5歳児におけるう蝕の有無による口腔内微生物群集の変化

2023年6月17日 20:09

オープンアクセス
発行：2023年6月16日
5歳児におけるう蝕の有無による口腔内微生物群集の変化

https://bmcoralhealth.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12903-023-03055-2

ゼンヤン・ヤン
ティン・カイ
...
ジー・ズー
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BMCオーラルヘルス23巻、記事番号：400（2023）この記事を引用する
測定値詳細
概要
背景
幼児期のう蝕は、ますます注目されている。口腔内細菌叢の研究は、う蝕の多菌性病因を理解するのに役立つ可能性がある。
目的
う蝕のある5歳児とない5歳児の唾液サンプルにおける微生物群集の多様性と構造を調査すること。
方法
う蝕の多い子ども18名（HB群）とう蝕のない子ども18名（NB群）から合計36個の唾液試料を採取した。そして、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて細菌サンプルから16S rDNAを増幅し、Illumina Novaseqプラットフォームを用いてハイスループット配列決定を実施した。
結果
配列は、16門、26綱、56目、93科、173属、218種に分布する運用分類単位（OTU）にクラスタリングされました。Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria, Patescibacteria, Epsilonbacteraeota, Cyanobacteria, Acidobacteria, Spirochaetesは基本的に異なるグループで同じでしたが、その相対量は異なっていました。コアマイクロバイオームは、218の共有微生物分類群からの種と定義された。アルファ多様性テストの結果、高う蝕群と無う蝕群の間で、微生物の存在量と多様性に有意差はなかった。主座標分析（PCoA）および階層的クラスタリングの結果、2つのグループには類似の微生物が存在することが示された。LEfSe解析により異なるグループのバイオマーカーを定義し、潜在的なう蝕関連菌と健康関連菌を同定した。支配的属の共起ネットワーク分析により、う蝕なしグループの口腔内微生物群集は、う蝕が多いグループのそれよりも複雑で凝集していることが示された。最後に、PICRUStアルゴリズムを用いて、唾液サンプルから微生物群集の機能を予測した。得られた結果から、ミネラル吸収は、高う蝕群よりも無う蝕群の方が大きいことがわかった。BugBaseを使用して、微生物群集のサンプルに存在する表現型を決定した。その結果、レンサ球菌は、高う蝕群の方が無う蝕群よりも多いことがわかった。
結論
本研究により、5歳児におけるう蝕の微生物学的病因が包括的に理解され、その予防と治療のための新しい方法が提供されることが期待される。
ピアレビュー報告
はじめに
5歳までに乳歯列が完全に確立され、比較的安定していることはよく知られている。2018年の中国本土における第4回全国口腔衛生調査[1]では、過去10年間、中国の幼児のう蝕有病率は楽観視できず、有病率は上昇傾向を示していることが明らかになった。5歳児のう蝕有病率は71.9％で、10年前より5.8％上昇した。また、1人当たりの平均う蝕数は4.24本であったが、う蝕による充填歯数は4.1％に過ぎなかった。現在、多くの学者が認めているう蝕の病因は、細菌がう蝕の発生に重要な役割を果たす四大要因説である。
う蝕は、慢性感染症ではなく、生活習慣病と定義されている。1994年、Marsh [2]は生態学的プラーク仮説を提唱した。彼らは、糖分の摂取量や食事内容、pH値の変化などの口腔内環境の変化により、バイオフィルム内の比較的バランスのとれた細菌組成が著しく変化し、マイクロバイオームがう蝕原性細菌にシフトすることを発見しました。例えば、低pH環境では、Streptococcus mutansやLactobacilliなどの潜在的なう蝕原性細菌の割合が増加し、口腔内微生物群集の生態系バランスが崩れ、う蝕に至る可能性があります。この仮説は、微生物と環境の両方がう蝕を誘発する要因であることを提唱している[3]。発見されたすべてのう蝕原性細菌は、口腔内の正常な細菌叢であり、相互に依存しあって動的なバランスを保っています。環境が変化すると、歯垢中の微生物、歯面、環境の生態系バランスが崩れ、う蝕の原因となる。Marsh博士は、う蝕原性細菌を標的とするだけでなく、生態系バランスが崩れる過程を阻害することで、う蝕を予防することができると提唱しました。高橋ら[4]は、う蝕原性微小環境は、動的安定期から酸産生期に移行し、最終的に酸抵抗性期へと発展する微小環境であると提唱しました。う蝕の発生と発症は、微生物群集のアンバランスに起因する。
健康な人の発育過程において、口腔内の微生物群集はダイナミックに変化し、口腔マイクロバイオームも生理的に変化するという強い証拠が存在する。微生物組成は、年齢層によって特異的です。Streptococcus mutansに加え、Veillonellales、Actinomyces、Granulosicoccus、Leptotrichia、Thiomonas、Bifidobacterium、Prevotellaなど、多くの種類の細菌がう蝕と密接に関連している。口腔内微生物群集のアンバランスは、う蝕の重要なメカニズムである可能性がある。本研究では、イルミナNovaseqシーケンシングを行い、う蝕のある5歳児とない5歳児の唾液サンプルにおける微生物群集の多様性と構造を調査しました。本研究で得られた知見は、5歳児におけるう蝕の微生物的病因の理解に役立ち、う蝕を予防・治療するための新しい方法を開発するためのエビデンスとなるであろう。
材料と方法
被験者の選択
中国重慶市渝北区にある同じ幼稚園から、う蝕の多い患者とう蝕のない患者を募集した。被験者の包含基準は以下の通りである： (i)年齢54～66ヶ月、(ii)過去2週間に上気道感染症にかかっていない、(iii)過去2ヶ月間に抗生物質を使用していない、(iv)部分義歯や器具を使用していない、(v)全身疾患、口腔疾患、歯科治療歴がない。最終的に高う蝕（虫歯、欠損、充填歯（dmft）指数≧6）者18名と無う蝕（dmft＝0）者18名が選ばれた。う蝕の定義と診断は、世界保健機関[5]の基準に基づいています。すべての参加者は、専門の歯科医師による包括的な口腔内検査を受けた。これらの参加者の両親または祖父母は、研究の目的について十分に説明され、重慶医科大学口腔病院倫理委員会が提供する書面によるインフォームドコンセントに署名した。
サンプル採取
参加者全員のサンプルを採取する前に、滅菌水で口をすすぎ、2時間飲食や歯磨きを禁止した。専門の歯科医師が無刺激唾液を採取し、1.5mLの滅菌マイクロチューブに入れ、次の使用のために-80℃で凍結させた。
DNA抽出、PCR増幅、illumina novaseqシークエンス
製造元のプロトコルに基づき、PowerSoil® DNA Isolation Kitによってすべての検体から微生物DNAを抽出した。プライマー338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）は、Veriti 96-Well Thermal Cycler（GeneAmp 9902、ABI、米国）でのPCRを用いて細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域を増幅するために使用した。ターゲットエリアPCRは、以下のプログラムで実施した：98 ℃で2分間の初期変性、98 ℃で30秒の変性、50 ℃で30秒のアニーリング、72 ℃で60秒の伸長、72 ℃で5分間の最終伸長を30サイクル、その後4℃で保存。ターゲットエリアPCRは、KOD FX Neo Buffer 15 µL、dNTPs 6 µL（各2 mM）、Vn F（10 μM）/VnR（10μM）、KOD FX Neo 0.6 μL、テンプレートDNA 50 ng ± 20%を含む30 μL混合物で3連で行われた。Solexa PCRは以下のプログラムで行った：98 ℃で30秒の初期変性、98 ℃で10秒の変性、65 ℃で30秒のアニーリング、72 ℃で60秒の伸長、72 ℃で5分の最終伸長というサイクルを10回。
Solexa PCRは、ターゲット領域PCR産物5 μL、2 × Q5 HF MM 10 μL、MPPI-a (2 μM)/MPPI-b (2 μM) 2.5 μLを含む20 μL混合物で3連で実施しました。
最終PCR産物は、120Vの電圧下で1.8%アガロースゲルから抽出した。40分後、OMEGA DNA精製カラムを使用してオーバーカラム精製を行った。PCR産物を精製、定量し、ホモジナイズして配列決定ライブラリーを構築した。構築されたライブラリーは、まずライブラリー品質検査にかけられ、適格なライブラリーはIllumina NovaSeq 6000 PE250でシーケンスされた。
シーケンシングデータの処理[6]。
Primary FastQファイルを処理用に複数のファイルに分割し、Trimomatic [7]で品質フィルタリングを行った。配列の組み合わせには、以下の基準を使用した。(i) 50 bpのスライディングウィンドウで平均品質スコア<20の部位に出会うとリードはカットされた。(ii) プライマーは完全に一致させ、2塩基のミスマッチを許容し、曖昧な塩基を持つリードは許容しなかった。(iii) 10 bpより長いオーバーラップを持つ配列は、そのオーバーラップ配列に基づいてマージされた。
USEARCH [8] (version 10.0)を用いて、類似度97%カットオフで運用分類単位(OTU)をクラスタ化した。さらに、UCHIME（バージョン8.1）[9]により、キメラ配列を認識し、削除した。RDP Classifierアルゴリズム [10] (version 2.2, http://sourceforge.net/projects/rdpclassifier/) とSilva [11] 16S rRNA (Release128, http://www.arb-silva.de) データベースとの比較により、各16S rRNA遺伝子配列の分類を80%の信頼閾値に基づいて分析した。
バイオインフォマティクスおよび統計解析[6]。
バイオインフォマティクス解析は、QIIMEを用いて行った。Shannon、Simpson、Chao、ACE、PD_whole_treeのα多様性指標は、Mothur [12] version v.1.30により97%の同一性で算出した。β多様性解析は、OTUレベルのBray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）により行った。また、重み付けされたUniFrac距離に基づく階層的なクラスタリング分析も実施した[13]。類似性分析（ANOSIM）は、R言語のveganパッケージを使用し、Pythonで描画した；異なるグループの比較には、重み付けされていないUniFrac距離が用いられた。異なるグループ間の優勢な細菌の相対的な存在量を比較するために、Welchのt-testが使用されました。Mothur [12]を用いて、種レベルでコアマイクロバイオームを定義するためにベン図を使用した。2つのグループのバイオマーカーを定義するために、効果量の線形判別分析（LEfSe）を実施した。特徴を区別するための対数LDAスコアの閾値は3に設定された[14]。属間の共起解析はPythonで行い、各グループの最もリッチな80属の共起解析も同時に行った。PICRUSt2（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）プログラムを用いて、ハイスループットシーケンスによる16S rRNAベースのデータを予測し、さらにIMG微生物ゲノムデータとの関連でKEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）［15］代謝経路の構成と差異を分析しました。BugBaseは、予測される16Sコピー数によってOTUを正規化し、提供された事前計算ファイルを用いて微生物の表現型[16]を予測する。差はP < 0.05のときに有意、P < 0.01のときに極めて有意とした。統計解析には、SPSS 25.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)を使用した。生データは、著者らによって、資格のある研究者に不当な予約なしに提供される予定である。
結果
塩基配列の情報
平均年齢60.2ヶ月の36人の子どもから唾液サンプルを収集した。すべての唾液サンプルを、う蝕なし（NB）グループ（n = 18）とう蝕が多い（HB）グループ（n = 18）の2グループに分けた。イルミナNovaSeqシーケンス後、36の唾液サンプルから2,525,425の有効配列を取得し、サンプルあたりの平均配列数は70,150であった。配列の平均長さは423bpであった。有効配列の97％がクラスタリングされ、10980（付録1）の運用分類単位（OTU）が取得された。Goodのカバレッジ推定値は99.9%以上、レアファクション曲線（図1）はイーブンステージに達しており、サンプリングは基本的に完了したものと考えられる。
図1
属レベルのレアファクションカーブ。X軸はサンプリングした配列数、Y軸はサンプリングした配列数。Y軸は操作分類単位（OTU）の数を示す。色の違いは異なるグループを表す
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アルファ多様性
Shannon、Simpson、Chao、ACE、PD_ whole_treeのアルファ多様性を算出し、全サンプルの多様性と存在感を分析した。Studentのt-testを行い、高う蝕群と無う蝕群の唾液サンプルの比較を行いました。高う蝕群と無う蝕群の間で、α多様性指数に有意差は見られなかった。このことから、口腔内微生物群集の多様性と存在量は、高う蝕群と無う蝕群の間で同様であることが示唆された。
微生物群集の構造
OTUは16門、26綱、56目、93科、173属、218種に分布していた。最も多い68属の系統樹を作成し、分類学的な構成と存在量を観察することができた（図2）。最も多い属は、ファーミキューテス（37.4%）、バクテロイデーテス（21.3%）、プロテオバクテリア（18.8%）、アクチノバクテリア（10.9%）、フソバクテリア（8.0%）、パテシバクテリア（1. 1%）、Epsilonbacteraeota（1.3%）、Cyanobacteria（0.6%）、Acidobacteria（0.3%）、Spirochaetes（0.2%）で、全配列の99.8%を占めていることが判明した。最も多い属は、Streptococcus（15.5%）、Neisseria（11.2%）、Veillonella（12.7%）, Prevotella_7（9.1%）, Rothia（5.9%）, Leptotrichia（4.9%）, Actinomyces（3.7%）, Prevotella（2.6%）, Fusobacterium（2.9%）, Alloprevotella（3.3%）の全71.9%である（図3). 両グループ間の優勢菌はほぼ一致していたが、相対的な存在量は異なっていた。Selenomonas、Bifidobacterium、Dialister、Olsenella、Anaeroglobusの相対量は、高う蝕群が無う蝕群に比べ有意に高かった。プレボテラの相対存在量は、高う蝕群が無う蝕群より有意に低かった（図4）。コアマイクロバイオームは、ほとんどの個体で種レベルで検出できるベン図で定義された。各グループで218種が確認された（図5）。その中で、すべての種が一致しており、高う蝕群と無う蝕群の唾液において、微生物の組成が安定していることが示された。
図2
最も多く含まれる68属の系統樹。各枝は分類群、長さは2つの分類群間の系統距離を示し、色の違いは異なる系統を表す。右側の棒グラフは、高う蝕群と無う蝕群における各属の相対的な存在量を示している
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図3
優勢菌の分布。A 門派レベルの結果。B属レベルでの結果。優勢な分類群（相対存在量＞平均2%）を示す。
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図4
属レベルでのWelchのt-test棒グラフ。高う蝕群と無う蝕群の結果。有意差のある結果のみを示す(P < 0.05)
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図5
種レベルでのベン図。色の違いは異なるグループを表す。重なっている部分はグループ間の共通種を、重なっていない部分は各グループの固有種を表している
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細菌組成の類似性・非類似性
PCoAを用いて、2つのグループ間の微生物群集構造の類似性を評価した（図6）。PCoAの結果、高う蝕群と無う蝕群の間で細菌組成に有意差はなく、高う蝕患者と無う蝕患者は類似した微生物群集構造を有していることが示唆された。また、ANOSIMテスト（図7）、階層型クラスター分析（図8）でも、高う蝕患者と無う蝕患者の試料間に顕著な差は見られなかった。
図6
同一性97%のOTUレベルでのBray-Curtis距離に基づくPCoA。各サンプルはドットで表現されている。異なる色の円は異なるグループを表す。PC1は観察された変動の14.84%を説明し、PC2は変動の5.24%を説明した。
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図7
高う蝕群と無う蝕群の間の非加重UniFrac距離に基づくANOSIM (P = 0.509)
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図8
OTUレベルの階層的クラスタリングツリー。枝の長さは2つのサンプル間の距離を表し、異なるグループは異なる色で表示される。
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LEfSeにより、う蝕が多いサンプルとう蝕がないサンプルの違いを説明する可能性が高い特徴が定義されました。図9は、異なるグループを表すバイオマーカー候補の分岐図である。属レベルでは、Propionibacteriumが高う蝕群で顕著に濃縮されていた。種レベルでは、s_uncultured_bacterium_g_Prevotella_7とs_uncultured_bacterium_g_Propionibacteriumの存在量は、高う蝕群が無う蝕群より相対的に高かった（LEFSe LDA = 3, P < 0.05）．
図9
LEfSeによりバイオマーカー候補が定義された。A 高う蝕群と無う蝕群の有意差を分類学的に表現するためのクラドグラム。内側の円から外側の円までの色付きの節は、門から属のレベルの分類群を表す。有意差のある分類群は、4つのグループを表す異なる色で表示されている。B グループ間で異なる豊富な特徴を示すLDAスコアのヒストグラム。識別特徴の対数LDAスコアの閾値は3.0とした。
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ネットワーク解析と機能予測
異なるグループ内の属間の相互作用を特定するために共起性解析を行った。相対存在量の多い上位80属は、各グループで複雑な相互作用があることがわかった。高う蝕群では、7属が負の相関を示したが（図10A）、無う蝕群では27属が負の相関を示した（図10B）。微生物群集は、高う蝕群より無う蝕群の方が負の相関が強く、より複雑な関係を示していた。
図10
ネットワーク解析では属の相互作用が見られた（｜SpearmanCoef｜> 0.8 and P < 0.01）。2つの異なるグループの細菌間相互作用。ノードの大きさは属の存在量に比例する。ノードの色は、門の分類に対応する。エッジの色は、正の相関（赤）と負の相関（緑）を表す
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PICRUSt2は、唾液サンプル中の微生物群集の機能を理解するのに役立てられた。棒グラフ（図11A）は、2つのグループの唾液サンプルが同様のKEGGマップを持つことを示し、2つのグループの微生物相の機能が類似していることを示唆しました。しかし、STAMP解析の結果、2つのグループ間で微生物群の機能に違いがあることがわかった。クラス2（図11B-1）では、高う蝕群が無う蝕群より環境適応の量が多く、無う蝕群が高う蝕群より免疫疾患の量が多かった（P < 0.05）．クラス3（図11B-2）では、植物-病原体相互作用と百日咳が高う蝕群で無う蝕群より多く観察され、ミネラル吸収、炭素代謝、チアミン代謝、原発性免疫不全、ニコチン酸・ニコチンアミド代謝、MAPKシグナル伝達経路-酵母が無う蝕群で高う蝕群より多く観察された（すべてP < 0.05）．
図11
PICRUSt による機能予測 A 両群の KEGG 機能の構成。B KEGGのWelch's t-testバープロット。B1 Class 2のカリエスなし群とカリエス高群の結果。B2 クラス3の高う蝕群と無う蝕群の結果。有意差のある結果のみ表示（P < 0.05）
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BugBaseを使用して、微生物叢のサンプルに存在する表現型を決定しました。両グループから、好気性、嫌気性、Contains_Mobile_Elements、Facultatively_Anaerobic、Forms_Biofilms、Gram_Negative、Gram_Positive、Potentially_Pathogenic、Stress_Tolerantの9つの表現型が予測された。通性嫌気性菌の相対量は、高う蝕群が無う蝕群より有意に高かった（P＜0.05）（図12A）。属レベルでは、Streptococcusが、むし歯のない群よりむし歯の多い群で通性嫌気性菌の相対存在量が高かった（図12B）。門レベルでは、う蝕高群でう蝕なし群より通性嫌気性菌の相対量が多いのは、ファーミキューテス属である（図12C）。
図12
BugBaseによる表現型予測。A 2群における表現型のWelchのt検定棒グラフ（赤は有意差（P < 0.05））。B 属レベルで異なる表現型の構成比。C 門レベルで異なる表現型の構成比
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考察
歯科バイオフィルムの細菌は、う蝕の発生と進展に不可欠であると考えられている[2, 17]。口腔マイクロバイオームを網羅的に研究し、その病因を理解するためには、健康や疾患に関連する微生物群集の組成や構造を研究するハイスループット技術が有効である。
これまでの研究により、異なる年齢における微生物組成の理解を深めることができました。一部の研究者は、思春期や成人よりも小児の方がファーミキューテスが低く、プロテオバクテリアが高いことを発見しましたが、思春期と成人では結論が全く逆でした [18]。以前の研究[19]によると、一般的に、歯や粘膜の表面に付着した微生物は唾液に流れ続け、唾液は口腔内微生物群集の保管場所であり、すべての口腔内微生物相の「指紋」であると考えられています。唾液サンプルを用いた本研究の結果は、幼児期のう蝕に関連する微生物群集を包括的に理解するのに役立つと思われます。
これまでの研究で、う蝕が発生すると、口腔内の微生物群集のα多様性が低下することが報告されています[20, 21]。一方、本研究で測定された微生物群集のα多様性は、高う蝕群と無う蝕群の間で微生物群集の多様性と存在量が同等であることを示した。このことは、先行研究の結果からも支持されている[22]。異なる研究間で一貫性のない結果が得られた理由は、被験者の選択にある程度起因しているのではないかと推測される。本研究の対象者は、高い均質性を持っている。すべての被験者は同じ地域に住み、同じような食生活と生活習慣を持っていました。彼らの唾液微生物群集は、種構成に一定の違いがあるものの、微生物の多様性は非常に類似しています。
検出されたOTUは、16門、26クラス、56目、93科、173属、218種に分布していた。その内訳は、ファーミキューテス、バクテロイデス、プロテオバクテリア、アクチノバクテリア、フソバクテリア、パテシバクテリア、イプシロンバクテラ、シアノバクテリア、アシドバクテリア、スピロカエテスでした。これらの結果は、これまでの知見[23, 24]と同様である。このことは、口腔内の微生物群集構造が比較的安定していることを示しています。コミュニティバーグラフから、高う蝕群の微生物群集構造は、う蝕なし群と同様であることがわかります。これは、病気の状態が細菌組成に顕著な影響を与えない可能性を示している。
属レベルでは、両群で最も人気のある細菌は基本的に同じであったが、相対的な存在量は異なっていた。小児のう蝕関連微生物の研究では、Prevotellaがしばしば検出され、Prevotellaは幼児のう蝕を検出するためのマーカーとして使用されると考えられている[25]。PrevotellaはBacteroidetes門のグラム陰性細菌で、以前から歯周病菌の可能性があると考えられていた。最近の研究では、う蝕におけるその役割が認識されています[26]。しかし、本研究では、う蝕がない群ではう蝕が多い群よりもPrevotellaが高かった。この知見は、う蝕は特定の微生物の活動ではなく、定常的に存在する微生物の破壊の結果であるとする「エコロジカルプラーク仮説」を支持するものである[27]。
LEfSeは、潜在的なバイオマーカーの異なるグループを示す。これらの著しく異なる属のうち、Propionibacteriumは、高う蝕群で無う蝕群より高い存在度を示した。Xiaoら[28]は、ヒトのう蝕からPropionibacteriumを分離した。彼らは、プロピオニバクテリウムの主な終末代謝産物は、多量のプロピオン酸と酢酸、および適量のコハク酸であることを発見した。Streptococcus mutansはStreptococcusの一種で、主なう蝕原性菌の一つとして認識されているが、本研究では、Streptococcus mutansについて、高う蝕群と無う蝕群の間に差は見られなかった。Agnelloら[29]は、重度の幼児う蝕を持つアボリジニの子どもたちの口腔内微生物群集が、う蝕のない子どもたちのそれと著しく異なっていることを明らかにした。また、重度の幼児う蝕を持つ子どもの微生物プラークには、極めて豊富なStreptococcus mutansが検出された。しかし、集団の特徴や分析方法が異なるため、一部の学者は、微生物プラーク中のレンサ球菌の相対的存在量は、う蝕が発生すると減少することも発見した[18]。多くの健常者において、Streptococcus mutansの含有量は、白斑病変や象牙質う蝕病変のある患者で検出されたものより高かった[21、30]。Streptococcus mutansの高存在率は、異なる程度のう蝕を有する患者の微生物プラークに常に存在するわけではない[31]。微生物群集におけるStreptococcus mutansの高存在率の割合は、健康な歯から深いう蝕までのう蝕の進行度と直線的に相関していない[21]。したがって、Streptococcus mutansのレベルは、う蝕の重症度と有意な相関がないと考える学者もいる[32]。疫学的およびう蝕リスク評価データからも、ここ数十年、Streptococcus mutansを主なターゲットとしたう蝕予防法の使用は、ほとんど効果がないことがわかります。
ネットワーク分析により、口腔内細菌叢とう蝕の潜在的な相関性が示された。グループによって異なる細菌間相互作用が見られる。う蝕なしグループの口腔内微生物群集の関係は、う蝕が多いグループのそれよりも複雑であった。この知見は、一部の微生物の関係が破壊され、生態系のバランスが崩れ、結果としてう蝕の発生につながる可能性を示しています。このことは、先行研究[33]で得られた知見と一致する。
本研究では、中国重慶市の5歳児を対象に、唾液中の微生物群集の機能を分析した。その結果、唾液微生物群集の機能がクラス3の場合、う蝕のない子どもの唾液にミネラル吸収遺伝子クラスターが集中することがわかった。その理由として考えられるのは、う蝕の発生が歯のミネラル化に関係していることである。う蝕のない子供の唾液に含まれる微生物は、ミネラルの積極的な吸収を促進し、歯のエナメル質への酸のダメージやミネラルの喪失に抵抗し、う蝕の発生を予防することができる。Wangら[34]は、う蝕の多い子どもとそうでない子どもの機能差は、主に炭水化物代謝に反映されることを明らかにした。Liuら[35]は、歯質深部のう蝕病巣の微生物機能を調査し、炭水化物代謝とアミノ酸代謝がう蝕の発生を促進することを明らかにした。しかし、本研究では、炭水化物代謝とアミノ酸代謝に差は見られなかった。これらのことから、糖質代謝とアミノ酸代謝の機能性遺伝子の産物をさらに調べ、口腔内フローラ代謝における糖質の役割を分析することに加え、ミネラル吸収など他の代謝経路を調べることは、う蝕の病因研究、予防、リスク評価の新しい入り口になることが期待されます。
BugBase解析の結果、Facultatively_Anaerobicには、う蝕が多いグループと少ないグループの間で表現型に差があることがわかりました。また、得られた結果から、高う蝕群のFacultatively_Anaerobicを増加させた主な要因は、属レベルで、Streptococcusであることが示されました。これまでの研究で、う蝕の発生・進展におけるStreptococcusの役割は十分に明らかになっている[36, 37]。しかし、高う蝕群と無う蝕群の間で、レンサ球菌の含有量に有意な差は見られなかった。この結果は、他の関連する研究結果[38,39,40]によっても支持された。この結果は、レンサ球菌がStreptococcus mutans、Streptococcus sanguinis、Streptococcus oralis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus mitisなど多くの細菌種を含むためではないかと推測される。これらの菌種は、う蝕の発生に果たす役割が異なるため、相対的な含有量によってう蝕の発生・進展の傾向が異なり、結果として、レンサ球菌全体の含有量が安定する可能性があります。口腔は消化器系の一部として、全システムの始点に位置し、外部環境と直接接触している。そのため、口腔内の微生物群集の全体的な構成は高度なダイナミクスを示す[41]。温度、pH、塩分、酸化還元電位、酸素や栄養素の獲得なども、微生物に一定の影響を与えます。正常な状態では、口腔内に存在する微生物群集は、外来種の侵入やコロニー形成に抵抗することができ、したがって、局所的および全身的な健康を調整することができます。一方、微生物群集のバランスが崩れると、一般的な虫歯や歯周病などの口腔疾患につながる可能性があります[42, 43]。生態学的プラーク仮説」によれば、う蝕は、口腔内環境の変化により正常な微生物群集のバランスが崩れることで生じるとされています[3]。本研究の結果は、う蝕に関与する微生物の変化が予想以上に複雑であることを改めて示している。う蝕の発生は特定の細菌に起因するものではなく、口腔内のあらゆる微生物間の微生物群集の構造が変化しているのです[3]。永久歯の萌出と年齢の上昇は口腔内微生物に影響を与えるため[30, 44]，口腔内マイクロバイオームの研究は年齢を基準にする必要がある．年齢の影響を排除するために、本研究では、5歳児のみを被験者として選択しました。また、外部環境の唾液サンプルへの影響を抑制しようと、同じ地域に住む子どもの唾液サンプルのみを選択しました。う蝕のある5歳児とない5歳児の唾液サンプルの微生物群集を調査し、微生物学の観点から5歳児のう蝕の診断と予防のためのエビデンスを提供することができました。しかし、サンプルサイズはやや小さい。また、唾液サンプルは環境要因や食事要因など様々な要因の影響を受けるため、本研究の結果と他の研究結果との間に矛盾がある。したがって、本研究の結果をさらに議論し検証するためには、サンプルサイズを増やすことが必要である。
結論
結論として、α多様性解析により、細菌群集の豊かさと多様性は、高う蝕児と無う蝕児の間で類似していることが示された。そして、PCoAと階層的クラスタリングにより、2つのグループには類似した微生物が存在することが示された。一方、LEfSe分析では、高う蝕群でいくつかの細菌が有意に高いレベルで検出され、これは潜在的な細菌バイオマーカーとして認識することができる。検出された微生物の一部は2つのグループで共有されており、口腔内コアマイクロバイオームの存在を裏付けています。これらの細菌は、口腔内の微生物生態系のバランスを維持する上で重要な役割を担っています。KEGGマップでは、2群間で違いが見られたことから、口腔内微生物の生態系のバランスを維持する機能があることが示唆された。乳幼児期における健康的なマイクロバイオームと食生活の重要性に関する保護者教育やカウンセリングは、できるだけ早い時期に実施する必要がある。
データおよび資料の入手方法
本研究のデータは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。
略号
OTUs：
作業分類学的単位
PCoA：
主座標分析
ANOSIM：
類似性解析
LEfSe：
効果量の線形判別分析
PICRUSt2：
未観測状態の再構築によるコミュニティの系統的調査
KEGG：
京都府遺伝子・ゲノム百科事典
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謝辞
該当なし。
資金提供について
本研究は、重慶市自然科学基金プロジェクト、番号CSTC2019jcyj-msxmX0191、重慶市衛生委員会科学プロジェクト、番号2021MSXM31、重慶市公衆衛生に関する主要学問分野の第一陣、および2016年の重慶市の高等教育機関における革新チーム構築プログラム、番号CXTDG201602006によってサポートされています。
著者情報
著者および所属
重慶医科大学口内科病院、重慶市、400015、中国
ヤン・ジェンヤン、カイ・ティン、リ・ユエヘン、ルオ・ジュン＆ジー・ズー
重慶市高等教育口腔生体工学重点実験室（中国・重慶市・400015
楊正燕、蔡廷、李月亨、姜丹、羅淳、周紫
中国・重慶市口腔疾患・生物医学重点実験室（400015
楊正燕、李月亨、周志(Zhi Zhou)
貢献度
(I) 構想と設計： JL、ZZ；(II)事務局サポート： ZZ、(III)研究材料または患者の提供： ZY、TC、YL、DJ、JL；（IV）データの収集と組み立て： ZY、TC、YL、DJ、JL；（V）データ解析と解釈： ZY、ZZ、(VI)原稿執筆： ZY、ZZ；(VII)原稿の最終承認：全著者。
対応する著者
Jun LuoまたはZhi Zhouに連絡すること。
倫理的宣言
倫理的承認と参加への同意
本研究はヘルシンキ宣言に基づき実施され、重慶医科大学口内科病院倫理委員会の承認を得た。本研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントは、参加者の両親または法定後見人から得た。
出版に関する同意
該当なし。
競合する利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
発行者のコメント
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
補足情報
追加ファイル1：
付録1. 97%の配列の解析により特定された10980の分類学的運用単位。
権利と許可
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Yang, Z., Cai, T., Li, Y. et al. 5歳児におけるう蝕のある場合とない場合の口腔内微生物群集. BMC Oral Health 23, 400 (2023). https://doi.org/10.1186/s12903-023-03055-2
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2023年1月20日受領
2023年5月17日受理
2023年6月16日発行
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