンAlexa 647（Thermo社製）、1:500ヤギ抗ウサギAlexa 488およびDAPIで1時間染色した。Operetta high content imaging system（PerkinElmer）を用いて、ウェル全体を20倍の倍率で撮像した（ウェルあたり69視野）。画像解析はHarmony（PerkinElmer）を用いて行った。T. gondii液胞は抗T. gondii染色により同定した。2匹以上の寄生虫を含む液胞（液胞の長さが8μm以上、幅が4μm以上で定義）のみをさらなる解析の対象とした。DBA陽性の液胞の割合を各ウェルで測定し、各菌株の複製ウェル間の平均割合を各生物学的複製を表すものとした。生物学的複製は3回行った。株間の差は、ボンフェローニ補正を用いた両側t検定により決定した。
定量化と統計解析
デュアルperturb-seqデータの解析
解析の概略は図S1にある。
前処理、フィルタリング、正規化
Homo sapiens GRCh38 release 95とToxoplasma gondii ME49 TGA4 release 42からなる複数種の参照ゲノムを、Cell Ranger v3.0.2（10x Genomics）を用いて作成した。Cell Ranger v6.1.2 (10x Genomics) を用いて、3' mRNA および CRISPR sgRNA ライブラリーから得られたシーケンスリードを、このリファレンスおよびプロトスペーサー配列のカスタムリファレンスにアライメントしました。Cell Rangerは、リードをトランスクリプトーム/プロトスペーサー配列リファレンスにアライメントし、リードをセルバーコードに割り当て、各セルバーコードに割り当てられた各遺伝子/プロトスペーサーのUMI数をカウントし、UMI x cell barcode count matricesを生成する（詳細はsupport.10xgenomics.comを参照）。以降の解析はすべて R v4.0.2 (www.r-project.org)で行った。Cell Ranger の UMI カウントマトリックスを Seurat v4.2.085 にインポートし、H. sapiens mRNA、T. gondii mRNA、CRISPR sgRNA カウントを、1 つの Seurat オブジェクトの別々のアッセイに分割した。細胞バーコードは、感染細胞に対応するH. sapiensとT. gondii mRNAの両方のUMIの合計カウントが高い細胞のみを保持するようにフィルタリングされた。低品質な細胞に特徴的な、ミトコンドリアゲノムにコードされた転写産物に由来するUMIが10%を超える細胞は除去された86。最後に、複数の寄生虫に感染した多血小板やHFFを排除する目的で、プロトスペーサー配列が1つだけ検出された細胞だけを残すようにフィルターをかけた。フィルタリング後、IFNγ刺激データ（9,265対15,920）では、非刺激データ（9,265対15,920）と比較して、回収された細胞の数が少なかったが、これは明らかにソーティング精度がわずかに低下したため（その結果、より多くの非感染細胞が通過した）、細胞生存率、およびsgRNA転写産物の回収率が低下したためである。濾過された細胞は、検出されたプロトスペーサー配列のT. gondii遺伝子標的に基づいて分類された。非刺激サンプルとIFNγ刺激サンプルの両方から得られたperturb-seqスクリーンのレプリケート（Chromiumチャンネル）をマージし、SCTransform v2を用いて正規化した。
エフェクタータンパク質の同定
SCTransform残差("scale.data "スロット)のうち、最も変動が大きい上位3000遺伝子を、Seuratを用いた主成分分析により解析した。各T. gondii標的遺伝子について、上位20主成分における感染細胞の分布を、Hotelling v1.0.8パッケージに実装されているHotellingのt2検定を使用して、他のすべての細胞（既知のエフェクタータンパク質で感染した細胞を除く）と比較した。Benjamini-Hochbergで調整したp値が0.01以下であることを基準にヒットとした。
疑似バルク解析
少なくとも30個の単一細胞で表される各T. gondii標的遺伝子について、最も変動が大きい上位3000遺伝子のSCTransform残差の平均値から擬似バルクトランスクリプトームを作成した。これらの擬似バルクプロファイルを主成分分析によって解析した。Hotellingのt2検定で同定したエフェクターについて、擬似バルクトランスクリプトーム間のピアソン相関係数を計算し、statsパッケージv4.0.4のhclust関数に実装されている完全連鎖法を用いてクラスタリングした。
差次発現遺伝子の同定
パイロット実験では、sg(UPRT)発現細胞を参照集団としてSCTransformで正規化したデータを用いて、両側Wilcoxonランク和検定により発現差のある宿主遺伝子を同定した。スクリーニングでは、各エフェクターについて、他の全ての細胞（コントロールを除く）を参照集団として、同じ方法で差次的に発現した宿主遺伝子を同定した。p値はBenjamini-Hochberg法を用いて調整した。
発現経路の同定
VISION v2.1.0.32でSCTransformで正規化した遺伝子発現データを用いて、Pathway Interaction Database45,46の遺伝子セットの発現について単一細胞をスコア化し、少なくとも30個の単一細胞で表される各T. gondii標的遺伝子について、他のすべてのノックアウト（既知のエフェクタータンパク質を除く）と比較して、そのノックアウトを感染させた細胞における各パスウェイのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを、両側Wilcoxon順位和検定で検定した。Hotellingのt2検定によって同定されたエフェクタータンパク質については、少なくとも1つのエフェクターによって発現が異なるパスウェイそれぞれについて、平均パスウェイZスコアをプロットした（Benjamini-Hochberg調整p値≦0.05）。エフェクターと遺伝子セットは、完全連鎖法を用いてこれらの平均Zスコアを用いてクラスタ化された。
VISIONシグネチャースコアを用いた、公表されているバルク表現型との比較
野生株と比較してT. gondiiノックアウト株感染時に発現が異なる宿主細胞遺伝子を、バルクRNA-seq/マイクロアレイデータから7つのエフェクタータンパク質について抽出した： MYR1（6 hpi RHΔMYR1感染HFF）、16 HCE1（6 hpi RHΔHCE1感染HFF）、17 IST（6 hpi RHΔIST感染HFF）、87 GRA16（18-20 hpi RHΔGRA16感染HFF）、 21 GRA24（18～20 hpi RHΔGRA24感染マウスBMDM）、22 GRA28（RHΔGRA28 感染 THP-1、時点は記載なし）、23 および ROP16（24 hpi II型： ROP16type I対type II野生型感染HFF）。 25 VISION v2.1.0を用いてSCTransformで正規化した遺伝子発現データを用いて、これらの遺伝子セットの発現について単一細胞のトランスクリプトームをスコア化した32。シグネチャースコアが高いほど、単一細胞のトランスクリプトームデータでもバルクのトランスクリプトームデータと同じ遺伝子がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされていることを示す。T. gondiiノックアウト感染細胞は、UPRTノックアウト細胞（パイロット実験）または他のすべての細胞（スクリーン実験）と比較して、対応するシグネチャーのスコアが高いかどうかをWilcoxon順位和検定で検定した。
データとコードの利用可能性
単細胞RNAシーケンスデータ（demultiplexed FASTQ files and Cell Ranger count matrices）は、Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE229505で寄託されている。
本論文のシングルセルRNAシーケンスデータの解析に使用したすべてのオリジナルコードとサポートファイルは、GitHubのhttps://github.com/simonwbutterworth/Dual-Perturb-Seq-2023/。
本論文で報告したデータの再解析に必要な追加情報は、リクエストに応じて入手可能である。
謝辞
フランシス・クリック研究所のCell Services、High Throughput Screening、Flow Cytometry、Advanced Sequencing Facility Science Technology Platformsのサポートに感謝する。49cを提供してくれたDominique Soldatiの研究室に感謝する。Manfred ClaassenとRevant Guptaには、データ解析に関する議論と助言をいただいた。VEuPathDB には、T. gondii のゲノムおよびその他の大規模データセットへのアクセスを提供していただいた。本研究は、M.T.へのWellcome Trustからの研究助成金（223192/Z/21/Z）、M.T.へのCancer Research UK（CC2132）、UK Medical Research Council（CC2132）、Wellcome Trust（CC2132）から基幹研究費を得ているFrancis Crick Instituteからの研究助成金、A.A.K.へのアリゾナ大学医学部からの研究助成金、A.A.K.へのアリゾナ大学BIO5研究所からの研究助成金によって行われた。F.T.はDeutsche Forschungsgemeinschaft (TO 1349/1-1)から資金援助を受けている。フランシス・クリック研究所の科学技術プラットフォームは、Cancer Research UK (CC0199)、UK Medical Research Council (CC0199)、Wellcome Trust (CC0199)から資金提供を受けている。オープンアクセスのため、著者らは、本投稿から生じるAuthor Accepted Manuscript版にはCC BYパブリック著作権ライセンスを適用している。
著者貢献
構想、S.B.およびM.T.；方法論、S.B.およびA.E.；調査、S.B.、S.C.、K.K.T.、F.T.、 およびE.J.L.；正式解析、S.B.およびK.K.；可視化、S.B.；執筆-原案、S.B.およびM.T.；執筆-校閲および編集、全著者；監修、R.G.、A.A.K.およびM.T.；資金獲得、A.A.K.およびM.T.
利益申告
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
補足情報
pdfダウンロード (6.48 MB)
pdfファイルのヘルプ
ドキュメントS1. 図S1-S11
xlsxをダウンロード (1.7 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S1. 図1に関連する、2ガイドパイロット実験におけるsg(MYR1)発現細胞とsg(UPRT)発現細胞間の遺伝子の発現の違い
(A）宿主細胞遺伝子の発現差。

(B）T.gondii遺伝子の発現の違い。

ダウンロード.xlsx (24.46 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S2. 図1に関連する24ガイドパイロット実験における宿主細胞遺伝子の発現差
ダウンロード .xlsx (.09 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S3. デュアルperturb-seqスクリーニングで使用した遺伝子ターゲットとプロトスペーサー配列。
ダウンロード .xlsx (.07 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S4. 図2に関連する宿主細胞遺伝子発現のHotellingのt2検定結果
(A) 複合データ（非刺激およびIFNγ刺激）の結果。

(B）非刺激サンプルデータの結果。

(C）IFNγ刺激サンプルデータの結果。

.xlsxのダウンロード (.02 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S5. 図2に関連するT. gondii遺伝子発現のHotellingのt2検定結果
ダウンロード .xlsx (.49 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S6. 図2に関連する、sg(GRA3)発現細胞におけるT. gondii遺伝子の差次的発現
ダウンロード .xlsx (.03 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S7. 図2に関連する、同族sgRNAを発現する細胞におけるT. gondii遺伝子の差次的発現
ダウンロード .xlsx (2.59 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S8. 図2に関連するPID遺伝子セットの発現差
ダウンロード .xlsx (29.51 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S9. 図2に関連する、有意なエフェクターに対する宿主遺伝子の発現差
ダウンロード .xlsx (.02 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S10. 本研究で使用したDNAプライマー配列、STAR Methods関連
ダウンロード .xlsx (.02 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S11. 本研究で作製したプラスミド、STAR Methods関連
参考文献
Keeling P.J.
マッカチョン J.P.
内共生：気持ちはお互い様ではない。
J. Theor. Biol. 2017; 434: 75-79
論文で見る
スコープス (54)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヤコボビッツ M.R.
ルップ S.
ボスP.A.
メーゲルI.
ゴーニック S.G.
グースA.
宿主細胞の免疫抑制によって嘔吐を免れる渦鞭毛藻共生体。
Nat. Microbiol. 2021; 6: 769-782
論文で見る
(21件)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ハキミ M.-A.
オリアスP.
シブリーL.D.
宿主のシグナル伝達と転写を標的とするトキソプラズマのエフェクター。
Clin. Microbiol. Rev. 2017; 30: 615-645
https://doi.org/10.1128/CMR.00005-17
論文で見る
スコープス (210)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ハンフォードH.E.
フォン・ドゥインゲロJ.
アブ・クワイク Y.
細菌のヌクレオモジュリン： 真核生物の司令塔への共進化的適応。
PLoS Pathog. 2021; 17e1009184
論文で見る
スコープス (13)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ラストギ S．
サイガンA.M.
ブースロイドJ.C.
トキソプラズマ・ゴンディによるエフェクタータンパク質の宿主細胞への移行。
Curr. Opin. Microbiol. 2019; 52: 130-138
論文で見る
スコープス (22)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
バリリュクK.
コレニーL.
Ke H.
バターワース S.
クルックO.M.
ラサディ I.
グプタ V．
トロマー E．
ムーリエ T.
スティーブンス T.J.
他
hyperLOPITによるトキソプラズマプロテオームの包括的細胞内アトラスは、タンパク質機能の空間的背景を提供する。
Cell Host Microbe. 2020; 28: 752-766.e9
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ヤングJ.
ドミニクス C.
ワグネルJ.
バターワース S.
イェ X.
ケリー G．
オーダン M.
サンダース B．
インストレル R．
ハウエルM.
他。
CRISPR プラットフォームを用いた in vivo 標的スクリーニングにより、マウスにおけるトキソプラズマ・ゴンディの病原性因子を同定。
Nat. Commun. 2019; 103963
論文で見る
スコープス（40）
クロスリファレンス
グーグル奨学生
サンガレ・L.O.
オラフソン E.B.
Wang Y.
ヤン N.
Julien L.
カメホ A.
ペサベント P.
シディク S.M.
ルリド S．
バラガンA.
他。
In vivo CRISPRスクリーニングにより、樹状細胞遊走のトキソプラズマモジュレーターとしてTgWIPを同定。
Cell Host Microbe. 2019; 26: 478-492.e8
論文で見る
スコパス (47)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Wang Y.
サンガレ・L.O.
パレデス-サントスT.C.
ハッサン M.A.
クリシュナムルシー S.
古田 A.M.
マーカス B.M.
ルリド S.
Saeij J.P.J.
ゲノムワイドスクリーニングにより、IFNγ活性化マウスマクロファージにおけるトキソプラズマ（Toxoplasma gondii）寄生虫の体力決定因子が同定された。
Nat. Commun. 2020; 115258
論文で見る
Google Scholar
バターワース S.
トレリ F.
ロッキアー E.J.
ワグネルJ.
ソン O.-R.
ブロンセル M.
ラッセル M.R.G.
モレイラ・スーザ A.C.A.
ヤング J.C.
トレック M.
トキソプラズマ・ゴンディの病原性因子ROP1は、マウスおよびヒトの自然免疫制限に対する寄生虫の感受性を低下させる。
PLoS Pathog. 2022; 18e1011021
論文で見る
スコパス(4)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リプルーグルJ.M.
ノーマンT.M.
シュー A.
フスマン J.A.
チェン J.
コーガン J.Z.
ミール E.J.
テリー J.M.
リオーダン D.P.
スリニヴァス N.
他
ガイドRNAの直接捕捉と標的配列決定によるコンビナトリアル単一細胞CRISPRスクリーニング。
Nat. Biotechnol. 2020; 38: 954-961
論文で見る
(134件)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ドナルド R.G.
ルース D.S.
原虫寄生体における挿入突然変異誘発とマーカーレスキュー：Toxoplasma gondii由来ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子座のクローニング。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92: 5749-5753
論文で見る
スコープス (145)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ベーンケ M.S.
ウートンJ.C.
レーマンM.M.
ラドケJ.B.
ルーカスO.
ナワス J.
シブリー L.D.
ホワイト M.W.
トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）のタキゾイトサイクルは、2つのサブトランスクリプトームを介した協調的な進行によって支えられている。
PLoS One. 2010; 5e12354
論文で見る
スコープス (193)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ラドケJ.R.
ストライペンB.
ゲリーニ M.N.
ジェローム M.E.
ルース D.S.
ホワイト M.W.
トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）のタキゾイト期の細胞周期の定義。
Mol. Biochem. Parasitol. 2001; 115: 165-175
論文で見る
スコープス (144)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
フランコ M．
パナス M.W.
マリノ N.D.
リー M.-C.W.
ブッフホルツ K.R.
ケリー F.D.
ベドナルスキー J.J.
スレックマン B.P.
プールマン N.
ブースロイドJ.C.
トキソプラズマの宿主細胞操作の中心となる新規分泌タンパク質MYR1。
mBio. 2016; 7 (e02231-e02215)
論文で見る
スコープス（95）
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ナオール A．
パナスM.W.
マリノ N.
コフィー M.J.
トンキン C.J.
ブースロイドJ.C.
MYR1依存性エフェクターは、トキソプラズマに対する宿主細胞の初期応答の主要なドライバーであり、MYR1非依存性作用を打ち消すことも含まれる。
mBio. 2018; 9 (e02401-e02417)
https://doi.org/10.1128/mBio.02401-17
論文で見る
スコープス (35)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
パナスM.W.
ナオールA.
サイガンA.M.
ブースロイドJ.C.
トキソプラズマは、新規のMYR1依存性エフェクタータンパク質HCE1を用いて宿主のサイクリンE発現を制御する。
mBio. 2019; 10 (e00674-e00619)
https://doi.org/10.1128/mBio.00674-19
論文で見る
スコープス (41)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ブラウン L．
ブレニエ-ピンシャールM.-P.
Hammoudi P.-M.
カンネラ D.
キーファー-ジャキノS.
ヴォレール J.
ジョセラン V.
トゥケ B.
クーテ Y.
タルデュー I.
他
トキソプラズマのエフェクターTEEGRは、EZH2を介してNF-κBシグナルを調節することにより、寄生虫の持続性を促進する。
Nat. Microbiol. 2019; 4: 1208-1220
論文で見る
スコープス (62)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
オリアス P.
イーサリッジR.D.
チャン Y.
ホルツマン M.J.
シブリーL.D.
トキソプラズマエフェクターはMi-2/NuRD複合体をリクルートしてSTAT1転写を抑制し、IFN-γ依存性遺伝子発現をブロックする。
Cell Host Microbe. 2016; 20: 72-82
論文で見る
スコパス (115)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ゲイG.
ブラウン L.
ブレニエ・ピンチャール M.-P.
ヴォレール J.
ジョセラン V.
ベルティーニ R.-L.
ヴァレザーノ A.
トゥーケ B.
デ・ボック P.-J.
クーテ Y.
et al.
トキソプラズマ・ゴンディTgISTは宿主のクロマチン抑制因子を共役し、STAT1依存的な遺伝子制御とIFN-γを介した宿主防御を弱める。
J. Exp. Med. 2016; 213: 1779-1798
論文で見る
スコープス (123)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ブグドールA.
デュランドーE.
ブレニエ-ピンシャールM.-P.
オルテP.
バラカット M.
キーファー S.
クルト＝ヴァレサーノ A.
クルト＝ベルティーニ R.-L.
バスティアン O.
クーテ Y.
他
トキソプラズマGRA16による宿主細胞の破壊、宿主細胞核を標的とし遺伝子発現を変化させる輸出濃顆粒タンパク質。
Cell Host Microbe. 2013; 13: 489-500
記事で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ブラウン L.
ブレニエ・ピンチャート M.-P.
ヨガベル M.
クルト-ヴァレザーノA.
クルト＝ベルティーニ R.-L.
フサイン T.
キーファー-ジャキノS.
クーテ Y.
ペルー H.
タルデュー I.
他
トキソプラズマの濃顆粒タンパク質GRA24は、宿主のp38 MAPK活性化を直接的かつ持続的に促進することにより、感染に対する初期免疫応答を調節する。
J. Exp. Med. 2013; 210: 2071-2086
論文で見る
スコープス (185)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ルツキ E.N.
アンデルS.E.
クームズR.S.
Alrubaye H.S.
カボ L.F.
ブランク M.L.
グティエレス・メロ N.
ドベイ J.P.
コイン C.B.
ボイル J.P.
ヒトおよびマウスにおける制御性ケモカインCCL22の胎盤特異的誘導には、トキソプラズマ・ゴンディGRA28が必要である。
mBio. 2021; 12e0159121
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
テン・ホーヴェ A.L.
ブラウンL.
ロドリゲス M.E.
オリベラ G.C.
ブグドールA.
ベルムデス L.
クーテ Y.
サエイ J.P.J.
ハキミ M.-A.
バラガン A.
トキソプラズマのエフェクターGRA28は、感染マクロファージにおいて樹状細胞様の遊走特性を誘導することにより、寄生虫の播種を促進する。
Cell Host Microbe. 2022; 30: 1570-1588.e7
論文で見る
スコパス (8)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Saeij J.P.J.
コラー S.
ボイルJ.P.
ジェローム M.E.
ホワイト M.W.
ブースロイドJ.C.
トキソプラズマは多型キナーゼホモログの注入によって宿主の遺伝子発現を制御する。
Nature. 2007; 445: 324-327
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マー J.S.
笹井正樹
大島 潤
リー Y.
坂東秀樹
武田和彦
山本幹男
トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）多型濃顆粒タンパク質GRA6による選択的かつ株特異的なNFAT4活性化。
J. Exp. Med. 2014; 211: 2013-2032
論文で見る
スコープス (82)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ヤン C.-S.
Yuk J.-M.
リー Y.-H.
Jo E.-K.
トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）GRA7が誘導するTRAF6の活性化は、宿主の防御免疫に寄与する。
Infect. Immun. 2016; 84: 339-350
論文で見る
スコープス (32)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Li J.-X.
He J.-J.
Elsheikha H.M.
Ma J.
Xu X.-P.
Zhu X.-Q.
ROP18を介したHEK293T細胞の転写リプログラミングにより、トキソプラズマ・ゴンディと宿主細胞の相互作用におけるROP18の新たな役割が明らかになった。
Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020; 10586946
論文で見る
スコパス (4)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ロソウスキー E.E.
ルー・D.
ジュリアンL.
ロッダ L.
ガイザー R.A.
ジェンセン K.D.C.
Saeij J.P.J.
新規Toxoplasma gondii濃顆粒タンパク質GRA15によるNF-κB経路の株特異的活性化。
J. Exp. Med. 2011; 208: 195-212
論文で見る
スコープス (304)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
He H.
ブレニエ-ピンシャールM.-P.
Braun L.
クラウト A.
トゥーケ B.
クーテ Y.
タルデュー I.
ハキミ M.-A.
ブグドゥール A.
トキソプラズマのエフェクターの特性解析から、GSK3/β-カテニンによる代替炎症制御経路が明らかになった。
eLife. 2018; 7e39887
https://doi.org/10.7554/eLife.39887
論文で見る
スコープス (50)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
シャストリ A.J.
マリノ N.D.
フランコ M.
ロドエン M.B.
ブースロイドJ.C.
GRA25はToxoplasma gondiiの新規病原因子であり、宿主の免疫応答に影響を及ぼす。
Infect. Immun. 2014; 82: 2595-2605
論文で見る
スコープス (45)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
デトマソD.
ジョーンズ M.G.
スブラマニアムM.
Ashuach T.
イェ C.J.
Yosef N.
単一細胞類似性マップの機能的解釈。
Nat. Commun. 2019; 104376
論文で見る
スコープス (90)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
アモスB.
アウレコエチアC.
バルバ M.
バレト A.
バセンコ E.Y.
バジャント W.
ベルナップ R.
ブレビンス A.S.
ベーム U.
ブレステリJ.
他。
VEuPathDB：真核病原体、ベクター、宿主のバイオインフォマティクスリソースセンター。
2022; 50: D898-D911
論文で見る
(119件)
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ローゼンバーグ A.
シブリーL.D.
トキソプラズマ・ゴンディの分泌エフェクターは宿主のリプレッサー複合体を共用してネクロプトーシスを阻害する。
Cell Host Microbe. 2021; 29: 1186-1198.e8
論文で見る
(35件)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
シディク S.M.
Huet D.
ガネサン S.M.
フイン M.-H.
ワン T.
ナサム A.S.
Thiru P.
サエイ J.P.J.
カラザーズ V.B.
ナイルズ・J.C.
他
トキソプラズマのゲノムワイドCRISPRスクリーニングにより、必須アピコンプレクサンを同定。
Genes Cells. 2016; 166: 1423-1435.e12
論文で見る
スコープス (448)
Google Scholar
ホテリング H.
スチューデント比の一般化。
Ann. 数学。Statist. 1931; 2: 360-378
論文で見る
クロス
グーグル・スカラー
マヨラル J.
冨田敏。
トゥー V.
アギラン J.T.
シドーリ S.
ワイス L.M.
トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）PPM3Cは、分泌型タンパク質リン酸化酵素であり、寄生体の液胞エフェクターの輸送に影響を与える。
PLoS Pathog. 2020; 16e1008771
論文で見る
スコパス (8)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シェン B．
ブラウン K.M.
リー T.D.
シブリー L.D.
CRISPR/CAS9を用いたトキソプラズマ・ゴンディの多様な株における効率的な遺伝子破壊。
mBio. 2014; 5 (e01114-e01114)
https://doi.org/10.1128/mBio.01114-14
論文で見る
スコープス(308)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
マリノ N.D.
パナスM.W.
フランコ M.
ザイセン T.C.
ナオール A.
ラストギ S．
ブッフホルツ K.R.
ロレンツィ H.A.
ブースロイド J.C.
トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）の寄生体液胞膜を通過するエフェクターのトランスロケーションに必須な新規タンパク質複合体の同定。
PLoS Pathog. 2018; 14e1006828
論文で見る
スコープス (53)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
サイガン A.M.
ザイセンT.C.
メンドーサ A.G.
マリノ N.D.
パナス M.W.
ブースロイド J.C.
MYR1との共免疫沈降法により、Toxoplasma gondii寄生体液胞内で濃顆粒エフェクターの宿主細胞への移行に必要な3つの追加タンパク質が同定された。
mSphere. 2020; 5 (e00858-e00819)
https://doi.org/10.1128/mSphere.00858-19
論文で見る
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
パナスM.W.
フェレルA.
ナオールA.
テンボーグ E.
ロレンツィ H.A.
ブースロイドJ.C.
トキソプラズマ感染細胞における寄生体液胞膜を横切る濃顆粒エフェクターのトランスロケーションには、ホプトライプロテインキナーゼであるROP17の活性が必要である。
mSphere. 2019; 4 (e00276-e00219)
https://doi.org/10.1128/mSphere.00276-19
論文で見る
スコープス (35)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ブレイクリー W.J.
ホームズ M.J.
Arrizabalaga G.
トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）由来の分泌型酸性ホスファターゼドメイン含有GRA44は、感染細胞におけるc-Myc誘導に必要である。
mSphere. 2020; 5 (e00877-e00819)
https://doi.org/10.1128/mSphere.00877-19
論文で見る
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
山本幹男
スタンドリーD.M.
高嶋慎太郎
斎賀秀樹
奥山雅史
嘉山秀樹
久保英明
伊藤英明
高浦正明
松田哲也
他
Toxoplasma gondiiキナーゼROP16上の1つの多型アミノ酸が、Stat3の直接的かつ系統特異的な活性化を決定する。
J. Exp. Med. 2009; 206: 2747-2760
論文で見る
スコープス (193)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
オング Y.-C.
リース M.L.
ブースロイドJ.C.
トキソプラズマのホプトリータンパク質16（ROP16）は、STAT6の直接的なチロシンリン酸化によって宿主機能を破壊する。
J. Biol. Chem. 2010; 285: 28731-28740
論文で見る
スコープス(173)
パブコメ
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
シェーファーC.F.
アンソニーK.
クルパ S.
ブチョフ J.
デイ M.
ハネイ T．
Buetow K.H.
PID：パスウェイ相互作用データベース
核酸研究 2009; 37: D674-D679
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
リベルゾン A.
スブラマニアンA.
ピンチバックR.
トルヴァルズドッティル H.
タマヨ P.
メシロフ J.P.
分子シグネチャーデータベース（MSigDB）3.0。
バイオインフォマティクス。2011; 27: 1739-1740
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
パナスM.W.
ブースロイドJ.C.
トキソプラズマはGRA16を使って宿主のc-Mycをアップレギュレートする。
mSphere. 2020; 5 (e00402-e00420)
https://doi.org/10.1128/mSphere.00402-20
記事で見る
クロスフィルム
グーグル・スカラー
ナディプラム S.M.
キム E.W.
バシシュト A.A.
リン A.H.
ベル H.N.
コペンス I.
ウオルシュレーゲルJ.A.
ブラッドリー P.J.
トキソプラズマの寄生体液胞のin vivoビオチン化により、寄生虫の増殖と病原性に重要な新規濃顆粒タンパク質が明らかになった。
mBio. 2016; 7 (e00808-e00816)
https://doi.org/10.1128/mBio.00808-16
論文で見る
スコパス (87)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
サイガン A.M.
ジャン・ベルトラン P.M.
メンドーサ A.G.
ブラノン T.C.
ティン A.Y.
カー S.A.
ブースロイド J.C.
トキソプラズマ寄生体液胞膜における宿主および寄生体タンパク質の近接性標識による新規発見。
mBio. 2021; 12e0026021
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ロッキアー E.J.
トレリF.
バターワース S.
ソン O.-R.
ハウエル S.
ウェストン A．
イースト P.
トレックM.
トキソプラズマタンパク質のヘテロ三量体複合体は、インターフェロンガンマ刺激ヒト細胞における寄生虫の生存を促進する。
PLoS Biol.
論文で見る
(0件)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
クリシュナムルシー S.
マル P.
ワン Y.
バイトウ M.A.
ムコパディヤイ D.
ヤマリョ＝ボッテ Y.
パレデス-サントスT.C.
サンガレ・L.O.
スワレ C．
ボッテ C.Y.
他
CRISPRスクリーニングにより、インターフェロンガンマ刺激ヒト細胞における寄生虫のフィットネスを決定するトキソプラズマ遺伝子が同定された。
mBio. 2023; 14e0006023
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
松倉真一
ステラートC.
プリットJ.R.
ビッケル C.
三浦和彦
ゲオラス S.N.
カソラロ V.
シュライマーR.P.
ヒト気道上皮細胞におけるNF-κBとSTAT6によるエオタキシン遺伝子転写の活性化。
J. Immunol. 1999; 163: 6876-6883
論文で見る
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ホエックJ.
Woisetschläger M.
ヒト皮膚線維芽細胞におけるeotaxin-3/CCLl26遺伝子発現の活性化はSTAT6によって媒介される。
J. Immunol. 2001; 167: 3216-3222
論文で見る
スコープス (99)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
コタニデス H.
ライヒ N.C.
IL-4によるDNA結合因子の迅速な活性化にはチロシンリン酸化が必要である。
Science. 1993; 262: 1265-1267
https://doi.org/10.1126/science.7694370
論文で見る
スコパス (231)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ホウ J.
シンドラーU.
ヘンゼル W.J.
ホー T.C.
ブラッスール M.
マックナイト S.L.
インターロイキン4誘導転写因子：il-4 stat...
Science. 1994; 265: 1701-1706
論文で見る
哺乳類
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シンドラーC.
カシュレバH.
ペルニスA.
パインR.
ロスマンP.
STF-IL-4：新規IL-4誘導シグナル伝達因子。
EMBO J. 1994; 13: 1350-1356
https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1994.tb06388.x
論文で見る
スコープス (169)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
クエル F.W.
下田紘一
ティアフェルダー W.
フィッシャー C.
キム A.
ルーベン S.M.
クリーブランド J.L.
ピアース J.H.
キーガン A.D.
ネルムス K.
IL-4およびIL-3に応答してチロシンリン酸化されるが、有糸分裂には必要とされないStatタンパク質、マウスStat6およびヒトStat6のクローニング。
Mol. Cell. 生物学 1995; 15: 3336-3343
論文で見る
(308ページ)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ドッガ S.K.
ムカルジー B.
ジャコD.
コックマンT.
モリノ L.
ハムディ P.-M.
ハートコルン R.C.
ヘール A.B.
ソルダティ・ファーブルD.
トキソプラズマの侵入と脱出に不可欠な薬剤投与可能な分泌タンパク質マチュラーゼ。
eLife. 2017; 6e27480
https://doi.org/10.7554/eLife.27480
記事で見る
スコープス (55)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ジェンセン K.D.C.
ワン Y.
ヴォイノ E.D.T.
シャストリ A.J.
Hu K.
コーネル L．
ボエデック E.
オン Y.-C.
チエン Y.-H.
ハンター C.A.
他。
トキソプラズマの多型エフェクターは、マクロファージの分極化と腸の炎症を決定する。
Cell Host Microbe. 2011; 9: 472-483
論文で見る
(179件)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
マレー P.J.
ウィン T.A.
マクロファージサブセットの保護機能と病原性機能。
Nat. Rev. Immunol. 2011; 11: 723-737
論文で見る
スコパス(3583)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
チェン L.
クリスチャン D.A.
コチャノフスキーJ.A.
ファン A.T.
クラーク J.T.
ワン S.
ベリー C．
オー J.
チェン X.
ルース D.S.
et al.
トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）病原因子ROP16はシスおよびトランスで作用し、T細胞応答を抑制する。
J. Exp. Med. 2020; 217e20181757
https://doi.org/10.1084/jem.20181757
論文で見る
スコープス (31)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ミルズ C.D.
キンケード K.
アルトJ.M.
ハイルマン M.J.
ヒル A.M.
M-1/M-2マクロファージとTh1/Th2パラダイム。
J. Immunol. 2000; 164: 6166-6173
論文で見る
スコパス(2124)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Dubey J.P.
第1章 トキソプラズマ・ゴンディの歴史とライフサイクル。
in： Weiss L.M. Kim K. Toxoplasma gondii. 第2版。Academic Press, 2014： 1-17
論文で見る
スコープス (26)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ポーター S.B.
サンデM.A.
後天性免疫不全症候群における中枢神経系のトキソプラズマ症。
N. Engl. J. Med. 1992; 327: 1643-1648
論文で見る
スコパス (526)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
トゥラダール S.
コチャノフスキーJ.A.
Bhaskara A.
ゴトミ Y.
チャンドラセカラン S.
Koshy A.A.
ROP16IIIに依存する初期免疫応答は、亜急性中枢神経系免疫応答とIII型トキソプラズマ・ゴンディの生存を決定する。
PLoS Pathog. 2019; 15e1007856
論文で見る
スコープス (14)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
コチャノフスキーJ.A.
チャンドラセカラン S.
サンチェスJ.R.
トーマス・K.K.
Koshy A.A.
ROP16を介したSTAT6の活性化は、神経細胞におけるIII型トキソプラズマ・ゴンディのシスト形成を促進する。
PLoS Pathog. 2023; 19e1011347
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ワイス L.M.
キム・K.
トキソプラズマ・ゴンディの褐虫藻の発生と生物学。
Front. Biosci. 2000; 5: d391-d405
論文で見る
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヘイマンO.
イェヘズケルD.
シオッリ・マッティオリC.
ブルンベルガーN.
ローゼンバーグG.
ソロモン A.
ホフマン D.
ボセル・ベン・モシェ N.
Avraham R.
マルチプレックスタグ付き細菌変異体を用いたペアシングルセル宿主プロファイリングにより、細胞内の病原性と免疫ネットワークが明らかになった。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2023; 120e2218812120
論文で見る
日本学術振興会特別研究員 (0)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ポルヴォリック S．
サンティビアゴC.A.
チェン P.
ロングF.
デサイ P.
フレッドランド J.
スライクマール S.
シルバ C.A.
チュー W．
チェン X.
他。
Salmonella Enterica sv Typhimuriumにおける明確な単一遺伝子および複数遺伝子欠失変異体コレクション。
PLoS One. 2014; 9e99820
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
アビタルG.
アブラハムR.
ファンA.
ハシムショニーT.
フン D.T.
柳井一男
scDual-Seq：宿主と病原体の単一細胞RNAシーケンスによるサルモネラ菌感染の遺伝子制御プログラムのマッピング。
ゲノム生物学 2017; 18200
論文で見る
スコープス (61)
PubMed
Crossref
グーグル奨学生
ドナルド R.G.
カーター D.
ウルマンB.
ルース D.S.
トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）ヒポキサンチン・キサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の挿入的タグ付け、クローニングおよび発現。安定形質転換のための選択マーカーとしての使用。
J. Biol. Chem. 1996; 271: 14010-14019
論文で見る
スコープス (359)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
フイン M.-H.
カラザーズV.B.
Ku80を欠損したToxoplasma gondii株における内因性遺伝子のタグ付け。
Eukaryot. Cell. 2009; 8: 530-539
論文で見る
スクパス (352)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シュナイダー C.A.
ラズバンド W.S.
Eliceiri K.W.
NIH ImageからImageJへ：画像解析の25年。
Nat. Methods. 2012; 9: 671-675
論文で見る
スコープス (38794)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ハーフェマイスターC.
Hafemeister C. Satija R.
正則化負の二項回帰を用いたシングルセルRNA-seqデータの正規化と分散の安定化。
Genome Biol.
論文で見る
スコープス (1299)
PubMed
Crossref
グーグル奨学生
チョーダリー S．
Satija R.
scRNA-seqの統計的エラーモデルの比較と評価。
Genome Biol.
論文で見る
スコープス(35)
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
マディセンL.
ズウィングマンT.A.
サンキンS.M.
オー S.W.
ザリワラ H.A.
グ H．
ン L.L.
パルミター R.D.
ホーリッチ M.J.
ジョーンズA.R.
他。
マウスの全脳を対象とした頑健で高スループットなCre報告および特性解析システム。
Nat. Neurosci. 2010; 13: 133-140
論文で見る
筑波大学
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
チャンドラセカラン S.
コチャノフスキーJ.A.
メリットE.F.
ラガス J.S.
スワニガン A.
Koshy A.A.
IFN-γで刺激されたマウスおよびヒトのニューロンは、細胞内寄生虫トキソプラズマ・ゴンディに対する抗寄生虫防御を行う。
Nat. Commun. 2022; 134605
論文で見る
スコパス (7)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
蘇 C.
チャン X.
Dubey J.P.
多座PCR-RFLPマーカーによるToxoplasma gondiiの遺伝子型判定：寄生虫同定のための高分解能かつ簡便な方法。
Int. J. Parasitol. 2006; 36: 841-848
論文で見る
スコープス (309)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シェン B．
ブラウン K.
ロング S.
シブリー L.D.
トキソプラズマ・ゴンディにおける効率的ゲノム編集のためのCRISPR/Cas9の開発。
Methods Mol. Biol. 2017; 1498: 79-103
論文で見る
スコープス (66)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
カブラル C.M.
マクガバン K.E.
マクドナルドW.R.
フランコ J.
コーシー A.A.
神経栄養寄生虫Toxoplasma gondiiの別系統を新規ツールとして用いたアミロイドβ沈着の解剖。
ASN Neuro. 2017; 91759091417724915
論文で見る
スコープス (21)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ジャンパーJ.
エヴァンスR.
プリッツェルA.
グリーン・T.
フィガーノフ M.
ロンネバーガー O．
トゥニャスヴナクールK.
ベイツ R.
ジーデク A.
ポタペンコA.
他
AlphaFoldによる高精度タンパク質構造予測。
Nature. 2021; 596: 583-589
論文で見る
論文リスト
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヴァラディ M.
アニャンゴ S.
デシュパンデM.
ナイル S.
ナタシア C.
ヨルダノワ G.
ユアン D.
ストロー O.
ウッド G.
レイドンA.
et al.
タンパク質構造データベース（AlphaFold Protein Structure Database）：高精度モデルによるタンパク質配列空間の構造カバレッジの大規模拡大
Nucleic Acids Res. 2022; 50: D439-D444
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ポッター S.C.
ルチアーニA.
エディ S.R.
パークY.
ロペス R.
フィン R.D.
HMMERウェブサーバー： 2018 update.
Nucleic Acids Res. 2018; 46: W200-W204
論文で見る
スコープス (950)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マデイラ F．
ピアース M.
ティビーA.R.N.
バスツカー P.
リー J.
エドバリ O.
マドゥスーダナン N.
コレスニコフ A.
Lopez R.
2022年におけるEMBL-EBIの検索および配列解析ツールサービス。
Nucleic Acids Res. 2022; 50: W276-W279
論文で見る
スコープス (477)
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ハオ Y.
ハオ S.
アンデルセン-ニッセンE.
マウク3世、W.M.
鄭 S.
バトラー A．
リー M.J.
ウィルク A.J.
ダービー C．
ゼイガーM.
他
マルチモーダルなシングルセルデータの統合解析。
Cell. 2021; 184: 3573-3587.e29
論文で見る
論文リスト(2596)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
イリチッチ T.
キム J.K.
Kolodziejczyk A.A.
バガー F.O.
マッカーシー D.J.
マリオーニ J.C.
タイヒマン S.A.
シングルセルRNA-seqデータからの低品質細胞の分類。
ゲノム生物学 2016; 1729
論文で見る
スコープス (358)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マッタ S.K.
オリアスP.
黄 Z.
ワンQ.
パーク E.
横山 W.M.
シブリー L.D.
トキソプラズマ・ゴンディのエフェクターTgISTは、I型インターフェロンのシグナル伝達を遮断して感染を促進する。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019; 116: 17480-17491
論文で見る
スコープス (39)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2023年10月11日
受理 受理：2023年9月7日
改訂版受理 2023年8月4日
受理：2023年8月4日 受理：2023年6月5日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.09.003

著作権
© 2023 The Author(s). 発行：エルゼビア社
ユーザーライセンス
クリエイティブ・コモンズ 表示 (CC BY 4.0)｜情報アイコンの再利用方法
サイエンスダイレクト
ScienceDirectでこの論文にアクセスする
図
図サムネイルfx1
グラフィカルアブストラクト
サムネイルgr1
図1デュアルperturb-seq転写プロファイルは、既知のT. gondiiエフェクターの表現型を再現する。
図のサムネイルgr2
図2A デュアルperturb-seqスクリーニングにより、宿主細胞の転写を標的とするT. gondiiエフェクターが同定された。
図のサムネイルgr3
図3GRA59（TGGT1_313440）は密顆粒エフェクタータンパク質の輸出に寄与している
図のサムネイルgr4
図4SOS1（TGGT1_222100）は感染細胞におけるSTAT6シグナルの持続に必要である
図のサムネイルgr5
図5SOS1は神経細胞における効率的なブラジゾアイト嚢子形成を維持する
関連記事
広告

研究ジャーナル
細胞
癌細胞
細胞化学生物学
細胞ゲノム
細胞宿主と微生物
細胞代謝
細胞レポート
セルレポーツ医学
セルレポーツ・メソッド
セルレポート 物理科学
細胞幹細胞
細胞システム
化学
化学触媒
カレントバイオロジー
発生細胞
ヘリオン
免疫
アイサイエンス
ジュール
物質
医学
分子細胞
ニューロン
一つの地球
パターン
STARプロトコル
構造
トレンドレビュージャーナル
生化学
バイオテクノロジー
癌
細胞生物学
化学
認知科学
生態学・進化学
内分泌学・代謝学
遺伝学
免疫学
微生物学
分子医学
神経科学
寄生虫学
薬理学
植物科学
パートナージャーナル
AJHG
生物物理ジャーナル
生物物理学レポート
EBioMedicine
HGGアドバンス
分子植物
分子療法ファミリー
植物通信
幹細胞レポート
イノベーション
コレクション
ベスト・オブ・セルプレス
セルプレスレビュー
セルプレスセレクション
コンソーシアムハブ
Nucleusコレクション
スナップショット・アーカイブ
ジャーナルを超えて
細胞キャリアネットワーク
細胞シンポジウム
ラボリンク
ウェビナー
論文を進化させる
図360
複数ジャーナル投稿
スニークピーク
STARメソッド
社会における科学
細胞写真ショー
セルプレスポッドキャスト
セルプレスビデオ
ぬりえ＆コミック
リサーチ・アーク
コネクト
セルプレスについて
採用情報
お問い合わせ
ヘルプ＆サポート
ニュースルーム
出版アラート
アクセス
購読申し込み
今すぐ読む
司書に薦める
インフォメーション
広告主の皆様へ
リクルーターの方へ
図書館員の方へ
利用規約
プライバシーポリシー
アクセシビリティ
本サイトのコンテンツは、あらゆる科学分野の医療従事者および研究者を対象としています。

当サイトでは、サービスの提供・向上およびコンテンツのカスタマイズのためにクッキーを使用しています。クッキーの設定を更新するには、このサイトのクッキー設定をご覧ください。
このサイトのすべてのコンテンツ： 著作権 © 2023 Elsevier Inc.
テキストマイニング、データマイニング、AIトレーニング、および同様の技術に関するものも含め、すべての権利はエルゼビア社に帰属します。
すべてのオープンアクセスコンテンツには、クリエイティブ・コモンズのライセンス条件が適用されます。

プライバシーポリシー 利用規約 アクセシビリティ ヘルプ＆サポート お問い合わせ
RELX