アタマジラミの核遺伝子の多様性から、世界各地へのヒトの拡散が明らかになる

2024年4月3日 11:07

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研究論文
アタマジラミの核遺伝子の多様性から、世界各地へのヒトの拡散が明らかになる

https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0293409

マリーナ・S・アスクンス、アリエル・C・トロサ、アンジェリカ・ゴンサレス＝オリバー、デビッド・L・リード

要旨
ヒトジラミ（Pediculus humanus）は偏性吸血性外部寄生虫であり、数千年にわたりヒトと共生してきた。この寄生虫とヒト宿主との密接な関係を考えると、ヒトジラミの研究は、他の生物学的証拠では解釈が困難なヒトの進化の側面を明らかにする可能性を秘めている。本研究では、核マイクロサテライト遺伝子座と雌性ミトコンドリアDNA配列を用いて、世界25地点のヒトジラミ274頭の遺伝的変異を解析した。核遺伝的多様性解析により、2つの異なる遺伝的クラスターIとIIが存在することが明らかになり、それらはサブクラスターに細分化された：それぞれIa-IbとIIa-IIbである。これらのサンプルの中で、我々は2つの最も一般的なシラミのミトコンドリアハプログループの存在を観察した： AおよびBは核クラスターIおよびIIの両方に見られた。核の混血は珍しく（12％）、アメリカ大陸の植民地化の歴史を反映している可能性がある新世界で優勢であった。これらの知見は、宿主と寄生虫の両方のデータを用いてパラメータを定義し、cIとcIIの混血がごく最近であることを示唆するモデルを構築した新しいDIYABCシミュレーションによって支持された。このパターンは、これら2つの核遺伝クラスター間の生殖障壁の結果である可能性もある。本研究は、このヒト寄生虫に関する新たな進化的知識を提供するだけでなく、他の宿主-寄生虫系における新たな解析の開発に役立つと考えられる。

引用 Ascunce MS, Toloza AC, González-Oliver A, Reed DL (2023) アタマジラミの核遺伝学的多様性は、ヒトの世界的な拡散に光を当てる。PLoS ONE 18(11): e0293409. doi:10.1371/journal.pone.0293409

編集者インド、バナーラス・ヒンドゥー大学、Gyaneshwer Chaubey

受領：受理：2022年10月18日：受理：2022年10月18日; 受理：2023年9月26日; 掲載：2023年11月8日発行：2023年11月8日

本論文はオープンアクセス論文であり、著作権は一切なく、合法的な目的であれば、誰でも自由に複製、配布、送信、修正、構築、その他利用することができる。本論文は、クリエイティブ・コモンズCC0パブリックドメインのもとで利用可能である。

データの利用可能性：すべての関連データは論文およびそのSupporting Informationファイル内にある。

資金提供： ACTはConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnica, Argentina（CONICET）の研究者であり、本研究はCONICETのPIP 2016-0198CO、PICT 2016-1111およびPICT-2019-01334からACTに部分的な財政支援を受けた。AGOはConsejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), México, Project CB 2015, no.252130から一部資金援助を受けた。この研究は、DLRに対するNSF助成金DEB 1655600からも一部助成を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成には関与していない。

競合利益：著者らは、競合する利害関係は存在しないと宣言している。

はじめに
ヒトジラミ（Pediculus humanus, Phthiraptera: Anoplura）は、吸血性で翅のないヒトに特有な外部寄生虫であり、義務性（宿主なしでは生きられない）で永続性（宿主の上でライフサイクルを終える）を有する [1] 。このような関係から、ヒトとシラミは共進化研究の理想的な対象である [2, 3]。過去の研究では、霊長類のシラミは過去2500万年（MY）にわたり宿主と共棲していたことが示されている [2, 3]。さらに、系統発生学的解析により、ヒトとチンパンジーのシラミ属Pediculusは約5.6万年前（MYA）に分岐したことが明らかになった。ヒトのアタマジラミは、ブラジル北東部の1万年前のヒトの遺体から発見されたアタマジラミ[5]や、イスラエルで発見された9,000年前のアタマジラミ[6]など、考古学的遺跡から見つかっている（図1）。シラミがヒトの外部寄生虫として最古のもののひとつであるという考えを裏付ける、世界各地で発見されたヒトのシラミに関する複数の考古学的知見を図1に示す。宿主-寄生虫系では、このような長期的な関係が宿主と寄生虫の相互適応（すなわち共進化）につながる可能性があり、寄生虫と宿主の系統樹を構築し、宿主と寄生虫の両方で共起した事象の時間推定を得ることができる[7]。寄生虫と宿主が切っても切れない関係にある場合、寄生虫の系統樹は宿主の進化史を反映している可能性がある [8-10]。また場合によっては、進化速度が比較的速く、個体群サイズが大きいといった寄生虫特有の生活史的特徴があるため、寄生虫は宿主よりも高いレベルの遺伝的多様性を長期にわたって維持することができる。このため研究者は、寄生虫の遺伝的多様性を利用して、考古学的遺跡や宿主の分子データなど、宿主の直接的証拠に基づく宿主進化の不明確な側面を探ることができる[10-13]。ヒトジラミの進化学的研究は、ヒトの進化研究における有用なツールであることがすでに証明されている。シラミの進化研究は、人類がいつ衣服を使い始めたか [14, 15]、人類がどのように世界各地を移動したか [16-18]など、初期の人類の生態に関する洞察を提供してきた。最近では、南米の古代ミイラの毛髪から発見されたダニからヒトのDNAが抽出され、人類の祖先の移動ルートが明らかになった[19]。さらに約20年前、Reedら [2]は、ヒトジラミのミトコンドリア・クレードが非常に分岐していることを報告し、それぞれのシラミのミトコンドリア系統が異なるヒト宿主上で進化したと仮定した。著者らは、解剖学的に現生人類（AMH）がアフリカから移動し、他のヒト科の動物と交流するにつれて、ヒト科の動物間の直接的な物理的接触により、異なる系統のシラミが宿主から宿主へと移動したことを示唆した [2]。ヒトジラミのデータから予測された、現生人類と古人類との直接的な接触という仮説は、その後、ヒトの遺体から採取した古代のDNAゲノムとAMHゲノムを比較した宿主ゲノム研究によって確認された[20]。

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図1. ヒトとシラミ。
この地図は、本研究で対象とした現代人のアタマジラミの地理的分布を緑色の点で示したものである。ヒトジラミの考古学的発見は、地図上のヒトジラミの図と、それに対応する推定年代[3, 5, 6, 21, 22]で示されている。加えて、地図はヒト科の化石遺跡のおおよその位置と、[23-38]に基づく分布案を反映している： [23-38]. 各ホミニンは以下のように色分けされている：ネアンデルタール人（青）、デニソワ人（黒）、解剖学的現生人類（オレンジ）。地図はウィキメディアからダウンロードした：地図作成者 Maulucioni (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:World_map_with_the_Americas_on_the_right.png)。このファイルはCreative Commons Attribution-Share Alike 4.0 International licenseの下でライセンスされている。https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/legalcode。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.g001

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ヒトジラミの遺伝的多様性は、ミトコンドリアDNAに基づいて広く研究されてきた。しかし、このヒトジラミの核遺伝的多様性については、特に世界的な規模ではほとんど知られていない。初期のヒトジラミのミトコンドリア研究から、A、B、Cと名付けられた3つの深く分岐したmtDNAクレードまたはハプログループの存在が明らかになった［2、3、14、17、39］。ハプログループAは、ヒトジラミのハプログループの中で最も一般的で、世界中に分布しており、2,000年前のイスラエルにおける人類の考古学的遺体からシラミが見つかっている [21]。ハプログループBは、アメリカ大陸、ヨーロッパ、オーストラリア、北アフリカ、南アフリカ [17, 39-41]で見つかっており、イスラエル [21] とペルー [3] の古代人の遺体からも見つかっている。ハプログループCは地理的に限定された分布をしており、ネパール、エチオピア、コンゴ民主共和国、パキスタン、タイで発見されたシラミにのみ存在する[14, 21, 42]。最近の研究では、さらに3つのクレードの存在が示唆されている： D、E、Fである [41, 43, 44]。クレードDは、エチオピア、ジンバブエ、コンゴ民主共和国で発見されたクレードAと姉妹関係にある[41, 43, 45]。クレードEはクレードCと姉妹関係にあり、セネガルとマリのアタマジラミから検出された[41]。クレードFは、他の地域では報告されていないことから、南米に特異的であると思われる［44］。アタマジラミはすべてのミトコンドリア・クレード（A～F）で検出されるが、衣料シラミはクレードAとDでのみ検出される［45］。入手可能なすべてのチトクロームb（cytb）遺伝子ヒトジラミ配列を用いた最近の研究では、これら6つのクレードの存在が裏付けられた： A、B、C、D、E、Fである。さらに、クレードADとBFは0.9MYA頃に最も新しい共通祖先を持っており、AからクレードD、BからクレードF、CからクレードEが分裂したのは同時期の0.6MYA頃であった[46]。多くの研究者がシラミのミトコンドリア多様性に関して広範な研究を行ってきたにもかかわらず、この母方から伝達される分子マーカーには、異なるシラミ集団間での交雑現象など、解決できない性質がある。この限界を克服するために、両親遺伝をする15種の新しい核マイクロサテライトマーカーが開発された[16]。この新しい研究では、ヒトジラミの遺伝的多様性を包括的に理解し、ヒトジラミ間の混血を評価するために、15種類のマイクロサテライトマーカーを用いた。

シラミのマイクロサテライト多様性に関する我々の以前の研究では、4つの地理的地域から11の地点の75匹のアタマジラミのみを対象とした[16]。その結果、ヒトジラミの核遺伝的多様性には大陸間の違いがあることが明らかになり、アメリカ大陸で見られた遺伝的パターンは、ヒトの宿主が新大陸に入植したときの様子を反映している可能性があることがわかった。この新しい研究では、シラミのサンプリング数を274に拡大し、10の地理的地域に分布する25の場所を対象とした（表1、S2ファイルのS1表、および図1）。このような幅広いサンプリングにより、ヒトジラミの核遺伝的多様性の理解を深めるとともに、ミトコンドリア多様性との相関をよりグローバルなスケールで評価することが可能になった。この新しい研究は、アメリカ大陸で採集されたシラミから450個のmtDNA COX1配列を解析した別の研究[17]で明らかになった疑問のいくつかも解決している。今回の研究では、サンプリングサイズを拡大し、地理的範囲を広げたことに加え、DIYABC-シミュレーションを実施して7つの異なる進化モデルを検証した。これらの新しいシミュレーションでは、宿主と寄生虫の両方の情報を用いてパラメータを作成した。これらのシラミ核遺伝クラスター間のハイブリダイゼーションの起源を探り、ハイブリッドのシラミが不完全系統選別（ILS）による古代の多型の保持の結果（モデル1と2）なのか、シラミ遺伝クラスター間の混血の結果なのかを検証したかった。モデル1と2では、ネアンデルタール人の頭部に寄生したシラミ（モデル1）と解剖学的現代人（AMH）の頭部に寄生したシラミ（モデル2）のハイブリッドシラミについて、不完全系統選別（ILS）による古代の多型の保持を検証した。混血の時期が異なる4つのシナリオがあった。古代の混血モデルでは、ネアンデルタール人とAMHの2つの宿主が同時代に存在した時期に、ネアンデルタール人に寄生するシラミとAMHに寄生するシラミの混血を検証した（モデル3）。モデル4では、500年前のヨーロッパによるアメリカ大陸植民地化における混血を分析した。モデル5では、第一次世界大戦と第二次世界大戦前後の過去100年から40年間に起こった混血を検証した。モデル6では1980年代から10年前までのグローバリゼーションの始まりを反映し、モデル7では過去10年間を参照した。この寄生虫に関する新たな進化的知識を提供するだけでなく、DIYABCシミュレーションのこの新しいアプローチを用いて、他の宿主-寄生虫系における新たな解析を開発する指針になると考えられる。

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表1. ヒトジラミ集団のマイクロサテライト多型。
グループは地理的地域とSTRUCTUREクラスタリングを反映している：アフリカ・イスラエル・スペイン（AIS）、南・東南アジア（SAs）、東アジア（EAs）、ヨーロッパ（E）、北アメリカ（NA）、メソアメリカ（MA）、中央アメリカ（CA）、南アメリカ（SAm）。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.t001

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材料と方法
倫理声明
フロリダ大学のInstitutional Review Boardは、本研究の審査を免除し（Exemption of Protocol #2009 -U-0422）、参加者の書面によるインフォームド・コンセントの必要性を免除した。この免除は、米国保健社会福祉省（HHS）の規則に基づいて発行された。具体的には、HHS規則45 CFRパート46が、人間を対象とする研究活動に適用される。シラミの駆除は任意であり、患者を直接、または患者に関連する識別子によって特定できるような情報は記録されなかったため、フロリダ大学は、参加者からの書面によるインフォームド・コンセントの必要性を免除した。収集手順に関する追加情報は、Supporting Informationのセクションに記載されている。

サンプリング
サンプリングの詳細は、図1、表1およびS2ファイルのS1表に記載されている。簡単に述べると、274人のヒトアタマジラミが、10の主要な地理的地域を網羅する世界25ヵ所の異なる個体から採集された。ヒトのシラミを収集するための詳細なプロトコールは、Supporting Informationのセクションに記載されている。

DNA抽出
我々は[16, 17]に詳述されているDNA抽出プロトコールに従った。このプロトコールでは、シラミを半分に切断し、半分を95%エタノールに保存し、もう半分を細胞溶解およびプロテイナーゼK溶液の入った1.5mlのエッペンドルフチューブに入れ、DNA抽出のために乳棒を用いて手で粉砕した。DNAはPuregene Core Kit A（QIAGEN、カリフォルニア州バレンシア）を用い、製造元の組織用プロトコールに従って抽出したが、シラミのサイズが小さかったため、プロトコールに記載されている量の3分の1しか使用しなかった。DNAはNanoDrop 1000 spectrophotometer（Thermo Scientific）を用いて定量し、DNAサンプルは5～10 ng/μLの濃度になるように希釈した。

多重共増幅：マルチプレックス
16]に記載されているように、4 つのマルチプレックスを用いて合計 15 のマイクロサテライト遺伝子座を増幅した。蛍光標識ユニバーサルプライマーを用いた： M13（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'）およびCAG（5'-CAGTCGGGCGTCATCA-3'）は、それぞれ固有の蛍光タグ（例えば、FAM、VIC、NED、PET；Applied Biosystems）で標識され、複数の遺伝子座を共増幅する。遺伝子座特異的プライマーは、一致する5′ユニバーサルプライマー配列の尾を付加することによって改変した。15座位の完全なセットを、7.5μLの2Xマスターミックス（Type-It Microsatellite PCR kit, Qiagen, Venlo, Netherlands）、0.015-0. 15μLの非標識フォワードプライマー（10μM）、0.15-0.8μLの非標識リバースプライマー（10μM）、0.5μLの標識ユニバーサルテールプライマー（10μM）、1-2μLの全ゲノムDNA（10-20ng）およびdH2Oを最終容量15μLまで加えた。2種類のサーマルサイクリングプロファイルが使用され、いずれも95℃での初期変性（5分間）で始まり、72℃での最終伸長（40分間）で終わった。v1（タッチダウンPCR）プロトコルは94℃（30秒）、60℃/55℃（-0.5℃/サイクル）45秒、72℃（45秒）を10サイクル行い、94℃（30秒）、55℃（45秒）、72℃（1分）を25サイクル行った。v2プロトコルは、94℃（30秒）、52℃（45秒）、72℃（45秒）を35サイクル行った。PCR産物を臭化エチジウムで染色した1.5%および4%アガロースゲルで電気泳動し、紫外線下で可視化した。フロリダ大学のバイオテクノロジー施設(ICBR)で、GeneScan 600 LIZを内部サイズ標準(Applied Biosystems)として使用し、アンプリコン(1:100)をdH2Oで希釈したものをABI 3730xl 96-キャピラリーシーケンサーで実行した。マイクロサテライト遺伝子型はGeneMarker version 1.60 software (SoftGenetics, LLC)を用いてスコア化した。

ミトコンドリアPCR増幅と配列決定
ミトコンドリア遺伝子チトクロームcオキシダーゼ1（COX1）は、[2]に記載されているように、プライマーH7005およびL6625[9]を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。各PCR反応は、10μLのマスターミックス（5PRIME）、1μLの各プライマー、2-4μLの全ゲノムDNA、および水を含む総容量25μLで構成された。PCRのサイクリングプロファイルは、94℃での初期変性（10分間）から始まり、94℃（1分間）、48℃（1分間）、65℃（2分間）を10サイクル繰り返した（1サイクルごとに0.5℃ずつ低下）。その後、94℃（1分）、52℃（1分）、65℃（2分）を35サイクル行い、最後に65℃（10分）で伸長した。PCR産物はアガロースゲルで増幅を確認した後、ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, Ohio)を用いて精製した。精製したPCR産物は、University of Florida DNA Sequencing Core Laboratory (ICBR, Gainesville, Florida)で、標準的な蛍光サイクルシーケンスPCR反応（ABI Prism Big Dye terminator chemistry, Applied Biosystems）を用いて配列決定を行った。

COX1配列編集、アラインメント、ハプロタイプ再構築
それぞれのシラミサンプルについて、順方向配列と逆方向配列を手作業で編集し、Sequencher 4.5 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan)を用いて整列させた。各サンプルについて、フォワード配列とリバース配列の両方を用いてコンセンサス配列を作成した。これらの新しいシラミCOX1配列は、我々の以前の研究[17]で使用されたシラミの以前の配列と一緒にアラインメントされた。379bpの最終アラインメントを用い、MEGA 4 [47]を用いて補正なしのp-distances（比較される2つの配列が異なるヌクレオチド部位の割合）を用いて一対差異の行列を構築した。遺伝的関係は、Lightら[1]に従い、PAUP* 4.0b10 [49]を用いて近傍結合(NJ)ツリー[48]を構築することにより推定した。ブートストラップはデータセットの100回の擬似複製を用いて行った。

マイクロサテライトを用いた採集地間の遺伝的多様性と集団構造の解析
Arlequin 3.5.1.2 [50]を用いてマイクロサテライトデータから集団の遺伝的多様性を推定した。サイトあたりのシラミの数に関係なくすべてのサイトについて、遺伝子座ごとの対立遺伝子の数を決定した。次に、1地点あたりのシラミ数が8匹を超える11地点について、観察されたヘテロ接合度と期待されるヘテロ接合度（HOとHE）、および1,023回の無作為順列を用いて有意性検定した集団ごとの遺伝子座の平均FISも推定した。サンプルサイズがサイト当たり8シラミを超える11サイトについては、Arlequin 3.5.22[51]を用いて集団のペアワイズFST値を推定した。1,000回の並べ替えを行う並べ替え手順を用いて、一対ごとのFST値の有意値を推定した。

ヒトジラミの遺伝的多様性がどのように世界中に分布しているかを理解するために、類似遺伝子型のクラスタリングに基づく3つの異なる方法を用いた。まず、STRUCTURE [52]を用いた。STRUCTUREはモデルベースのベイズクラスタリング法で、遺伝子座間のハーディー・ワインベルグ平衡と連鎖平衡を仮定している。さらに、これらの仮定を持たず、潜在的な隠微構造を可視化できる2つの多変量解析法、GenAlEx 6.5のPCoA（主座標分析）[53, 54]と主成分の判別分析（DAPC）[55]を用いた。

ベイズクラスタリング解析。
STRUCTURE 2.3.4[52]に実装されているベイズクラスタリングアプローチは、個々の多座遺伝子型データを使用して、データとモデルが与えられた事後確率に基づいて、異なる遺伝的クラスター数（K）を仮定したモデルを評価します。個体の多座遺伝子型と再構成されたクラスターについて推定された対立遺伝子頻度に基づいて、各個体のゲノムは確率的に各クラスターのメンバーシップ分率（q）（先祖）に分割された。混血先祖は、個体iが集団kの先祖からゲノムのある割合（q）を受け継いでいると仮定することによってモデル化される[52]。ハイブリッドは、ある個体がq値において2つ以上のクラスターの中間であることを観察したときに推定できる。例えば、q=0.5の個体は第一世代のハイブリッドである可能性が高い。我々はVäHä and Primmer (2005) [56]で提案されているように、0.2のq値の閾値に基づいてハイブリッドの可能性を識別した。すべてのシミュレーションは、バーンイン段階で50,000マルコフ連鎖モンテカルロ（MCMC）世代を使用し、データ収集段階では100,000世代を使用した。バーンイン中の平衡と事後確率の推定の一貫性を確保するため、各Kについてデフォルトのパラメーターを用いて10回の独立した実行を行った。別個のクラスター数の選択は、オンラインツールSTRUCTURE HARVESTER[58]を用いたΔK統計量[57]の評価に基づく。各Kにおける10回のSTRUCTURE実行は、ほぼ同じ個々のメンバーシップ係数を生成した。DISTRUCT[59]を用いたプロットには、各Kにおける優勢なクラスタリングパターン（すなわち最頻値）のパラメータ値を与えられたデータの尤度が最も高いランを使用した。

主座標分析（PCoA）を用いた多変量解析。
この多変量解析は、GenAlEx 6.5 [53, 54]で計算された個体間のペアワイズ遺伝的差異を用いて実施され、STRUCTUREを用いて発見された遺伝的クラスターを検証し、さらに定義した。

主成分の判別分析（DAPC）を用いた多変量解析。
この解析は、Rソフトウェア環境バージョン3.6.3 [61]の'adegenet'パッケージ2.1.3 [60]を用いて行った。これらの分析では、マイクロサテライト遺伝子型とミトコンドリア・ハプログループ配列の両方を得ることができた175匹のシラミのみを対象とした。追加のDAPCでは、同じシラミサンプルを用いたが、核クラスターとハプログループのメンバーによって4つのグループを考慮した。

各主核STRUCTURE遺伝クラスター内の対立遺伝子の豊かさ。
コンピュータプログラムADZE（Allelic Diversity Analyzer）バージョン1.0 [62]に実装されている希薄化法を用いて、各主核STRUCTURE遺伝クラスター内の対立遺伝子の豊かさを推定した。対立遺伝子の豊かさの測定はサンプルサイズを考慮するため、希薄化法は集団からサイズ "g "の異なるランダムサブサンプルの対立遺伝子の豊かさを推定することができる[63, 64]。

STRUCTURE遺伝クラスターとミトコンドリアクレードに基づく分析。
核およびミトコンドリア多様性の地理的分布をよりよく理解するために、一連のKruskal-Wallisノンパラメトリック分散検定分析を行った[65]。マイクロサテライト遺伝子型とミトコンドリア・ハプログループ配列データの両方を得ることができた175のシラミと、前述の8つの地理的地域を対象とした。計算された中央値は比較され、P < 0.05で分離された[66]。8つの地理的地域間の任意の予想頻度セットに対するデータ（頻度）の適合性を評価するために、Observed vs. Expected Frequency X2検定を比較した。すべての統計検定はα = 0.05の有意水準で行った。

異なるマイクロサテライト対立遺伝子（FSTベース）の数を考慮した分子分散分析（AMOVA）は、Arlequin 3.5 [50]を用いて2つの核クラスター：cIとcII間の遺伝的変異の分割を調査するために用いられた。各レベルにおける分化の統計的有意性は、1,023回の並べ替えによって評価された。

上記の方法で同定された遺伝的クラスター間の歴史的移動パターンは、Migrate-n 3.3.0で最尤法 [67, 68]を用いて推定された。Migrateは、最も尤度の高い合体空間の領域をサンプリングするために、系譜の推定値を採用した。乱数の種と開始値のƟと4Nem（Nemは遺伝子の流れの間接的な尺度）はFSTを開始パラメータとし、ブラウン突然変異モデルを用いた。収束を保証するための適応加熱とともに、10回の短鎖（104MCMCステップ）と3回の長鎖（105MCMCステップ）を用いてデータを解析した。

人口統計モデルの比較
DIYABCプログラムv2.0 [70]に実装されている近似ベイズ計算(ABC)アプローチ[69]を用いて、マイクロサテライトデータに基づくヒトジラミの個体群統計学的歴史を推論した。我々は、それぞれのシラミ遺伝子クラスターが異なるヒト宿主集団上で進化し、宿主と連動して分岐するという異なる進化モデルをテストした。ヒトの進化とシラミの情報に基づいて、集団サイズと分岐時間を推定し、合計7つの異なる進化モデルを検討した（表2、図2）。最初の3つのモデルは、Reedら（2004）[2]の、現生人類と古生人類の間の古代のハイブリダイゼーションという仮説を直接検証するものである。モデル1と2は、ハイブリッドシラミがネアンデルタール人の頭部に寄生したシラミ（モデル1）、あるいは解剖学的現代人（AMH）の頭部に寄生したシラミ（モデル2）に由来する場合、ハイブリッドシラミにおける不完全系統選別（ILS）による古代の多型の保持を解明することを目的としている。モデル3では、宿主の共存期間中にネアンデルタール人とAMHに寄生したシラミの混血現象が検証された。最後の4つのモデル（モデル4、5、6、7）は、古代ヒトを必要とせず、最近の期間におけるAMH内での混血事象のみに基づいている。モデル4では、ハイブリッドシラミは500年前のヨーロッパによるアメリカ大陸植民地化の際に、アメリカ先住民のシラミと最初のヨーロッパ人のシラミが交雑してできたものであるという仮説を検証した。モデル5では、第一次世界大戦と第二次世界大戦前後の過去100年から40年間に起こった雑種化を検証した。モデル6は1980年代から10年前のグローバリゼーションの始まりを反映し、モデル7はここ10年のごく最近の出来事を指している。

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図2. 進化モデル。
DIY-ABCプログラムのアプローチを用いて、3つの異なる寄生レベルと3つの異なるシラミの世代交代時期を持つ7つの異なる人口統計学的歴史モデルを使用し、合計63の異なるシナリオを比較した。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.g002

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表2. 人口動態シナリオの歴史的パラメータと人口動態パラメータの事前分布。
括弧[]内は人類学的文献から得られた宿主の値である。時間の推定については、シラミの値はシラミの世代（g）を表し、ヒトの［］の間の値は年（y）である。この表では、ヒトの30%に20匹のシラミが寄生し、その世代数は18日であると仮定してシラミの数を推定した。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.t002

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各モデルについて、1頭当たり10匹のシラミが寄生し、10%しか寄生していない低レベル（S2ファイルのS2表）、1頭当たり20匹のシラミが寄生し、30%しか寄生していない中間レベル（表2）、1頭当たり50匹のシラミが寄生し、50%も寄生している高レベル（S2ファイルのS2表）の3つの寄生レベルを検討した[71]。

シラミのライフサイクルには、卵、3つの幼虫期、成虫がある。したがって、文献で報告されているような自然発生的な体長変動を考慮するため、各個体群動態モデルおよび各寄生レベルについて、3つの異なる世代時期について検定した。本研究では、アタマジラミが卵から生殖可能な雄成虫および産卵可能な雌成虫になるまでの成熟期間を18日、27日、36日と考えた（表2およびS2ファイルのS3表）[72-74]。すべてのマイクロサテライトはデフォルトの一般化ステップワイズ突然変異モデルを使用し、平均突然変異率は10-9-10-2の間の対数一様分布を割り当てた。マイクロサテライトの標準的な突然変異率は、1世代あたり遺伝子座あたり10-6-10-2の間と考えられている[75]。しかし、マイクロサテライトの場合、異なる反復長が異なる突然変異率を持つ可能性があるため[76]、テトラ、トリ、ジヌクレオチド反復を別々にモデル化した。したがって、Bertorelleら[78]に従って、変異率[77]を最適化するために予備的な実行が行われた。プログラム開発者が推奨するように、40個の連続した対立遺伝子状態の対立遺伝子サイズの範囲を使用した（A. Estoup, personal communication）。

マイクロサテライト遺伝子座について計算された要約統計量は以下の通り：平均対立遺伝子数、平均遺伝的多様性、平均サイズ分散、平均FST。要約統計量の選択は、これらの要約統計量が使用され、Bertorelleら[78]に従ってモデルとパラメータを回復できた予備テストに基づいて経験的に行われた。これらの予備テストを通じて、上記の要約統計量が我々のデータに適していることが実証された。

各シナリオの事前パラメータを用いて約714,000回のシミュレーションを行い、5,000,000回のシミュレーションデータセットからなる参照表を作成した。まず、モデル（シナリオと事前パラメータ）の適合性を確認するために、パラメータの事前分布でシミュレーションしたデータセットと観測データ、および事後予測分布のデータセットを用いて主成分分析（PCA）を行い、シナリオの事前分布に対する観測値の適合性を事前評価した。各シナリオの事後確率は、要約統計量での線形判別分析[70]の後、直接アプローチと、シミュレーションされた（参照表から）データセットと観測されたデータセットの差を推定する多変量重み付きロジスティック回帰[79, 80]を実行することによって評価された。観察されたデータに最も近いシミュレーション・データセットの1%（50,000）の事後確率のみが保持された。シナリオ選択の信頼度は、選択されたシナリオが、500のシミュレーションデータセットについて、競合するシナリオと比較して、最も高い事後確率を持たない場合の割合として推定された（タイプIエラー）。シナリオ選択の信頼性は、さらに事前誤差率の推定も含めて検証された。事前誤差率は、モデルインデックスとパラメータ値を事前値に引き込む際に、誤ったモデルを選択する確率（選択したシナリオが正しくない場合に選択する確率、II型誤差）として計算される。シナリオ選択後、事後分布のモードと95％信頼区間（CI）から推定されるパラメータ推論に進んだ。

結果
核遺伝的多様性
世界10地域、25地点からなる274のヒトジラミ検体から、1遺伝子座あたり5～20対立遺伝子、平均12対立遺伝子という高いマイクロサテライト多様性が明らかになった（表1およびS1ファイル）。8匹以上のシラミを解析した11ヶ所では、HO値は0.032から0.524（平均0.257）、HE値は0.248から0.706（平均0.402）の範囲であり、ヘテロ接合体の不足という一般的なパターンを反映していた（表1）。さらに、11のシラミ個体群すべてにおいて、遺伝子型の比率はハーディー・ワインベルグ期待値から有意に逸脱し、FISの値は有意に正で、全体のFIS値は0.469（P < 0.00001）であった（表1）。全体として、11地点間で遺伝的分化が高い値を示し、地点間のFST値は最大0.663であった：モンゴル（Mn）とオランダ（Neth）の間のFST値は最大0.663であった（S2ファイルのS4表）。最も低いFSTは0.053で、ニューヨーク（Oce）とテネシー（Nash）のサイト間に見られた。

ミトコンドリア多様性
我々はまた、9つの地理的地域にわたる18のサンプリング地点にまたがる175匹のアタマジラミからCOX1配列データを得た（表3）。104匹のシラミがハプログループAに属し、71匹がハプログループBに属していた（表3）。先行研究[17, 39, 40]から予想されるように、ハプログループAはアフリカ、アジア、ヨーロッパ、アメリカ大陸を含む世界中に分布している。今回のサンプリングでは、ハプログループBは分布が狭く、ヨーロッパ、北アメリカ、中央アメリカのシラミにのみ見られる（表3）。

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表3. シラミの核およびミトコンドリア遺伝的多様性。
COX1遺伝子に基づくミトコンドリアDNAハプログループと、本研究で記述した各ジラミの主要な核遺伝クラスターへの割り当てを合わせた情報を含む、175人のヒトジラミの地理的分布（GenBank Accession number： KF250510-KF250546 [17]およびOR072805-OR072814 [本研究]）。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.t003

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世界規模での核遺伝クラスター
すべてのクラスタリング手法： STRUCTURE、PCoA、DAPCは、異なる核遺伝クラスターの同定において一致した： IaとIbのサブクラスターを持つクラスターI（cI）と、IIaとIIbのサブクラスターを持つクラスターII（cII）である（図1およびS1）。アフリカ、イスラエル、アジア、アメリカ大陸に生息するアタマジラミで定義されるcIは、より世界的な分布を示すのに対し、ヨーロッパとアメリカ大陸を主な生息地とするアタマジラミで構成されるcIIは、より限定された地理的分布を反映している。世界中のヒトジラミ集団の遺伝的多様性の大部分は地理的に高度に構造化されているようであるが、我々がサンプリングしたシラミの約12％（274匹中33匹）はハイブリッド（q値が0.8未満のシラミ）であるようで、ハイブリッドの75％（25匹）は新世界で発見された。

STRUCTURE解析では、K = 2 (ΔK = 858.853, S2 Fig)でシグナルが得られた後、STRUCTUREプロットでKの値が大きくなるにつれて、地理的に局在した構造が明らかになった。K = 3では、元のcIIからヨーロッパ内に新しいクラスターが形成され、主にオランダのシラミからなるサブクラスターcIIb（水色）が形成された。Kを4まで上げると、ホンジュラスとアメリカ大陸の他の地域からの集団がIbサブクラスターとしてクラスターIから出現し、他のサンプルはサブクラスターIaに残った。このホンジュラスのサブクラスター（Ib）は、アメリカ先住民のシラミの系統を示しているのかもしれない。

主座標分析（PCoA）では、STRUCTUREで同定された2つの主要な核遺伝クラスターとサブクラスターが支持され、推定雑種シラミはどちらのクラスターにも割り当てられず、むしろその間に雑種が配置された（図3）。最後に、DAPC解析で得られた固有値から、遺伝的構造は主にcI（右）とcII（左）を表す第1主成分によって捉えられていることが示された（S1図）。

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図3. ヒトジラミの世界的な核遺伝的多様性。
A) K = 2におけるSTRUCTUREシミュレーションから推定された遺伝的クラスター：クラスターI（cI、オレンジ）とクラスターII（cII、青）、K = 3 cIとcIIa-cIIb、K = 4 cIa-cIbとcIIa-cIIb。棒グラフでは、それぞれのシラミを1本の縦線で表し、各色セグメントの長さは、各クラスターに属する割合（Q）を表す。STRUCTURE棒グラフの上部には、それぞれのシラミサンプルが採取された大陸と主な地理的地域ごとに異なる色を使った棒グラフを追加した。STRUCTURE棒グラフの下部には、表1で定義した略号を用いて、シラミの地理的起源に対応するコードを示した。B) 一対の遺伝的距離比較を用いた主座標分析（PCoA）から得られた最初の2次元における点の分布。各サイトはSTRUCTUREの結果と一致するように色分けされた（例えば、アジアのサイトはオレンジ色、ヨーロッパのサイトは青色に色分けされた）。これらのコードは、表1で定義した地理的起源と略号に対応している。地図作成者 Maulucioni (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:World_map_with_the_Americas_on_the_right.png)。このファイルはCreative Commons Attribution-Share Alike 4.0 International licenseの下でライセンスされている。https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/legalcode。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.g003

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さらに、STRUCTUREのq値から同定されたハイブリッドを除いた全データセットでさらなる解析を行った。このように、[56]が示唆したように、共有祖先q値が0.8より大きい非混血個体のみを縮小したデータセットを使用した場合、STRUCTURE解析は、K = 4で対応するサブクラスターを持つcIとcIIを同定する同様の結果を反映した（S3図）。

世界的クラスターI
cI（q値が0.5より大きい）に属する全てのシラミを、このクラスター内の部分構造を評価するために、2回目のSTRUCTUREシミュレーションに含めた。K = 2のとき、この図は2つのクラスターの存在を示した：1つは旧世界（アフリカ、アジア、ヨーロッパ）のシラミで構成され、もう1つは新世界（アメリカ大陸）のシラミである（S4図）。STRUCTURE解析で定義されたKが増加するにつれて、遺伝的クラスターがさらに分割され、K = 3では、モンゴル産のシラミの大部分を除き、アジア産のクラスターが出現し、旧世界産のクラスターにとどまった（S4図）。K = 4では、モンゴルからのシラミのサブセットがユニークな新しいクラスターを形成した（S4図）。

地理的に限定されたクラスターII
現在のサンプリングによると、cIIはcIよりも地理的分布が狭く、ほとんどがヨーロッパとアメリカ大陸に限定されている（図3）。このクラスターはK = 2で部分構造を示し、オランダ産のシラミの大部分と他の数種類が明確なクラスターを形成している（プロットでは水色）（S5図）。cIとcIIに関するこれらの個々のクラスター解析は、シラミ集団間で観察される地理的構造を強調している。

主要遺伝クラスターごとの対立遺伝子濃厚度分析
コンピュータプログラムADZE (Allelic Diversity Analyzer) Version 1.0[62]に実装されているレアファクション法を用いて、主要な非混合クラスターIとII（ハイブリッドなし）ごとの対立遺伝子濃度を推定した。非混合クラスターあたりの対立遺伝子濃度は、クラスターIの方がIIよりも高かった（S6図）。このパターンは、2つのクラスターの進化の歴史が大きく異なることを反映している。対立遺伝子濃度が高いことは有効集団サイズが大きいことと一致するが、遺伝的構造が大きいことと一致する可能性もある。また、クラスターIとIIではサンプルサイズが異なることも注目に値する（cIではシラミ80匹、cIIでは174匹）。

遺伝的クラスターとミトコンドリア・クレードの統計解析
核クラスターに属する頻度とミトコンドリアのハプログループをコレスポンデンス分析（CA）を用いてプロットしたところ、4つの明確に定義されたグループが存在することがわかった（S7図）。次元1と2は、独立性の逸脱の尺度を表す慣性または分散の最大量を表していた。次元のそれぞれは、その相対的な重要性と分散のどの程度が説明されるかを表す固有値を持つ。我々の研究では、1つの次元が慣性の58.7%を表し、2つの次元が慣性の99.6%を表している。このうち、1次元は核遺伝クラスターcIとcIIを区別し、2次元はミトコンドリアハプログループを区別した。1つのグループは核クラスターII-ハプログループAのシラミに相当し、ヨーロッパ、北アメリカ、メソアメリカ、南アメリカのシラミが含まれている。第二のグループは、南米を除く同じ地域の核クラスターII-ハプログループBである。第3のグループはクラスターI-ハプログループAの個体で構成され、南アジア、アフリカ-イスラエル-スペイン、ヨーロッパの一部で、最後のグループはハプログループBを持つクラスターIに属し、中央アメリカで見つかった（S7図）。さらに、多重比較（ノンパラメトリック・クラスカル・ワリス検定）により、核遺伝クラスターIとIIに割り当てられた個体の分布は、8つの地理的地域間でランダムに分布していないことが示された（H = 103.55, P < 0.0001）。南アジア（SAs）、東アジア（EA）、アフリカ・イスラエル・スペイン（AIS）、中央アメリカ（CA）、ヨーロッパ（E）（P < 0.05）。一方、北米（NA）、南米（Sam）、メソアメリカ（MA）のクラスターメンバーシップ中央値に有意差はなかった。核遺伝子の割り当てとハプログループ頻度はともに、8つの地理的地域間で有意に異なっていた（核クラスター割り当て Χ2 = 175, P < 0.0001; ハプログループ頻度 Χ2 = 42, P < 0.0001）。

核クラスターとミトコンドリア・クレードによるAMOVA
2つの核遺伝クラスター：cIとcIIを考慮した核遺伝的変異の分布を調べるために用いた分子分散階層分析（AMOVA）では、それらの間に有意な遺伝的差異があることが明らかになった（ΦST = 0.33; P < 0.00）。非混血個体（祖先係数の値が少なくとも0.8である個体）のみを検討すると、cIとcIIの間の分化は増加した（ΦST = 0.4; P < 0.00）。

核遺伝クラスターとミトコンドリア・クレードを考慮した移動パターン
歴史的な移動パターンはMigrate-n 3.3.0で最尤推定とブラウン運動突然変異モデルを用いて推定された[67, 68]。先行研究ではミトコンドリアハプログループAとBの間で異なる進化史が示唆されていることから、STRUCTUREから推定された核クラスターとミトコンドリアハプログループの両方で定義される4つの集団（cI-mtDNA A; cI-mtDNA B; cII-mtDNA A and cII-mtDNA B）を用いて完全な移動モデルを評価した。一般的に、核クラスター内の移動率は高く、ミトコンドリアハプログループ内の移動率が低いのとは対照的であった（S8図）。例えば、クラスターII（クラスターII-mtDNA AとクラスターII-mtDNA B）内の移動率が最も高く、クラスターI-mtDNA AとクラスターII-mtDNA Aの間の移動率が最も低いことが観察された。STRUCTURE解析により、ヒトジラミの遺伝的構造に対する地理的な影響が示されたため、地理的なヒトジラミ集団間の移動パターンをさらに理解するためには、各サンプリング地点からのより多くのサンプルを含むさらなる研究が必要である。

人口統計学的歴史
2つのシラミの異なる核遺伝クラスター（IとII）が存在するのは、不完全な系統選別（ILS）による古代の多型の保持、あるいは以前の孤立した系統からの混血の結果である可能性がある。我々は、DIY-ABCパッケージ[52]に実装されているベイズ計算(ABC)法を用いて、それぞれのシラミ遺伝子クラスターとそのハイブリッドが異なるヒト宿主集団上で進化し、ヒト宿主集団と連動して分岐するという7つの異なる人口動態モデルを検証した。これらのモデルは、ネアンデルタール人とAMHの混血（モデル1-3）から地球をめぐるヒトの移動（モデル4-7）まで、ヒトの進化を追ったさまざまな仮説を反映している（表2および図2）。これらの7つの人口統計モデルを、3つの異なるレベルのシラミ寄生と3つの異なる世代の時間を用いてテストし、合計63のシナリオを作成した（S9図）。最も強く支持された3つの人口統計学的モデル（5、6、7）は、トポロジー的に類似しており、それぞれが世界大戦後の移動（モデル5）、初期のグローバル化（モデル6）、現在の時代（モデル7）以降の異なる時期に、2つの核クラスター間の混血を含んでいた（図4、表4、S9図）。シラミの寄生率が10％と30％の場合、どの世代（18日、27日、36日）においても、7つの人口モデルを比較した結果、モデル7（現在）がロジスティック事後確率が約0.90と最も高いモデルであった（図4、表4、S9図）。寄生率が50%と高い場合、世代時間が長いほど古い混血モデルが高い確率で示された（S9図）。例えば、世代交雑時間が最も長い36日間をシナリオに用いた場合、モデル4が最も高い確率のシナリオとなった。このモデルは、ヨーロッパ人による新大陸の植民地化に相当する。世代時間として27日間を選んだ場合、モデル5が最も高い確率を示した。最後に、世代時間を18日に設定した場合、グローバリゼーションと関連するモデル6が最も高い確率を示した（S9図）。

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図4. 7つの人口モデルの事後確率。
ヒトの30％がシラミに罹患しており、1頭あたり20匹のシラミがいる中間的なシラミ罹患レベルを考慮した場合の、7つの人口統計モデルを比較したDIY-ABC解析による事後確率のグラフ。A)では事後確率は直接アプローチで推定され、B)ではロジスティック・アプローチ[70]で推定される。各シナリオは以下のように色分けされている：モデル1 -緑、モデル2 -赤、モデル3 -水色、モデル4 -ピンク、モデル5 -黄色、モデル6 -黒、モデル7 -灰色。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.g004

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表4. 図2に示した7つの人口統計モデルの事後確率。
DIY-ABC解析から推定した7つのシナリオについて対数法で求めた確率（括弧内は95％信頼区間）。各モデルで3つの寄生レベルを考慮し、10%はヒト族集団の10%が頭あたり10匹のシラミを持ち、30%と50%はそれぞれヒト族集団の30%と50%が頭あたり20匹と50匹のシラミを持つことを示す。世代時間は18日とした。各比較において、選択されたシナリオ（網掛けセル内の太字）は、確率値が最も高いものである。確率値の下に示されたシナリオ選択の信頼性は、モデル5と7それぞれについて、無作為に作成した1000のシミュレーションデータセットからタイプIエラー率を推定することにより評価した。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.t004

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考察
本研究において、シラミの核マイクロサテライトデータは、cIとcIIの2つの異なる遺伝的クラスターに分類されることがわかった。クラスターIは世界中に分布していたのに対し、cIIはヨーロッパとアメリカ大陸に限られていた（図5）。驚くべきことに、この2つの核クラスターは、ヨーロッパまたはアメリカ大陸で地理的に重複しているにもかかわらず、両者の間に有意な遺伝的分化が認められた（ΦST = 0.33; P < 0.00）。K = 4の構造解析では、2つのクラスターはさらにサブクラスターに分裂した： Ia-IbとIIa-IIbに分かれ、それらは地理的起源（すなわち大陸）に基づいてソートされた。これらの結果は、4つの地域（北アメリカ、中央アメリカ、アジア、ヨーロッパ）からの少ないサンプル数でシラミのマイクロサテライト遺伝的多様性を評価した我々の過去の研究結果と一致している[16]。今回の研究と過去の研究の両方が、アタマジラミ集団は地理的に強い構造を持っているという考えを裏付けている。今回の研究では、アジア（cIa）と中央アメリカ（cIb）のサブクラスター間の遺伝的関係が明らかになり、中央アメリカのクラスター（cIb）はおそらくネイティブ・アメリカン起源であろうという考えが支持された。このように、マイクロサテライトのデータは、アメリカ大陸の現在のヒトジラミ集団が、最初の人々が持ち込んだヒトジラミの遺伝的多様性を保持していることを示唆している[16]。この研究は、ヒトジラミが人類進化の追跡のために利用できることを示した我々のこれまでの研究に追加されるものである。

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図5. ヒトジラミとヒトの世界的な共同移動の提案。
上：本研究で対象としたヒトジラミの採集地点を示した地図。各円の色は、サンプル個体が割り当てられた核遺伝子の多数クラスターに対応している。シラミが混在している地点は、その地点の2つの主要遺伝子クラスターの色を含むパターン化された円で示されている。解剖学的に現生人類がアフリカからヨーロッパ、アジア、アメリカ大陸へ移動したとされる移動と、より最近のヨーロッパによる新大陸植民地化を太い灰色の矢印で示す。ヒトジラミの共移行の仮説はオレンジと青の矢印で示されている。下部には、K = 4（表1）で25の地理的地点から得られた274のシラミの割り当てに対応する、図3AのSTRUCTUREプロットが示されている。地図はウィキメディアからダウンロードした：地図作成者地図作成者：Maulucioni (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:World_map_with_the_Americas_on_the_right.png)。このファイルはCreative Commons Attribution-Share Alike 4.0 International licenseの下でライセンスされている。https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/legalcode。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.g005

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他のヒトの寄生虫もまた、ヒトの進化の様々な側面に光を当ててきた[11-13]。例えば、ヒトの胃に寄生するヘリコバクター・ピロリという細菌寄生虫の遺伝的多様性は、ヒトの移動に関する洞察を得るために研究されており、寄生虫とヒト宿主の間には、アフリカからの拡大 [84, 85]、オーストロネシア語圏の植民地化 [86]、ベーリング海峡を越えたアジア人によるアメリカ大陸への定住 [87] を反映する強い相関関係が見つかっている。しかし、細菌やウイルスなど、クローン的に繁殖する微生物の中には、選択的掃引の影響を受けて、系統全体が除去されたり、遺伝子特異的だけでなくゲノム全体の遺伝的多様性が減少したりするものもある。寄生虫がクローン性繁殖をするようなシナリオでは、淘汰の影響が強く、寄生虫の系統樹は宿主の人口統計学的な歴史ではなく、淘汰（selective sweep）下にある遺伝子の進化史を反映することになる。一方、大寄生虫（シラミなど）は有性生殖をすることが多く、選択的掃引の影響が少なくなる。したがって、有性生殖を行う寄生虫は、クローン性の寄生虫よりも宿主の進化の歴史を正確に追跡できる可能性がある。このため、蟯虫 [89] やシラミ [2, 3] のように、宿主に寄生し、宿主と共進化した大寄生虫をヒトの進化研究に利用することが多くなっている。実際、ヒトジラミ（Pediculus humanus）は最もよく研究されているヒトの寄生虫の一つである [1-6、14-19、21-28]。

ヒトジラミは、どの運動期（ニンフおよび成虫）でも宿主から別の宿主へと移動することができるが、成虫は頭部から頭部へと移動する可能性が高い［90］。シラミは直接的な身体接触、例えば喧嘩の最中、他者との同居、または2つの頭部が近接している他のあらゆる手段によって移される可能性がある［91］。さらに、アタマジラミは、頭部を覆う衣服や櫛を共有するなどの間接的な接触によっても移ることがある。この場合、共有物には生きたシラミが残っている可能性があり、非感染者に移る可能性がある［92］。シラミが直接または間接的に宿主から宿主へ移動する能力は、宿主と比較して集団サイズが大きい、分子進化の速度が速いなどのシラミの生活史的特徴とともに、宿主が他の種とどのように相互作用しているか、宿主の不可解な集団構造など、宿主の不可解な側面を明らかにする可能性がある。このような宿主の側面は、宿主のデータだけでは明らかにならなかったり、宿主のゲノムではまだ識別できなかったりするかもしれない[9, 93, 94]。寄生虫と宿主の固有な生活史形質の違いが、宿主と寄生虫の間の集団構造のパターンに不調和をもたらす可能性がある [95-99]。この現象は、ハエ [99]、蠕虫 [100]、羽虱 [101]などの寄生虫の間で観察されている。ある事例では、アラスカにおける北極圏のガレ類とその寄生シラミの関係を共進化的に研究した結果、シラミがその地域の異なる宿主種や個体群の間を一貫して移動していることが示唆されている [102]。宿主である鳥類はある程度の個体群構造や距離による隔離が見られるが、寄生シラミは何の構造も示さない [102]。このように寄生虫と宿主の遺伝的構造が一致していないことから、宿主となる鳥の個体群の間には、まだ何らかの不可解な接触や分布の重複があることが示唆される。このような種の相互作用は宿主のデータだけでは認識できないが、生態学的・保全的な取り組みに役立つ可能性がある。今回の研究では、2つの異なる核遺伝クラスターが存在することを示した：これはヒトの宿主では観察できない。これらは、不完全な系統選別（ILS）による古代の多型の保持、あるいは過去の孤立した系統からの混血の結果である可能性がある。現在のシラミの遺伝的多様性がILSや混血の結果であるかどうかを調べるために、DIY-ABCパッケージ[70]に実装されている近似ベイズ計算（ABC）法を用いた。

7種類の人口統計モデル、3種類の寄生レベル、3種類の世代交代時期についてABC分析を行った（表2、4、図2、4、S9）。10％と30％の寄生水準でより高い確率を示す人口統計学的モデルは、モデル7の2つの核クラスターIとIIの間の最近の混血を示唆するモデルに対応した。このモデルは、ハイブリッドのほとんどが新世界で観察されるというSTRUCTURE解析を支持するものである。寄生率が高いケースでは、モデル4、5、6を含む古い混血モデルが支持されたが。過去においては、気候や人為的な環境条件の違いにより、寄生率も世代交代時期も異なっていた可能性がある。実際、いくつかの研究で、シラミの生活史形質が気温によって変化することが示されている。例えば、実験室条件下では、産卵、卵の孵化率、稔性が気温によって大きく変化することが報告されており、シラミの個体数は冬季に増加し、夏季に減少する可能性が示唆されている [103]。別の研究では、P. h. humanusは20℃以下では産卵しなくなり、37℃では急速に産卵することが報告されている。これらの条件下での平均寿命はそれぞれ16日と27日である [72]。温度との関係で生活環にばらつきがあるにもかかわらず、シラミがまれであることが知られている地域でも、世界のあらゆる地域であらゆる集団の人間からアタマジラミが記録されている［104］。これは一般的に、気候よりもむしろ人間の習慣に起因していると考えられる［105］。この後の議論では、シラミの現在の生息状況を反映している可能性が最も高い30％レベルの寄生シナリオに焦点を当てることにする［106-108］。

世界中のヒトジラミ集団の遺伝的多様性のほとんどは、地理的に高度に構造化されているようであるが、分析した274匹のシラミのうち、合計33匹の雑種があり、現在のサンプリングの12%に達している。しかし、これらのハイブリッドのうち25種（75％）は新世界で見つかっており、これは人類が植民地化した結果、二次的な接触が起こった地域を示している可能性がある。両大戦後のヨーロッパ人移住による最近の混血イベント（モデル5）、初期のグローバル化（モデル6）、サンプリング時の現在（モデル7）を考慮した3つのモデルが最も支持された（表2、4、図4、S9）。したがって、この研究から得られた新しく不可解な知見は、ハイブリッドシラミの有病率が非常に低いこと、そしてこれらのハイブリッドシラミが地理的に新世界に集中していることがわかったことである。このパターンは、前述のようにヨーロッパによる新世界の植民地化を反映している可能性がある。しかし、このような植民地化現象がシラミの何世代にもわたって起こっているのであれば、ハイブリッドの出現率が低いことの説明にはならない。多くのサンプルがアメリカ大陸から得られており（43％）、サンプリングが空間的／地理的に偏っている可能性もある（表1）。その場合、他の地域では今回のデータよりもハイブリッドが一般的である可能性もある。この疑問に答えるために、ヒトジラミの遺伝的多様性に関する今後の研究では、他の地理的地域をより深くサンプリングすることを検討すべきである。しかし、アメリカ大陸にハイブリッドが存在しないことについては、さらに議論を深める価値がある。本稿の範囲外ではあるが、このような限定的な混血パターンは、cIとcIIの遺伝的隔離を示唆している可能性があり、ヒトジラミ集団内でハイブリッドが何世代にもわたって存続することはできない、という仮説を立てた。従って、今後の研究のために潜在的な原因を列挙することは価値がある。

生殖隔離のメカニズムのひとつに、宿主の生物学に対する共生細菌の影響が考えられる。内共生はまた、雌化、単為生殖、雄殺し、精子と卵の不和合性といった生殖操作の誘発など、多様な方法で宿主の生物学を変化させる可能性がある。ウォルバキアは節足動物やフィラリア線虫に共通する細胞内細菌共生体で、ヒトジラミに感染することが示されている [110-112]。異なる系統のウォルバキアを含む昆虫宿主の個体群が交配した場合、あるいは一方の個体群がウォルバキアを持ち、他方の個体群が持たない場合、交配（「ハイブリッド」）はフィットネスを低下させるか、あるいは子孫をまったく残さない結果となった。しかし、ウォルバキア内共生体は卵細胞質を通じてミトコンドリアゲノムと一緒に伝達されるため、内共生体とmtDNAは同じような歴史を反映しているはずである。我々の研究では、ミトコンドリア系統は2つのミトコンドリア・ハプログループに分類された。核クラスター（cIとcII）の両方にAハプログループとBハプログループの個体が見られた。これは、ミトコンドリアのハプログループ（AおよびB）と核の遺伝子クラスターとの間に一対一の相関関係はないという点で、私たちが最初に発見した結果 [16]と一致している。

ヒトジラミは、ほとんどの動物が単一染色体のミトコンドリア（mt）ゲノムを持つのとは異なり[113]、断片化したmtゲノムを持ち、それぞれが9-20個のミニ染色体を持つ[114, 115]。ヒトのアタマジラミ（Pediculus humanus capitis、Pediculidae科）とヒトのケジラミ（Pediculus humanus corporis）は、最も断片化されたmtゲノムを持ち、20個のミニ染色体が保存された共通パターンを持つが、他のタンパク質をコードする遺伝子とrRNA遺伝子はそれぞれ独自のミニ染色体を持つ[114]。さらに、このような遺伝子分布のパターンと断片化されたmtゲノムは、ヒトジラミのMRCAで進化し、それ以来保持されているようである[116]。同一の配列（長さ26-127bp）が異なるミニ染色体上の遺伝子間で共有されていることが発見されたので、これはミニ染色体間組換えの証拠であると考えられたが [114]、組換えの頻度は明確には確立されていない。我々は1つの遺伝子にしか着目していないので、mtミニ染色体の組換えについての懸念はあるかもしれないが、それが我々の結果に影響を与える可能性はほとんどないと予想される。

ヒトジラミのように、栄養的に不完全な食餌（例えば、葉茎や血液）を持つ昆虫種は、しばしば欠乏している栄養分を合成する相互扶養細菌を保有している[117-119]。ウォルバキアと同様に、これらの共生細菌は細胞内に存在し、母親から子孫へと垂直に伝達される。ヒトジラミの内部共生体はCandidatus Riesia pediculicola [120]であり、ゲノム研究によると、この内部共生体はビタミンB5の合成に必要な小さなプラスミドを持っている [121]。研究により、この義務的ヒトジラミ内共生細菌は、シラミの中腸の腹側に局在するマイセトームに収容されていることが確認されている。雌の場合、この内部共生生物は卵形成の初期に側卵管にも移動し、母性遺伝を確認しながら経卵管的に子孫に伝達される [124, 125]。Boydら[121]は、カンボジアのシラミ（cI-mtDNA A）とオランダのシラミ（cII-mtDNA A）から発見されたCandidatus Riesia pediculicolaのゲノム配列を実験室の株と比較した。しかし、ホンジュラスのシラミ（cI-mtDNA B）から得られたゲノムを含めると、著者はインデルを発見した[121]。より多くのシラミを用いた最近の研究でも、シラミの宿主であるP. humanusのmtクレードと内部共生生物であるCandidatus Riesia pediculicolaの共分散が示されている[124, 125]。我々の研究では、ミトコンドリアDNAと核の遺伝子クラスターには相関がなく、Candidatus Riesia pediculicolaはmtDNA系統と共分散していることから、この共生生物はシラミの雑種が少ないことを説明できない。

別の説明として、他のシラミ目（特にリポセライド科とフシギダネ科）で報告されている、異常な父方ゲノム除去（PGE）に関連する可能性があり、これら2つの系統ではPGEが性決定様式であることが示唆されている[126]。先行研究では、衣料シラミP. h. humanusの雄は、すべてではないが、マイクロサテライトマーカーの母体コピーのみを伝達し、雌はメンデル型の遺伝子伝達を示すことが示されている [127]。この雄シラミによる非メンデル遺伝の様式は、父系ゲノム除去（PGE）として知られる擬似倍数体生殖の一種であり、雄は母系遺伝した対立遺伝子のみを子孫に伝達する[128]。さらに最近の研究 [129]では、衣料シラミとアタマジラミの両方でこの現象を評価した。ヒトジラミの両生態型において、雄はもっぱら（あるいは場合によっては優先的に）母方遺伝の対立遺伝子のみを子孫に伝達することが明らかになり、McMeniman and Barker (2006) [127]の初期の知見と一致するゲノムワイドな雄の伝達比の歪みが両生態型で明らかになった。我々の研究では、33のハイブリッドのうち、19が雌、10が雄、4が幼体であった。PGEシナリオのもとでは、10頭の雄の雑種はすべて母方に遺伝した対立遺伝子のみを子孫に受け継がせることになり、個体群における混血が少なくなる。我々の研究ではシラミは1つの時点で収集されたため、PGEを詳細に検討するために必要であったシラミの血統に関するデータはない。加えて、ヒトのシラミの性比は女性に偏っているため、PGEによる影響は少ないと考えられる。ハイブリッドシラミの数が少ないことがPGEの結果であるかどうかを理解するためには、シラミの家系や対立遺伝子伝播パターンの分析を含む今後の研究が必要である。

もしハイブリッドが、混血していない親シラミと比較して適応性の低い何らかの表現型を示すのであれば、これは別の仮説につながる可能性がある。例えば、DNAメチル化やヒストン修飾のようなエピジェネティックなメカニズムは、遺伝子制御、表現型の可塑性、発生、ゲノムの完全性の維持に影響を与えることがよく知られている。エピジェネティクスの研究の多くが世代内エピジェネティクスに関連するものであるのに対し、世代を超えたエピジェネティクス、すなわち遺伝子や遺伝子配列の変化を伴わずに親世代から改変された表現型が受け継がれることに注目した研究が増えている。このトランスジェネレーショナル・エピジェネティクスは、エピジェネティクスが進化の過程に直接的・間接的に寄与していることを示唆している。世代を超えたエピジェネティクスの遺伝様式の一つは、遺伝子が父方遺伝か母方遺伝かによってパトリジェネかマトリジェネに区別される「ゲノムインプリンティング」である [131]。この様式はしばしば親特異的遺伝子発現（PSGE）と呼ばれ、社会性昆虫の間でよく研究されており、エピジェネティクスの変化がカースト形成に機能的に関与していることが示されている [132]。シラミの間ではエピジェネティクスは研究されておらず、新たな研究分野として期待されている。また、PGEとPSGEの間に、ハイブリッドシラミの生存能力および／または繁殖能力を阻害する関係がある可能性もあり、ヒトのシラミにおけるエピゲノム研究が必要である。

最後に
本研究では、274匹のシラミから得られたマイクロサテライトデータを解析することにより、ヒトジラミの核遺伝的多様性を、世界各地におけるヒトの移動を復元するためのツールとして利用できるかどうかを評価した。よく知られた遺伝学的解析手法に加え、ヒト宿主のデータを用いてDIY-ABCモデルによる人口動態シナリオを評価する新たなアプローチを開発した。この新たなアプローチは、他の宿主-寄生虫系における新たな解析法の開発にも役立つ可能性がある。その結果、2つの分岐した核シラミ遺伝子クラスターが存在し、その混血はごく限られた最近のもので、そのほとんどが新世界に存在することが示された。このパターンは、アメリカ大陸へのヒトの移住を反映しており、新世界の人口が増加した初期にシラミとヒトの共同移住の波が起こり、その後、最も最近のヨーロッパ人の移住が起こったことが示唆された。我々はまた、この2つの分岐した核クラスター間の混血を妨げている潜在的なメカニズムが存在すると仮定した。進化の速いマーカーとして知られるマイクロサテライトを用いたため、我々の解析は最近の事象に適しており、進化の遅いマーカーはより古代の事象についての洞察を与える可能性がある。より多くのサンプル、全ゲノムおよびエピゲノムアプローチを含むヒトジラミのさらなる研究により、シラミの進化とヒト宿主に関する新たな知見が得られる可能性がある。

参考情報
S1ファイル。

a)リード研究室が作成したヒトジラミの収集プロトコール、b)世界的研究への参加に関するアンケート、c)マイクロサテライトデータ。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s001

(PDF)

S2ファイル S1表。本研究で使用したヒトジラミサンプルの詳細。

グループは地理的分布とSTRUCTUREクラスタリングを反映している：アフリカ・イスラエル・スペイン（AIS）、南・東南アジア（SAs）、東アジア（EAs）、ヨーロッパ（E）、北アメリカ（NA）、メソアメリカ（MA）、中央アメリカ（CA）、南アメリカ（SAm）。S2_S3 表。表2および図2に記述した人口統計学的シナリオの検定に用いた個体群サイズのパラメータとイベントの時間の事前分布。括弧[]内は、本原稿の表2に示したように、人類学的文献から得られた宿主の値である。シラミの値は、異なるシラミ蔓延レベルおよび異なる世代時間のもとで、人類学的文献を用いて推定した。S2表 10％と50％のシラミ侵入レベルを考慮した集団サイズの事前分布。S3 表．シラミの発生時間事前分布は、それぞれ27日と36日の世代時間を仮定し、シラミの世代数を考慮して表現されている。ヒトの値は年。S4 表。遺伝的分化。8頭以上のシラミが採集された地点における15個のマイクロサテライト遺伝子座のFST値に基づくシラミの一対ごとの遺伝的分化。サンプルサイズは集団名の後の括弧内にある。対角線下の値はFST値、p値は対角線上に示す；*は公称α水準0.05で有意であることを示す。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s002

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S1 図. 主成分の判別分析（DAPC）。

それぞれのシラミのクラスター構成は、95％慣性楕円の内側に異なる色で描かれている。DA固有値は、右下の挿入されたグラフに示され、互いにプロットされた判別因子の番号は濃い灰色で、分析に保持された残りの判別因子は薄い灰色で示されている。このDAPCでは合計10軸が保持され、これはadegenetパッケージのn-dim関数を参照し、保持されたDAPC軸の数を示し、これは保持されたPCA軸とDA軸の両方の数に影響される。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s003

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S2 図クラスター数。

図3からのSTRUCTURE解析によるEvannoら[39]のΔK統計量。k = 2 (δk = 858.853)。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s004

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S3 図. K = 4におけるクラスターIとIIの両方からの非混血シラミ（雑種なし）のみを含むSTRUCTUREプロット。

非交雑種と雑種を効率的かつ正確に区別できることから、[38]で提案されているq値の祖先閾値を用いた。q値が0以上0.20未満または0.8以上1の個体のみが非混血と分類され、この分析に含まれた。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s005

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S4 図：クラスターIの部分構造。

非混合シラミ（雑種なし）のみを含むSTRUCTUREプロット。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s006

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S5 図：クラスターIIの部分構造。

非混合シラミ（雑種なし）のみを含むSTRUCTUREプロット。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s007

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S6 図. アレリックの豊かさ。

コンピュータプログラムADZE (Allelic Diversity Analyzer) Version 1.0 [44]に実装されているレアファクション法を用いた核遺伝クラスター（cI、オレンジ色、cII、青色）ごとの対立遺伝子の豊かさ。対立遺伝子の豊かさの測定はサンプルサイズを考慮するため、希釈化法によって集団からサイズ "g "の異なるランダムサブサンプルの対立遺伝子の豊かさを推定することができる[45, 46]。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s008

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S7 図：コレスポンデンス解析（CA）。

アタマジラミの核クラスター構成頻度とミトコンドリアハプログループのCA。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s009

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S8 図：遺伝子の流れ。

STRUCTUREから推定された核クラスターとミトコンドリアハプログループの両方によって定義された4つのユニットを持つ完全な移動モデル：ユニット1）cI-mtDNA A、ユニット2）cII-mtDNA A、ユニット3）cI-mtDNA B、ユニット4）およびcII-mtDNA B。矢印の上下の数値は移動率を示し、矢印は方向性を示す。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s010

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S9 図：寄生レベルおよび世代時間ごとの63のシナリオの事後確率のグラフ。

シラミの寄生には10％（S9図A）、30％（S9図B）、50％（S9図C）の3つのレベルがあり、10％はヒト集団の10％が1頭につき10匹のシラミを持ち、30％は1頭につき20匹のシラミを持ち、集団の30％しか寄生していないと考え、50％は集団の50％が1頭につき50匹のシラミを持つという高レベルの寄生を反映している。本研究では、アタマジラミが卵から生殖可能な雄成虫および産卵可能な雌成虫に成熟するまでの期間を18日、27日、36日と考えた。各統計モデルは以下のように色分けした。シナリオ1-緑、シナリオ2-赤、シナリオ3-水色、シナリオ4-ピンク、シナリオ5-黄色、シナリオ6-黒、シナリオ7-灰色。

doi:10.1371/journal.pone.0293409.s011

(ZIP)

謝辞
フロリダ大学の元学部生に感謝したい：また、Lauren Justiceと元フロリダ大学ポスドクMarie de Gracia Coquerel（現Donald Danforth Plant Science Center）には、原稿の初期バージョンについてコメントをいただいた。ケイティ・シェパード（The Shepherd Institute for Lice Solutionsの創設者兼CEO）、マリエータ・A・H・ブラックス（オランダ国立公衆衛生環境研究所、人獣共通感染症・環境研究室）、および本研究で使用したシラミを提供してくれた世界中の収集家の貢献に大いに感謝する。Aida Miró-Herrans、Niyomi House（米国フロリダ大学）、Jan Štefka（Institute of Parasitology, Biology Centre CAS、チェコ共和国）には、本原稿の以前のバージョンについてコメントをいただいた。

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