シロイヌナズナ微生物群のコア微生物共生体のリソースが完成し、実験的探索を待っている

2022年12月9日 16:24

https://apsjournals.apsnet.org/doi/10.1094/PBIOMES-11-20-0080-A

Kenneth Dumack, Melanie Sapp, Tiemo von Steimker, Anna Tatjana Mänz, Laura Ellen Rose, and Michael Bonkowski.
所属
オンライン公開:2021年8月17日
https://doi.org/10.1094/PBIOMES-11-20-0080-A
について
セクション
記事を見る
概要
根圏および終末圏における土壌微生物群の特定サブセットの特性は、植物種特異的マイクロバイオームの認識につながっている。これまで、原核生物と真菌が最も注目されてきた。最近になって、植物種特異的な原生動物のマイクロバイオームが存在することを示す説得力のある証拠が提示された。原生生物は細菌や菌類の群集を形成し、それによって植物の健康に直接影響を与えると予想されるが、これらの重要な植物共生原生生物の培養物がないため、実験的な探求が妨げられてきた。我々は、植物マイクロバイオームの実証的研究を促進するために、シロイヌナズナをサンプルとし、植物共生原生動物のほぼ全ての主要なグループを網羅する79種類の培養液を樹立し、これらを一般に公開した。本研究では、これらの原生生物が植物マイクロバイオームの構築に果たす役割の可能性について議論する。

植物は、豊富で多様な微生物群集を収容している（Bai et al.2015、Lundberg et al.2012）。この単位、いわゆるホロビオントは、特定の微生物群集とその宿主から構成されている（Rosenberg and Zilber-Rosenberg 2016）。このホロビオントの成立と構造は、微生物-微生物相互作用を含む、宿主固有の要因と環境要因に依存している（Müller et al.2016 ）。植物宿主に関する微生物相互作用の包括的な概要が最近発表されました（Hassani et al.2018）。植物ホロビオントを形成する微生物相互作用の例としては、病原体による侵入（Aglerら2016；Belhajら2017；Chapelleら2016）、協力（Kimら2010；Mousaら2016； Petersonら。2006）、競争（Bernal et al. 2018; Raaijmakers and Mazzola 2012; Ryu 2015）、ファージによる制御（Bulgarelli et al. 2015; Morella et al. 2018）、捕食（Benhamou et al. 2012; Rosenberg et al. 2009）。特に細菌は、植物の成長と健康に影響を与えることが示されているが、これらのコミュニティが捕食によってどのような影響を受けるかについては比較的知られていない（Bordenstein and Theis 2015; Hassani et al.2018; Xiong et al.2020 ）。原生生物（単細胞真核生物）は、土壌におけるバクテロイバーの支配的なグループである。彼らは根圏細菌群の構成と機能に大きな影響を与え、植物の健康に影響を与えることが分かっている（Bonkowski 2004; Trap et al.2016; Xiong et al.2020）。

最近のデータでは、原生生物の特定のグループであるセルコゾアが植物と密接な親和性を持つことが明らかになった（Li et al.2020; Santos et al.2020; Simonin et al.） Cercozoaを対象とした研究では、さらに根圏および葉圏に特異的な分類群が明らかになった（Dumackら2020; Fluesら2018; Sappら2018)。Plochら（2016）およびSappら（2018）は、シロイヌナズナの原生生物マイクロバイオームを特徴づけました。重要な発見は、根圏「コアマイクロバイオーム」（すなわち、異なる土壌の複数のA. thaliana植物間で一貫して共有されていた分類群）が、ほぼ唯一のセルコゾアンのクラスSarcomonadeaで構成されていたことであった。Sarcomonadeaは、土壌中に最も豊富に存在し、遺伝的に多様で、広く分布する微生物バクテロイバーと考えられており、植物との親和性は繰り返し記録されている（Fiore-Donno et al.2018, 2019; Glücksman et al.2010; Mahé et al.2017; Oliverio et al.2020). ほぼすべての既知のSarcomonadea種は、細菌を餌にしています（Braithwaite et al.）彼らの捕食パターンは種特異的であり、これらの原生生物によって及ぼされる放牧圧力が細菌群集の組成と機能を調節しているという証拠が蓄積されている（Flues et al.）細菌群に「トップダウン」の制御効果を及ぼすことができる強力な食菌として、Sarcomonadeaは植物マイクロバイオームを形成するこれまで見られなかったプレイヤーであると考えられる（Xiong et al.2020）。

植物マイクロバイオームの機能を定義するために必要な前提条件は、コア微生物の異なる組み合わせでgnotobiotic宿主を含む制御された実験の実行である（Liu et al.2019）。マイクロバイオーム原生生物からの培養物の既存の不足は、これまでそのような合成コミュニティ（SynCom）アプローチを妨げてきた。この状況を改善するために、我々は自然環境からA. thalianaをサンプリングし、その根に付随するSarcomonadeaの群集を培養した。我々の結果を、先行するSappら（2018）の環境シーケンス研究の結果と比較し、我々の知見の類似点と相違点を議論する。今後のマイクロバイオーム研究を促進するため、将来の再構成実験のための培養物を提供します。

リソースの確立
根に付着した土を含む植物を、ドイツのケルンおよびその周辺で収集した（補足表S1）。長さ約1cmの根の断片を摘み取り、WG培地（Bonkowski 2019）で洗浄し、24ウェルプレートの個々のウェルに移し、調査前に少なくとも1日インキュベートした。サンプルは最大5週間インキュベートし、倒立顕微鏡（Nikon Eclipse TS100；Ph1；倍率40〜400倍）で毎週サルコモネード細胞のスクリーニングを行った。ガラス製マイクロピペットで細胞を摘出し、WG培地を1mlずつ入れた24ウェルプレートの新しいウェルに移した。モノクローナル培養は、約2ヶ月ごとに再培養した。単離したViridiraptoridae種は、真核生物の餌であるSpumella様鞭毛虫と共培養する必要があった。

分類群の同定には、バーコーディング法を選択した。Sappら（2018）により記載され、Fiore-Donnoら（2018）により公開されたCercozoa特異的プライマーとプロトコルを使用しました。配列は、Sappら（2018）から報告された操作上の分類単位（OTU）とmafft linsiアルゴリズム（Katoh and Standley 2013）により整列し、Sappら（2018）がOTUの定義に用いたカットオフと同じ97％以上の類似性を示した場合に同一と見なした。得られた配列をNCBIデータベースに、重複を除去した樹立培養物をCulture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) (https://www.ccap.ac.uk/)に提出した。アクセッション番号は補足表S1に示す。

培養に基づくアプローチは手間がかかり、微生物の多様性を完全に把握することはほとんどない。しかし、培養により、将来的には群集再構成などの綿密な実験が可能になる（Liu et al.2019）。Sappら（2018）の環境解析と同様に、我々の培養ベースのアプローチでは、A. thalianaの根圏に多数のサルコモネアデスの分類群が存在することが明らかになった。どちらの方法でも、Cercomonadidae、Paracercomonadidae、Sandonidae、Allapsidae、および単一のViridiraptoridae OTUの幅広い多様性が得られた（図1）。Sappら（2018）では、異なる土壌タイプで栽培されたA. thaliana植物がいくつかのParacercomonadidae OTUを共有していたことから、これらの一貫して共有されている分類群を「コアマイクロバイオーム分類群」として考えることになった。培養に基づくアプローチでも同様の結果が得られ、報告されている4つのコアマイクロバイオームParacercomonadidaeのうち2つ（例えば、C8株とC41株）を培養することができた。我々が提供する唯一のViridiraptoridae培養物（すなわち、C35株）は、Sappら（2018）が報告した単一のViridiraptoridaeコアマイクロバイオームタクソンと同一であり、したがって、我々のコアマイクロバイオームタクサーの定義にも該当する。我々が入手した多数のSandonidae培養物から、Sappら（2018）が報告したOTUと同一の培養物は1つ（C21）だけであった。しかし、Sappら（2018）のOTU18と同一のこの培養物は、Sappら（2018）のA. thalianaの根に強い所属を示さなかったため、我々の定義するコアマイクロバイオームには該当しなかった。

図1.
キャプション
パワーポイントとしてダウンロード
合計で、35のユニークな遺伝子型の79の培養物を確立することができた。これらの35のユニークな原生生物培養物のうち、34は研究の全期間にわたって安定していた。これらの34種の培養液は、著者またはCCAPに依頼すれば入手可能である（補足表S1）。合計で、パラコモンアド科の8つの遺伝的に異なる培養物、セコモンアド科の7つ、アラプス科の10つ、サンドン科の8つ、そしてビリディラプトル科の1つの培養物を提供している。特に、3つのコアマイクロバイオーム分類群（C8、C41、C35培養物）と、潜在的にC21を今後の実験に含めることを推奨する。C21はコア微生物分類群に分類されなかったが、他の培養物とは異なる系統的なクレードを表している。しかし、これらの原生生物が単に土壌や植物に関連した原生生物であるのか、それとも本当に A. thaliana に関連した原生生物なのかはまだ分かっていない。

展望
土壌には、多様な遠縁の原生生物が生息しており、それらは補完的あるいは冗長な機能を果たしている（Bates et al.）このプールから、植物種は、根滲出物で提供される成長制限炭水化物および明確な代謝物プロファイルを介して特定の微生物を勧誘する（Baetz and Martinoia 2014; Jones et al.2009; Sasse et al.2018; van Dam and Bouwmeester 2016）。植物に付随する微生物群集は、異なる物理的および化学的特性を呈する採取場所および土壌の種類に強く影響される（Girvan et al. 2003; Sessitsch et al. 2001; Simonin et al. 2020; Ulrich and Becker 2006; Zhao et al. 2019, 2020）。植物が生育している土壌によって引き起こされる変動に加えて、植物関連および非関連原生生物群集組成の変動のより高い割合が、植物自身によって説明されるという証拠がある（de Araujo et al.2018; Dumack et al.2020; Leff et al.2018; Sapp et al.2018; Simonin et al.2020).

植物宿主は、特定の宿主有益機能を果たすために微生物分類群に依存している。植物関連原生生物の機能的役割を解明することを目的とした研究は数多くあるが、多くの場合、容易に入手できる培養物が実験に使用されている。しかし、残念ながら、これらの培養物は必ずしも本物の土壌関連種または根関連種の優れた代表とは言えない。典型的な例は、Tetrahymena spp.が土壌実験に広く継続的に使用されていることである。Tetrahymena spp.は淡水性の繊毛虫で、土壌には存在しないが（Foissner 1998）、このような実験にはTetrahymena spp.が使用されている。

今回提供した培養液は、植物から採取した本物の土壌原生生物の多様な集合体である。Sarcomonadeaは主に細菌食性であり、最近の研究では、Sarcomonadeaがその種特異的な餌の好みによって植物病原性細菌を制御することを示し、植物の健康の重要な予測因子であると決定した（Xiong et al.2020）。このように、今回提供された培養液は、細菌培養液やin situホロビオントによる包括的な摂食試験を可能にし、Acanthamoeba castellaniiなどのモデル生物を用いた試験から得られた知見を補完する（Amacker et al.2020; Asiloglu et al.2020; Gao et al.2019; Murase et al.2006; Rosenberg et al.2009).

一般に、シロイヌナズナの植物随伴原生生物の機能は、バクテリボリーにとどまらない可能性がある（Dumack et al.2019 ）。私たちが提供した特定の培養物の1つは、Sappら（2018）によってA. thalianaの中核的な微生物共生体であることが判明したViridiraptor科の未記載種である。Viridiraptoridaeの数少ない既知種（図1）は辺縁性で、糸状藻類に寄生するような捕食が見られる（Hess and Melkonian 2013）。今回報告した陸棲種は、真核生物の餌としてスプメラ様鞭毛虫を培養することができたが、まだ未記載であり、その餌のスペクトルも未解明である。しかし、私たちの未発表の研究成果から、陸生Viridiraptoridaeは線虫や植物細胞など、様々な真核生物の死骸を食べることができることがわかりました。このViridiraptoridaeの分離株が生きた植物組織に感染することができるかどうかは非常に興味深く、現在試験中である。予備的なデータでは、植物の体力に直接影響を与えることが示唆されているが、この分離株とA. thalianaとの相互作用を包括的に理解するためには、さらなる実験が必要である。残りの植物に関連するサルコモナデアンクレードであるグループTe（図1）は、Sappら（2018）によってコア微生物共生体として発見されたものの、私たちは培養することができなかった。我々が分離できなかったということは、培養における他の要件を示唆しているのかもしれない。このグループが細菌や他の微生物性真核生物を捕食しないのか、あるいは特定の土壌条件で起こりうる酸素欠乏環境など、より極端な条件に適応しているため、我々の培養アプローチを回避した可能性は不明である（Howe et al.2009, 2011）。

結論
ここで提供された培養物は、この分野の重要なギャップを埋め、一般的に適用されるSynComアプローチ（Liu et al.2019）と同様のgnotobioticホストでの実験を容易にする。我々は、Sappら（2018）によっても見出された主要なSarcomonadea系統の1つを除くすべての培養物を提供することができた。

著者は利益相反がないことを宣言する。

資金提供。Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), Germany's Excellence Strategy, grant number EXC-2048/1, project ID 390686111 により支援された。

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？