小麦の真菌エンドファイト群集は宿主と不可分であり、植物の発育に影響を与える

2024年1月11日 18:46

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研究論文
2023年12月22日
小麦の真菌エンドファイト群集は宿主と不可分であり、植物の発育に影響を与える

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.02533-23

著者 Or Sharon https://orcid.org/0000-0003-1299-6127, Naomi Kagan-Trushina, Amir Sharon https://orcid.org/0000-0002-6045-9169 amirsh@tauex.tau.ac.ilAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.02533-23
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概要
はじめに
結果
考察
材料と方法
謝辞
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参考文献
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参考文献
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要旨
植物は複雑で非常に多様な真菌類エンドファイト（FEC）群集を保持しているため、個々の分類群、群集のサブセット、あるいはFEC全体の機能的役割を評価することは困難である。このシステムの複雑さを軽減するため、われわれは真菌ヌル小麦（Triticum aestivum）の生産を目指した。この目的のため、熱と殺菌剤で種子を処理し、救出した胚とカルス組織から植物を作製した。培養に基づくアプローチと逆転写PCR分析では陰性であったことから、すべての処理で真菌を見かけ上含まない植物が得られることが示された。しかし、digital droplet PCRと次世代シークエンシングを用いたDNA解析の結果、すべての処理から得られた組織は、低レベルながら多様性に富んだFECを保持していることが明らかになった。FECの組成は処理と組織によって異なるが、いずれも菌叢の中核分類群を含んでいた。真菌バイオマスの減少は、FEC組成の変化とともに、植物の発達に悪影響を及ぼし、植物の適切な発達とフィットネスへのFECの寄与を支持した。FECの大部分は植物から分離することができず、種子や組織培養を通して伝播することができるという我々の発見は、コアタクサの概念、伝播様式、機能種といった特定のマイクロバイオームパラダイムを再評価することを求めている。
重要性
単一分類群や合成群集の効果を評価する際には、その植物にもともと存在するマイクロバイオームを考慮しなければならない。既存のマイクロバイオームは、人工的に添加された微生物カーゴと相互作用する可能性があり、最終的な結果に影響を与える。このような問題は、エンドファイトを含まない植物を使用することで少なくとも部分的には解決できる。この植物は、単一の分類群、分類群の組み合わせ、またはマイクロバイオーム全体が植物のパフォーマンスに及ぼす影響を決定する際に有用であるはずの清浄な背景を提供する。これまでの報告では、培地上で真菌が増殖しないこと、あるいは組織培養から植物が生成されることで、植物はエンドファイトを含まない、あるいはアクセニックであるとみなされていた。我々はここで、殺菌剤で処理した植物や組織培養で再生させた植物から真菌を分離することはできなかったが、それでもすべての植物が豊富な真菌エンドファイト群集を含んでいること、すなわち真菌フリーのコムギ植物を作ることは不可能であることを示した。この結果は、中核分類群、伝播様式、機能種といった微生物群に関連する基本的な概念を再考する必要性を示唆している。
はじめに
真菌類エンドファイト（FECs）群集は非常に複雑でダイナミックであるため、特定の効果を単一の分類群または分類グループに帰属させることは困難である。さらに、あるFECの構成は、群集内の分類群間の相互作用に大きく支配されており（1, 2）、中核種や機能種の同定を複雑にしている。
パンコムギのFECはいくつかの研究で特徴づけられている(3-6)。コムギと5種の穀類野生作物近縁種における茎真菌エンドファイトの最近のメタ解析では、これらの植物種における中核分類群はCladosporium属とAlternaria属に属する真菌類で構成されていることが示された(7)。さらに、酵母の一種であるCandida sakeが小麦において最も豊富な分類群であることが判明し、第1段階の中核分類群として同定された。コアマイクロバイオームが宿主植物において重要な役割を果たしていることは広く想定されている。しかし、コア種の機能的役割に関する実験的証拠はまだ乏しい(8)。
このような複雑な問題を克服し、コアマイクロバイオームやその他のマイクロバイオームの機能解析を支援する一つの方法は、エンドファイトを含まない植物を作出することである。このような植物はまた、単一の分類群または分類群の組み合わせによる影響を明らかにすることを目的とした研究に役立ち、微生物生態学研究を促進し、植物マイクロバイオーム内の微生物-微生物相互作用研究のツールとして役立つ。エンドファイトを含まない植物を生産する方法には、熱処理と殺菌剤処理がある。熱は、宿主Agrostis hyemalisからエンドファイトを持つEpichloë amarillansを除去し(9)、エンドファイトを含まないコムギ植物を生産するために用いられてきた(10)。同様に、ライグラス（Lolium perenne および Lolium multiflorum）をクラビシペティカス属真菌のエンドファイトから清浄化するために、熱および殺菌剤処理が用いられてきた（11）。エンドファイトを含まない種子を得るには、種子表面の殺菌で十分であることが様々な研究で報告されている(12-15)。
微生物を含まない植物を生産する方法として、組織培養も試みられている。例えば、分裂組織の再生によって生産されたイチゴやバナナは真菌を含まないことが報告されており（16, 17）、無菌胚から育てた小麦の苗は細菌を含まないことが判明している（18）。しかし、さらなる研究により、さまざまな植物種の胚やカルスに真菌が存在することが報告され（19-21）、次世代シーケンシング（NGS）を用いてコナラの胚を調べたところ、多様な真菌・細菌群集の存在が明らかになった（22）。
我々の当初の目的は、エンドファイトを含まないパンコムギ（Triticum aestivum L.）の植物と種子を生産し、それを用いて真菌エンドファイトがコムギの発育に及ぼす影響を研究することであった。種子の熱処理と殺菌剤処理、胚とカルスからの植物体の生産、およびすべての処理の組み合わせを用いた。驚くべきことに、真菌を含まない植物を生産することはできなかった。DNAの定量化により、すべての処理によって真菌バイオマスが劇的に減少したが、除去されたわけではないことが明らかになり、NGS分析により、元の組織、得られた植物、新しい種子のすべてに、真菌の分類群に富み、対照植物のFECと同様に多様なFECが含まれていることが示された。真菌の負荷が減少した新しい種子は、発芽率が低く、発育が遅かった。これらの結果を総合すると、真菌類エンドファイトはコムギ植物と切っても切れない関係であり、真菌類の荷量と組成が植物のフィットネスと発育に影響することを裏付けている。
結果
エンドファイトを含まない植物の生産
熱処理および殺菌剤処理
まず、種子を65℃で30分間培養した。1週間後、種子の発芽は見られなかったが、種子の約20%が真菌培養物を生産した（表S1）。次に、広範囲のグループ3殺菌剤であるスポルタックの効果を試験した。スポルタックの濃度が1%～5%の場合、種子の発芽に影響はなかったが、酵母のコロニーはすべての濃度で観察された。種子を水中でプレインキュベーションせずにスポルタックで処理した場合、発芽率は80％以下に低下し、糸状菌のコロニーが40％近くの種子で発育した（表S1）。したがって、熱処理やスポルタック処理では、種子内生菌の除去には不十分であった。
より効果的な処理を求めて、さらに3種類の殺菌剤を選択した（表1）。まず、コムギFECに多く含まれる5種の真菌（Mycosphaerella tassiana、Alternaria infectoria、Alternaria alternata、Cryptococcus magnus、Cladosporium cladosporioides）の感受性を調べた。それぞれの殺菌剤に対する菌の感受性は様々であったが、すべての菌種は4種類の殺菌剤の組み合わせで阻害された（表S2）。これらの結果に基づき、各殺菌剤を1%ずつ含む溶液に種子を2時間浸漬する処理を選択した。このプロトコールでは、種子の発芽率は50%未満に低下し、6%の種子で真菌のコロニーが形成された（表S1）。殺菌剤にさらす前に種子を発芽させると、すべての苗が生存し、明らかな真菌の増殖は見られなかった。このことは、この手順が真菌の発生を防ぎながら、種子に害を与えないことを示している。
表1
表1 本研究で使用した殺菌剤
会社名有効成分殺菌剤クラス
スポルタックメルハブアグロ社イスラエルプロクロラズクラス 3
ベイフィダン 250 リドールエレメンツ、イスラエルトリアジメノールクラス 3
Folicur Lidor Elements, イスラエル Tebuconazole クラス 3
Ortiva Top Adama, イスラエル Difenoconazole + azoxystrobin クラス 3 + 11
植物の再生
胚とカルス組織の両方から植物を再生させた。これらの植物をムラシゲ・スクーグ（MS）培地を入れた滅菌ガラス管に移し、3週間生育させた。いずれの場合も、真菌の増殖は観察されなかった（Fig.）
殺菌剤処理および再生した植物体に真菌が本当にいないことを確認するため、前述の各方法で苗を生産し（表2）、生育培地に0.1%殺菌剤ミックス（vol/vol）を添加したものと添加しないものを無菌チューブで3週間生育させた後、植物組織をポテトデキストロース寒天培地（PDA）にサンプリングしてプレーティングした。30日間にわたり、いずれの処理でも真菌は検出されなかった（Fig. S2A）。次に、茎のサンプルからRNAを抽出し、真菌特異的チューブリンおよびコムギアクチンプライマーを用いて逆転写PCR（RT-PCR）分析を行った。コムギアクチンプライマーはすべてのサンプルで均一なバンドを生成したが、真菌特異的プライマーは対照植物および真菌の茎から得られたcDNAでのみアンプリコンを生成した（図S2B）。これらの結果から、処理した植物では、培養やRT-PCR分析によって真菌を分離・検出できないことが確認された。植物に真菌がいないことをさらに確認するため、すべての処理から得られたサンプルをNGSでチェックした。予期せぬことに、単離およびRT-PCR分析とは対照的に、NGSデータからすべての植物に真菌DNAが含まれていることが明らかになった（表S4）。ddPCR（digital droplet PCR）による定量化では、種子と比較して、胚とカルスにおける真菌DNA量が少なくとも10倍減少（コピー/μL）しており、対照植物と処理植物の茎の間でも同様であった（図1）。これらの結果から、殺菌剤処理およびマイクロプロパゲーションによって、処理植物中の真菌エンドファイトが除去されたわけではなく、観察された真菌の増殖およびRT-PCRアンプリコンの欠如は、おそらく真菌負荷の大幅な減少によるものであることが示された。
図1

図1 菌源組織および対応する植物の茎における真菌DNAの量。植物はガラス管内で殺菌剤を添加または無添加で生産し、3週間後にサンプルを採取してDNAを抽出し、真菌特異的ITS1FおよびITS2プライマーを用いてddPCRにより真菌DNA量を定量した。「真菌DNA」は、真菌Botrytis cinereaから単離したDNAを陽性対照とした。左はソース組織中の真菌DNAのコピー数、右は対応する植物の茎中の真菌DNAのコピー数。処理間の統計的差異は、一元配置分散分析およびTukeyポストホック検定分析を用いて算出した。統計的に異なる（P < 0.05）処理は異なる文字で表した。
表2
表2 異なる処理から得られた茎サンプルの説明
処理名
Cont MS培地を入れたガラス管中でコントロールの種子から生育させた茎サンプル。
SF MS培地を入れたガラス管中で、殺菌剤中で培養した種子から生育させた茎サンプル。
SF f 殺菌剤添加 MS 培地を含むガラス管中で、殺真菌剤中で培養した種子から生育させた茎試料。
胚 MS培地を含むガラス管中で胚から生育させた茎のサンプル。
胚 f 胚から、殺菌剤を添加した MS 培地を含むガラス管中で生育させた茎のサンプル。
カルス MS培地を含むガラス管中で、カルスから生育させた茎のサンプル。
カルス f 殺菌剤を添加したMS培地を含むガラス管中でカルスから生育させた茎のサンプル。
FEC組成
種子および組織培養
アンプリコン配列データの解析から、異なる組織におけるFECの組成に著しい変化があることが明らかになった。胚およびカルスでは、種子に比べて分類群数が劇的に増加し、種子では合計8分類群であったのが、胚およびカルスではそれぞれ57および68分類群であった（図2A）。さらに、タクサ・リッチネスとシャノン指数は胚とカルスで4倍高かった（P < 0.001）（表S5）。Bray-Curtis非類似度行列を用いた存在量の主座標分析（PCoA）と並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）分析では、種子のFECと胚およびカラスのFECの間に明確な分離が見られた（F = 4.7361, R2 = 0.38186, P < 0.001）（図2B; 表S6）。
図2

図2 発生源組織におけるFEC。(B）ブレイ・カーティス非類似度行列に基づくFECのPCoA。PERMANOVA分析によると、種子FECは胚およびカルスFECと統計的に異なる（P < 0.001）。(C）ヘリンジャー変換した存在量データに基づく、異なるソース組織における真菌分類群のクラスレベルの相対存在量。
FEC構造の変化も観察された。種子では相対存在量が1に近く（0.97と0.99）、歯糸状菌が優勢であったが、胚とカルス組織では平均0.5に減少し、酵母や酵母に似たクラス、例えばMicrobotryomycetesやSaccharomycetesが濃縮された（図2C）。異なる組織で検出された104分類群のうち、全組織サンプルに共通して検出されたのは4分類群のみであった： Stemphylium ASV6、Coliolopsis gallica、A. infectoria、A. alternataであり、これらの分類群の存在量は組織によって異なっていた（表S7）。最も顕著なのはA. infectoriaで、種子では優勢であったが（相対存在量はコントロールで0.7、殺菌剤処理種子で0.84）、カルスと胚では0.2以下に減少した（表S7）。種子におけるA. infectoriaの優位性とは異なり、カルスと胚のFECを支配する単一の分類群は見出されず、これらの組織のFECで最も優位な分類群（胚ではA. alternata、カルスではCladosporium sphaerospermum）は相対存在量が0.2以下であった。その結果、カルスと胚のFECは種子のFECよりも均等性が高かった。カルスと胚のFECにおけるPielouの均等性指数は0.94であったのに対し、対照と殺菌剤処理種子ではそれぞれ0.36と0.4であった（表S5）。Cladosporium属など、コムギに共通するその他の真菌分類群は、対照種子を除くすべてのサンプルで検出された。これらの結果は、コムギのカルスと胚は真菌類の分類群に富み、種子では検出されないユニークな分類群を多くの割合で含んでいることを示している。
処理植物
胚とカルスから再生した植物の茎には80以上の分類群が含まれ、その数はコントロール（23）と殺菌剤処理（24）の種子から再生した植物の茎の数の約2倍であった（図3A）。DNAを含まないサンプルのうち2つ（ネガティブコントロール）はリードを含まなかったため、QIIME2プラットフォームを用いた最初のQAプロセスを通過しなかった。3 番目のサンプルには、3 つのアンプリコン配列バリアント (ASV) のみを含む 1,772 個のリードが含まれていました：ボトリティス・シネレア（Botrytis cinerea）、ボトリティス・カロリニアナ（Botrytis caroliniana）、ステレウム・オストレア（Stereum ostrea）の3種のみであった（表S7）。
図3

図3 茎のFEC。(A) 異なる茎グループ間で共通する真菌分類群とユニークな真菌分類群を示す逆プロット。赤で示した線は、すべての処理に共通する分類群の数を示す。対照サンプルはオレンジ色で示す。(B) Bray-Curtis非類似度行列に基づくFECのPCoA。対照茎のFECは、PERMANOVAとペアワイズアドニス分析によると、他のすべてのFECと統計的に異なる（P < 0.001）。(C) ヘリンジャー変換した存在量データに基づく、異なる茎における真菌分類群のクラスレベルの相対存在量。茎の処理に関する注釈は表2にある。
すべてのグループ間の分類群リッチネスにおける差は、統計的に有意ではなかった。コントロール種子の茎のFECは最低の多様性（シャノン指数）を示し、他のすべての植物処理のFECと統計的に異なっていた（P < 0.005）（表 S5）。Bray-Curtis非類似度行列を用いたPCoAとPERMANOVA分析では、対照植物と処理植物の茎からのFECの間に明確な分離（F = 2.2237, R2 = 0.2326, P < 0.001）が示された（図3B; 表S6）。
処理した種子または再生植物からの茎中のFECは、対照植物の茎中のFECとは異なる組成を有していた。供給源組織で観察された存在量と同様に、Dothideomycetes 属に属する分類群の相対存在量は、対照植物の茎では 0.99 であったのが、処理した植物の茎では平均 0.6 まで低下した（図 3C）。A. infectoriaは、対照区の茎（0.7）、殺真菌剤処理した種子由来の茎（0.4）および胚再生植物（0.35）において最も豊富な分類群であったが、カルス再生植物（0.09）ではそうではなく、M. tassiana（0.26）とA. alternata（0.24）が最も豊富であった（表S7）。Pielouの均等性指数は対照区の茎では低く（0.4）、処理区の茎（0.9）とは統計的に区別された。これは、対照区の茎のFECは少数の分類群に支配されているのに対し、処理区の茎のFECは均等に分布していることを示している。処理群間で分類群数の差が観察されたものの、クラスカル・ワリス統計解析によると、統計的に有意な差は認められなかった。
すべての処理において、殺菌剤を添加した培地で生育した植物の茎は、殺菌剤を含まない培地で生育した対応する植物の茎と比較して、より少ない分類群を含んでいた（図3A）。さらに、殺菌剤を添加した培地で生育した植物の茎に含まれる真菌類の分類群は、対応する植物に含まれる分類群とは異なっていた。例えば、胚から作られた茎には82の分類群が見られたが、培地に殺菌剤を添加した場合、この数は58分類群に減少した。すべての処理から得られた茎から検出された200分類群のうち、全グループに共通するのはわずか9分類群のみであった：4つのCladosporium sp.、2つのAlternaria sp.、Blumeria graminis、M. tassiana、および単一の酵母分類群Sporobolomyces roseus（図3A）。
NGSのデータを総合すると、ソース組織におけるFECの変化は対応する茎に拡大し、そのFECに影響を与えることがわかる。また、植物成長培地を殺菌剤で補うことで、分類群の数が減少し、対応する植物のFECの組成が変化することも示された。
新しい種子の分析
処理した植物の茎で観察された真菌バイオマスの減少は、新しい種子にも及んだ；様々な処理からの種子中の真菌DNAの激減は、供給源の種子と比較して明らかであった（図4A）。70の種子サンプル（表S8およびS9）のITSアンプリコン・シークエンシングの結果、供給源および新しい種子では40分類群、殺菌剤処理種子およびカルス再生植物の種子ではそれぞれ32および33分類群、胚再生植物の種子では最大70分類群が検出された（図4B）。陰性コントロールの配列決定ではシグナルが得られず、QIIME2のQCプロセスで自動的に除去された。種子の異なるグループ間（観察された分類群の数とシャノン指数）でFECの多様性に差は観察されず（表S10）、Bray-Curtis非類似度行列に基づくPCoA分析では、新しい種子のFECとソース種子のFECは分離されなかった（図4C）。しかし、PERMANOVAとペアワイズ・アドニスは、新種と原産種子のFEC間に統計的な差異を示したが、新種の異なるグループ間には認められなかった（F = 1.8605, R2 = 0. 0.20998, P < 0.001）（表S11）。
図4

図4 種子中のFEC。(A）種子中の真菌DNA量。植物を温室で栽培し、種子を採取して表面殺菌し、DNAを抽出した。真菌DNA量は、真菌特異的ITS1FおよびITS2プライマーを用いたddPCRで定量した。処理間の統計的差異は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）と Tukey post hoc 検定を用いて解析した。統計的に異なる処理（P < 0.05）は異なる文字で示した。(B) 異なる種子グループ間で共通する真菌分類群とユニークな真菌分類群を示す逆プロット。赤で示した線は、すべての種子FECに共通する分類群の数を表す。ソース種子（対照試料）はオレンジ色で示す。(C) Bray-Curtis非類似度行列に基づくFECのPCoA。ソース種子からのFECは、PERMANOVAおよびペアワイズアドニス分析によると、他のすべての新種FECと統計的に異なる（P < 0.001）。(D) Hellinger変換した存在量データに基づく、種子中の真菌分類群のクラスレベルの相対存在量。(E) 種子に最も多く含まれる上位10分類群の相対存在量。各分類群の値は平均相対存在量を表す。詳細は表2を参照。
乾燥菌類は種子FEC全体で最も豊富な分類群であったが、相対的存在量は異なるグループ間でかなり異なっていた（図4D）；原産種子で最も多く（0.91）、殺菌剤処理種子から生産された植物の種子で最も少なく（0.14）、その中では放線菌類が最も豊富な分類群であった（0.53）。すべての処理から得られた新しい種子では、放線菌酵母も濃縮されていた。
異なる処理におけるFECは、種レベルで高いばらつきを示した。最も顕著だったのは、原産種子中の相対存在量が最も高かったA. infectoria（0.61）で、新産種子では0.05以下に減少し、Acremonium sclerotigenumとCladosporium sp.に取って代わられた（図4E；表S12）。Kruskal-Wallis統計解析およびBenjamini and Hochberg調整P値によると、種子グループ間の分類群の存在量の差は統計的に有意ではなかった。さらに、Pielouの均等性指数は、処理植物からの供給源種子と新しい種子との間で有意な差はなかった（表S10）。
真菌類の分類群数は異なる種子グループ間で異なり、殺菌剤処理胚から生産された植物の種子では70分類群、殺菌剤処理種子から生産された植物の種子では32分類群であった（図4B）。ほとんどの分類群（134分類群のうち109分類群）は特定のグループに特有であり、すべての処理から得られた種子に共通する分類群は8分類群のみであった：Cladosporium sp.4種、Alternaria sp.2種、A. sclerotigenum、C. gallica。
一般に、新しい種子には子株の茎と同程度かそれ以下の分類群が含まれていた。種子中の167分類群のうち113分類群は茎にも含まれていた。新しい種子の各グループに含まれるFECを、対応する植物の茎に含まれるFECと比較した結果、一般的に24%の分類群が種子に固有で、28%が種子と茎に共通で、残りの分類群は茎の1つ以上のグループに見られた。すべての処理から得られた種子と茎の間で共有されていたのは4つの分類群のみであった： A. infectoria、A. alternata、C. sphaerospermum、C. cladosporioidesであった。
これらの新種子の分析を総合すると、殺菌剤に常に曝露され、清浄な条件下で生育しているにもかかわらず、得られた種子にはバイオマスは少ないが、FECの多様性は豊かであり、FECの組成は原種種子と比較して劇的に変化していた。
植物のフィットネスへの影響
このような真菌の負荷と組成の変化が、植物のフィットネスと発育に影響するかどうかを調べるため、3つの処理から得た新しい種子と、原産種子の発芽と成長を比較した： (i)クラドスポリウム・ハロトレランス（Cladosporium halotolerans）が最も豊富な分類群（0.33）であったカルス、(ii)A. スクレロチゲナム（A. sclerotigenum）が最も豊富な分類群（0.55）であった殺菌剤処理種子、および(iii)優勢な分類群が存在しなかった殺菌剤処理カルスである（表S12）。
原植物の種子の発芽率は 98％であったのに対し、各処理区の種子の発芽率は平均 82％であった（図 S3）。新しい種子から発芽した生後14日目の苗は、供給源の種子から発芽した苗よりもシュートと根が短く、バイオマス量も少なかった。3つの処理区の中で、殺菌剤で処理したカルスからの苗は、シュートの長さが最も短かった（図5）。また、カルスおよび殺菌剤処理した種子の苗は、対照群に比べて根が短く、殺菌剤処理した種子の苗は、他の全群に比べて根のバイオマスが最も少なかった（図5）。これらの結果は、真菌負荷の低減と、観察されたFECの組成の特異的変化が、植物発生の初期段階に様々な悪影響を及ぼすことを示していた。
図 5

図5 種子処理が苗のバイオマスおよびサイズに及ぼす影響。発芽した種子を砂に植え、清潔な温室で育てた。14日後、苗を土から引き抜き、集中的に洗浄し、根とシュートの長さとバイオマスを記録した。統計的差異は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）と Tukey post hoc 検定を用いて分析した。統計的に異なる（P < 0.05）処理区は、異なる文字で示した。詳細は表2を参照。
前の実験で示された表現型に基づき、殺菌剤処理した種子とカルスから生産された植物の種子を選択し、苗から成熟までの植物発生における真菌エンドファイト組成とバイオマスの変化の影響を試験した。殺菌剤で処理した種子から生産された植物は、最も強い発育変化を示した：発育不良を示し（図6）、3週間で蘖数が最も少なくなり、4週間でシュート重量が最も少なくなった（図S4）。6週目（ヘッディング）には、殺菌剤処理した種子の株は、他のグループよりも花穂を持つ株の割合が低く、全体の花穂数も少なかった。また、開花期の最初の2週間には、花穂数が最も少なかった（図6）。カルス再生植物の種子から生育させた植物は、どの測定パラメータにおいても、原植物の種子から生育させた対照植物との統計的な差異は認められなかった。成熟期には、収量（種子の数および重量）、花穂および茎の重量において、いずれの処理区間でも統計的に有意な差は見られなかった（図 S5）。
図 6

図 6 植物発生に対する種子処理の影響。発芽した種子を泥炭を入れた 3L ポットに植え、清潔な温室で成熟まで生育させた。生育期間中、発育パラメータを記録した：(A)蘖数、(B)花穂数および開花時の花穂数、(C)花穂を持つ株の割合、(D)開花時に花穂を持つ株の割合。処理間の統計的差異は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）と Tukey post hoc 検定を用いて分析した。統計的に異なる（P < 0.05）処理区は異なる文字で示した。詳細は表2を参照。
全体として、真菌負荷の低減は植物の発育に概して悪影響を及ぼした。しかし、このデータは、異なる処理によるFEC組成の特異的な変化が、植物の発育に、菌類バイオマスの変化よりもさらに重大な影響を及ぼす可能性があることを示している。
考察
エンドファイトの群集は複雑であるため、個々の分類群の影響を評価することは困難である。システムの複雑さを軽減し、FECの特定のメンバーまたは一部の分析を簡素化するため、既報のアプローチを用いて、コムギ植物から本来の真菌カーゴを除去し、真菌を含まない植物を作出することを試みた。すべての処理で内生菌のバイオマスは劇的に減少したが、これまでの報告（10, 11, 16）とは対照的に、植物は、どの方法を用いても除去できなかった、由来FECとは量も組成も異なる多様なFECを保持していた。これらの驚くべき結果は、環境中に非常に多く存在する種や潜在的な病原体である種を含め、植物とそのFECとの間に密接かつ断ち切れない関係があることを示している。真菌バイオマスの減少は植物の発育に悪影響を及ぼし、植物のフィットネスにとってFECが重要であることを裏付けている。
植物上あるいは栄養豊富な培養液中で真菌が増殖していることを目視で確認できないことは、これまで真菌のいない植物の証拠とされており（10, 25, 26）、無菌植物あるいはaxenic植物を用いて作業することは、真っ当な慣行とみなされてきた（13, 14, 27）。我々の培養分離とRT-PCR分析は、これらの報告と一致している。しかし、以前から指摘されているように（21, 28）、長期間経過しても真菌が増殖しないだけでは、植物に真菌が本当に存在しないかどうかを判断するには不十分である。我々は、ddPCR (29)を用いて、異なる処理から少量の真菌DNAを検出することができた。陰性対照（DNAなし）のシグナルはゼロではなく、検出閾値を示す値であった。いくつかの処理では、真菌DNAのレベルはこの閾値より低く、これらの組織には真菌が存在しないことを示唆していた。しかしNGSのデータは、真菌バイオマスの量が激減したにもかかわらず、すべてのサンプルに豊富なFECが含まれていることを示した。
NGS解析の結果、種子から茎、種子、そして胚やカルスに至るまで、植物発生のあらゆる段階において、広範な真菌類が伝播可能であることが示された。これらの分類群は陰性対照群では検出されず、また群集は発生源組織から茎、新しい種子へと各段階で絶えず変化していたことから、外部からの汚染や偽陽性の結果から生じた可能性は排除され、処理した植物では目に見える真菌の増殖が見られず、RT-PCRで真菌を検出できないにもかかわらず、真菌が生存していることが確認された。さらに、新たに開発された植物は、無菌チューブ内で無菌状態で長期間培養されたため、元の組織に存在した真菌に由来するものでなければならない。ひとつの可能性として、検出された真菌は代謝的に不活性か休眠状態であり(30)、そのために増殖せず、殺菌剤処理に耐える能力がないことが説明できる。また、宿主植物が殺菌剤から菌類を守っているか、殺菌剤が十分な濃度で菌類に到達していない可能性もある。とはいえ、植物組織中に生菌が存在するにもかかわらず、真菌が増殖しないことは不可解であり、さらなる調査が必要である。
すべての植物種はFECを保有しており、その中には数百から数千の真菌の変異体が含まれている可能性がある(31-34)。菌根菌や内生性のEpichloë種やSerendipita種など、FECの特定のグループは、宿主に利益をもたらす相互依存関係を形成している。しかし、大半の分類群は、特定の機能的役割を持たない常在菌と考えられている。コムギと関連する野生種における研究から、FECには高い割合で低存在の散発性分類群と、一般にコア分類群と呼ばれる比較的安定した高存在の分類群の小さなサブセットが含まれることがわかっている（3, 7, 24）。コア分類群は植物とより密接な関係にあり、宿主に直接作用するか（35, 36）、あるいは植物マイクロバイオームの集合体を形成する（37, 38）ことにより、機能的な役割を担っている可能性があると考えられてきた。今回の結果は、植物から真菌を取り除くことはできないだけでなく、植物内に保持されているFECには、非中核的で希少な分類群もかなり含まれていることを示している。この知見は、これまで散発的または時折と考えられていた腐生菌種や潜在的病原体を含む広範な真菌内生菌が垂直伝播能力を持つことを示す報告に追加された（4, 5, 22）。この研究で使用したプライマー（ITS1fとITS2）は、特定の真菌分類群に偏っており、ITS領域を持たない真菌やプライマー部位に変異を持つ真菌を検出できないことに注意することが重要である（39）。さらに、ITS領域はフザリウム属のような種の多い属に属する種を正確に同定するために必要な可変性に欠ける(40)。このような制約があるにもかかわらず、われわれは多数の希少な分類群を検出することができ、より正確な分類学的マーカーがあれば、さらに多様な群集を明らかにできたと思われる。FECの大部分が植物から切り離せず、種子や組織培養を通じて伝播することがわかったことは驚くべきことであり、コアタクサの概念、伝播様式、機能種など、特定のマイクロバイオームパラダイムを再考する必要がある。
植物のカルスや胚内に真菌類が存在することは、以前にも報告されている。Bouteloua eriopodaとAtriplex canescensのカルスは真菌に包まれていることがわかったが、これらの組織から真菌を培養することはできなかった(21)。既存の研究で行われたNGS解析では、コナラ（Quercus robur L.）の胚に21の真菌分類群が存在することが示され（22）、小麦8品種の胚に30属の細菌が存在することが報告されている（41）。これらの結果と一致し、我々は胚で57、カルスで68の真菌分類群を検出した。組織培養物およびそれに対応する再生植物中の FEC には、A. infectoria、A. alternata、Cladosporium spp.などのコムギ FEC (7)の最も一般的な分類群すべてに加え、Pseudoidium neolycopersici（トマトうどんこ病）やコムギの義務的病原体である Blumeria graminins などの植物病原菌を含む、コムギ種子や茎ではこれまで検出されなかった ASV が含まれていた。
異なる処理区のFECは構成が異なり、多くの分類群が各処理区に固有であった。少数の分類群はすべての処理に共通しており、関心のあるいくつかのマイクロバイオーム（35）、この場合は供給源の種子と組織、新しい茎、新しい種子の間で共有されているため、コア分類群とみなすことができる。植物から除去できなかった最も顕著な共通分類群は、AlternariaとCladosporium種であった。これらの分類群は、コムギやその近縁作物、イネ科植物に非常に多く存在することが以前に判明しており（3-5, 24, 42, 43）、コムギおよび穀類作物の近縁野生イネ科植物5種において中核的な分類群であることが確認されている（7）。アルテルナリアとクラドスポリウムの分類群はすべての処理区のサンプルから検出されたが、相対的な存在量はかなり異なっていた。A.infectoriaは原種種子で最も多く、新種種子では激減したが、Cladosporium属は原種種子と比較して胚、カルス、新種種子で増加した。これらの結果は、アルテルナリア属の垂直伝播性は比較的低く、クラドスポリウム属の垂直伝播性が高いという報告と一致している(4)。
マイクロバイオーム研究の主な目的は、有益な微生物（23, 44-46）や微生物コンソーシアム（47-50）を同定することである。このような単離株や合成群集の植物への影響を評価する際には、既存のマイクロバイオームを考慮することが重要である。予想通り、内生菌の負荷を減らすことは植物の発育に悪影響を及ぼしたが、FEC組成の変化はバイオマスの減少以上に影響力があることが判明した。例えば、防カビ剤で処理した種子から育てた植物は、成長が遅れた。この処理によるFECへの最も顕著な影響は、A. infectoriaがA. sclerotigenumに取って代わられ、最も豊富な分類群となったことである。両種はコムギを含む多くの植物種に共通するエンドファイト（43, 51, 52）であるが、潜在的な植物病原菌（53, 54）でもある。アルテルナリア種はコムギにおいて最も多く存在するエンドファイトであるが、有益な効果は実証されていない。一方、A. sclerotigenumは潜在的な生物防除剤として報告されており(51, 55)、パンコムギの水分制限条件下で植物の成長を促進することが判明した(56)。内生菌が優勢か病原性菌が優勢かという厳密な分類は近年変わってきており、菌類は条件によって生活様式を変えることが、例外というよりむしろ規則的になってきている(57-59)。観察されたA. infectoriaのバイオマスの減少は、FEC内のバランスを損ない、その結果、A. sclerotigenumのバイオマスが増加し、有益または常在菌的な生活様式から寄生的な生活様式へとシフトした可能性がある。
これらの知見を総合すると、FEC内の分類群の構成とバランスが変化すると、特定のFECメンバーの宿主への影響が変化する可能性があることが示され、微生物-植物および微生物-微生物相互作用の動態をより深く理解する必要性が浮き彫りになった。植物を真菌から治療することはできなかったが、マイクロバイオーム研究のさまざまな側面において、エンドファイトを減らし、FECを改変した植物を使用することは有益である。温室環境はFECの組成に大きな影響を与えるため（4）、自然条件下でのさまざまな処理またはFECの変化の効果を評価することが重要であろう。
材料と方法
植物材料
実験は、2015-201 年に生産されたコムギ cv. Galilの種子を用いた。この種子は2015-2016年に生産され、6℃の乾燥した（湿度15%以上）貯蔵室で保管された。
熱処理
手順は(11)に記載されたプロトコルを改変した。種子を23℃の水浴中で4時間インキュベートし、乾燥させた後、65℃で30分間インキュベートした。処理した種子をPDA（Acumedia Manufacturers, Inc.） 7日後、発芽と真菌コロニー形成を記録した。
殺菌剤処理
未発芽種子を熱処理種子と同様に23℃で培養し、1％、3％、5％（vol/vol）のスポルタクを含む水溶液に1時間移し、PDA上に置いた。7日後に種子の発芽と真菌のコロニー形成を記録した。
発芽した種子（56個）を、4種類の殺菌剤の組み合わせと濃度を変えた水溶液中で2～4時間培養した（表1）。殺菌剤で処理した種子を滅菌したガラス管に移し、半分の強さのMS培地を加え、16時間/8時間の明暗を繰り返すグロースチャンバー内で、明期24℃、暗期22℃で培養した。3週間後に植物の生存率と菌類コロニーの形成を記録した。
植物の再生
未熟なコムギ種子を70％エタノールに1分間、次いで11％次亜塩素酸ナトリウムに11分間浸漬して表面殺菌し、滅菌二重蒸留水（DDW）で5回洗浄した後、胚を無菌条件下で解剖した。詳細なプロトコールはmethods S1を参照。
新しい種子
オートクレーブ滅菌したガラス管に、0.1%の殺菌剤ミックス（vol/vol）を添加または無添加した半強度MS培地を入れ、苗を生産した。3週間後、苗をオートクレーブ処理した砂を入れた0.5Lポットに移した。週2回、滅菌DDWに滅菌ホーグランド栄養液を加え、潅水した。2週間ごとに、混合殺菌剤で処理した。発芽前に、スパイクをオートクレーブ処理した紙袋で覆った。すべての種子を3％漂白剤中で5分間インキュベートして表面殺菌し、滅菌DDWで3回洗浄した後、層流フード中で一晩乾燥させた。
殺菌剤に対する真菌の感受性
小麦に多く含まれるエンドファイトを代表する5つの菌株を選択した：すなわち、Mycosphaerella tassiana、Alternaria infectoria、Alternaria alternata、Cryptococcus magnus、Cladosporium cladosporioidesである。生後7日目のコロニーから採取した菌糸体を、試験した殺菌剤の組み合わせと濃度を添加したPDAのある24穴プレートに移した。プレートは22℃で培養した。4日後に放射状成長を記録した。各処理は4反復を含み、実験は3回繰り返した。
真菌の分離
生後3週間の植物を3～5cmに切り、10％PDAを入れたプレートに置いた。各プレートには1株の葉、芽、根のサンプルを入れた。真菌の増殖は30日間モニターした。
RNAの抽出とRT-PCR
TRIzol試薬（60）を用いて3週齢の茎からRNAを抽出した。RNA サンプル（2 µg）を RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific, USA）を用いて逆転写した。RT-PCRは、2組のプライマー：真菌チューブリンプライマーBT2α／T222（61、62）およびコムギ特異的アクチンプライマーActin＿wheat＿F（5′-AGGGAGTCCGAGTGATCCCGA-3′）およびActin＿wheat＿R（5′-ACCGTGCCCATTTACGAAGGAT-3′）を用いて行った。詳細については、方法S1を参照のこと。
DNA抽出およびアンプリコン配列決定
種子サンプルには 1～3 粒の種子（100～150 mg）を含む；1 個のスパイク中の全種子の胚をプールして 1 個のサンプル（100～150 mg）を作成した；1 個の未分化カルスおよび 100～150 mg の茎サンプルを使用した。サンプルは 2 mL の滅菌チューブに入れ、液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保存した。他のサンプルと同様に処理した空のチューブから、3種類のネガティブコントロール（DNAフリー）を作製した。DNAは、3つの異なる時点で、真のサンプルとともに空のチューブから抽出した。さらに、真菌やその他の汚染を避けるため、DNA抽出専用のフードを備えた別の研究室でDNAを抽出した。すべてのサンプルは、オートクレーブ滅菌または濾過した器具と試薬で取り扱った。
サンプルは一晩凍結乾燥し、Geno/Grinder 2000（OPS Diagnostics社、ニュージャージー州）で粉砕し、CTABプロトコル（24）を用いてDNAを抽出した。真菌ITSアンプリコン、ライブラリー調製、塩基配列決定は文献(24)に従って行った。ITS1f（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）およびITS2r（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）プライマーを用いてアンプリコンライブラリーを作成した（63）。コントロール種子、殺菌剤処理種子、胚、カルス、茎サンプルは1回のイルミナランで配列決定し、新しい種子は別のランで配列決定した。
シーケンス処理およびデータ解析
QIIME2プラットフォーム（64）およびDADA2パイプライン（65）と "Cutadapt"（66）を用いて、参考文献（4）に記載されているように配列を処理した。最終的なデータ解析は、参考文献(4)に従ってRバージョン4.0.2環境で行った。詳細はmethods S1を参照。
デジタル液滴PCR
真菌DNAの定量はQX200 Droplet Digital PCR System（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を用いて行った。詳細はメソッド S1 を参照。
植物の表現型決定
植物の発育は、最適な温室条件下で試験した。短期実験では、4つの異なる種子グループ（原種子、F1 SF、F1カルス、および殺菌剤を添加したF1カルス）から植物を14日間生育させた。長期実験では、ソース種子、F1 SF、および F1 カルス種子から植物を生育させた。詳細な実験情報については、方法S1および表2を参照のこと。
謝辞
カルス再生過程を通して、穀物研究所のArava Shatil博士のご助力に感謝する。また、NGS解析についてご指導いただいた河北大学のXiang Sun博士に感謝する。最後に、このプロジェクトに資金を提供してくださったイスラエル農務省のChief Scientist grant 383/15に感謝したい。
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