微生物による脂質過酸化はオベチコール酸によるマウスの非アルコール性脂肪肝炎に対する抗線維化作用を阻害する
59巻、2023年2月、102582号
微生物による脂質過酸化はオベチコール酸によるマウスの非アルコール性脂肪肝炎に対する抗線維化作用を阻害する
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https://doi.org/10.1016/j.redox.2022.102582
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概要
オベチコール酸（OCA）は非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）の治療薬として検討されているが、最近の第III相臨床試験では、抗線維化効果は満足できるものではなく、反応率も不十分である。我々は、西洋食を長期間摂取させたマウスNASHモデルを用いて、OCA型の腸内細菌叢が脂質過酸化を誘導し、抗線維化作用を阻害することを明らかにした。OCAによって濃縮されたバクテロイデスは、タウロ共役胆汁酸を脱共役して過剰なチェノデオキシコール酸（CDCA）を生成し、肝ROSの蓄積を引き起こすというメカニズムである。さらに、OCAは多価不飽和脂肪酸を含むトリグリセリド（PUFA-TGs）レベルを低下させるが、遊離PUFAおよびPUFAを含むホスファチジルエタノールアミン（PUFA-PEs）は過酸化脂質（特にアラキドン酸（ARA）由来の12-HTrE）に酸化されやすく、肝細胞フェロプトーシスおよび肝星細胞（HSCs）の活性化を誘導することが明らかにされた。ペントキシフィリン（PTX）による脂質過酸化の抑制は、OCAの抗線維化効果を回復させることから、OCAと脂質過酸化抑制剤の併用は、NASH-線維症の臨床における抗線維化薬理学的アプローチとなる可能性があることが示唆された。
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はじめに
ファルネソイド X 受容体（FXR、NR1H4 にコードされる）は、胆汁酸（BA）リガンドをトリガーとする転写因子で、肝臓再生に代表される代謝恒常性や、糖・脂質・コレステロール代謝に機能することが報告されている[1], [2], [3], [4]]. OCAはチェノデオキシコール酸（CDCA）から誘導された半合成のFXRアゴニストで、天然のBAリガンドよりもはるかに高い親和性を有しています[5]。現在までにOCAは、胆道閉鎖症、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）、原発性硬化性胆管炎（PBS）などの様々な慢性肝疾患の治療薬として開発されており、2016年にFDAによってPBCの臨床第二選択治療として承認されました［⑥］［⑦］［⑧］。しかし、線維化を伴うNASHに対するOCAの最近の第III相臨床試験では、OCAは中程度の抗線維化効果を示し、反応率が不十分であることが示されました（10 mg投与で18％、25 mg投与で23％、プラセボの12％）［9,10］。さらに、OCAはPBCによる肝線維化を改善することができず、閉塞性胆汁うっ滞における胆道傷害を悪化させる可能性があります[11,12]。さらに、OCA は肝細胞のミトコンドリア機能を低下させ、細胞のアポトーシスを促進することが報告されてい ます[13,14]。FDAは、臨床試験で観察された複数の有害事象（用量依存的なそう痒症、LDLコレステロールの増加、胆石形成のリスク、ならびに稀な肝機能低下）により、NASH治療のためのOCAの早期承認の支持を拒否しました[8,9,15,16]。したがって、NASH の進行のどのドライバーが OCA の抗線維化効果を損なうかという本質的な問題が提起され、その反応率を向上させるために重要な臨床的意義があると思われます。
肝線維化は、主に肝星細胞（造血幹細胞）の活性化から生じ、その過程で造血幹細胞は、ビタミンAを豊富に含む静止状態の細胞から、線維化、増殖、および炎症性の細胞に移行します[17]。造血幹細胞は、主に肝細胞由来および炎症細胞由来の線維化シグナルによって活性化され、肝細胞傷害に対する脂質毒性反応は活性酸素の放出に寄与し、その結果造血幹細胞の線維化発現を刺激する[18,19]。代謝性肝疾患における制御性細胞死（RCD）は、主にアポトーシス、ネクロプトーシス、パイロプトーシス、フェロプトーシスから構成されている[20,21]。これらの細胞死のうち、フェロプトーシスは、脂質代謝、酸化還元状態、鉄のバランスと関連しており、NASHの細胞死と炎症を引き起こす主要なタイプのRCDであると認識されています[22]。さらに、NAFLD患者の約3分の1では、肝鉄過剰と異常沈着が検出されており、これはNASHとその後の線維化を誘発する重要な要因の一つと考えられています[20,[22],[23],[24]]。しかしながら、NASHにおけるフェロプトーシスの特異的なメカニズムと主要なドライバーはさらに解明される必要があり、OCAがフェロプトーシスを緩和できるかどうかはまだ不明である。
本研究では、OCAがNAFLDの様々な病理学的変化を緩和できるかどうかを調べ、その不満足な抗フェロプトーシスおよび抗線維化効果におけるOCA由来のマイクロバイオームおよびリピドームの役割を検証した。ヘリコバクターは腸の過酸化状態に関係し、バクテロイデスはCDCAを生成して肝臓の活性酸素レベルを上昇させることが確認された。さらに、OCAは多価不飽和脂肪酸を含むトリグリセリド（PUFA-TGs）を減少させ、遊離PUFAsとホスファチジルエタノールアミン結合アラキドン酸（ARA-PEs）を増加させて、脂質過酸化とその後のフェロプートシスを誘発させた。その結果、ARA由来の過酸化脂質、特に12-HTrEが蓄積し、肝細胞のフェロプトーシスを促進し、造血幹細胞を活性化し、最終的にOCAの抗線維化作用を阻害することが明らかになった。これらの結果は、OCAと過酸化脂質阻害剤の組み合わせによる肝線維化に対する治療法の可能性を示唆している。重要なことは、OCAとペントキシフィリン（PTX）の相乗効果により、NASHマウスのOCA非応答性肝線維化が相加的に緩和されることを実証したことである。
結果
2.1. OCA は肝脂質蓄積および肝炎を改善した。
FXRアゴニスト、特にOCAは、グルコースと脂質のホメオスタシス障害、およびインフラマソームの活性化など、NASH活動の主要な要素を改善することが証明されている[25], [26], [27]．しかしながら、NASHのプロファイルに対するOCAの特定の影響を結論付ける系統的な研究は不足しています。この懸念に対処するため、WD飼育マウスにおいて、NASHに対するOCAの効果を評価した（図1a）。これまでの研究と同様に、OCAは体重を有意に減少させ、肝脂質蓄積を緩和し、HEおよびORO染色に基づくNASスコアおよびOil red O（ORO）面積の低下として現れた（図1bおよびc）。OCA投与マウスはWD投与マウスと比較して、肝臓および血清中の総コレステロール（TC）およびTGレベルが低下し（図1d、図S1a）、VLDLおよびLDLに対するHDLの比率が上昇したが（図S1b）、自由脂肪酸（FFA）は変化しなかった。また、脂質代謝遺伝子SREBP-1c、ChREBP、PPAR-γおよびPPAR-αの肝mRNAレベルは、OCAがWDによって動機づけられた脂質生成の活性化を誘発することを示唆した（図1e）。
図1
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図1. OCAは肝脂質蓄積を改善するが、インスリン抵抗性への影響は限定的である。(a)実験デザイン。(b)OCA投与後の体重変化（各群n = 8）。(c) HEおよびオイルレッドOで染色した肝切片の代表画像（上チャンネル）および対応するNASスコアとオイルレッドO面積指数（各群n＝8）（下チャンネル）、スケールバー80μm。矢印は、肝臓の炎症性細胞浸潤を示す。(d) 肝臓のTCおよびTGのレベル（各グループにつきn = 7-8）。(e）脂質代謝遺伝子SREBP-1c、ChREBP、PPAR-γおよびPPAR-αの肝臓発現（各群n = 6）。(f）静脈内グルコース負荷試験（IGTT）、曲線下面積（AUC）および血清インスリンレベル（各群n＝7〜8）。データは平均値±SEMで示した。(この図の凡例における色の参照についての解釈は、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)。
インスリン抵抗性は、グルコースおよび脂質代謝と相互作用し、NASHにおける線維化に寄与することが証明された[18,28]。以前の研究では、OCA がインスリン抵抗性を緩和するかどうかに関して、矛盾した所見が示された [26,29,30]。OCA治療とインスリン抵抗性の相互関係を明らかにするために、腹腔内ブドウ糖負荷試験（IGTT）が採用され、ブドウ糖耐性と血清インスリンレベルに差がないことが示された（図1f）。逆に、血清GLP-1およびPPY値は上昇傾向を示した（Fig. S1d）。
さらに、NASHの進行に関与する炎症活性について検討した。OCA投与マウスは、WD投与マウスと比較して、血清ALTおよびAST値が正常化し、好中球浸潤が改善する特徴があった（図2aおよびb）。一貫して、全身性炎症はOCA処理によって改善され、IL-1β、IL-3、IL-5、IL-6のレベルの低下と抗炎症サイトカインIL-10の上昇によって特徴づけられた（図2c）。同様の結果は、炎症性遺伝子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、MCP-1およびCXCL2の肝mRNA発現においても観察された（Fig. 2d）。
図2
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図2. OCAは肝炎および全身性炎症を緩和する。(a) 血清ALTおよびAST値（各群n = 8）。(b) MPO免疫組織化学染色による肝切片の代表画像、スケールバー40μm。矢印は、肝臓における好中球の浸潤を示す。(c）炎症性サイトカインIL-1β、IL-3、IL-5、IL-6およびIL-10の血清濃度（各群につきn＝8）。(d）炎症性遺伝子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、MCP-1およびCXCL2の肝臓発現（各群n = 6）。データは平均値±SEMで示した。
これらの知見は、OCAがWD誘発の脂質蓄積と炎症を逆転させるが、インスリン抵抗性には限定的な効果しかないことを示していた。
2.2. OCAは限られた抗酸化作用と抗線維化作用を発揮する
酸化ストレスは、NASH関連線維症の発症における主要なドライバーとして認識されている[31,32]。OCAがNASHの酸化ストレス状態を調節するかどうかを確認するために、活性酸素種（ROS）のレベルが評価された。ジヒドロエチジウム（DHE）染色により、肝ROS濃度に有意な変化は見られなかった（図3aおよびd）。組織学的解析と一致して、酸化遺伝子NOX2とMPO、抗酸化遺伝子GSTM1とCAT、過酸化指標GSH、MDAとSOD活性もまた、違いを示さなかった（図3cとd）。同様に、OCAはWD誘発回腸ROSレベルの減少（図S2aおよびb）および抗酸化物質の血清レベルの正常化（図S2c）には有効でない。
Fig.
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図3. OCAは限定的な抗酸化作用と抗線維化作用を発揮する。(a) ジヒドロエチジウム（DHE）（スケールバー40μm）、シリウスレッドおよびα-SMA（スケールバー80μm）免疫組織化学染色を行った肝臓切片の代表的な画像。矢印は肝臓の膠原線維とα-SMAの発現を示す。(b）NASスコアリングシステムによるシリウスレッド染色に基づく線維化スコアとα-SMA陽性領域（各群n＝8）。(c）酸化損傷関連遺伝子NOX2、MPO、GSTM1およびCAT、ならびに線維化関連遺伝子ACTA2およびTGF-β1の肝表現（各群n＝6）。(d) 酸化ストレスバイオマーカーGSH、MDA、SODおよびROSの肝濃度（各群n = 8）。データは、平均±SEMとして示される。(この図の凡例における色の参照についての解釈は、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)。
様々な動物モデルや第 III 相臨床試験における以前の研究では、OCA は用量依存的で緩やかな抗線維化効果を示すことが示された [9,[33],[34],[35],[36]]．そこで、さらに WD 飼育マウスに対する OCA の抗線維化効果を評価した。シリウスレッドおよびα-SMA染色は、OCA処理によって違いを示さず（図3aおよびb）、線維化遺伝子ACTA2およびTGF-β1の発現は、有意に減少しなかった（図3c）。
これらの結果は、OCAが酸化ストレスと過酸化脂質の調節に有効でないことを示し、これが抗線維化作用の不十分さの一因であると推測された。
2.3. OCA は胆汁酸代謝を調節し、肝脂質過酸化を誘発する。
肝臓や血液中に蓄積された胆汁酸は、肝細胞のアポトーシス、酸化的損傷、造血幹細胞の活性化に関連している[36], [37], [38][38]。そこで、FXRシグナルとBAホメオスタシスに及ぼすOCAの影響を検証した。予想通り、OCAは血清および糞便中の総BAs濃度を顕著に低下させた（図4a）。詳細には、共役および二次的なBAが血清中に濃縮された。非共役BAは、CA、LCAおよびDCAの減少、CDCA、α-MCA、β-MCAおよびUDCAの上昇として示された（図4bおよびc、図S3a）。同様に、糞便中のBAsスペクトルは、CA、CDCA、HDCAおよびDCAの減少として特徴づけられた（Fig.4c）。OCA処理により、主にグリシン結合型BAよりもタウリン結合型BAが減少した（Fig. S3b）。BAプロファイルと一致して、肝および回腸のFXR軸（FXR、SHP、BSEPおよびFGF15）のシグナルが上昇し、WDによって誘導されたBA合成酵素（CYP7A1、CYP27A1、CYP7B1およびCYP8B1）の上昇が、OCA処理で逆転した（図4dおよびe）。興味深いことに、古典的経路のBA合成酵素（CYP7A1、CYP8B1）は、代替経路の酵素（CYP27A1、CYP7B1）に比べて大きな減少を示した（図4d、e）。さらに、蓄積したCDCAが酸化的障害を引き起こすかどうかを検討した。その結果、CDCAは用量依存的にヒト肝細胞株L-02のミトコンドリアにおける活性酸素の蓄積とMDAレベルの上昇を誘導した（図4fおよびg）。これらの結果は、OCAを濃縮したCDCAが肝臓のROS蓄積および脂質過酸化を誘導することを強く支持するものであった。
図4
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図4. OCA由来CDCAはミトコンドリアROS蓄積を誘導する。(a) 血清および便中の総胆汁酸（TBA）レベル（各群n = 7-8）。(b) 血清中のBA組成（各群n = 7-8）。(c) 血清および便中のBAプロファイル（各群n = 7-8）。(d）FXRシグナルとその標的遺伝子SHP、BSEPおよびFGF15の発現（各群n＝6）。(e）BA合成酵素CYP7A1、CYP27A1、CYP7B1およびCYP8B1の肝mRNA発現量（n = 6/グループ）。異なる濃度のCDCAで処理したヒト肝細胞株L-02におけるMito-Tracker Red CMXRos（赤、スケールバー10μm）（f）およびMDAレベル（g）により検出したミトコンドリアROS（各群n＝3）。データは、平均±SEMとして示される。*p < 0.05. (この図の凡例における色への言及の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)。
2.4. OCA形状の腸内細菌叢は過酸化脂質と関連していた
腸管上皮と常在菌のクロストークは活性酸素の発生を誘発し、NASHの進行に関与する[[39], [40], [41]]。OCA が腸を標的としていることを考慮すると、OCA が腸内細菌叢の変化を媒介し、脂質過酸化に寄与していると仮定した。このため、便および粘膜に関連するマイクロバイオームに着目して、16S rRNAの配列決定を行った。OCAは、WDの介入によって損なわれた微生物の豊富さ（Chao1、Shannon）を明らかに上昇させ、群集組成のシフトを媒介した（図5a、b、図S4a、b）。これらの変化は、Bacteroidota門の増加、Desulfobacterota門とFimicutes門の減少を含んでいた（図5c）。さらに、OCA処理群では、Helicobacteraceaeが増加し、Lachnospiraceaeが減少していた（Fig.） 同様に、LEfSeは、OCA由来のマイクロバイオームが、Helicobacter属とともに、Bacteroidota門のBacteroidesおよびRikenellaceae分類群として酸化ストレスに対応していることを明らかにした（図5e、図S4cおよびd）。相関解析の結果、肝臓の活性酸素レベルとBacteroidesの濃縮度には有意な正の相関があり、Helicobacterの濃縮度は回腸の活性酸素レベルと正の相関があった（Fig.5f）。脂質過酸化における腸内細菌叢の役割をさらに解明するために、OCAトレッドマウスで腸内細菌を除去する腸内除染を行ったところ、OCAは抗生物質（ABX）の存在下でWDによるROS蓄積とMDAレベルを顕著に減少させた（図5g、h、図S4e）。また、CDCAを生成するOCA型微生物群の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（BSH）活性を調べたところ、OCAによって上昇したBSH活性は、ABXの共存下で消失した（Fig. 5i）。これらの結果から、OCAによる脂質過酸化への影響は、少なくとも部分的には腸内細菌叢の変化を通じて影響を受けていることが示唆された。バクテロイデスおよびヘリコバクターは、それぞれ肝臓および腸の活性酸素蓄積に関連する2つの酸化的対応微生物であった。
図5
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図5. OCA型腸内細菌叢が脂質過酸化を誘導する。(a) α-多様性指標Chao1およびShannon（各群n = 8-9）。(b) Weighted UniFrac距離に基づくPCoA分析（各群n = 8-9）。門 (c) と科 (d) レベルでの相対的存在度 (n = 8-9 per group)。(e) 線形判別分析 (LDA) の効果量 (LEfSe) に関連した差分分類群の LDA スコア。LDA スコア ＞ 4 の分類群のみ表示。(f) Spearman解析に基づく活性酸素レベルと腸内細菌分類群の相関ヒートマップ。カラーキーと四角の大きさは、微生物間の相関の強さ（r値）を示す。カラーキー（r値）と線幅（p値）は、微生物と活性酸素レベルの相関の強さを示す。濃い赤はより正の相関、濃い青はより負の相関、白は相関がないことを示す。線が太いほど有意差があることを示す。(g）抗生物質とともに、または抗生物質なしでOCAで処理したマウスのDHE染色による肝臓切片の代表的な画像、スケールバー40μm。(h）抗生物質を含むまたは含まないOCAで処置したマウスにおける肝MDAレベル（1群あたりn＝8）。(i）ニンヒドリンアッセイにより分析した腸内細菌BSH活性（TCDCAからCDCA）（群あたりn＝8）。データは平均値±SEMで示した。ABX、抗生物質。(この図の凡例における色の言及の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)。
2.5. OCA は過酸化脂質に対して感受性のある肝脂質プロファイルを選択的に媒介する
OCA は、FXR 経路に依存して TG（脂質滴の主成分）合成と脂質の腸管吸収を調節することが報告されている[42]。しかし、OCAが肝脂質プロファイルに与える影響については、広範に明らかにされていない。そこで、我々はUPLC-ESI-MS/MSを利用して、肝臓のOCA修飾脂質クラスを検出し、1788の個々の脂質種を濾過した。予想通り、OCAは肝臓の脂質プロファイルに選択的な変化をもたらし、TGとリン酸セラミド（CerP）クラスの減少、PE、ジメチルホスファチジルエタノールアミン（dMePE）、脂肪酸（FA）、セラミド（Cer）、スフィンゴミエリン（SM）クラスの上昇を特徴付けた（図6a）。主要な脂質種をさらに特定すると、OCAは2つ以上の二重結合を持つ脂肪酸（PUFA）を含むTGの大部分を減少させた（図6b）。逆に、遊離のω-3 PUFAであるドコサヘキサエン酸（DHA）、ドコサペンタエン酸（DPA）、ω-6 PUFAであるリノール酸（LA）およびARAはOCA処理後に増加することが検出された（図6cおよびd）。KEGG解析により、OCAはPUFA、主にARA（20：4 ω-6）、LA（18：2 ω-6）およびα-リノレン酸（ALA、18：3 ω-3）の代謝を増加させることも明らかにした（図6e）。注目すべきは、ARA-TGの減少および遊離ARAの変化なしと比較して、ARA含有グリセロリン脂質PE（ARA-PE）はOCA処理によって有意に上昇し（図6f）、ARAを含む他のグリセロリン脂質（ARA-PDおよびARA-PC）は変化しないままであった（図S5）。さらに、OCAは、セラミドの脂質毒性作用の大部分を媒介するC16:0セラミドの肝濃度を上昇させた（図S6a及びb）[43]。リピドミクス結果に基づいて、我々は、OCAが脂質の過酸化を受けやすく、その後、脂質毒性をもたらす遊離ω-6 PUFAsおよびARA-PEsのレベルを上昇させたと結論付けることができる。
図6
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図6. OCAは肝脂質プロファイルを選択的に変化させる。(a) 肝脂質クラスのヒートマップ。(b) 二重結合以上の脂肪酸（PUFA）を含むトリグリセリド（TG）種のリピドーム解析。(c) 遊離のω-3およびω-6 PUFAsの定量。(d) ω-3 および ω-6 PUFAs のクラス。(e)WD飼育マウスとOCA飼育マウスのKEGGエンリッチメント解析。(f) ARA、ARA含有TGおよびARA含有PEの肝濃度。データは平均±SEMで示した。LA、リノール酸。DPA、ドコサペンタエン酸。ARA、アラキドン酸。DHA、ドコサヘキサエン酸。EPA、エイコサペンタエン酸。TG、トリグリセリド。PE、ホスファチジルエタノールアミン。
2.6. 過酸化脂質を介したフェロプトーシスが造血幹細胞の活性化に関与していること
ω-3 PUFA と ω-6 PUFA は過酸化脂質の前駆体であり、フェロプートシスを引き起こすことが報告されている [[44], [45], [46]] ので、OCA によって濃縮された ARA-PE が過酸化され、さらにフェロプートシスと脂質毒性を誘導すると想定された。NASHに肝フェロプ トシスが存在するかどうかを検証するために、TUNEL染色を行ったところ、OCA処理はWD誘発肝細胞死を軽減できないことが示唆された（図S7aおよびb）。さらに、肝鉄濃度は、OCAがNASHのFe2+過負荷をわずかに悪化させることを示した（図7a）。同様に、抗フェロプターシス遺伝子であるSLC7A11とGPX4の肝mRNAレベルはダウンレギュレートされていたが（図7b）、それらの回腸mRNAレベルは有意に制御されていなかった（図S7c）。抗アポトーシス遺伝子もグループ間で差がなく、このモデルではアポトーシスがNASHの進行にほとんど関与していないことが示された（図S7d）。
図7.
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図7. PUFA由来の過酸化脂質12-HTrEは肝細胞のフェロプトーシスを誘導し、造血幹細胞を活性化する。(a) 肝臓Fe2+定量（各群n = 8）。(b) フェロプートシス遺伝子の相対的mRNA発現（各群n = 8） (c) 標的過酸化物オミックスに基づくOCA投与マウスとWD給餌マウスの過酸化脂質の差の倍率変化（各群n = 6）。(d) ARA由来のオキシリピンの代謝図。(e) 12-HT処理したL-02またはLX-2細胞のフェロプトーシス遺伝子の発現(n = 3/グループ)。(f) エラスチンまたは12-HTで処理したL-02のMDAレベル、フェロプ トシス阻害剤Fer-1、NACおよびPTXの併用または非併用（各群n=3）。(g) C11-BODIPYで検出した異なる処理を施したL-02の脂質過酸化、スケールバー10μm。(h) 12-HTで処理したLX-2の線維化遺伝子の発現（各群n = 3）。(i) トランスウェルアッセイを用いた共培養モデル。(j）12-HT処理したL-02と共培養したLX-2の線維化遺伝子の発現（各群n = 3）。データは平均値±SEMで示す。*p < 0.05. 12-HHTrE, 12S-hydroxy-5Z,8E,10E-heptadecatrienoicacid（ヘプタデカトリエノイックアシッド）。Fer-1、フェロスタチン-1。NAC、N-アセチル-L-システイン。PTX、Pentoxifylline。
肝フェロプトーシスと線維化に関与する過酸化脂質をさらに同定するために、UPLC-ESI-MSを用いたターゲットオキシリピンオミクスを採用した。その結果、WDによるARAおよびその炎症性産物であるPGE2とLXA4の血清レベルの上昇は、OCAによって逆転されることが示された（図S8a）。DHA、EPAおよびARA由来のオキシリピンはOCA処理後に循環血中に濃縮され、中でも8,9-diHETE、17,18-EPETEおよび12-HTrE（12-HT）が最も濃縮されていた（図7cおよびd）。Spearmanの解析では、腸内細菌のBacteroidesとHelicobacterが12-HHTと正の相関があることが示された（図S9）。さらに、OCAはARA代謝酵素（特に12-HHTとHETEをそれぞれ生成するCOX2とLOX5）の発現を有意に上昇させた（図S8b）。これは、腸内細菌叢由来のシグナルが肝臓の脂質過酸化と相互作用してオキシリピン12-HTを生成しフェロプソスを誘導している可能性を示している。
ARA由来の12-HTの肝細胞および造血幹細胞に対する毒性影響を確認するために、ヒト肝細胞株L-02およびヒト造血幹細胞株LX-2を12-HTとインキュベートして、さらに細胞生存率およびフェロプトーシス遺伝子発現実験を行った。驚くべきことに、12-HTの濃度を1μMまで上げると、細胞生存率の明らかな低下が検出され、これも用量依存的な阻害効果を示したが、LX-2は有意な差を示さなかった（Fig. S10a）。細胞活力測定と同様に、SLC7A11とGPX4のmRNAレベルはLX-2で高く（図7e）、肝細胞は造血幹細胞よりも12-HT誘発フェロプトーシスに対して敏感であることが示唆された。さらに、12-HHTによるMDAレベル、脂質過酸化、フェロプートシス遺伝子発現の上昇と細胞生存率の低下は、フェロプートシス誘導物質であるエラスチンによって誘導される表現型と似ており、これはフェロプートシス阻害物質Fer-1とNACによって回復されうる（図7fおよびg、図S10bおよびc）。興味深いことに、我々は脂質過酸化抑制剤PTXを採用したが、これはFer-1やNACと同等のMDAレベルの低下とフェロプトーシス遺伝子発現の調節にかなりの効果を示した（図7fとg, 図S10c）。
さらに、12-HTが造血幹細胞を直接活性化するかどうかを調べたところ、TGF-β1の存在にかかわらず、線維性遺伝子の発現の上昇が検出された（図7h）。フェロプティック肝細胞と活性化造血幹細胞との間のクロストークを提供するために、肝線維化の過程で目撃される典型的なイベントであるフェロプティックL-02が、造血幹細胞を活性化する重要なトリガーとなりうるかどうかを検討した。さらに、肝細胞のフェロプトーシスが造血幹細胞の活性化に及ぼす影響を、共培養モデルで評価した（図7i）。予想通り、フェロプティックL-02とインキュベートしたLX-2は、線維化遺伝子TGF-β1およびCOL1A1の発現上昇を示した（Fig. 7j）。
結論として、これらの結果は、ω-6 PUFA ARA由来の12-HTが肝細胞のフェロプトーシスを誘導することにより、直接的または間接的に造血幹細胞を活性化することを示した。
2.7. OCA と過酸化脂質阻害剤 PTX の併用は、NASH に関連するフェロプトーシスと進行した線維化を改善した。
フェロプトーシスは NASH 関連肝線維症の発症における重要な病理学的刺激であり、肝細胞フェロプトーシス に対する OCA の影響は限られていることを考慮すると、OCA と脂質過酸化抑制剤の併用は相加的に抗線維化 効果を示すと予想されるのは妥当であろう。そこで、WD飼育マウスを用いて、OCAとPTXの相乗的な抗線維化効果をさらに評価した（Fig.8a）。ARA由来のオキシリピン、主に12-HHTは、PTX添加後に有意に減少した（Fig. 8b, Fig. S11）。特に、PTXの添加は、肝ROS過負荷を改善し（図8c）、酸化的遺伝子およびフェロプチン遺伝子の肝発現を制御し（図8d）、これらは、GSHレベルの上昇およびMDAレベルの低下と一致していた（図8e）。重要なことは、OCAとPTXの組み合わせは、コラーゲン繊維の沈着とα-SMAの発現をかなり減少させ、線維化遺伝子の発現をダウンレギュレートした（図8fとg）。
図8
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図8. OCAと過酸化脂質阻害剤PTXの併用は、NASHにおけるフェロプトーシスと進行した線維化を阻害する。(a) 実験デザイン。(b）12-HTの血清レベル（各群n = 6-7）。(c) ジヒドロエチジウム（DHE）染色による肝臓切片の代表画像、スケールバー40μm。(d) 酸化損傷関連遺伝子NOX2、MPO、GSTM1、CATおよびフェロプローシス関連遺伝子GPX4、SLC7A11の肝mRNA発現（各群n = 5-6）。(e）酸化ストレスバイオマーカーGSHおよびMDAの肝濃度（各群n＝5〜8）。(f）シリウスレッドおよびα-SMA免疫組織化学染色を行った肝切片の代表画像、スケールバー80μm。(g）線維化バイオマーカーACTA2およびTGF-β1の肝mRNA発現（各群n＝5〜6）。データは平均±SEMで示す。12-HTrE、12S-hydroxy-5Z，8E，10E-heptadecatrienoicacid（ヘプタデカトリエン酸）。(この図の凡例にある色の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)。
しかし、OCAとPTXの併用は、OCA治療と比較して、肝機能と高脂血症にそれ以上の緩和を示さなかった（図S12a）。さらに、PTXは明らかにグルコース機能障害を改善したが、併用はPTXのこの代謝的利益を消失させた（図S12bおよびc）。これは、OCAによるインスリン抵抗性関連脂質Cerの上昇によって説明され得る（図S12d）。
考察
FXRアゴニストOCAは、NAFLDの新規治療薬であり、BA代謝を調節することにより、肝脂肪生成、脂肪症および糖新生に有益な効果を示したが[5、47]、OCAがNASHを改善するメカニズムについては系統的に明らかにされていない。さらに、最近の第III相臨床試験において、NASH患者の肝線維化は、OCA治療によりわずかに減少しただけであった[9]。したがって、NASHの進行におけるどのドライバーがOCAの抗線維化効果を損なうかを特定することが重要であり、その基礎となるメカニズムは、臨床におけるOCAの有効性を決定する上で重要であると考えられる。
過負荷の酸化ストレスと抗酸化防御の障害は、肝細胞死を誘発し、進行性のNASH線維化を促進することが立証されている[31,48]。我々は、OCAが肝臓、回腸および血清におけるプロ酸化系と抗酸化系の間の不均衡を明らかに改善することができないことを示し、その抗酸化作用の限界を示唆した。しかしながら、これらの知見は、OCAが肝臓FXR経路を活性化することによりミトコンドリア機能障害および酸化ストレスを防ぐことができるとした以前の研究とは一致しない[49,50]。OCA が肝臓の FXR-SHP 軸を明らかに活性化することを考慮すると、FXR を介した OCA の抗酸化作用を弱める他の機序が存在する可能性があると推測される。
BA、特に二次 BA は脂溶性であるため、細胞膜を乱し、膜から ARA を放出させ、最終的に肝細胞に活性酸素を蓄積させる可能性がある [51]。我々は、OCAがBA合成の代替経路ではなく古典的経路を明らかに阻害することを示し、CAの枯渇とCDCAの上昇を特徴とすることを明らかにした。CDCA はミトコンドリアと結合し，ミトコンドリア機能障害と活性酸素の蓄積を引き起こす有害な BA として認識されている [51], [52], [53]．同様に，OCA の投与により，CDCA はミトコンドリアと結合し，活性酸素の蓄積を引き起こすことがわかった．同様に，CDCA は用量依存的に肝細胞のミトコンドリア活性酸素過剰と脂質過酸化を誘導することを見出した．さらに、OCA処理に反応して、血清または便中のタウロ結合BAが減少した。腸肝循環における胆汁酸の共役BAsの脱共役には微生物叢由来のBSHが介在することから[51]、これらの結果は、腸内細菌叢がCDCA生成とOCAのプロオキシダント効果に関連している可能性を示唆するものであった。
腸は、腸内細菌がコロニーを形成するOCA吸収の主要な標的であり、腸内細菌叢は、脂肪蓄積および酸化還元シグナルを媒介することによってNAFLDの進行に関与することが認識されている[40,54]。我々の結果は、OCAが群集組成を再形成し、特にBacteroidesとHelicobacterを濃縮することを実証した。Bacteroidesは、TCDCAを脱共役してCDCAを生成する主要なBSH細菌であり[55]、Helicobacterは、腸管上皮細胞との相互作用を通じて腸内ROS産生の主要な微生物刺激として認識されている[56]。裏付けるように、これら2つの微生物は、肝臓および回腸の活性酸素レベルとそれぞれ正の相関があった。そして、ABXによる腸管除染は、微生物叢が媒介する酸化ストレスを消失させ、OCAの抗酸化作用を救助した。これらのデータは、FXR活性化とは独立した腸内細菌叢-肝臓軸を介して、OCAが肝臓の酸化ストレスに影響を及ぼす別のメカニズムを部分的に説明する可能性がある。
本研究では、WDによるMDA蓄積はOCAによって改善されなかった。このことは、酸化ストレス下の過酸化脂質の肝脂質毒性が、肝線維症を悪化させる重要なメディエーターである可能性を示唆している。NASHにおける脂質毒性は、主に飽和脂肪酸（SFA）、遊離コレステロール（FC）、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ω-3 PUFA、またはPUFA由来の特殊な分解促進メディエーターの肝臓レベルの上昇によって引き起こされます[57,58]。偶然にも、OCA は PUFA を含む TG の肝濃度を主に減少させることが報告されている[42]。我々のリピドミクスデータは、OCA が肝臓の脂質プロファイルを選択的に調節し、特に TG を含む PUFA を低下させる一方で、遊離 PUFA を上昇させることを示唆した。遊離のω-6 PUFAs（LA、DPA、ARA）は OCA 処理後に濃縮され、これは酸化ストレスによって誘発される過酸化脂質の材料になる。また、オキシリピンオミックスにより、ω-6 PUFA ARA 由来の HHT、EET、HETE を中心とするオキシリピンが、この過程で微生物のシグナルに応答して産生されることが示された。
一般に、ARAの大部分はPC、PE、PIなどのグリセロリン脂質の形で存在し、これらの固定化されたARAは酸化的刺激により過酸化され、さらに細胞膜を障害してフェロプトーシスに至る可能性がある[59,60]。注目すべきは、OCA処理によりARA-PEが濃縮されることである。TGはNAFLDにおいて脂質滴を形成する主要な脂質クラスであり、それらは有害な脂肪酸（FAs）を結合することによって脂質過多による脂質毒性から保護することができる[45,57]。さらに、LDsに貯蔵されたFAsは、細胞の必要性を満たすために動員され、酸化される可能性がある[61]。したがって、OCAはARA-TGを脂肪分解してARAを放出し、さらにグリセロリン脂質に取り込まれて利用されると仮定した。ARA-PEやその伸長産物であるアドレナリン酸（C22:4）は、酸化を受け、細胞をフェロプトーシスへと導く重要なリン脂質と見なされている[62]。これまでの研究で、NASHの進行に伴い、FFA、TG、PC中のARAが減少し、ARA由来のリポキシゲナーゼ（LOX）オキシリピン5-HETE、8-HETE、11-HETE、15-HETEが上昇することが示されている[63,64]。さらに、急性・慢性肝不全患者では、他のPUFAsではなく、遊離ARAの血漿レベルが高く、ARAと関連するオキシリピンが肝リピドキシ性において重要な役割を果たすことが示唆された[65]。
本研究では、OCAを介したARA代謝酵素のアップレギュレーションとARA由来のオキシリピンHETEsと12-HTの濃縮を同定した。HETEs は細胞膜の破裂とフェロプ トシスを誘導することが広く研究されているので [66,67] 、我々はさらに微生物に関連する 12-HHT の潜在的な脂質酸化性を調べ、12-HT が介在する肝細胞死の主要なタイプとしてフェロプ トシスを同定した。フェロプトーシスの役割は、肝細胞のフェロプトーシスが肝線維症の現れであるのに対し、造血幹細胞のフェロプトーシスを標的とすることは造血幹細胞の活性化を抑制する新たな治療法であるという、矛盾したものです [68]。我々は、造血幹細胞が、12-HTの病的濃度（1μM）において、肝細胞よりも12-HTを介したフェロプトーシスに対して強い抵抗性を示すことを見いだした。さらに、12-HTは、造血幹細胞のプロフィブロティックな発現を、直接、あるいは造血幹細胞を活性化するために肝細胞のフェロプトーシスを誘発するという二つの方法でアップレギュレートする可能性があることがわかった。これらの証拠は、脂質過酸化がNASH関連線維化の主要なドライバーとして機能し、OCAの抗線維化効果を逆転させることを示している。
現在までに、脂質代謝、BAホメオスタシス、酸化ストレス、インスリン抵抗性、脂質毒性などを含む複雑なプロフィールのために、NASHに対する有効な治療法はない。[69]. したがって、NASH の治療には、複数の側面を標的とした複合的な治療が必要である。OCAが脂質過酸化を介したフェロプトーシスを誘発することを考慮すると、脂質過酸化の阻害がNASH関連線維化の治療戦略として可能性があると推測される。この戦略の実行可能性は、その後、ω-6 PUFAs 由来の酸化脂質 HETEs、HODEs および oxoODEs の血漿レベルを低下させることが証明された脂質過酸化阻害剤である PTX によって示された [70]．このように，PTXはフェロプ トシス阻害剤Fer-1やNACと同様に，過酸化脂質とその後のフェロプ トシスを有意に減少させることが示された．一方、PTXは、脂質過酸化とフェロプトーシスに対するOCAの不満足な効果を救助することができ、PTXサプリメントは、OCA非反応性肝線維症を追加的に緩和することができた。
さらに、PTXはインスリン抵抗性を改善するが、併用するとOCAによって相殺され、グルコースホメオスタシスに対する相反する効果を示すことが分かった。1つの可能な説明は、OCAによる腸FXR経路の活性化に関連する肝臓の蓄積セラミド[71]が、貧しいインスリン抵抗性を説明するということである[72,73]。フェロプ トシスを低下させる脂質過酸化抑制剤 PTX は、インスリン抵抗性を回復させる OCA の悪い効果を救うことができず、これはフェロプ トシスよりもむしろセラミドの上昇と関連している可能性を示している。
本研究の大きな限界は、OCA を介した腸内細菌叢が肝脂質過酸化に重要な役割を果たすことを示し、関連する微生物を同定したことであるが、OCA が微生物組成の変化をどのように媒介するのか、具体的なメカニズムはまだ不明な点である。BAsと短鎖脂肪酸（SCFA）は、宿主と微生物叢の間のダイナミックなコミュニケーションを維持するための重要な決定要因であることを考慮すると[74,75]、OCAを介したBAおよびSCFAスペクトラムが微生物叢を再構築するメカニズムについてはさらに解明する価値があると思われる。無菌マウスは、根本的なメカニズムを解明し、脂質過酸化に対する特定の微生物の効果を種レベルで検証するために検討することができる。我々のリピドミクスデータでは、ARA-TGの減少、遊離ARAおよびARA-PEの増加が認められた。したがって、ARAはTGから遊離しPEに取り込まれてさらに酸化されると考えられるが、この仮説はARA同位体追跡分析でさらに検証する必要がある。OCA が BA スペクトル、腸内細菌、肝脂質スペクトルの変化を伴う ARA 由来のフェロプ トシスを誘導することから、ヒトとマウスでは BA プール、腸内細菌組成、肝脂質プロファイルが異なることが明ら かになっている。同様に、ヒトとマウスでは質量比の代謝速度が異なるため、ミトコンドリアでのエネルギー代謝の副産物である活性酸素のプールや細胞の恒常性維持能力が異なり、最終的に活性酸素による細胞死の感受性の違いに寄与している[76]。したがって、マウス実験と比較して、ヒトではさらなるメカニズムがある可能性があり、NASH-線維症患者に対するこの組み合わせの相乗効果を証明するために、さらなる無作為臨床試験を処理する必要があることを示している。
要約すると、ARA 由来のオキシリピン 12-HHT の線維化促進作用は、NASH の肝線維化に対する脂 質過酸化とフェロプトーシスの重要な寄与を裏打ちするものである。この結果は、NASH線維化に対するOCAの不十分な抗線維化効果は、OCAが媒介するオキシリピンスペクトルが引き起こすフェロプトーシスに起因する可能性を示している。BA代謝、腸内細菌叢、脂質代謝のクロストークにより、OCAを介したフェロプトーシスに腸内細菌叢が重要な役割を果たすことが明らかとなった。重要なことは、OCAと脂質過酸化防止剤PTXの相乗効果により、OCA非応答性の線維化が相加的に緩和されることを見出したことである（図9）。
図9
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図9. NASHに対するOCAの貧弱な抗線維化作用の提案されたメカニズム。OCAは腸内細菌組成を変化させ、特に酸化ストレスに対応するヘリコバクターとバクテロイデスを濃縮する。ヘリコバクターは腸内活性酸素の蓄積に関係し、バクテロイデスはBSHを介した共役胆汁酸の脱共役による過剰なCDCA生成を通じて肝臓の活性酸素過剰を誘導する。さらに、OCA は肝脂質プロファイルを選択的に制御し、ARA-TG の減少、過酸化脂質に弱い ω-6 PUFA と ARA-PE の上昇を特徴とする。12-HHT は、OCA の抗腐敗性及び抗線維化効果を損なう重要なエフェクターであると同定された。
方法
4.1. 薬剤の調製
OCA (Sunshine Chemical, Wuhan, China) を 0.5% メチルセルロース (MC) に懸濁し、6 g/L の投与量とし、使用前に超音波洗浄を行った。ペントキシフィリン（PTX，Alarddin，Shanghai，China）は10 g/Lの用量で通常生理食塩水に溶解し，使用前に0.22 μmのフィルターで濾過した。
4.2. 動物投与
雄の特定病原体フリー（SPF）C57BL/6Jマウスを、12-12時間の明暗サイクルを制御して室温で飼育した。すべてのマウスは、1週間の馴化後に投与した。
NASH関連線維化に対するOCAの影響を調べるために、マウスを、（a）対照食とビヒクル（CD群）；（b）西洋食（高脂肪食＋飲料水中の高果糖／グルコース）とビヒクル（WD群）；（c）西洋食とOCA（30 mg/kg）で処置した。OCAは20週目から5週間、毎日経口ガベージで投与された。
OCAによる脂質過酸化における微生物叢の役割を調べるため、WD飼育マウスを、バンコマイシン（100 mg/kg）、硫酸ネオマイシン（200 mg/kg）、メトロニダゾール（200 mg/kg）およびアンピシリン（200 mg/kg）などの腸内細菌を取り除くための7日間の抗生物質カクテルで前処理をした。その後、マウスにOCA（30 mg/kg）を7日間投与した。
NASHにおける酸化ストレス関連線維化に対するOCAと脂質過酸化抑制剤の相乗効果を調べるために、マウスを、（a）ビヒクルによる西洋食；（b）OCA（30mg／kg）による西洋食；（c）PTX（100mg／kg）による西洋食；（d）OCA（30mg／kg）およびPTX（100mg／kg）による西洋食、で処理した。PTXは毎日腹腔内注射で介在させた。OCAとPTXは20週目から5週間投与した。
4.3. 細胞培養
ヒト肝細胞株L-02および造血幹細胞株LX-2をATCC（米国バージニア州マナサス）より購入した。両細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS、Gibco）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Beyotime、上海、中国）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、MD、米国）を用いて、37℃インキュベーター内で5％CO2で培養された。
CDCAが肝臓のROS蓄積を誘導するかどうかを調べるために、L-02細胞を0、20、50、100、200μM CDCAで24時間処理し、脂質過酸化アッセイのために採取した。
12-HHT が肝細胞および造血幹細胞にフェロプトーシスを誘導し、造血幹細胞を直接活性化するかどうかを調べるために、LX-2 および L-02 細胞をそれぞれ 1 μM 12-HHT で 24 時間培養し、さらなるアッセイのために採取した。
12-HT誘導肝細胞死がフェロプトーシス阻害剤によって逆転できるかどうかを調べるために、L-02細胞を、Fer-1（1μM）、NAC（2mM）またはPTX（1mM）の存在または不在下でエラスチン（5μM）または12-HT（1μM）と共に24時間培養し、さらなるアッセイのために採取した。
4.4. トランスウェルアッセイ
12-HTがフェロプチン肝細胞による造血幹細胞の活性化を促進するかどうかを調べるために、8μmの孔を有するトランスウェルチャンバーを用いて、修正共培養モデルが登録された。簡単に言うと、LX-2細胞は6ウェルプレートに、L-02細胞は別の6ウェルプレートの上部透過性チャンバー上にプレーティングされた。L-02細胞を1 μM 12-HTまたはビヒクルと24時間インキュベートした後、細胞培養インサートをPBSで洗浄し、新しい培地で置換してLX-2細胞を含むプレート上に移した。24時間の共培養の後、LX-2細胞をさらなるアッセイのために採取した。
4.5. 血清生化学
血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）および総胆汁酸（TBA）の濃度は、自動血液生化学分析装置（SRL.、東京、日本）により定量された。
4.6. 血清中サイトカイン・ケモカイン測定法
IL-1β, IL-3, IL-5, IL-6, IL-10 などのサイトカインおよびケモカインの血清濃度を Bio-plex Mouse Cytokine kit (Bio-Rad, CA, USA) を用いて製造者の説明書に従って定量化した。
4.7. 肝臓 ELISA アッセイ
TC、TG、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）及びグルタチオン（GSH）の肝濃度は、市販のELISAキット（Abcam、MA、USA；Sigma-Aldrich Corp、MO、USA）により定量化された。簡単に言えば、肝臓切片をホモジナイズし、遠心分離して上清を採取し、さらに測定した。
4.8. 血清 ELISA アッセイ
遊離脂肪酸（FFA）、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、ペプチドYY（PYY）、GSHおよびSOD活性の血清レベルは、市販のELISAキット（Abcam；RayBiotech、GA、USA）により評価された。
4.9. 過酸化脂質アッセイ
脂質過酸化レベルは、マロンジアルデヒド（MDA）定量、C11-BOPIYおよびMito-Tracker Red CMXRos染色により評価した。
簡単に説明すると、MDAの定量は、10mgの肝切片または106個の細胞をホモジナイズすることにより、市販のELISAキットを用いて行った。細胞内ROSを評価するために、細胞を採取し、2μM C11-BODIPYまたは200nM Mito-Tracker Red CMXRosと37℃で30分間インキュベートした。その後、LSM T-PMT共焦点顕微鏡（Zeiss）により画像を取得した。
4.10. 腹腔内グルコース負荷試験（IGTT）
IGTTは、以前に記載されたように、犠牲の1週間前に実施された[77]。簡単に言えば、マウスを16時間絶食させ、その後、2g／kgのグルコースを腹腔内注射した。血糖値は、グルコメーター（Roche, Basel, Switzerland）を用いて、注射後0.15、30、60、90、120分に評価した。
4.11. 病理組織学的解析
新鮮な肝臓切片を10％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、パラフィンに包埋し、2μm厚のスライスに切り出した。スライスは、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）およびシリウスレッドで染色した。NAFLD活性スコア（NAS）システムを適用し、NAFLD進行の程度を既述のように推定した[78]。線維化指標は、NASに従ってSirius Red染色を基に評価した。
4μm厚の凍結肝切片を4％中和ホルムアルデヒドで固定し、Oil Red-Oで染色し、ImageJで脂質滴面積を算出し、肝脂質蓄積量を評価した。
肝細胞死は，プロトコールに従い，Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay (Vazyme, Nanjing, China)により検出した．陽性細胞の割合は、Image Jを使用してカウントした。
4.12. ジヒドロエチジウム（DHE）染色および活性酸素種（ROS）定量化
肝臓と回腸の凍結切片をDHEで染色し、活性酸素濃度を評価した。
肝臓と回腸のROS濃度を定量するためにROS ELISAキットを採用した（Biolab, Beijing, China）。
4.13. 免疫組織化学染色
パラフィン包埋肝切片を、α-SMAおよびMPO抗体（Abcam）およびHRP結合二次抗体（Beyotime）で順次インキュベートした。α-SMAの陽性面積をImageJ IHCプロファイラーを用いて測定し、線維化の進行度を評価した。
4.14. 細胞生存率アッセイ
細胞生存率の測定には、Enhanced Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Beyotime)を使用した。L-02 および LX-2 細胞を 96 ウェルプレートに 5000 個/ウェルの密度で播種し、0-5μM 12-HHT と共に 24 時間培養した。細胞はCCK8アッセイで2時間インキュベートし、450 nmで吸光度を測定した。各条件について、6つの独立した生物学的二重鎖を評価した。
4.15. BSH活性アッセイ
細菌BSH活性は、タウロ共役胆汁酸塩から放出される遊離タウリンを定量することにより測定した（いくつかの修正を加えた以前の研究に基づいて）[79,80]。簡単に言えば、50 mg の便をホモジナイズし、氷上で溶解し、遠心分離して便の総タンパク質を抽出した。次に、タンパク質抽出物をBCAアッセイで定量し、3 mM酢酸ナトリウムで1 mg/mlに希釈した。37℃、30分のインキュベーション下、10μLのタンパク質抽出液に170μLの3mM酢酸ナトリウムと20μLの1mM TDCAまたはTUDCAを加えてBSH反応を行なった。その後、ドライアイスに突っ込むことで反応を停止させた。2回目の反応は、解凍した混合物を遠心分離し、上清20μLを蒸留水80μLとニンヒドリン試薬1.9mL(0. 5 mLの1% (wt/vol) ニンヒドリン、0.5 M クエン酸ナトリウム緩衝液、pH 5.5; 1.2 mLの30% (wt/wt) グリセロール; および 0.2 mLの0.5 M クエン酸ナトリウム緩衝液，pH 5.5) と十分に混合し、15 分間煮沸させた。その後冷却した後、タウリンを標準として570 nmの吸光度を測定した。BSH活性は、TCDCAからCDCAの生成に基づいて測定した。
4.16. 鉄の評価
鉄の定量は、市販の鉄アッセイキット（Abcam）を用いて、説明書に従って行った。簡単に言えば、新鮮な肝組織をPBSで洗浄し、ホモジナイズし、比色マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
4.17. RNA 抽出およびリアルタイム定量 PCR
RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA) を用いて、肝臓または細胞の Total RNA を製造者のプロトコールに従って抽出し、VⅡA7 リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems, CA, USA) により評価した。相対的 mRNA 発現量は、遺伝子 GAPDH のレベルに対して正規化した。プライマー配列は補足表 1 に示す。
4.18. 統計解析
データの正規性を評価するために、Kolmogorov-Smirnov 検定を採用した。正規分布を持つ2つ以上のグループ間の差異を確認するために一元配置分散分析を用い、多重比較の調整のためにトルコの検定を行い、それ以外はクラスカル-ウォリス検定を用いた。一対の比較における統計的有意性は、正規分布がある場合はStudentのt検定で解析し、それ以外の場合はMann-Whitney U検定が用いられた。ANOSIM は、微生物群集のクラスタリングの検定に使用した。2 つのパラメータ間の相関は Spearman の順位相関で確認した。IBM SPSS Statistics 20 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., IL, USA) および R ソフトウェアは、データの解析と図の作成に使用された。データは平均値±SEMで示し、p値<0.05は統計的に有意であると認めた。
倫理に関する記述
すべての手順は、2011 National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals に厳密に準拠して行われ、浙江大学医学部第一付属病院動物倫理ケア委員会によって委ねられた。
利益相反の宣言
著者は利益相反を宣言していない。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（81790631）、中国国家重点研究開発計画（2018YFC2000500、2021YFA1301104、2021YFC2301804）、CAMS医療科学革新基金（2019-I2M-5-045）、済南微工程生物医学山東研究所研究計画（JNL-2022001A）から支援を受けて実施した。
付録A. 補足データ
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引用元: (0)
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Aoxiang Zhuge、Shengjie Li、Yin Yuanはこの研究に等しく貢献した。
© 2022 The Authors. 発行：Elsevier B.V.
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