オートファジーは小胞体ストレスを緩和することで腸杯細胞からの粘液分泌を制御する

2023年2月21日 09:39

細胞・宿主・微生物
2023年2月3日オンライン公開
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論文
オートファジーは小胞体ストレスを緩和することで腸杯細胞からの粘液分泌を制御する

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312823000318?via%3Dihub

著者リンク open overlay panelMaria Naama 1, Shahar Telpaz 1, Aya Awad 1, Shira Ben-Simon 1, Sarina Harshuk-Shabso 1, Sonia Modilevsky 1, Elad Rubin 1, Jasmin Sawaed 1, Lilach Zelik 1, Mor Zigdon 1, Nofar Asulin 1, Sondra Turjeman 1, Michal Werbner 1, Supapit Wongkuna 2 3, Rachel Feeney 2 3, Bjoern O. Schroeder 2 3, Abra Bijer Nu. シュローダー 2 3、アブラハム・ニスカ 4、マイタル・ヌリエル・オハヨン 1、シャイ・ベル 1 5
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https://doi.org/10.1016/j.chom.2023.01.006
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ハイライト

小胞体ストレスは、大腸杯細胞からの粘液分泌を制御する

オートファジーは小胞体ストレスを緩和し、粘液の適切な分泌を促進する

ERストレスを介した粘液分泌の制御は、微生物叢とNOD2に依存している

過剰な粘液分泌は微生物叢を再形成し、大腸炎から保護する

まとめ
大腸の杯細胞は特殊な上皮細胞であり、粘液を分泌して宿主と微生物叢を物理的に分離し、細菌の侵入や炎症を防いでいる。大腸杯細胞が分泌する粘液の量をどのように制御しているかは不明である。我々は、マウスにおいて、Beclin 1を介してオートファジーを構成的に活性化すると、小胞体ストレスが減少し、粘液層が厚くなり、侵入しにくくなることを見いだした。従って、Beclin 1によるオートファジーを遺伝的に阻害すると粘液分泌が障害され、一方、ERストレスを薬理的に緩和すると粘液分泌が過剰になる。このERストレスを介した粘液分泌の制御は微生物叢に依存し、クローン病リスク遺伝子Nod2が必要である。粘液の過剰分泌は、腸内細菌叢を変化させ、特にAkkermansia muciniphilaなどの粘液利用菌を拡大し、化学物質や微生物が引き起こす腸の炎症から保護する。このように、ERストレスは粘液分泌を制限する細胞内在性のスイッチであり、一方、オートファジーはERストレスを緩和することで腸のホメオスタシスを維持するのである。

図解抄録

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キーワード
粘液小胞細胞オートファジーERストレス炎症性腸疾患微生物性大腸炎アンフォールドタンパク質応答Beclin 1Nod2
はじめに
ゴブレット細胞は腸の上皮細胞であり、粘液と抗菌性タンパク質を分泌し、宿主と微生物叢の間に化学的バリアを形成している。この粘液バリアは、微生物と宿主上皮の接触を制限し、その後の炎症反応を抑制するため、宿主と微生物叢の共生に不可欠である1。このバリアが破壊され、細菌が粘液層内部に侵入することが、炎症性腸疾患（IBD）や腸管感染症の特徴であり、おそらく原因でもある2,3。しかし、その重要性にもかかわらず、杯細胞が腸内腔に分泌する粘液量をいかに制御するかは不明であった。

マクロオートファジー（以下、オートファジー）は、飢餓や感染症、小胞体へのフォールドアップタンパク質の蓄積などのストレス時に活性化する、細胞の恒常性維持に重要な細胞内リサイクル機構である。パネス細胞や杯細胞などの腸管分泌細胞は、オートファジーや小胞体ストレス応答経路の乱れに対して非常に敏感である。実際、オートファジーやERストレス関連遺伝子の変異は、腸管バリアの破壊やIBD発症のリスクファクターとなっています。しかし、その正確な理由は完全には解明されていません4。

私たちは、杯細胞が分泌する粘液の量をどのように制御しているのか、また、杯細胞が適切に機能するためになぜオートファジーが必要なのかを理解したいと考えました。ここでは、オートファジーが、杯細胞の小胞体ストレスを緩和し、粘液の分泌を促進することを示す。マウスにおいて、Beclin 1タンパク質を介してオートファジーを遺伝的に活性化すると、腸の小胞体ストレスが抑制され、粘液の過剰分泌が促進されることを見いだした。この粘液の過剰分泌は、オートファジーのプロセスを操作することなく、薬理学的にERストレスを低減させたり、 unfolded protein response (UPR) の特定のアームを活性化することによって達成された。さらに、この粘液の過剰生産は微生物叢に依存し、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質2（Nod2）が必要であった。過剰な粘液分泌は、粘液を利用する細菌の拡大や大腸炎からの保護につながった。このように、ERストレスは粘液分泌を制限する細胞内スイッチであり、オートファジーはERストレスを緩和することで粘液分泌を適正に保ち、腸のホメオスタシスを維持することが明らかとなった。

研究成果
Beclin 1を介したオートファジーの活性化により、より厚く、浸透性の低い結腸粘液層が産生される
定常状態では、オートファジー開始タンパク質であるベクリン1は、B細胞リンパ腫2タンパク質（Bcl-2）と結合することにより隔離され、不活性化されている。オートファジーを引き起こすには、Bcl-2がリン酸化され、ベクリン1が放出される必要があり、その結果、オートファゴソームの合成が開始される（図1A）5。オートファジーは咽頭細胞の機能を正常に保つために不可欠であるので6、オートファジー過程の構成的活性化によって咽頭細胞の機能と粘液分泌が改善すると仮定した。そこで、Beclin 1の121位のフェニルアラニン残基をアラニンに変異させたノックインマウス（Becn1F121Aマウス）を調べ、Beclin 1とその阻害因子Bcl-2の結合を阻害して、オートファジーを恒常的に活性化させることに成功した（図1A）5。Becn1F121Aマウスの粘膜層が厚くなったことでバリア機能が改善されたかどうかを調べるために、マウスの血清中の内腔抗原のレベルを測定した。血中の微生物抗原の存在は、腸管バリア機能に直結している7。我々は、Becn1F121Aマウスの血清中に、NOD1、NOD2、Toll様受容体4（TLR4）およびTLR5を活性化する作動薬のレベルが低いことを見出した（図1D、1E、S1A～S1C）。このことは、これらのマウスの厚い粘液層が、細菌抗原の宿主組織への移行を制限していることを示唆している。

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図1. Becn1F121Aマウスは大腸粘液層が厚くなり、大腸組織での免疫応答が低下している。

(A) Becn1F121AマウスにおけるBcl-2リン酸化を介したオートファジー活性化の制御とその変化を示すスキーム。

(B) Carnoy's固定した大腸組織のアルシアンブルー染色。粘液層は破線によって定義されている。スケールバー、50μm。

(D と E) (D) レポーター細胞株を用いたマウス血清中の TLR4 および (E) TLR5 アゴニストの検出。

(F) 大腸組織で行ったRNA配列解析の主座標分析（PCoA）プロット。

(G)RNA配列解析で得られた転写産物のボルケーノプロット。Becn1F121Aマウスでは、青色で示した遺伝子が野生型マウスに比べて発現量が低下し、赤色で示した遺伝子が発現量が増加していることがわかる。

(H) Becn1F121Aマウスで発現が低下している転写産物を、GO生物学的機能に従ってパスウェイ解析した。棒グラフは-log（p値）、点線はパスウェイに含まれる遺伝子数を表す。

(I) FDR < 0.01の自然免疫系遺伝子の発現量の差のヒートマップ。各列はマウスを、各行は遺伝子を表す。

(C-F)各点はマウスを、(G)各点は遺伝子を表す。∗p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001; Student's t test. WT, 野生型; F121A, Becn1F121A; a.u., 任意単位.

Becn1F121Aマウスで改善されたバリアが大腸組織にどのような影響を与えるかを明らかにするために、転写解析を行った。野生型マウスとBecn1F121Aマウスの大腸組織のRNA配列解析では、2つのマウスグループの間で転写パターンに明らかな違いが見られた（図1Fおよび図1G）。RNAシーケンスデータの偏りのないパスウェイ解析により、Becn1F121Aマウスでは、免疫制御や細菌への反応に関わる遺伝子の発現が減衰していることが明らかになった（図1H）。具体的には、自然免疫サイトカイン、抗菌タンパク質、および急性反応タンパク質をコードする転写産物のレベルが、Becn1F121Aマウスで低下していた（図1I）。このように、オートファジーの構成的な活性化は、大腸杯細胞からの粘液の過剰分泌を引き起こす。この過剰な粘液は、大腸の免疫反応を制限すると同時に、内腔抗原の宿主血清への移行をよりよく制限するバリアーを形成している。

オートファジーは小胞体ストレスを軽減し、杯細胞からの粘液分泌を促進する。
次に、オートファジーの活性化が粘液の分泌を促進するメカニズムを明らかにしたいと考えた。一つの可能性として、オートファジーの構成的な活性化が杯細胞の数の拡大につながることが考えられた。しかし、Becn1F121Aマウスでは、野生型マウスと比較して、杯細胞の数がわずかに減少しているだけであり（図2A）、粘液で満たされた細胞質（杯細胞テーカ）面積に差は見られなかった（図2B）。さらに、杯細胞系譜を示す転写因子であるAtoh1およびSpdef8の転写レベルは、2群のマウスで同程度であった（図S2A）。もう一つの可能性は、構成的オートファジーが粘液形成遺伝子の転写を制御することによって粘液分泌を促進するというものであるが、野生型とBecn1F121Aマウスを比較してもこれらの遺伝子の転写レベルに有意差は認められなかった（図2CおよびS2A）。さらに考えられる説明は、杯細胞における活性酸素種（ROS）レベルの変化である。活性酸素はオートファジーの欠陥によって影響を受け、その結果粘液分泌に影響を与えることが以前示されている6。しかし、我々は活性酸素指標である4ヒドロキシノネナールの杯細胞レベルに差を見いだせなかった（図S2B）。したがって、Becn1F121Aマウスで粘液層が厚くなった理由は、杯細胞の拡大、粘液形成遺伝子の過剰発現、活性酸素レベルでは説明できない。

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図2. オートファジーは小胞体ストレスを緩和し、杯細胞からの粘液分泌を促進させる。

(A）クリプトあたりの大腸杯細胞数。

(B）大腸杯細胞の粘液で満たされた細胞質面積の定量化。

(D) 小胞体ストレス応答遺伝子のFDR < 0.01の差分発現をヒートマップで表示した。各列はマウスを、各行は遺伝子を表す。

(E)マウス大腸の代表的なウエスタンブロットで、指定の抗体で検出した。

(F) (E)と同様のウェスタンブロットのデンシトメトリー解析。

(G）蛍光活性化セルソーティングにより大腸組織から分離した杯細胞におけるHspa5 mRNAのqPCR解析。

(H）免疫組織化学による大腸杯細胞特異的なCHOPのタンパク質レベルの定量化。

(I）タプシガルジンを介したERストレス活性化を示すスキーム。

(JおよびK）タプシガルギンを投与したマウスの大腸切片の粘液の厚さを測定し、アルシアンブルーで染色した。スケールバー、50μm。

(L）Bcl2AAAマウスにおけるBcl-2リン酸化を介したオートファジー活性化の制御とその抑制を示すスキーム（A-C、F-H、Bcl2AAAマウス）。

(A-C、F-H、K）各点はマウスを表す。 ns, not significant; ∗p < 0.05; ∗p∗ < 0.001; ∗p∗ < 0.0001. (A-C, F-H) Student's t test; (K) one-way ANOVA; WT, wild type; F121A, Becn1F121A; AAA, Bcl2AAA; AB, Alcian blue; RPKM, reads per kilobase per million mapped reads; MFI, mean fluorescent intensity; RQ, relative quantity.の頭文字をとった。

次に、RNAシーケンスデータをGene Ontology（GO）細胞成分解析で再解析したところ、Becn1F121Aマウスの大腸で転写量の異なる遺伝子の多くが、ERに局在するタンパク質をコードしていることがわかった（図S2C）。小胞体ストレスの緩和機構として、細胞はオートファジーのプロセスを活性化するが9,10、オートファジーの障害は小胞体ストレスの増加につながる。11 注目すべきは、小胞体ストレス応答の障害は、杯細胞の機能障害に関連していることだ12。実際、Becn1F121Aマウスの結腸組織では小胞体ストレスに応じて発現する転写物のレベルが低下していた（図2D）。また、ERストレスマーカーであるC/EBP homologous protein（CHOP）のタンパク質レベルもBecn1F121Aマウスの大腸で低下していた（図2Eおよび図2F）。ERストレスレベルが杯細胞で特異的に減少していることを確認するために、蛍光活性化セルソーティングを用いて野生型マウスとBecn1F121Aマウスから大腸杯細胞を分離し、ERストレス応答遺伝子Hspa5の発現を解析した。大腸組織全体で得られた知見と同様に、Becn1F121Aマウスの選別された杯細胞では、Hspa5のmRNAレベルが減少していることがわかった（図2G）。次に、大腸切片の杯細胞の免疫組織化学的解析により、この杯細胞におけるERストレスの減少をタンパク質レベルで検証した。その結果、Becn1F121Aマウスの杯細胞では、ERストレスタンパク質であるCHOPのレベルが特異的に低下していることがわかった（図2H）。このように、オートファジーの構成的な活性化は、大腸杯細胞におけるERストレスを軽減する。

このことから、Becn1F121Aマウスでオートファジーを構成的に活性化すると、杯細胞のERストレスが減少し、粘液分泌が促進されるという仮説が立てられた。この仮説を検証するために、ERストレス誘導剤であるタプシガルジンをBecn1F121Aマウスに投与したところ（図2I）13、タプシガルジン投与のBecn1F121Aマウスでは、粘液層が車両投与のそれと比較して減少し、野生型マウスの粘液層と区別がつかないことが分かった（図2Jおよび図2K）。オートファジーがERストレスを軽減することによって粘液分泌を促進するという概念をさらに検証するために、ベクリン1を介したオートファジーの活性化を妨げ、したがって杯細胞がオートファジーによってERストレスを軽減できない状態にすると、粘液分泌が損なわれるかどうかをテストした。我々は、Bcl-2の3つの特定残基をアラニンに変異させ、ベクリン1からの解離を可能にしたノックインマウスを用いた（図2L）。Bcl2AAAマウスの粘液層は、野生型マウスに比べて薄く、一部の大腸領域では完全に消失していた（図2Jおよび2K）。このように、オートファジーは、杯細胞のERストレスを緩和することで、Beclin 1を介して粘液の分泌を促進する。

ERストレスを薬理学的に軽減すると、粘液の過剰分泌が持続する
オートファジーの活性化によってERストレスが緩和され、粘液分泌が増加するということは、ERストレスが粘液分泌を制限する細胞内の合図である可能性を示唆している。この仮説を検証するために、ERストレスを軽減する化学シャペロンである胆汁酸タウルソデオキシコール酸（TUDCA）で野生型マウスを処理した（図3A）13。TUDCA処理により、Becn1F121Aマウスの粘液層に類似した厚い粘液層の分泌が認められた（図3Bおよび図3C）。TUDCA処理した野生型マウスの20%では、大腸内腔が粘液で満たされていることが確認された（図3D）。

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図3. ERストレスは粘液分泌を制御する律動的なスイッチである

(A）サルブリナールによるeIF2α脱リン酸化の阻害、TUDCAによるERストレス軽減、AA147によるATF6活性化のスキームを示す。

(B-D）示したようにTUDCAまたはサルブリナールで処理し、アルシアンブルーで染色したマウスからの大腸切片における粘液の厚さの測定値。スケールバー、50μm。各点はマウス1匹を表す。

(E）ATF6活性化剤AA147で処理し、アルシアンブルーで染色したマウスからの大腸切片における粘液の厚さの測定値。各点はマウス1匹を表す。

(F) 粘液の成長速度の測定結果を示すスキーム。BioRender.comで作成した。

(G)粘液の経時的な成長±SEM。

(H)粘液成長速度。線は同じマウスの組織を結んでいる。

∗(C) 一元配置分散分析 (E) スチューデントのt検定 (G) 非線形回帰 (H) ペアt検定。WT, 野生型; F121A, Becn1F121A; TUDCA, tauroursodeoxycholic acid.

TUDCAは、Unfolded protein response (UPR) の3つのアームすべてに非特異的に作用する15。UPRは、ERストレスを緩和して細胞機能を維持し、アポトーシスを回避する高度に制御された細胞プログラムである12。したがって、次に、UPRの特定のアームの活性化を介してERストレスを緩和するだけで、粘液分泌が誘導されるかどうかを判断しようと考えた。このことを調べるために、野生型マウスと Becn1F121A マウスに、真核生物翻訳開始因子 2α （eIF2α）の脱リン酸化を特異的に阻害するサルーブリンを投与した（図3A）16 。UPR の膵臓 ER キナーゼ（PERK）群は、ER ストレスセンサー PERK が eIF2αをリン酸化することで活性化する。eIF2αがリン酸化されると、特定の転写産物の翻訳を阻害する一方で、シャペロンやERストレスの解消に必要な他のタンパク質をコードする転写産物の翻訳を促進する12。我々は、野生型マウスにおいてサルブリナル処理によるeIF2αの活性化が、TUDCA処理マウスと同様に杯細胞からの粘液分泌の過剰につながることを発見した（図3Bおよび図3C）。さらに、サルブリナール処理したBecn1F121Aマウスの粘液層は、ビヒクル処理したBecn1F121Aマウスと差がなかった（図3Bおよび3C）。これは、Beclin1を介したオートファジー活性化とeIF2α活性化が同じ経路に収斂して粘液分泌を誘導していることを示唆している。さらに、ERストレスに応答してERシャペロン遺伝子を転写する転写因子である活性化転写因子6（ATF6）の薬理活性化17も、野生型マウスの粘液分泌を増加させることになった（図3E）。このように、eIF2αまたはATF6の活性化を介してERストレスを緩和することは、杯細胞からの粘液分泌を増加させるのに十分である。

次に、ERストレスの軽減によって誘導される粘液分泌の上昇の動態を明らかにしたいと考えた。我々は、各野生型マウスから隣接する2つの結腸切片を取り出し、生理的条件下で生きた非固定組織からの粘液分泌を測定することができる2つのチャンバーに設置した。一方のチャンバーにのみTUDCAを注入し、同じマウスに由来する組織の異なる条件を比較することができた（図3F）。その結果、TUDCA処理によって粘液分泌速度が2倍と大幅に増加することがわかった（図3Gおよび3H）。さらに、コリン作動性アゴニストであるカルバコールで急激な杯細胞脱顆粒を誘導すると、15分間にわたって粘液が急速に分泌され、その後分泌速度が低下するのとは異なり18、TUDCA処理では45分間の測定時間全体にわたって粘液分泌速度が持続的に上昇した（図S3A）。この分泌率の増加は、コントロール群と比較して、粘液透過性に影響を与えなかった（図S3B）。このように、ERストレスは、杯細胞からの粘液分泌を制限する細胞内在性のスイッチであることがわかった。

粘液分泌速度に対するERストレス制御は、微生物叢とNod2によって制御されている
宿主免疫系と腸内細菌叢のクロストークは、腸管バリアを形成する複数の構成要素を制御している19。そこで次に、これらの免疫-微生物相互作用が、粘液分泌におけるERストレスの制御に影響を与えるかどうかを検討した。まず、無菌マウスにTUDCAを投与し、ERストレスを軽減させた。従来のコロニー形成マウスとは異なり、TUDCA投与は野生型無菌マウスの粘液層厚に影響を与えないことがわかった（図4A）。次に、微生物叢の枯渇が粘液分泌速度にも影響を及ぼすかどうかを検証した。野生型マウスを飲料水中の抗生物質のカクテルで処理し、その後、隣接する2つの結腸切片を取り出し、2つのチャンバーに入れて粘液分泌率を測定した（図3と同様）。微生物相欠失マウスの大腸にTUDCAを投与しても粘液分泌は増加したが、注入による刺激効果は、コロニー形成マウスと比較して有意に低かった（図4B）。さらに、抗生物質投与マウスの大腸粘液層の厚さは、TUDCA投与に反応して拡大しないことを組織切片で確認した（図4C）。このように、粘液分泌のERストレス制御には、腸内細菌叢の存在が必要であることがわかった。

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図4. ERストレスに制御された粘液分泌は、微生物叢とNod2によって制御されている

(A) TUDCAを投与した野生型無菌マウスの大腸切片における粘液の厚さの測定値。

(B）未処置または抗生物質で処理したマウスの大腸組織のTUDCAに対する粘液分泌速度の変化率。

(C）抗生物質、TUDCA、およびIL-22の組み合わせで処理した野生型マウスの大腸切片における粘液の厚さの測定値。

(D）TUDCAで処理したRag1-/-マウスの大腸切片の粘液の厚さを測定した。

(E）TUDCAで処理したMyD88fl/flおよびMyD88ΔIECマウスの大腸切片における粘液の厚さの測定値。

(F）TUDCAで処理したNod2-/-マウスの大腸切片の粘液厚の測定。

(ns, not significant; ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.001. (A, B, D, F) Student's t test; (C, E) one-way ANOVA; WT, wild type; TUDCA, tauroursodeoxycholic acid; ABX, antibiotics; IL-22, interleukin 22; fl, flox; IEC, intestinal epithelial cell.我々は、TUDCA投与による腸管上皮細胞におけるIL-22の発現低下を調べた。

次に、微生物相がどのように宿主に感知され、過剰な粘液分泌を許しているのかを明らかにしたいと考えた。腸管バリア機能の複数の側面は、Tヘルパー細胞や自然リンパ系細胞からのインターロイキン22（IL-22）の分泌によって制御されており、その結果、腸管上皮細胞において抗菌反応が誘導される。そこで、マイクロビオタを減少させたマウスにIL-22とTUDCAを投与した。その結果、IL-22は、これらのマイクロバイオータ減少マウスにおいて、ERストレスの減少に応じた粘液分泌を誘導するのに十分でないことがわかった（図4C）。次に、免疫系の適応部門が微生物叢を感知して過剰な粘液分泌を許容しているかどうかを検証した。そこで、成熟したT細胞やB細胞を持たないRag1欠損マウスをTUDCAで処理した。その結果、この処理によって粘液層が拡大することがわかった（図4D）。このことは、T細胞およびB細胞が、微生物叢の存在に反応して過剰な粘液分泌を調節する構成要素ではないことを示している。次に、TLRを介した腸管上皮細胞による直接的な微生物叢感知が、過剰な粘液分泌を促進するのに必要であるかどうかを検証した。その結果、TLRによるシグナル伝達に必要なアダプタータンパク質MyD88を欠くマウスも、TUDCA処理に反応して過剰な粘液分泌を示すことがわかった（図4E）。最後に、細菌の細胞内センサーであるNod2が、過剰な粘液分泌を促進するのに必要であるかどうかを検証した。その結果、Nod2欠損マウスはTUDCA処理に反応せず、過剰な粘液分泌が見られた（図4F）。このように、機能的なNod2は、ERストレスの減少に応じた過剰な粘液分泌に極めて重要である。

Becn1F121Aマウスにおける過剰な粘液分泌は、腸内細菌叢を変化させる
大腸粘液層は、細菌がエネルギーを生産するための糖鎖を供給することによって、微生物叢の栄養源としても機能している20。そこで次に、オートファジーの構成的活性化が、粘液層の調節を介して腸内細菌叢を形成するかどうかを検討した。別々に飼育したマウスの糞便サンプルの16S rRNA遺伝子配列解析の結果、Becn1F121Aマウスは野生型マウスと比較して、より高い微生物多様性によって特徴づけられる明確な腸内細菌叢を保有していた（図5A、5B、S4A）（図5C）。相対存在量解析の結果、Akkermansia属の細菌がBecn1F121Aマウスで濃縮されていることが明らかになった（図5D）。さらに線形判別分析効果量（LEfSe）分析により、粘液利用細菌Akkermansia muciniphilaがBecn1F121Aマウスで異常に過剰であることが確認された（図5E、5F、およびS4B）。

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図5. Becn1F121Aマウスは腸内細菌叢が変化している。

16S rRNAの配列決定を行い、腸内細菌叢の組成を特徴付けた。

(AおよびB）（A）Bar-Ilan大学で飼育されたマウスにおける、重み付きUniFracに基づく糞便微生物叢のβ多様性のPCoAおよび（B）Bray-Curtis非類似度。

(D)相対的な分類学的構成比。

(E) 野生型マウスとBecn1F121AマウスのLEfSe解析による存在量の異なる菌のクラドグラム。

(F) Bar-Ilan Universityで飼育されているマウスにおけるAkkermansia muciniphilaの相対的な存在量。

(G) UTSWで飼育されたマウスにおける重み付きUniFracに基づく糞便微生物叢β多様性の主座標分析(PCoA)。

(H) UTSWで飼育されているマウスにおけるAkkermansia muciniphilaの相対的存在量。

(A, B, F-H) 各記号はマウスを表す。 (D) 各列はマウスを表す。∗∗∗(C, F, H) Student's t test. WT, 野生型; F121A, Becn1F121A; UTSW, UT Southwestern.

21 オートファジーの構成的活性化が微生物叢の構成に及ぼす影響がどの程度強固であるかを調べるため、別の動物施設（UT Southwestern Medical Center）で、別の供給者からの飼料を与えて飼育した野生型マウスとBecn1F121Aマウスの糞便について16S rRNA遺伝子配列の解析を実施した。ここでも、野生型マウスとBecn1F121Aマウスの間で微生物組成に明らかな違いが見られ、Akkermansia muciniphilaが異常に過剰に存在していた（図5Gおよび図5H）。Akkermansia muciniphilaは粘液でのみ培養可能な粘液利用菌であることから22、Becn1F121Aマウスの大腸におけるその相対量の多さは、これらのマウスの粘液過剰をさらに示唆している。このように、オートファジーの構成的な活性化は、粘液を利用する細菌の増加とともに、腸内細菌叢を再現性高く厳密に変化させる。

Becn1F121Aマウスの腸内細菌叢は大腸炎から保護されている。
次に、Becn1F121Aマウスの粘液層の変化が、大腸炎に対する感受性にどのような影響を及ぼすかを評価した。大腸粘液層の透過性は、マウスでもヒトでも大腸炎に直結している2,3。そこで、Becn1F121Aマウスは大腸炎にかかりにくいと仮定した。デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与は、粘液バリアへの直接的な毒性作用により大腸炎を誘発することから2、Becn1F121Aマウスの粘液層の頑健性を検証するのに適したモデルとして選択された。3%DSSを5日間および7日間投与したところ、Becn1F121Aマウスは野生型マウスと比較して、体重減少、重症化、結腸短縮の減少、組織学的損傷の減少が認められた（図6A-6D、S5A-S5E）。さらに、マウスを2%DSSで7日間処理した中等度大腸炎モデルで確認した（図S5F-S5H）。さらに、Becn1F121Aマウスは、DSS処理後も野生型マウスよりも優れたバリア機能を維持していることを見出した（図S5I）。

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図6. Becn1F121Aマウスの微生物叢は大腸炎から保護されている。

(A-D) マウスを3%DSSで7日間処理した。(A）相対体重変化±SEM、（B）疾患活動性指数±SEM、（C）結腸長、および（D）組織学的損傷スコア。

(E)FMT実験のスキーム。BioRender.comで作成した。

(FおよびG）FMT後の野生型無菌マウスおよび別々に収容した野生型およびBecn1F121Aマウス糞便ドナーの重み付きUniFrac（F）およびブレイ・カーティス非類似度（G）に基づく糞便微生物叢のβ多様性のPCoA。

(H）FMT後の野生型無菌マウスの豊かさと均等性に基づくα多様性比較。

(I-K）FMT後のマウスを3％DSSで7日間処理した。(I）疾患活動性指数±SEM、（J）結腸長および組織学的損傷スコア（K）。

(C, D, F, G, J, K) 各記号はマウスを表す。∗p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊p＜0.0001；(C, D, J, K) Studentのt検定；(A, B, I) 誤検出率補正多重t検定；(H) 一元配置分散分析。WT, 野生型; F121A, Becn1F121A; FMT, 糞便微生物叢移植.

腸内細菌叢は大腸炎感受性に重要な役割を果たしている23。別途飼育したBecn1F121Aマウスの細菌叢は野生型マウスと比較して変化していることから、この細菌叢がDSS誘発大腸炎に対するBecn1F121Aマウスの感受性低下に寄与しているか検討した。無菌の野生型マウスに、野生型マウスまたはBecn1F121Aマウスの微生物叢をコロニー形成し（図6E）、糞便微生物叢移植（FMT）の効果を解析した。野生型ドナーから野生型レシピエントへのFMTは非常に効率的であったが、Becn1F121Aドナーから野生型レシピエントへのFMTは部分的にしか効率的ではなかった（図6Fおよび図6G）。このことは、Becn1F121Aマウスの腸内に存在する特定の条件が、その微生物叢構造を支持するために必要であることを示唆している。しかし、Becn1F121Aマウスから得られたレシピエントの微生物叢は、依然として野生型マウスから得られたレシピエントの微生物叢とは異なり、非常に多様であった（図6F-6H）。次に、これらのレシピエントマウスにDSSをチャレンジしたところ、Becn1F121Aマウスの微生物叢は体重減少や大腸短縮を防げなかったが、組織学的損傷を軽減した（図6I〜6K）。このように、Becn1F121Aマウスの微生物叢は、大腸炎から部分的に保護することができる。

Becn1F121Aマウスは、微生物叢に依存しない方法で大腸炎から保護される
次に、Becn1F121Aマウスの特異な微生物叢が、これらのマウスを大腸炎から保護するために必須であるかどうかを調べた。野生型とBecn1F121Aマウスのヘテロ接合体マウスを交配し、発生から成体まで同じ微生物叢にさらされるようにした（図7A）。その結果、同腹の野生型マウスとBecn1F121Aマウスの微生物叢は互いに似ており、別々に飼育した野生型マウスの微生物叢と区別がつかないことがわかった（図7B〜7D）。しかし、Becn1F121Aマウスの粘液層は野生型同腹子の粘液層よりも厚いままであり（図7E）、Becn1F121Aマウス固有のマイクロバイオータは、Becn1F121Aマウスの過剰粘液分泌の促進に本質的に関与していないことが示された。次に、これらの同腹のマウス、および野生型とBecn1F121Aマウスを別々に飼育したマウスにDSSを負荷した。その結果、Becn1F121Aマウスは、同腹の野生型マウスと比較して、別々に飼育したBecn1F121Aマウスよりも程度は小さいが、依然として急性大腸炎から保護されていた（図7Fおよび図7G）。したがって、Becn1F121Aマウスの大腸炎に対する保護には、変化した微生物叢は必要ないことがわかった。

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図7. Becn1F121AマウスはDSSおよびAIECによる大腸炎から微生物非依存的に保護される。

(A) リターメイト(L.M.)の実験デザインを示すスキーム。BioRender.comで作成した。

(B and C) (B) 重み付けUniFracに基づく糞便微生物叢β多様性のPCoAと(C) Bray-Curtis非類似度の、別々に飼育した野生型マウスと同腹子のBecn1F121Aマウスの比較。

(D) 豊かさと均等性に基づくα多様性の比較。

(E）アルシアンブルーで染色した同腹マウスの大腸切片における粘液の厚さの測定値。

(FおよびG）3％DSSを7日間投与したマウスの疾患活動指数±SEM（F）、および組織学的損傷スコア（G）。

(H-K）20mgのストレプトマイシンで前処理し、108CFUのAIECを10週間感染させたマウスの生存曲線（H）、便中リポカリン2濃度（I）、結腸長（J）および組織学的損傷スコア（K）。

(LおよびM）20mgのストレプトマイシンを前投与し、108CFUのAIECを14日間感染させたマウスの結腸長（L）および組織学的スコア（M）。

(B、C、E、G、I-M）各記号はマウス1匹を表す。∗p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊p＜0.001；＊＊p＜0.0001；（DおよびG）一元配置分散分析；（EおよびI-M）スチューデントのt 検定。WT, 野生型; F121A, Becn1F121A; L.M., 同腹子; a.u., 任意単位.

Becn1F121Aマウスは感染駆動性大腸炎から保護される
最後に、Becn1F121Aマウスが、臨床的に関連性の高い腸炎モデルである付着性-侵入性大腸菌（AIEC）感染からも保護されるかどうかを検証した24。AIEC感染はIBDと強く関連しており、IBD発症の初期段階に関与していると考えられている25。24 我々は、野生型マウスとは異なり、Becn1F121AマウスはAIEC感染後10週間経過しても慢性腸炎を発症せず、結腸短縮も起こさないことを明らかにした（図7H-7K）。さらに、これらの結果を急性感染モデル（14日間）でも検証した（図7Lおよび7M）。このように、オートファジーの構成的な活性化は、感染症による慢性大腸炎からマウスを守ることにもなる。

考察
ゴブレット細胞は、微生物の侵入から腸を守るために粘液を産生する役割を担っている26。しかし、これらの細胞が分泌する粘液の量を正確に制御する方法は明らかではなかった。今回の研究成果により、腸杯細胞からの粘液分泌が小胞体ストレスとオートファジーによってどのように制御されているかが明らかになった。実際、UPRに関与する遺伝子の欠損は、in vivoでの杯細胞のアポトーシスを引き起こす27。さらに、単一細胞解析により、ERストレスの緩和に関与する遺伝子が、定常状態において野生型マウスの杯細胞集団に特異的に濃縮されていることが明らかにされている8。このことは、他の腸管上皮細胞と比較して、杯細胞は、定常状態において、ERストレスを緩和するような転写プログラムを実行し、プロテオスタシスを維持しようと試みていることを示唆している。したがって、ERストレスと粘液分泌の結合は、細胞が限界に達したときに粘液分泌を抑えることによって、杯細胞が生存能力を維持するメカニズムである可能性がある。粘液は放出されて体外に出るため、その濃度をフィードバックして分泌量を調節することはできない。しかし、今回紹介するERストレスを介した調節機構は、分泌される粘液の量を細胞内部で制御することができる。

Beclin 1の活性化が、どのようにして杯細胞のERストレスを緩和するのかは、今のところ明らかではない。特に腸管上皮細胞では、Atg16L1依存性のオートファジーによってイノシトール要求酵素1α（IRE1α）を除去し、ERストレスを軽減して杯細胞の機能を維持することが示されている11。さらに別の可能性としては、オートファジーによって杯細胞からミスフォールドしたタンパク質が除去されていることが考えられる。粘液形成タンパク質であるMUC2を適切に折りたたむことは、杯細胞にとって難しい作業であり、この折りたたみ過程の欠陥は、杯細胞の機能障害に関連している28。

小胞体ストレスを緩和して粘液生産を維持するためにオートファジーが必要であるという我々の発見は、IBD患者に見られる主要なオートファジー遺伝子の変異の有病率の説明となる可能性がある4。さらに、小胞体ストレスが軽減されたときに粘液分泌を促進するためにNod2が必要であるという我々の観察は、IBD患者に高頻度に見られるこの遺伝子の変異を説明する可能性を与えている29, 30。したがって、NOD2の不活性化変異が慢性炎症を特徴とする疾患の素因となるという観察は、やや逆説的である。私たちが発見した粘液分泌におけるNod2の役割は、IBD患者3が粘液層を透過し、微生物と宿主上皮が常に接触し、その結果慢性炎症が起こることを説明するものであると思われる。

最後に、オートファジーが構成的に活性化されると、杯細胞は腸の炎症から保護するように粘液をより多く産生する能力を持つという我々の観察は、なぜ進化によって杯細胞が野生でそうならないように形作られたのかという疑問を投げかける。MUC2タンパク質は高度にグリコシル化されているため、粘液の生産はエネルギー的に非常に高価である。したがって、進化の制約によって、動物のエネルギー消費量に合うように粘液層が形成された可能性がある。粘液の過剰分泌は、例えば、嚢胞性線維症、アレルギー、喘息などでは有害な場合もある。したがって、腸の粘液分泌の調節を変えることで、他の臓器の粘液分泌にも影響を与える可能性がある。実際、ある生物がより多くの粘液を分泌する必要がある場合、腸の寄生虫や虫の感染時に見られるように、杯細胞の数を増やすことによって粘液を分泌する。31 興味深いことに、腸で杯細胞の産生を増やすのと同じシグナル（タイプ2サイトカイン）は、気道でも杯細胞の増加と粘液分泌を引き起こす32。

研究の限界
ここでは、ERストレスレベルが大腸杯細胞からの粘液分泌を制御していること、構成的に活性化されたオートファジーがERストレスを軽減し、過剰な粘液分泌と大腸炎からの保護を促進することを示した。我々は、本研究にいくつかの限界があることを認識している。第一に、オートファジーの構成的活性化あるいはERストレスの軽減が、杯細胞以外の細胞にも影響を与え、これらの細胞が粘液分泌、微生物叢、大腸炎感受性に影響を与える可能性を排除することはできない。例えば、パネス細胞は大腸に存在しないが、パネス細胞からの抗菌性タンパク質の分泌はオートファジーとERストレスレベルの両方に強く依存しており、これらのタンパク質が大腸に到達することが示されている34。しかし、現在、杯細胞のみでオートファジーの構成的活性化あるいはERストレスの低下を可能にするマウスモデルは存在しない。第二に、Becn1F121Aマウスの粘液層がどのように変化し、ムチン利用菌が増殖しているのかは不明である。高感度グリコミックスやプロテオミクスの手法を用いて、粘液層のこれらの変化の特徴を明らかにすることは貴重であろう。最後に、特に杯細胞においてオートファジーが小胞体ストレスを緩和する分子機構を正確に理解することは、粘液を標的とした治療薬の開発に有効な選択肢を提供することになると思われる。

STAR★Methods
主要リソース一覧
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
抗GADD153/CHOP SCBT sc-166682
抗チューブリン Abcam ab176560
抗 EPCAM BD バイオサイエンス 563214
抗4ヒドロキシノネナール Abcam ab48506
細菌・ウイルス株
付着器感染性大腸菌病型（AIEC）、NRG857c 株（O83:H1） Small et al.24 N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
タウロウルソデオキシコール酸 (TUDCA) Sigma-Aldrich T0266
Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA I), DyLight™ 649 Vector Laboratories DL-1068-1
フィクサブルバイアビリティステイン 510 BDバイオサイエンス 564406
サルブリナールエンゾ ALX-270-428
タプシガルギンシグマ・アルドリッチ T9033
デキストラン硫酸ナトリウム大腸菌グレード 36,000 - 50,000 Da MP Biomedicals SKU: 02160110-CF
コンパウンド147 (AA147) Abbexa abx283245
IL-22-Fc Genentech PRO312045
重要なコマーシャルアッセイ
TLR4 HEK-Blue™ レポーター細胞 Invivogen hkb-mtlr4
TLR5 HEK-Blue™ レポーター細胞 Invivogen hkb-mtlr5
RNeasy Universalキット Qiagen 73404
Purelink™ Microbiome DNA Purification Kit Invitrogen A29790
AMPure磁気ビーズ Beckman Coulter A63880
Lcn-2 ELISAキット R&D systems DY1857-05
NOD1 HEK-Blue™レポーター細胞 Invivogen社製 hkb-mnod1
NOD2 HEK-Blue™ レポーター細胞 Invivogen hkb-mnod2
TLR9 HEK-Blue™ レポーター細胞 Invivogen hkb-mtlr9
寄託データ
RNA シークエンス本紙 GSE220457
16S rRNA 遺伝子シーケンス本紙 GSE220883
実験モデル生物／系統
マウス C57BL/6JOlaHsd Envigo Israel 2BL
マウスマウス：Becn1F121A (C57BL/6) Fernández et al.5 N/A
マウス Nod2flox/flox (C57BL/6) Kim et al.35 N/A
マウス B6.129X1(Cg)-Bcl2tm1.1Sjk/J The Jackson Laboratory #018430
Mouse: マウス：Germ-free Mice/Swiss Webster Taconic Biosciences SW-F/SW-M
マウス B6.129S7-Rag1tm1Mom/J The Jackson Laboratory # 002216
マウス B6.129P2(SJL)-Myd88tm1Defr/J The Jackson Laboratory # 008888
マウス B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J The Jackson Laboratory # 006054
マウス B6.Cg-Tg(Vil1-cre)997Gum/J The Jackson Laboratory # 004586
オリゴヌクレオチド
515F - （バーコード） 5′-AATGATACGGCGACCACCGAG
ATCTACGCTAGCCTTCGTCGCTATGTAATGT
G TGYCAGCMGCCGCGTAA-3′ DeSantis et al.36 N/A
806 R 5′- caagcagaagacggcatacgagatag
TCAGTCAGCCGACTACHVGGTWTCTAAT -3′ DeSantis et al.36 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2) Bolyen et al.37 N/A
PRISM Graphpad N/A
FIJI Schindelin et al.38 N/A
Divisive Amplicon Denoising Algorithm (DADA2) DeSantis et al.36 N/A

リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報およびリクエストは、リードコンタクトのShai Bel (shai.bel@biu.ac.il)までお願いします。

材料の入手可能性
この研究では、新しい独自の試薬は生成されなかった。

実験モデルおよび被験者の詳細
マウス
マウス（主要リソース表参照）は、特に指示のない限り、別々に飼育し、イスラエルのBar-Ilan大学Azrieli Faculty of MedicineのSPFバリアで維持した。MyD88ΔIECマウスは、MyD88floxマウスとVil1-creマウスを交配することによって作製した。Nod2-/-マウスは、Nod2flox (Philip Rosenstiel35からの親切な贈り物)とCMV-creマウスの交配により作製した。8-14週齢のマウスをすべての実験に使用した。すべての実験は、Bar-Ilan大学のInstitutional Animal Care and Use Committees（IACUC）により承認されたプロトコルを用いて実施した。

粘液の厚さの測定
マウスはIACUCガイドラインに従って頸椎脱臼により安楽死させ、糞便ペレットを含む1cm長の結腸組織試料を取り出した。組織は、粘液層を保存するために直ちにCarnoyの固定剤で固定し、パラフィン包埋用に処理した40。5μm厚の切片をミクロトームを用いて切り出し、アルシアンブルー染色で染色した。染色した切片をZeiss Axioimager M2顕微鏡で可視化し、Zeiss Zenソフトウェアを用いて粘液層の厚さ（糞便ペレットを包む青く染色された部分）を測定した。1セクションにつき30回の測定を行い、各マウスについて平均値を算出した。抗生物質投与後の測定では、マウスを1 mg/ml アンピシリン、0.5 mg/ml バンコマイシン、1 mg/ml ネオマイシン、1 mg/ml ストレプトマイシン、1 mg/ml メトロニダゾールで6週間処理した。

バリア機能解析
心臓穿刺により死後採血し、1.5mlチューブで30分間室温でインキュベートし、凝固させた。その後、サンプルを1,500g、4℃で20分間遠心分離し、新しいチューブに血清を採取した。20μlの血清は、InvivoGen HEK-Blue™レポーター細胞を含むウェルに加えられ、製造元の指示に従ってルーミナルアンチジェンが検出された。

In vivo タウロウルソデオキシコール酸、サルブリナール、タプシガルギン、AA147およびIL-22処理
タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA; Sigma T0266）をPBSに溶解し、250 mg/kg体重で投与した。TUDCAを1日2回、3日間、腹腔内注射でマウスに投与した。4日目、マウスは午前中に投与し、最後の投与から4時間後に安楽死させた。対照マウスにはPBSを投与した。サルブリナール（エンゾ ALX-270-428）は、50mg／mlでジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、PBSで1：400に希釈した。マウスは、1日1回、3日間、腹腔内注射により1mg Salubrinal／kg体重で処理した後、安楽死させた。タプシガルギン（シグマT9033）、10mg／mlでエタノールに溶解し、次いでPBSで1：40に希釈した。タプシガルギン（2.5mg/kg体重）を1日1回2日間腹腔内注射でマウスに投与し、最後の処置の4時間後にマウスを安楽死させた。対照マウスには、エタノールをPBSで1:40に希釈したものを投与した。AA147（2mg／kg体重）を1日2回、3日間、腹腔内注射によりマウスに投与し、最後の処置の4時間後にマウスを安楽死させた。IL-22-Fc（Genentech社、1回100ug）を1日1回、4日間投与した。

化学物質誘発性大腸炎モデル
マウスに、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS、大腸炎グレード、36,000-50,000 Da、MP）を、図の説明で示した濃度および期間で飲料水中に投与した。毎日、新鮮なDSSを調製した。疾患活動性指数（DAI）は、体重減少、便の硬さおよび直腸出血に基づいて毎日測定した。41 簡単に言えば、初期体重に対する体重減少、便の硬さ（固い、ゆるい、下痢）および直腸出血をそれぞれ0〜4のスケールで個別に採点し、指定した時点における各マウスの合計を求めた。FITC-デキストランを用いたバリア機能は、以前に記載したように最終日に実施した41。簡単に言えば、マウスは終了の4時間前に200μlの3-5 kDa FITC-デキストランを経口投与された。その後、血液を採取し、上記のように血清を分離した。FITC-デキストランは、プレートリーダーを用い、485 nmで励起し、530 nmで検出された。

感染誘発性大腸炎モデル
マウスに付着侵入型大腸菌（AIEC）、NRG857c株（O83:H1）（Brian Coombesからの親切な贈り物24）を感染させた。NRG857cはクロラムフェニコール（34μg＊ml-1）とアンピシリン（100μg＊ml-1）を含むLuria broth（LB）中で培養した。感染24時間前に20mgのストレプトマイシンを投与し、108個のコロニー形成ユニット（CFU）AIECを感染させた。14日後または10週間後にマウスを安楽死させ、腸を4％PFAで固定した。Lipocalin-2レベルの定量化のため、糞を採取し、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。その後、0.1% Tween 20を含むPBSで再構成し、20分間ボルテックスした後、21,000g、20分間、4℃で遠心分離した。糞便中のLcn-2濃度は、Lcn-2 ELISAキット（R&D systems、DY1857-05）により、製造者の説明書に従って測定した。結果は、ODと糞の重量比により算出した。

糞便微生物叢移植
SPFバリア施設に収容したマウスから採取した糞を、直ちに嫌気性チャンバーに移した。糞は滅菌PBS中でボルテックスし、残骸を重力で沈降させ、上清を新しいチューブに移した。その後、密封したチューブを嫌気室から取り出し、無菌のSwiss Websterマウスに経口投与した。SPF飼育の各マウスの糞を使用して、2匹の無菌マウスに接種した。接種したマウスはTecniplast IsoCageに移し、2週間外部からの汚染を防ぎ、その後、上記と同様にDSSを投与した。

メソッドの詳細
RNA配列決定と解析
凍結大腸組織からQiagen RNeasy Universal kitを用いてRNAを抽出した。単離した RNA の完全性は、Bar-Ilan 大学 Azrieli 医学部 Genome Technology Center で Agilent TS HS RNA Kit と TapeStation 4200 を用いて分析した。1000ngのtotal RNAをNEBNext poly (A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB, #E7490L) で処理した。NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7770L) を用いてRNAシーケンスライブラリーを作製した。ライブラリーの定量は、dsDNA HS Assay KitとQubit（Molecular Probes, Life Technologies）を用いて行い、定性はAgilent TS D1000キットとTapeStation 4200を用いて行った。各ライブラリーの250nMをプールし、NextSeqメーカーの指示に従い4nMに希釈した。1.6pMを1% PhiXライブラリーコントロールとともにFlow Cellにロードした。ライブラリーは、Illumina NextSeq 550プラットフォームで、製造元の説明書に従って75サイクルのシングルエンドリードでシーケンスされた。配列データは、Partekバイオインフォマティクスソフトウェアを使用してアライメントおよび正規化（100万マッピングリードあたりのキロベースリード）した。ヒートマップ、主成分分析（PCA）プロット、ボルケーノプロットは、GraphPad Prism ソフトウェアを使用して作成した。

qPCR 解析のための杯細胞の単離
大腸組織を PBS で洗浄し、3 分割して、5% FBS と 1% ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した HBSS バッファーで氷上で洗浄した。次に、切断した組織を10mM EDTA, 1mM DTT, 5% FBS, 1% penicillin and streptomycinを添加したHBSSバッファに移し、37℃、200rpmで10分間振盪しながらインキュベートした。その後、組織をボルテックスし、70μmのストレーナーを通し、さらにシリンジで解離させた。解離した細胞は、500g、4℃で10分間遠心分離して回収した。分離した細胞を5%FBS含有PBSに再懸濁し、BD Horizon™ Fixable Viability Stain 510、抗EPCAM抗体、UEA-1-DyLight 649とともにインキュベートし、BD FACSAria™ Cell Sorterを用いてソーティングした。RNAはQiagen RNeasy Universal KitでEPCAM+ UEA-1+細胞から抽出し、cDNAはThermo High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kitで作成した。Hspa5のmRNAレベルはTaqMan probeで解析し、18sレベルで正規化した。

イムノブロット
RIPAバッファ（Thermo Fisher 89900）中でホモジナイズすることにより、大腸組織サンプルから全タンパク質を抽出した。50μgの総タンパク質（Bradford assayで決定）を4-20％勾配SDS-PAGEにロードし、その後PVDF膜に移した。膜は、0.1% Tween-20を含むPBS中の5%脱脂乾燥乳でブロックした。膜を以下の一次抗体とともに40℃で一晩インキュベートした：α-GADD153/CHOP（SCBT sc-166682）およびα-Tubulin（Abcam ab176560）。洗浄後、膜を、種に応じたHRP結合二次抗体とインキュベートした。膜はAlliance Q9システムで可視化し、バンド密度はFIJIソフトウェアで定量化した38。

Ex vivo 粘液測定とタウロウルソデオキシコール酸処理
大腸組織摘出物における粘液増殖速度は、いくつかの修正を加えて、以前に記載された18通りに測定された。簡単に言うと、8-12週齢の野生型マウスから遠位結腸組織を採取し、4-5mlのKreb's transport bufferで洗浄した。筋肉を除去した後、組織を2つに分離した。組織を加温チャンバー（37℃）にマウントした。結腸の1片は6mg/mlタウロソデオキシコール酸（TUDCA）を添加したRPMIでインキュベートし、もう1片は対照としてRPMIでマウントし、インキュベートした。マウントした組織をKreb's mannitol bufferで覆い、10μmサイズのビーズで粘液を重ね、マイクロマニピュレーター接続のガラス針で粘液の厚さを繰り返し測定した。粘液の成長測定は45分間行った。抗生物質投与後の測定では、マウスを滅菌飲料水中の1 mg/mlのAmpicillin、0.5 mg/mlのCefoperazoneおよび1 ml/mlのClindamycinで5日間処理した。その後、2日間抗生物質を除去し（ウォッシュアウト）、マウスをさらに5日間、1mg/mlのストレプトマイシン、1mg/mlのネオマイシン、0.5mg/mlのバンコマイシンで処理した。その後、上記と同様に粘液測定の12時間前に抗生物質を飲料水に置換した。

細菌DNAの抽出、増幅、精製
糞便サンプルから、Invitrogen Purelink™ Microbiome DNA Purification Kitを用い、製造元の説明書に従って、2分間のビーズビート（Bio Spec）後に、DNAを抽出した。DNA抽出後、515Fおよび806Rプライマーを用いて、細菌16S rRNA遺伝子のV4可変領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅し、各サンプルには固有の515Fバーコードプライマーを付与した。使用したプライマー配列は以下の通り。515F-（バーコード） 5′-AATGATACGGCACCGAGATCTACGCTAGCCTTCGTCGCTATGTAATTGTG TGYCAGCMGCCGCGTAA-3′ および806R 5′- CAAGCAGAAGACGCATACGAGATTCAGCCGACTVGGTWTCTAAT -3′36 であった。

PCR反応はPrimestar taq polymerase（Takara）を用いて、変性（95℃）、アニーリング（55℃）、伸長（72℃）を30サイクル行い、最後に72℃で伸長させることにより実施した。アンプリコンはAMPure磁気ビーズ（Beckman Coulter）を用いて精製し、その後Picogreen dsDNA定量キット（Invitrogen）を用いて定量を行った。サンプルは等濃度（50 ng/μl）でプールし、2% E-Gel (Thermo Fisher) にロードし、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) を用いて精製した。

16S rRNA遺伝子配列解析
精製産物をIllumina MiSeqプラットフォーム（Azrieli Faculty of Medicine Bar-Ilan UniversityのGenome Technology center）を用いて配列決定した。FASTQデータをQuantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2) version 2019.4で処理・解析した37。シングルエンド配列は脱多重化し、リードはDivisive Amplicon Denoising Algorithm (DADA2) 36を用いてノイズ除去およびクラスタリングした。プライマーは切り捨て、シングルエンドリードを≥150 base pairsに切り詰めた。系統樹を構築し、Greengenes参照データベースを用いて、99%の信頼度でフィーチャーに分類を割り当てた36。

ミトコンドリアと葉緑体配列をろ過した後、サンプルあたり7340リードの希薄な特徴テーブルで解析を行った。サンプル間の多様性（β多様性）については、加重および非加重UniFrac距離を算出した44。過剰発現および過小発現の特徴は、線形判別分析の効果量（LEfSe）を用いて特定した45。

大腸炎重症度の組織学的スコアリング
遠位結腸組織を 4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋後、切片化し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。病理組織学的分析と半定量的スコアリングは、炎症と潰瘍の進展度（横方向、粘膜に沿って、粘膜、粘膜下層、筋層への深部）を考慮し、Cooperら46の記述したスコアリングシステムに従い、毒性学認定病理医が実施した。解析は、盲検下で行われた。

免疫組織化学
パラフィン包埋結腸組織を切片化し、キシレンで洗浄後、低濃度のエタノールで再水和させた。抗原賦活は、0.1Mクエン酸三ナトリウムでスライドを沸騰させ、PBSで洗浄することにより行った。スライドを1% BSA, 10% FBS, 1% Triton X-100 in PBSでブロックし、一次抗体と1:200希釈で4℃、一晩インキュベートした。二次抗体は1:400に希釈し、室温、暗所で1時間スライドに塗布した。その後、スライドを洗浄し、マウントした。画像は Zeiss AxioImager M2 顕微鏡で撮影し、Zeiss または FIJI ソフトウェアのいずれかで分析した38。

定量化および統計解析
統計解析は、図の説明で示したように、GraphPad PRISMを使用して実施した。

謝辞
この研究は、パイオニアであり、親切な指導者であったBeth Levineを記念して行われた。Lora V. Hooperには、UT Southwestern Medical Centerで飼育されていたマウスのサンプルを提供していただき、感謝している。資金提供 The Azrieli Foundation Early Career Faculty Fellowship (S.B.); Israel Science Foundation (ISF) grants 925/19 and 1851/19 (S.B.); European Crohn's and Colitis Organization (ECCO) grant (S.B.); Mizutani Foundation for Glycoscience (S.B.); European Research Council (ERC) starting grant GCMech 101039927 (S.B.); Swedish Research Council-grants 2018-02095 and 2021-06602 (B.O.S.).

著者による貢献
構想、M.N., M.W., B.O.S., M.N.-O., S.B.、調査、M.N., S.Telpaz, A.A., S.B.-S., S.H.-S., S.M., E.R., J.S., L.Z., M.Z., N.A., S.Turjeman, S.W., R.F., A.N, とM.N.-O.；資金獲得、B.O.S.とS.B.；監督、S.B.；執筆-原案、S.B.；執筆-レビューと編集、M.W., B.O.S., S.Turjeman, M.N.-O. と S.B...

利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。

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RNA-seqデータ（GSE220457）および16S rRNA遺伝子シーケンスデータ（GSE220883）はNCBI Gene Expression Omnibusに寄託されており、出版日現在、一般に公開されています。Accession numberはkey resources tableに記載されています。本論文で報告された顕微鏡データは、要求に応じて主席研究員が共有する予定である。

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