腸内ウイルスの性依存性腸管複製

2017年3月13日
腸内ウイルスの性依存性腸管複製

https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.02101-16

著者 クリストファー・M・ロビンソン、ヤオ・ワン、ジュリー・K・ファイファーAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/jvi.02101-16
PDF/EPUB
JVI
第91巻 第7号
1 2017年4月
概要
はじめに
結果
考察
材料と方法
謝辞
参考文献
情報と貢献者
指標と引用
参考文献
図表とメディア
表
シェア
要旨
コクサッキーウイルスは、消化管で感染を開始してから末梢組織に播種して疾患を引き起こす腸管ウイルスであるが、ウイルスの複製に影響を及ぼす腸管因子の研究は不十分である。さらに、コクサッキーウイルス感染による重篤な後遺症には性差があることがヒトで観察されている。ヒトの病態を模倣したマウスモデルはよく特徴付けられているが、これらの実験の多くはコクサッキーウイルスを腹腔内に注射してマウスに感染させ、腸を迂回させている。腸内ウイルスの複製を変化させる微生物叢のような腸内因子を同定した最近の研究に照らして、我々は腸内でのコクサッキーウイルスの複製を調べようとした。ここで、我々はマウスにコクサッキーウイルスB3（CVB3）を経口感染させ、腸内でのCVB3の複製には性差があることを見いだした。CVB3は雄マウスの腸内で効率的に複製されたが、雌マウスでは複製されなかった。さらに、I型インターフェロン反応と性ホルモンが、ウイルスの複製と致死率を変化させることも明らかにした。全体として、これらのデータは、腸におけるCVB3の複製において、性と免疫応答が重要な役割を果たしていることを示唆しており、ヒトの疾患において観察される性の偏りを考慮する必要がある。
重要性 腸管ウイルス感染による重篤な後遺症における性差が観察されている。ウイルスはその環境ニッチにおいて最適レベルの適性を達成するように進化してきたため、最初の複製部位におけるウイルスの研究が不可欠である。ここでは、消化管における自然な感染経路に従ったCVB3の経口接種システムを用いた。その結果、性別が腸管におけるCVB3の複製に影響を与えることがわかった。さらに、I型インターフェロン反応と性ホルモンは、CVB3の腸内複製と致死率の両方を変化させる。全体としてこの研究は、腸内ウイルスの複製と病原性の研究において、性別を考慮すべきであるという事実を浮き彫りにした。
はじめに
性差は多くのヒト疾患の頻度と重症度に関与している(1-3)。疫学的研究によると、男性は細菌、ウイルス、真菌の感染症にかかりやすい(2)。女性は病原体に対する抵抗力は強いが、自己免疫疾患のリスクが高い。疾患における性的二型性は、遺伝子発現の差、性ホルモン、免疫機能の差に起因している(4)。しかし、疾患モデルにおける変数としての性については研究が不十分であり、様々な疾患における性の偏りのメカニズムについての理解が限られている。
コクサッキーウイルスはピコルナウイルス科の非エンベロープ型RNAウイルスで、様々な疾患に関与している(5-8)。ヒトでは、コクサッキーウイルス感染による後遺症を発症する確率は、男性が女性の2倍である(9)。ほとんどのコクサッキーウイルス感染は自己限定的であるが、重症化することもある。特に、コクサッキーウイルスB3（CVB3）はウイルス性心筋炎の主要な原因であり、広範な心臓障害が心不全につながることがある（10、11）。現在、コクサッキーウイルス感染症に対するワクチンや治療法はないため、CVB3の病態のさらなる解明が不可欠である。
マウスモデルは、CVB3による心筋炎に関する知識を深める上で重要なツールとなっている。腹腔内（i.p.）注射後、CVB3は組織内で高力価まで複製され、ヒトで観察されるのと同様の疾患を引き起こす(12-14)。感染した心筋細胞の直接的なウイルス溶解と心組織の免疫介在性障害である(15)。後者が疾患の性差の原因であるという仮説がある。この仮説は、CVB3は雄マウスでも雌マウスでも心臓で同じように複製されるにもかかわらず、雄マウスだけが性特異的な免疫反応によって心臓の障害が増加するという観察に基づいている(16-18)。
これまでのマウス実験は、CVB3の病原性について重要な洞察を与えてきたが、それは糞便経口経路による感染ではなく、CVB3の全身感染に基づくものであった。CVB3は腸管ウイルスであり、胃腸管における感染の第一段階を迂回することになる。コクサッキーウイルスをマウスに経口接種した研究は比較的少ない(19-23)。そのため、CVB3の複製や腸管でのウイルス複製に影響を与える因子については、まだ十分に理解されていない。ここでは、初回腸管感染後のCVB3の複製と致死率を調べるためのCVB3の経口接種マウスモデルについて述べる。その結果、これまでのマウスモデルやヒト感染モデルと同様に、CVB3の発症には性差があることがわかった。これまでのi.p.注射マウスモデルの結果とは対照的に、CVB3は雄マウスの腸内で複製されたが、雌マウスでは複製されなかった。免疫応答は雌雄で異なり、性ホルモンはCVB3の複製に影響を与えた。これらのデータは、腸内における腸内ウイルスの複製を研究することの重要性を強調している。
結果
CVB3の複製は雄マウスの腸内で亢進する。
消化管におけるCVB3の複製を調べるため、雌雄のC57BL/6 IFNAR-/-マウス（α/β-インターフェロン[IFN-α/β]受容体欠損）に5×107 PFUのNancy株CVB3（CVB3-Nancy）を経口接種した。我々は、I型インターフェロン応答の欠如が経口経路によるヒト腸管ウイルスの感染に対するマウスの感受性を高めることを示した以前の研究に基づいて、IFNAR-/-マウスを選択した(24, 25)。経口接種後、接種後24、48、72時間（hpi）に糞便を採取し、プラークアッセイによりCVB3力価を定量した。48時間後および72時間後の糞便中のCVB3力価は、雄マウスの方が雌マウスよりも100倍から1,000倍高いことが観察された（図1A）。雄マウスで観察された糞便中力価は、ウイルス複製が起こったことを示唆したが、接種ウイルスのフロースルーの可能性があるため、糞便中ウイルス排出は必ずしも腸内でのウイルス複製を示すとは限らない(26)。そこで、光感受性CVB3を用いて、雄マウスの糞便中の接種ウイルスと複製されたCVB3を区別した。中性赤色色素の存在下で増殖したウイルスは、RNAの架橋により不活性化されるため、光に敏感に反応する。暗所（例えば腸内）でウイルスが複製されると、複製されたビリオンは光感受性を失うため、接種ウイルスと複製ウイルスを区別して複製を評価することが容易になる(27-29)。暗所で光感受性CVB3をマウスに経口接種した後、暗所で24、48、72時間後に糞便を採取した。採取後、糞便中の明所暴露ウイルスと暗所暴露ウイルスの力価の比を測定することにより、CVB3の複製を定量した。我々の研究室での過去のデータ（29）と同様に、48時間後および72時間後に雄マウスから排出されたウイルスのほとんどは複製されたウイルスであった（図1B）。一方、雌マウスから採取した糞便では、CVB3の複製は検出されないか、あるいは限定的であった（図1B）。全体として、これらのデータは、CVB3が雌性IFNAR-/-マウスよりも雄性IFNAR-/-マウスの腸内でより効率的に複製されることを示唆している。
図1
図1 性に依存したCVB3の腸内複製。(A)5×107PFUのCVB3-Nancyを経口接種した雌雄IFNAR-/-マウスにおけるCVB3-Nancy糞便力価(n = 14から15/性)。(B)光感受性中性標識ウイルスを用いた雌雄IFNAR-/-マウスにおけるCVB3-Nancyの複製。複製状態は、光に曝露したサンプルのPFU/ミリリットル数を暗所に曝露したサンプルのPFU/ミリリットル数で除算し、その結果に100％を乗じて求めた(n = 4から7/性)。(C)経口接種した雌雄免疫不全C57BL/6マウスにおけるCVB3-Nancy糞便力価(n = 7 to 12 per sex)。(D)経口接種した雌雄免疫不全C57BL/6マウスにおけるCVB3-H3糞便力価（雌雄各n = 10から15）。すべてのデータは平均値±平均値の標準誤差である。, P < 0.05（Mann-Whitney検定）。WTは野生型。
次に、I型IFN応答の消失が腸内での性差によるCVB3の複製に寄与しているかどうかを調べるために、野生型で免疫不全のC57BL/6マウスでCVB3の糞便中力価を定量した。5×107PFUのCVB3-Nancyを経口接種したところ、雌雄の野生型マウスともに糞便中への排出は限定的であった（図1C）。72時間後の雄のCVB3-Nancy糞便力価は雌の糞便力価より高かったが、統計的に有意ではなかったので、野生型マウスにおけるウイルス複製の欠如が雌雄間の複製差を覆い隠したと我々は仮定した。この限界を克服するために、より強毒なCVB3株であるCVB3-H3を経口接種した野生型マウスの糞便力価を定量した。H3株はCVB3-Nancyの変種で、i.p.注射後にマウスに重症心筋炎を引き起こす(30)。実際、IFNAR-/-マウスで得られた結果と同様に、免疫不全の雄マウスは雌マウスよりもCVB3-H3を接種後3日目および7日目に有意に多く排出した（図1D）。これらのデータは、腸におけるCVB3の性差に依存した複製は、I型IFN応答とは無関係であることを示している。
IFNAR-/-マウスにおけるCVB3誘発致死は性依存性である。
ヒトと同様に、これまでのマウスモデルでも、CVB3の発症には性差があることが示されている(16, 18, 31, 32)。経口感染マウスが性差によってCVB3誘発致死を示すかどうかを調べるために、IFNAR-/-マウスを接種し、経口感染後の生存率を調べた。その結果、IFNAR-/-マウスの雄のみが、CVB3-Nancy感染後に発病した（図2A）。次に、CVB3による致死がI型IFN応答の消失に依存しているかどうかを調べるために、野生型免疫不全マウスにCVB3-Nancyを経口接種した。IFNAR-/-マウスとは対照的に、すべての免疫不全雌雄マウスはCVB3感染を生き延びた（図2B）。さらに、CVB3-H3の経口接種は、雌雄の免疫不全マウスにおいて致死を誘導することができなかった（図2C）。全体として、これらのデータは、IFNAR-/-マウスにおいて、CVB3の経口接種後の生存が性差に依存することを示唆している。
図2
図2 経口接種したマウスにおけるCVB3誘発致死率の性依存性。(A) 5×107 PFUのCVB3-Nancyを経口接種したC57BL/6 IFNAR-/-マウスの雌雄の生存率。, P < 0.05 (対数順位検定; n = 14 to 15 per sex)。(B）5×107PFUのCVB3-Nancyを経口接種したC57BL/6免疫不全雌雄マウスの生存率（n = 11から12/雌性）。(C）5×107PFUのCVB3-H3を経口接種したC57BL/6免疫不全雌雄マウスの生存率（雌雄各n＝16）。
I型IFN応答は、i.p.接種後の末梢組織におけるCVB3の性差に依存した複製に影響を与える。
これまでのCVB3発症モデルマウスでは、疾患の性差はウイルス複製の差とは無関係であることが証明されている。具体的には、雄マウスはより重篤な心筋炎を発症するが、i.p.接種後の雄雌マウスの心臓におけるCVB3の複製は同等である(16, 17)。しかし、経口接種したIFNAR-/-マウスでは、腸におけるCVB3の複製は性差に依存することがわかった。性差に依存したCVB3の複製が腸に特異的であるか、あるいはIFNAR-/-モデルに特異的であるかを調べるために、雌雄のIFNAR-/-マウスに1×104 PFUのCVB3-Nancyをi.p.接種した。3dpiで心臓、肝臓、脾臓、腎臓を摘出し、プラークアッセイでCVB3力価を定量した。以前の報告(16)と同様に、心臓と腎臓のCVB3力価に雌雄間で有意差は認められなかった（図3A）。しかし、雄マウスの肝臓と脾臓におけるウイルス力価は、雌マウスのそれよりも有意に高いことがわかった(Fig. 3A)。このことは、IFNAR-/-マウスの肝臓と脾臓におけるCVB3の複製も性差に依存していることを示唆している。次に、I型IFN応答の消失が肝臓と脾臓における性差依存性の複製に関与しているかどうかを調べるために、野生型の免疫不全マウスに1×104 PFUのCVB3-H3をi.p.接種した。CVB3-H3のi.p.接種後、雌雄マウスの心臓、肝臓、脾臓、腎臓のウイルス力価に有意差は認められなかった（図3B）。これらのデータから、i.p.接種マウスのほとんどの組織におけるCVB3の複製は性差に依存しないが、I型IFN応答の消失により肝臓と脾臓では性差に依存した複製が促進されることが示唆された。対照的に、経口接種マウスの腸におけるCVB3の複製は性差に依存する（図1）。
図3
図3 i.p.接種後の末梢組織におけるCVB3の複製。雌雄マウスに1×104 PFUのCVB3-NancyまたはCVB3-H3をi.p.接種した。マウスは3dpiで安楽死させ、組織を採取した。(A)雄(青)および雌(赤)のIFNAR-/-マウスにおけるCVB3-Nancy組織力価(n = 13から15/性)。(B)免疫不全C57BL/6マウスの雄(青)と雌(赤)におけるCVB3-H3組織力価(n = 6/性)。すべてのデータは平均値±平均値の標準誤差である。nsは有意ではない（Mann-Whitney検定）。
CVB3-Nancyは、経口接種した雄のIFNAR-/-マウスでは免疫応答を誘導するが、雌のIFNAR-/-マウスでは誘導しない。
経口接種した雌性IFNAR-/-マウスではCVB3-Nancyが複製されなかったことから、雌性マウスでは免疫応答が亢進しているため、腸内でのCVB3の複製が制限されるのではないかと考えた。この仮説を検討するため、雄雌のIFNAR-/-マウスの72時間後の血清サイトカインレベルを調べた。我々の仮説に反して、CVB3感染雄マウスでは非感染対照マウスと比較してサイトカインレベルの上昇が観察されたが、雌マウスでは観察されなかった。雄のIFNAR-/-マウスでは、IFN-γ、インターロイキン-1β（IL-1β）、IL-6、インターフェロンガンマ誘導蛋白質10（IP-10）、ケラチノサイト由来ケモカイン（KC）の血清サイトカインレベルが上昇していた、 単球走化性タンパク質1（MCP-1）、RANTES、腫瘍壊死因子α（TNF-α）は、CVB3感染後、感染していないコントロールの雄性IFNAR-/-マウスのものと比較した（Fig. 4). さらに、CVB3感染雌性IFNAR-/-マウスの血清サイトカインレベルは低く、未感染の雌性マウスと同様であった。これらのデータは、経口接種した雌性IFNAR-/-マウスは、72 hpiでは強い免疫応答を引き起こさないことを示している。
図4
図4 腸管CVB3-Nancy複製に対する性依存性免疫応答。CVB3-Nancyに感染した雄(青)と雌(赤)のIFNAR-/-マウスの72時間後の血清中サイトカイン定量と非感染マウス(白)の血清中サイトカイン定量。感染マウスに5×107 PFUのCVB3-Nancyを経口接種した。血清中のサイトカインレベルを、ガンマインターフェロン（IFN-γ）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-6（IL-6）、インターフェロンガンマ誘導タンパク質10（IP-10）、マウスケラチノサイト由来サイトカイン（KC）、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、RANTES、および腫瘍壊死因子α（TNF-α）について測定した（n＝3～6/性）、 検出不能。
次に、経口経路による雌雄IFNAR-/-マウスのCVB3感染が、CVB3に対する適応免疫応答を誘導するかどうかを調べた。これまでの研究で、i.p.接種後7日目に検出可能なCVB3中和抗体が示されている(14, 33)。そこで、経口接種後のCVB3に対する適応免疫応答を評価するために、経口接種後7日目に生存している雄および雌マウスから血清を採取し、プラークアッセイを用いてin vitroでCVB3-Nancyを中和する能力を試験した。その結果、雄マウスの血清はCVB3-Nancyのプラーク形成を10～100倍有意に減少させたが、雌マウスの血清には効果がなかった（図5）。コントロールとして、CVB3-Nancyを感染していないマウスの血清とインキュベートしたが、CVB3-Nancyを中和することはできなかった（データは示さず）。これらのデータは、雌ではなく雄のIFNAR-/-マウスが経口接種後にCVB3に対する中和血清を産生することを示唆している。
図5
図5 CVB3-Nancyの血清中和。雌雄IFNAR-/-マウスに5×107PFUのCVB3-Nancyを経口接種し、7dpiで血清を採取した。血清は経口接種に用いた1×105PFUのインプットCVB3-Nancyとインキュベートした。血清とウイルスを37℃で1時間インキュベートした後、CVB3-Nancyの感染性をプラークアッセイで定量した。データは平均値±平均値の標準誤差である。, P < 0.05（n=3〜5/性）。
性ホルモンは腸内のCVB3排出と致死率を変化させる。
これまでの研究で、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロンなどの性ホルモンが、マウスにCVB3をi.p.注射すると、CVB3の複製と病原性を変化させることが示されている(31, 34, 35)。我々の経口感染モデルにおいて、性ホルモンが性差に依存したウイルス排出に寄与しているかどうかを調べるために、去勢および卵巣摘出したIFNAR-/-マウスの腸におけるCVB3の複製を調べた。雄マウスは外科的に去勢してテストステロンを減少させるか、4週齢で模擬去勢手術を行った。雌マウスは4週齢で、エストロゲンとプロゲステロンを減少させるために外科的に卵巣摘出するか、模擬卵巣摘出手術を行った。術後6週目に、マウスにCVB3-Nancyを経口接種した。その結果、雄マウスの去勢はCVB3による致死を防ぎ、48時間後のCVB3の排出を有意に減少させた（図6AおよびB）。卵巣摘出はCVB3による致死を増強しなかったが、卵巣摘出した雌マウスは、24 hpiの時点で、手術対照の雌マウスよりも有意に多くのCVB3を排出した（図6CおよびD）。これらのデータは、性ホルモンが経口接種後のCVB3の排出と致死の両方を変化させる可能性があることを示している。
図6
図6 性ホルモンは腸内CVB3の複製と致死率を変化させる。週齢の雄 IFNAR-/- マウスと雌 IFNAR-/- マウスは、それぞれ精巣と卵巣を摘出する手術を受けた。10～12週齢で、去勢および卵巣摘出したマウスに5×107PFUのCVB3-Nancyを経口接種した。(A）CVB3-Nancy感染後の模擬去勢および去勢雄マウスの生存率。, P < 0.05 (対数順位検定; n = 10マウス/群)。(B) 模擬去勢および去勢雄マウスの糞便中CVB3-Nancy力価。データは平均値±平均値の標準誤差。, P < 0.05 (Mann-Whitney検定; n = 10 mice per group)。(C）CVB3-Nancy感染後の模擬卵巣摘出および卵巣摘出雌マウスの生存率（n = 9から10匹/群）。(D) 模擬卵巣摘出マウスおよび卵巣摘出雌マウスにおける糞便中のCVB3-Nancy力価。データは平均値±平均値の標準誤差。*, P < 0.05 (Mann-Whitney検定; n = 9 to 10 mice per group)。
考察
腸管ウイルスは糞口経路で伝播し、消化管で感染を開始する。これまでのコクサッキーウイルスのマウスモデルは、全身性のウイルス感染と心臓の病態を再現しているが、腸管におけるCVB3の初期複製に影響する因子は不明である。ここでは、腸におけるウイルス複製を研究するために、CVB3の経口接種モデルを用いた。これまでの経口投与マウスでの研究とは対照的に、腸内でのCVB3の性差に依存した複製が観察された。CVB3は雄のIFNAR-/-マウスでは効率よく複製され、致死率も上昇したが、雌のIFNAR-/-マウスでは見られなかった。我々の知る限り、腸内ウイルスの複製に性差が影響することが証明されたのは本研究が初めてである。
我々のデータは、性ホルモンが雄と雌のマウスの複製と病態の違いに寄与している可能性が高いことを示している。我々は、性ホルモンがCVB3の宿主消化管内での複製能力に影響を与え、致死率にも影響を与えることを観察した（図6BおよびD）。ホルモンはウイルスレセプターの利用可能性を変化させる可能性がある。エストロゲンはウイルス侵入コアセプターである崩壊促進因子（DAF）の発現を調節することが示されている(36)。さらに、エストロゲンとテストステロンはCVB3の心筋細胞への接着を促進する(31)。興味深いことに、コクサッキーウイルスの主要なレセプターであるコクサッキーウイルスおよびアデノウイルスレセプター（CAR）は、腸上皮細胞のタイトジャンクションに存在する。性ホルモンはタイトジャンクションタンパク質を制御することが最近の証拠で示されている。したがって、ホルモンは腸におけるCARの利用可能性を制御し、したがってCVB3の複製を調節する可能性がある。しかし、性ホルモンがCVB3の腸内複製を調節するメカニズムは不明である。
これまでの研究で、いくつかのヒト腸管ウイルスに対するマウスの感受性には、IFN型応答の消失が必要であることが示されている(26, 37, 38)。同様に、IFNAR-/-雄マウスではCVB3による致死率が野生型免疫不全雄マウスと比較して増加することが見いだされた。IFN-α/βはウイルスの複製を制限することにより、ウイルス感染において重要な役割を果たしている。実際、in vitroとin vivoの両方の研究で、IFN-α/βがCVB3の複製と病原性を減少させることが証明されている(39-42)。これらのデータと一致するように、I型IFN応答はCVB3-Nancyの腸内複製を減少させた（図1C）。興味深いことに、CVB3-H3株はI型IFN応答を部分的に克服し、免疫不全野生型雄性マウスで複製することができた。H3株はCVB3-Nancy変異体であり、マウスに重篤な心筋炎を引き起こす(30)。ウイルスカプシドのVP2領域における塩基配列の違いが、H3株の心筋炎誘発能を高めている。さらに、VP1ウイルスカプシドタンパク質の変異は、宿主ウイルスレセプターとの相互作用部位の近くに集まっている(43)が、これらのアミノ酸の違いが腸管複製に重要であるかどうかは不明である。
我々はまた、経口接種IFNAR-/-マウスモデルでCVB3に対する免疫反応を調べた。これまでの研究から、ウイルス病原体に対する細胞介在性免疫応答は、男性よりも女性の方が優れていることが示唆されている(1)。従って、我々は、雌性マウスにおけるウイルス複製の欠如は、抗ウイルス性サイトカイン応答の亢進によるものであると仮定した。しかし、雄のIFNAR-/-マウスではCVB3感染後72時間で血清サイトカインが増加したのに対し、雌のIFNAR-/-マウスの血清サイトカインレベルは未処置のコントロールと同程度であった。さらに、生き残ったCVB3感染雄マウスの血清はin vitroでCVB3を中和することができたが、雌マウスの血清はCVB3を防御しなかった。これらのデータから、雌マウスはCVB3の経口感染後72時間では免疫応答を引き出せないことが示された。しかし、サイトカイン誘導と血清中和の動態が雌雄間で異なるかどうかを調べるには、今後の実験が必要である。全体として、これらのデータは、雌マウスがCVB3の腸内感染に抵抗性であること、腸内環境の因子が性差に依存したCVB3の複製に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。以前、我々の研究室では、腸内細菌がポリオウイルスの複製と病原性を増強することを示した(27, 28)。ポリオウイルスはコクサッキーウイルスと同じウイルス科に属する腸内ウイルスであるため、腸内細菌はCVB3の複製も促進する可能性がある。興味深いことに、性差が腸内細菌の構成に影響を与えることが最近示唆されている(44, 45)。したがって、性特異的な細菌が腸内でのCVB3の複製に寄与している可能性がある。
結論として、CVB3の複製および致死率は、経口接種した雄マウスの方が雌マウスよりも高く、これは腸内でのウイルス複製に差があるためであることがわかった。さらに、性ホルモンとI型IFN応答は、腸管でのCVB3の複製と発症に重要な役割を果たしている。これらのデータから、腸管ウイルスの研究においては、性差と自然経口感染経路を考慮すべきであることが示唆される。
材料と方法
細胞とウイルス。
HeLa細胞は、10％子牛血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で増殖させた。CVB3-NancyおよびCVB3-H3感染クローンはMarco Vignuzzi (Pasteur Institute, Paris, France)から入手した。感染クローンプラスミドとT7 RNAポリメラーゼを発現するプラスミドを共導入することにより、HeLa細胞にCVB3のストックを調製した。ウイルス力価は、以前に記載されたように、HeLa細胞を用いたプラークアッセイにより決定した(29, 46)。糞便ウイルスがインプット／インキュラムウイルスであるか、複製を経たウイルスであるかを決定するために、以前に記載されたように、中性赤標識光感受性CVB3を用いた（26, 29）。光による不活化の有効性は、中性赤標識CVB3ストックを蛍光灯に10分間照射して測定した。NR-CVB3ストック中の光感受性PFUと光感受性PFUの比率は、2.4×105分の1であった。経口接種後、腸内で複製されたウイルスの割合を測定するため、サンプルを暗所で処理し、一部を光照射した。複製ウイルスの割合は、光曝露したPFU/ミリリットル数を非光曝露のPFU/ミリリットル数で除算し、その結果に100を乗じて算出した。
マウス実験。
すべての動物は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）が承認したGuide for the Care and Use of Laboratory Animals（47）に従って取り扱われた。すべてのマウス研究は、UT Southwestern (Animal Welfare Assurance A3472-01)で、地元のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコルを用いて、苦痛を最小限にするように設計された方法で実施され、重篤な疾患を示した動物はイソフルランを用いて直ちに安楽死させた。C57BL/6 PVR IFNAR+/+およびC57BL/6 PVR IFNAR-/-マウスはS. Koike (Tokyo, Japan)から入手した(25)。去勢および卵巣摘出手術は、4週齢のマウスをイソフルランで麻酔し、精巣と卵巣を外科的に摘出した。模擬去勢雄および模擬卵巣摘出雌を生存手術の対照として用いた。経口接種では、10～12週齢のマウスに5×107 PFUのCVB3を経口接種した。生存実験では、接種後14日目まで疾病をモニターした。マウスは重症化した時点で安楽死させた。排出実験および複製実験では、24、48、および 72 hpi に糞便を採取し、既述のように処理した(27)。腹腔内接種では、10～12週齢のマウスに1×104 PFUのCVB3を前述のように接種した(33)。心臓、肝臓、腎臓、および脾臓を無菌的に摘出し、0.9～2.0 mmのステンレススチールビーズを用いてリン酸緩衝生理食塩水中でブレットブレンダー（ネクストアドバンス社製）でホモジナイズした。細胞残屑は12,000×g、10分間、4℃で遠心分離して除去し、CVB3はHeLa細胞を用いたプラークアッセイで定量した。
サイトカイン発現。
雌雄のIFNAR-/-マウスから、感染前(未感染)またはCVB3-Nancyで72hpiに心臓穿刺により血液を採取した。血液サンプルは凝固を誘導するために室温で30分間インキュベートした。血清サンプルは分析まで-20℃で保存した。サイトカインレベルはMouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel（EMD Millipore）を用いて測定し、アッセイはUniversity of Texas Southwestern Medical Center Metabolic Phenotyping Coreが実施した。このアッセイでは、サイトカイン/ケモカインレベルの幅広い範囲を示す25種類のサイトカインを測定した。図4に示したサイトカインは性差を示したものである。
血清中和アッセイ。
非感染マウスまたは経口感染マウスから7dpiに顎下静脈から血液を採取し、室温で30分間凝固させた。4,000rpm、4℃で15分間の遠心分離後、血液サンプルの血清を採取した。各血清サンプルの連続希釈液をDMEMで調製し、56℃で30分間熱不活化した。連続希釈した血清サンプルを105 PFUのCVB3-Nancyと混合し、ガラス管中で37℃、1時間インキュベートした後、HeLa細胞を用いたプラークアッセイによりCVB3を定量した。
謝辞
実験に協力してくれたPalmy Jesudhasan、Misty Demaree、Matthew Riegel、University of Texas Southwestern Metabolic Phenotyping Core、原稿のレビューをしてくれたAndrea Ericksonに感謝する。
本研究は、Burroughs Wellcome Fund Investigator in the Pathogenesis of Infectious Diseases award（J.K.P.）、R01 AI74668（J.K.P.）、T32 AI070116（C.M.R.）、およびK01 DK110216（C.M.R.）の助成を受けた。
参考文献
1.
Klein SL and Flanagan KL. 2016. 免疫応答における性差。Nat Rev Immunol16:628-638.
Crossref
グーグル奨学生
2.
vom Steeg LG and Klein SL. 2016. 感染症病原体におけるSeXXの重要性。PLoS Pathog12:e1005374.
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
3.
Ober C, Loisel DA, and Gilad Y. 2008. ヒト疾患の性特異的遺伝的構造。Nat Rev Genet9:911-922.
引用文献へ
引用
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
4.
Danska JS. 2014. 性差はメカニズムに重要である。Sci Transl Med6:258fs240.
引用文献へ
クロスリファレンス
グーグル・スカラー
5.
Kosrirukvongs P, Kanyok R, Sitritantikorn S, and Wasi C. 1996. 1992年にタイで発生した急性出血性結膜炎。Southeast Asian J Trop Med Public Health27:244-249.
引用文献へ
パブコメ
Google Scholar
6.
He SJ, Han JF, Ding XX, Wang YD, and Qin CF. 2013. 2010年広東省の手足口病患者から分離されたエンテロウイルス71とコクサッキーウイルスA16の特徴。Int J Infect Dis17:e1025-1030.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際感染症学会
Google Scholar
7.
Andreoletti L, Leveque N, Boulagnon C, Brasselet C, and Fornes P. 2009. ヒト心筋炎のウイルス性原因。Arch Cardiovasc Dis102:559-568。
引用文献へ
相互参照
PubMed
国際心筋学会
グーグル
8.
Sane F, Moumna I, and Hober D. 2011. B群コクサッキーウイルスと自己免疫：1型糖尿病を中心に。Expert Rev Clin Immunol7:357-366.
引用文献へ
引用文献
PubMed
Google Scholar
9.
Shah VA, Chong CY, Chan KP, Ng W, and Ling AE. 2003. シンガポールで発生した手足口病の臨床的特徴。Ann Acad Med Singapore32:381-387.
引用文献へ
パブコメ
ISI
Google Scholar
10.
Archard LC, Khan MA, Soteriou BA, Zhang H, Why HJ, Robinson NM, and Richardson PJ. 1998. 拡張型心筋症患者の心筋におけるコクサッキーBウイルスRNAの、逆転写-ネステッドポリメラーゼ連鎖反応産物の塩基配列決定による特徴付け。Hum Pathol29:578-584.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
11.
Cihakova D and Rose NR. 2008. 心筋炎と拡張型心筋症の病態。Adv Immunol99:95-114.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際免疫学会
Google Scholar
12.
Gauntt CJ, Trousdale MD, LaBadie DR, Paque RE, and Nealon T. 1979. マウスに対して心筋炎性または心筋炎性を示すコクサッキーウイルスB3変異体の特性。J Med Virol3:207-220.
引用文献へ
相互参照
PubMed
国際医療福祉大学
グーグル
13.
フェアウェザーDとローズNR。2007. Coxsackievirus-induced myocarditis in mice: a model of autoimmune disease for studying immunotoxicity. Methods41:118-122.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
14.
Wolfgram LJ, Beisel KW, Herskowitz A, and Rose NR. 1986. コクサッキーウイルスB3誘発心筋炎に対する感受性のマウス系統間における差異。J Immunol136:1846-1852.
クロスレフ
PubMed
ISIについて
Google Scholar
15.
Garmaroudi FS, Marchant D, Hendry R, Luo H, Yang D, Ye X, Shi J, and McManus BM. 2015. コクサッキーウイルスB3の複製と病原性。Future Microbiol10:629-653.
引用文献へ
クロスレフ
PubMed
国際医療福祉大学
Google Scholar
16.
Frisancho-Kiss S, Davis SE, Nyland JF, Frisancho JA, Cihakova D, Barrett MA, Rose NR, and Fairweather D. 2007. 最先端：TLR4とT細胞Igムチン-3による相互制御が、炎症性心疾患の性差を決定する。J Immunol178:6710-6714.
クロスレフ
PubMed
ISIについて
Google Scholar
17.
Li Z, Yue Y, and Xiong S. 2013. CVB3誘発心筋炎における性別の偏りには、Th17の誘導が異なっている。Cardiovasc Pathol22:373-382.
Crossref
PubMed
Google Scholar
18.
Li K, Xu W, Guo Q, Jiang Z, Wang P, Yue Y, and Xiong S. 2009. コクサッキーウイルスB3に感染した雌雄BALB/cマウスにおけるマクロファージ分極の差は、ウイルス性心筋炎への感受性を規定する。Circ Res105:353-364.
Crossref
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
19.
Bopegamage S, Kovacova J, Vargova A, Motusova J, Petrovicova A, Benkovicova M, Gomolcak P, Bakkers J, van Kuppeveld F, Melchers WJ, and Galama JM. 2005. マウスのコクサッキーBウイルス感染：経口経路による接種は膵臓を損傷から保護するが、感染からは保護しない。J Gen Virol86:3271-3280.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
20.
Bopegamage S, Borsanyiova M, Vargova A, Petrovicova A, Benkovicova M, and Gomolcak P. 2003. マウスのコクサッキーウイルス感染。コクサッキーウイルスB3およびB4に経口感染させたマウスのウイルス動態と病理組織学的変化。Acta Virol47:245-251.
引用文献へ
パブコメ
国際ウイルス学会
Google Scholar
21.
Harrath R, Bourlet T, Delezay O, Douche-Aourik F, Omar S, Aouni M, and Pozzetto B. 2004. 経口感染したマウスの腸管細胞およびヒトCaCo-2細胞株におけるコクサッキーウイルスB3の複製と持続性。J Med Virol74:283-290.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
22.
Loria RM, Kibrick S, and Broitman SA. 1974. 成体マウスにおけるB群コクサッキーウイルスの経口感染：腸の防御機能。J Infect Dis130:539-543.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISI社
Google Scholar
23.
Loria RM, Kibrick S, and Broitman SA. 1974. 新生マウスにおけるB群コクサッキーウイルス経口感染：ヒト感染モデル。J Infect Dis130:225-230.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際感染症学会
Google Scholar
24.
大岡 聡、五十嵐裕之、永田直樹、酒井正樹、小池修一、野地俊彦、清野裕之、野本明彦 2007. α/βインターフェロン受容体を欠損したヒトポリオウイルス受容体発現トランスジェニックマウスにおけるポリオウイルス経口感染系の確立。J Virol81:7902-7912.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
25.
井田・細沼正彦、岩崎哲也、吉川忠志、永田直樹、佐藤祐樹、佐多俊彦、米山雅彦、藤田俊哉、田谷慈、米川博、小池修一 2005. α/βインターフェロン応答は、ポリオウイルスの組織向性および病原性を制御する。J Virol79:4460-4469.
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
26.
Kuss SK, Etheredge CA, and Pfeiffer JK. 2008. 複数の宿主障壁がマウスにおけるポリオウイルス輸送を制限する。PLoS Pathog4:e1000082.
Crossref
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
27.
Kuss SK, Best GT, Etheredge CA, Pruijssers AJ, Frierson JM, Hooper LV, Dermody TS, and Pfeiffer JK. 2011. 腸内細菌叢は腸内ウイルスの複製と全身性の病原性を促進する。Science334:249-252.
Crossref
PubMed
ISI社
Google Scholar
28.
Robinson CM, Jesudhasan PR, and Pfeiffer JK. 2014. 細菌のリポ多糖結合はビリオンの安定性を高め、腸内ウイルスの環境適合性を促進する。Cell Host Microbe15:36-46.
Crossref
PubMed
ISI社
Google Scholar
29.
Wang Y and Pfeiffer JK. 2016. コクサッキーウイルスB3に感染したマウスにおける大型プラーク変異体の出現。
Crossref
PubMed
Google Scholar
30.
Knowlton KU, Jeon ES, Berkley N, Wessely R, and Huber S. 1996. VP2のパフ領域の変異はコクサッキーウイルスB3のWoodruff変異体の感染性cDNAの心筋炎表現型を減弱させる。J Virol70:7811-7818.
クロスレビュー
PubMed
ISI社
Google Scholar
31.
Lyden DC, Olszewski J, Feran M, Job LP, and Huber SA. 1987. コクサッキーウイルスB-3誘発心筋炎。心筋細胞のウイルス血症および感染性に対する性ステロイドの影響。Am J Pathol126:432-438.
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
32.
Lyden D, Olszewski J, and Huber S. 1987. コクサッキーウイルスB群3型誘発心筋炎に対するBalb/cマウスの感受性の年齢による変化。Cell Immunol105:332-339.
引用文献へ
クロスレフ
PubMed
国際免疫学会
グーグル
33.
Huber SA and Pfaeffle B. 1994. コクサッキーウイルスB群3型に感染した雌雄BALB/cマウスにおけるTh1細胞とTh2細胞の反応の違い。J Virol68:5126-5132.
Crossref
PubMed
国際標準化機構
Google Scholar
34.
Huber SA, Job LP, and Auld KR. 1982. Balb/cマウスにおけるコクサッキーB-3ウイルス感染に対する性ホルモンの影響。Cell Immunol67:173-179.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
35.
Huber SA, Kupperman J, and Newell MK. 1999. マウスのコクサッキーウイルスB3誘発心筋炎におけるCD4+ T細胞応答のホルモン制御。J Virol73:4689-4695.
引用文献へ
クロスレフ
パブコメ
ISI社
グーグル
36.
Song WC, Deng C, Raszmann K, Moore R, Newbold R, McLachlan JA, and Negishi M. 1996. マウス崩壊促進因子：グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型をコードする遺伝子のエストロゲンによる選択的かつ組織特異的誘導。J Immunol157:4166-4172.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
ISIについて
Google Scholar
37.
Lazear HM, Govero J, Smith AM, Platt DJ, Fernandez E, Miner JJ, and Diamond MS. 2016. ジカウイルス病原体のマウスモデル。Cell Host Microbe19:720-730.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
Google Scholar
38.
Marvin SA, Huerta CT, Sharp B, Freiden P, Cline TD, and Schultz-Cherry S. 2015. I型インターフェロン応答は、アストロウイルスの複製を制限し、in vitroおよびin vivoにおけるバリア透過性の亢進から保護する。J Virol90:1988-1996.
引用文献へ
Crossref
PubMed
ISI研究所
Google Scholar
39.
Deonarain R, Cerullo D, Fuse K, Liu PP, and Fish EN. 2004. コクサッキーウイルスB3感染におけるインターフェロンβの保護的役割。Circulation110:3540–3543.
引用文献へ
引用文献
PubMed
グーグル奨学生
40.
Wang YX, da Cunha V, Vincelette J, White K, Velichko S, Xu Y, Gross C, Fitch RM, Halks-Miller M, Larsen BR, Yajima T, Knowlton KU, Vergona R, Sullivan ME, and Croze E. 2007. Balb/cマウスのコクサッキーウイルスB3誘発心筋炎および心外膜炎におけるマウスインターフェロン-βおよび-α2の抗ウイルス効果および心筋細胞保護効果。Am J Physiol Heart Circ Physiol293:H69-H76.
引用文献へ
引用文献
PubMed
Google Scholar
41.
Heim A, Stille-Seigener M, Pring-Akerblom P, Grumbach I, Brehm C, Kreuzer H, and Figulla HR. 1996. ヒト心筋線維芽細胞のコクサッキーウイルスB3感染キャリア状態培養において、組換えインターフェロンβおよびγはインターフェロンαよりも高い抗ウイルス活性を有する。J Interferon Cytokine Res16:283-287.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
グーグル奨学生
42.
Althof N, Harkins S, Kemball CC, Flynn CT, Alirezaei M, and Whitton JL. 2014. 心筋細胞からのI型インターフェロン受容体のin vivoアブレーションは、コクサッキーウイルスのクリアランスを遅延させ、心筋疾患を加速させる。J Virol88:5087-5099.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
グーグル
43.
Schmidtke M, Selinka HC, Heim A, Jahn B, Tonew M, Kandolf R, Stelzner A, and Zell R. 2000. 様々な細胞株へのコクサッキーウイルスB3亜種の付着：カプシドタンパク質VP1に対する表現型の違いのマッピング。Virology275:77-88.
引用文献へ
相互参照
PubMed
Google Scholar
44.
Markle JG, Frank DN, Mortin-Toth S, Robertson CE, Feazel LM, Rolle-Kampczyk U, von Bergen M, McCoy KD, Macpherson AJ, and Danska JS. 2013. 腸内細菌叢における性差は、ホルモン依存的な自己免疫の制御を駆動する。Science339:1084–1088.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
45.
Yurkovetskiy L, Burrows M, Khan AA, Graham L, Volchkov P, Becker L, Antonopoulos D, Umesaki Y, and Chervonsky AV. 2013. 自己免疫におけるジェンダーバイアスは微生物叢の影響を受ける。Immunity39:400-412.
引用文献へ
相互参照
パブコメ
国際医療福祉大学
グーグル
46.
Pfeiffer JK and Kirkegaard K. 2003. ポリオウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼの単一変異はフィデリティの増加を介して変異原性ヌクレオチドアナログに対する耐性を与える。Proc Natl Acad Sci U S A100:7289-7294.
引用文献へ
引用文献
パブコメ
ISI研究所
Google Scholar
47.
National Research Council Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 2011. 実験動物の飼育と使用の手引き第8版. National Academies Press, Washington, DC.
引用文献へ
Crossref
グーグル・スカラー
全文を見るPDFをダウンロード
推奨
関連腸管ウイルスはマウスにおける宿主微生物叢に対する要求が異なる
J Virol, 2019
マウスにおけるウイルス集団の迅速な伝播と独占が、バーコード化されたウイルスパネルを用いて明らかになった
J Virol, 2019
男性ホルモンは経口接種マウスにおけるコクサッキーウイルスB3の腸管複製と播種を促進する
J Virol, 2022
CSOG MFM委員会ガイドライン 妊娠中のB型肝炎の管理とB型肝炎ウイルスの母子感染予防（2020年）
周毅華ほか、母体胎児医学、2021年
中国における代謝外科：現在と未来
Yinfang Tuほか、Journal of Molecular Cell Biology誌、2021年
妊娠中のウイルス感染： 母体と胎児の健康を脅かす大きな課題
Wenzhe Yuほか、Maternal-Fetal Medicine誌、2022年
搭載