縦断的メタゲノム研究により明らかになったブタの生涯を通じた糞便中の抗生物質レジストームの動態

2023年11月9日 10:22

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公開日： 2023年11月08日
縦断的メタゲノム研究により明らかになったブタの生涯を通じた糞便中の抗生物質レジストームの動態

https://animalmicrobiome.biomedcentral.com/articles/10.1186/s42523-023-00279-z?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

馬林燕, 宋元元, ...蕭英平著者一覧を見る
アニマルマイクロバイオーム5巻、記事番号：55（2023）この記事を引用する

メトリクス詳細

概要
背景
抗生物質耐性遺伝子（ARG）の拡散は、環境の安全性とヒトの健康に大きな脅威をもたらす。ここでは、豚の糞便マイクロバイオームにおけるARGの動態とその健康リスクを探るために、メタゲノム配列決定と組み合わせた、出生から市場出荷までの豚の一生にわたる縦断的ペア研究を紹介する。

結果
異なる成長段階におけるARGの組成と分布を系統的に明らかにした。21の異なるARGタイプに属する合計829のARGサブタイプが検出され、テトラサイクリン、アミノグリコシド、MLSが最も豊富なタイプであった。実際、134のコアARGサブタイプはすべてのステージで共有され、成長ステージに関連したパターンを示した。さらに、ARG、腸内細菌叢、移動遺伝要素（MGEs）の相関から、大腸菌がARGの主要な保菌者であることが明らかになった。また、ほとんどの場合、支配的なARGは子孫の子豚に伝播することがわかり、ARGの世代伝播の可能性が示唆された。最後に、抗生物質耐性の脅威を評価することで、健康リスクの高いARGを早期に警告することができる。

結論
この比較的包括的な研究により、豚のマイクロバイオームにおけるARGプロファイルの生涯にわたる主要な概観が得られ、養豚場におけるARGの健康リスクと世代間伝播が明らかになった。

図解抄録

はじめに
世界的に、食用動物の生産には推定73％の抗生物質が使用されている[1]。世界的な抗菌薬の使用は抗菌薬耐性（AMR）の発生を促進し、動物とヒトの健康に大きな脅威を与えている[2,3,4]。現在、AMRは毎年70万人以上の死亡の原因となっており、2050年までにさらに1000万人に増加する可能性があると予測されている[5, 6]。AMRの発生は主に抗生物質の選択圧によって引き起こされ、新興環境汚染物質である抗生物質耐性遺伝子（ARG）の動員や水平移動を促進する [7, 8]。移動性遺伝要素（MGEs）によるARGの同時拡散は、ヒト、動物、環境の間で起こる可能性があり、ARGの持続性と拡散をさらに悪化させている [9]。

腸内細菌叢はARGの貯蔵庫と考えられている [10, 11]。ヒトや動物の腸内細菌と抗生物質耐性菌との間には密接な関係があることが、研究によって示唆されている [12,13,14]。例えば、大腸菌（E. coli）はヒトと動物の消化管に広く存在する常在菌であり、薬剤耐性遺伝子を持つ重要な指標菌として広く研究されている [8, 15]。食用動物における抗生物質の長期使用は、たとえ低用量であっても、抗生物質耐性菌（ARB）の産生を加速させる可能性がある[16]。その結果、動物由来のARBの抗生物質耐性がヒトに移行し、様々な健康への影響を引き起こす可能性がある[6, 17]。

養豚場は、ARGの拡散と発展の潜在的なホットスポットと考えられている。豚はARGの重要な供給源であり、中国における抗菌薬使用量の52.2％を占めている [18]。様々な腸内部位や農場の場所における豚の腸内レジストームの特徴は、豚における抗菌薬の使用を最適化するための参考資料となっている [19, 20]。最近、ヒトの研究により、ARGの組成は年齢によって変化することが示され、ARGの研究においては年齢を重要な因子と考える必要があることが浮き彫りになった [21]。さらに、ヒトの母親の腸内微生物は、出生中または出生直後に新生児に移行するARGを保有しており、母子間のARG感染パターンが明らかになっている [22, 23]。近年の技術進歩により、豚の腸内レジストーム研究は急速に増加しているが、豚の腸内レジストームの母体世代と乳児世代の両方からの伝播や、異なる成長年齢にわたるARGプロファイルの動態に関する系統的な縦断的研究は不足している。

ここでは、この知識ギャップを埋めるために、出生から市場に出るまでの豚の生涯にわたって、F0世代からF1世代までの144の糞便サンプルと、メタゲノムシークエンシングを組み合わせた一対の縦断的研究を紹介する。我々は、豚のマイクロバイオームにおける異なる成長段階間のARGの組成と分布を系統的に特徴付け、異なる成長段階に関連するARGのパターンを同定した。さらに、ARGと腸内細菌叢との関連を明らかにし、大腸菌がARGの主な宿主微生物である可能性を特定した。さらに、ほとんどの場合、F0母豚世代で優勢なARGが乳児子豚に伝播する可能性があり、これは腸内細菌伝播と関連している可能性があることを見出した。最後に、養豚場の各成長段階における抗生物質耐性の脅威を評価することで、関連するハイリスクARGの早期警告を得ることができた。

結果
豚の各成長段階におけるARGの分布と存在量
ARGの相対的存在量に基づくPCoAにより、ブタのサンプル間で有意に異なるARGパターンが明らかになった（図S2）。例えば、新生子豚のARGパターンは他のステージのものよりも不連続であることが判明し、これは環境暴露に起因する可能性がある（Fig.）さらに、離乳期のブタでは、仕上げ期の傾向が見られた（図S2）。ARGの存在量（16 S rRNA遺伝子あたりのコピー数）は、F0世代およびF1新生子豚で有意に高かった（図1A）。さらに、ARGの存在量は離乳期以降では明らかに減少していたが、哺育期から仕上がり成長期にかけてはわずかに増加していた（図1A、表S1）。一方、検出されたARGサブタイプ数の変化は、離乳期から仕上がり期にかけて減少した（図1B、表S1）。

図1
図1
ブタの各成長段階におけるARGの特徴。(A)各成長段階におけるARG型の総存在量（コピー/16s rRNA遺伝子）を示す箱ひげ図。(B）各成長段階における検出されたARGサブタイプ数。(C）タイプの異なるブタにおける相対的ARG存在量の分布。(D）各サンプルにおける存在量に基づく上位20のARGサブタイプ

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一般に、これらのARGは21の主要なARGタイプに分けられ、特に「W_Piglets_1WからFinish_Pigsのステージ」ではアミノグリコシド、テトラサイクリン、MLSが最も優勢なタイプであり、総存在量の約80％を占めた。さらに、Boar、Sow、N_Pigletsではアミノグリコシド、テトラサイクリン、Multidrugが優勢なARGタイプであった（図1C）。さらに、新生子豚のF1世代は、猪および母豚サンプルのF0世代と同様のARG型パターンを示した（図1C）。哺乳期から仕上期にかけて、クロラムフェニコールは増加した（図1C）。しかし、これらのステージではAMRクラスの豊富さは減少しており、ARG数の減少と一致していた（図1C）。さらに、多剤耐性はイノシシ、母豚、新生子豚の各グループで非常に高かった（図1C）。一般的なARG型パターンは、肥育期と仕上がり期でも同様であった（図1C）。

さらに、21の異なるARG型に耐性を付与する合計829のARG亜型が検出された。存在量が0.1％を超える亜型は優勢ARGとして同定され、98亜型が含まれ、全存在量の93.8％を占めた。図1Dに、最も存在量の多いドミナントARGサブタイプ上位20種類を積み重ねた棒グラフで示した。これらのARGサブタイプのうち、11種類がテトラサイクリン耐性遺伝子に属し、その中にはtetW、tetM、tetQ、tet(40)、tet(44)、tetA、tetOおよびtetLが含まれ、ほとんどのステージ、特に育苗期、生育期および仕上げ期を通して最も優勢なARGクラスであった（図1D）。さらに、3つのアミノグリコシド耐性サブタイプ（aadE、aph(3)-III、ant(9)-I）も、ほぼすべての生育ステージで濃厚であった（図1D）。

ブタの成長段階による耐性機序の違い
さらに、ARGサブタイプの耐性メカニズムを同定したところ、4つの異なる耐性メカニズムが網羅された（図S3）。図S3に示すように、サンプル間で優勢な2つの耐性機構は、抗生物質の不活性化に対する耐性と抗生物質の標的防御に対する耐性であった。特に、排出機構を利用して複数の抗生物質に対する耐性を付与するARGは、他のステージよりもF0イノシシ、新生子豚、離乳子豚に多く存在した（Fig.）

ブタの異なる成長段階におけるコアARGと段階関連ARG
サンプルの少なくとも95%に存在するARGサブタイプをコアARGと定義し、17のARGタイプに属する合計134のコアARGサブタイプが全サンプルで共有された。ARGサブタイプの共起パターンは、強い相関（スピアマンの相関係数（ρ）＞0.9）と有意な相関（p値＜0.01）を持つネットワーク推論を用いて探索された（図S4）。図S4は、51のノード（ARGサブタイプ）と455のエッジから構成されている。モジュール性クラスに基づいて、ネットワーク全体を5つの主要なモジュールに解析することができた。多剤耐性遺伝子は最大のモジュールIを形成し、アミノグリコシドに対するARGはモジュールIIを形成し、その中でAph (6')-Iはハブであった；さらに、tet (X)を含むテトラサイクリン耐性遺伝子はモジュールIIIを形成した（図S4）。

ステージに関連するARGは、LEfSeを用いてさらに同定され、ヒートマップで可視化された（図2）。図2に示すように、核となるARGサブタイプは全ステージを通して持続していたが、それらの存在はステージに関連したパターンにも従っていた。例えば、トリメトプリム耐性遺伝子adeJ、多剤耐性遺伝子mphB、mdfAおよびmdtA、MLS耐性遺伝子mphBおよびmarBは、イノシシおよび母豚サンプルのF0世代に豊富に存在したが、離乳後のステージでは著しく低かった。アミノグリコシド耐性遺伝子は離乳期の1～4週で多かったが、それ以降は減少した。テトラサイクリン耐性遺伝子は哺乳期から仕上期にかけて増加した。

図2
図2
ブタの各成長段階におけるステージ関連ARG。ヒートマップは、LEfSe（LDA > 3）によりサンプル間で同定された90のステージ関連ARGサブタイプを示す。ヒートマップは、行に基づく正規化平均存在量を示す。左の線は、以下のARGサブタイプに属するARGタイプを意味する。

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ブタの異なる成長段階におけるマイクロバイオームプロファイル
Bray-Curtis距離に基づくPCoAプロットでは、すべてのステージの実験ブタ間で細菌群集と構造の有意なシフトが観察された（図3A）。異なる成長ステージでは、肥育期のブタと仕上がり期のブタは明らかに異なる細菌群集パターンを示し（R値＝0.3669；P値＝0.001）、哺乳期の子ブタサンプルの微生物叢プロファイルも肥育期および仕上がり期のサンプルと有意に異なっていた（R値＝0.4161；P値＝0.001）。さらに、新生児サンプルはF0母豚サンプルとは異なり、より類似していた（R値＝0.6772；P値＝0.001）。シャノン指数（図3B、表S1）で示されるように、全体的なアルファ多様性は出生期から経時的に有意に増加し、保育期から減少した。しかし、チャオ1指数のα多様性は離乳期以降に増加した（図S5A-B）。腸内微生物の保有数が少ない新生子豚は、細菌の多様性と豊富性が低いことを示した（図3Bおよび図S5A-B）。

図3
図3
ブタの異なる成長段階におけるマイクロバイオームプロファイル。(A）PCoAプロットは、各グループにおける明確なクラスターを示す。(B）各群のシャノン指数による微生物の豊富さを示すボックスプロット。(C)門から種レベルまでの異なる分類群における細菌の分布。長方形の色は異なる細菌を表す。

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門レベルでは、すべてのサンプルで固形化門が優勢であり、離乳期から仕上がり期にかけて増加した（図3Cおよび図S5C）。プロテオバクテリアの相対量は、新生児期から仕上期にかけて減少した（Fig.）また、アクチノバクテリア（Actinobacteria）の濃度は子豚期、特に離乳豚のサンプルで高かった。さらに、F0世代のサンプルではバクテロイデーテス（Bacteroidetes）属のレベルが高かった。属レベルでは（図S5D）、Lactobacillus属、Escherichia属、Clostridium属がすべてのサンプルで上位3属であった。乳酸桿菌は肥育期および仕上げ期のサンプルでより多く見られた。Escherichiaなどの病原菌は、F0世代、新生児期、仕上げ期のサンプルで多かった（図S5D）。

次に、ARGの多様性に影響を与える主要な細菌を同定するために、微生物叢コミュニティとARGの相関分析を行った。本研究では、最も豊富なFirmicutes門がほぼすべてのタイプのARGと有意な相関を示し、スルホンアミド、β-ラクタム、キノリン、トリメトプリム、多剤耐性、ポリミキシン、ホスミドマイシンおよびカスガマイシン耐性遺伝子と共起することがわかった（図S5E）。さらに、Firmicutesはアミノグリコシド、バクテリア、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ブレオマイシン、MLSと正の相関があり、これは以前の報告[24]と同様であった。一方、プロテオバクテリア（Proteobacteria）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）は、β-ラクタム、キノリン、トリメトプリム、マルチドラッグなどのARGと正の相関を示し、プロテオバクテリア（Proteobacteria）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）がこれらのARGを保有している可能性が示された（図S5E）。

ブタの異なる成長段階におけるMGEsの分布と存在量
実験ブタにおけるMGEsの分布と総存在量を図S6に示す。イノシシおよび母豚のF0世代は、他のグループよりもMGE量が多かった。さらに、検出されたMGE数は離乳期以降に減少した（図S6B）。積み重ねた棒グラフに示すように、すべてのサンプルで支配的なMGEはトランスポザーゼとISに属していた（図S6C）。トランスポザーゼの一種であるTnpAは、すべてのサンプルの中で、特にフィニッシングステージで最も優勢なMGEサブタイプであった（図S6D）。また、離乳期の子豚ではIS10とtnpABの発現量が高かったことから、離乳ストレスがIS10とtnpABの発現量を増加させた可能性がある（図S6D）。

ARG、MGEおよび細菌間の共起パターン
微生物群集、ARG、およびMGE間の関連性をさらに調べるために、これらのプロファイルを相関させるためにProcrustes分析を使用しました（図4Aおよび表S2）。その結果、ARGプロファイルは細菌群集（Mantel_r = 0.774, Proc_r = 0.597, p < 0.001）およびMGEs（Mantel_r = 0.520, Proc_r = 0.620, p < 0.001）と有意に関連していた。さらに、MGEは細菌群集と有意に関連していた（Mantel_r = 0.374, Proc_r = 0.809, p < 0.001）（図4Aおよび表S2）。

図4
図4
ARG、MGE、および細菌種間の共起パターン。(A)ARGと微生物、ARGとMGE、微生物とMGEの存在量の関連をプロクラステス解析とマンテル検定で示した。(B)ネットワーク解析。強い相関（スピアマンの相関係数(ρ)>0.9）および有意な相関（p値<0.01）を持つ異なるARGsサブタイプ、MGEsサブタイプおよび細菌種に応じてノードを色分けした。ノードサイズは接続数、エッジは相関係数を表す。

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コアARG、MGEsおよび細菌種間の共起ネットワークは、116個のノードと526個のエッジから構成されていた（スピアマン相関＞（0.9）、p値＜0.01）。この点に関して、Shigella属とEscherichia属に属する病原体（Shigella dysenteriae、Shigella flesneri、Escherichia marmotae、E. coli）、多剤耐性菌（E. 大腸菌）、多剤耐性遺伝子（mdtB、mdtE、mdtF、mdtM、ompR、ompFなど）、MLS耐性遺伝子（macA、mexE、mexXなど）、MGE（IS10、IS62、IS26、IS CR1など）が最大のモジュールを形成し、これらの相互作用が示唆された（図4B）。S.dysenteriae、S.flesneri、大腸菌は、IS62、IS26、ISCR1のキャリアである可能性がある。他のモジュールでは、ほとんどの細菌種が、特定のARGサブタイプ1つだけとより強い関連性を示した。例えば、クロストリジウム属はテトラサイクリン耐性遺伝子であるtet(35)と有意な相関を示した。さらに、Tannerella forsythia、Paeniclostridium sordelliiおよびAcinetobacter sp. SWBY1は、mefA、tetP、tet39およびadeJの潜在的宿主として働く可能性がある。また、Weissella paramesenteroidesがtnpABのキャリアーとして働く可能性も示された。

ブタにおけるARGに関連する大腸菌の分布
大腸菌および赤痢菌は、ブタ検体中のほとんどのARGと強く関連していることがわかったため、これらの大腸菌関連ARGを潜在的リスクARGとして同定した。ヒートマップから、潜在的リスクARGは主にF0世代と新生児サンプルに濃縮されていることが示された。図5Aでは、大腸菌の相対量がARGの変動の大部分と関連していることがわかった（図5A）。さらに、大腸菌の相対量（log10）と、全サンプルのARGおよびMGEの存在量および数をプロットし、大腸菌とレジストーム全体の結果との関連を直接的に調べた。散布図は、大腸菌とARGおよびMGEの存在量および検出数との間に、異なる生育ステージにわたって強い関連があることを示している（図5B）。

図 5
図5
ブタにおけるARGに関連する大腸菌の分布。(A）異なる成長段階におけるブタにおけるこれらのARGの存在量を示すヒートマップ。(B)大腸菌の存在量とARGおよびMGEsの存在量、数の相関。

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豚の異なる成長段階におけるARG評価の健康リスク
次に、ARGリスクを評価し、公衆衛生を危険にさらす可能性の大きいARGを特定するために、ARGリスクランク分析を行った[25]。図6に示すように、最も高いリスクランクI（ARGの病原体にすでに存在する）関連のARGは、新生子豚の初期に増加したが、哺育期には減少した。しかし、肥育・仕上げ期には増加した。特にハイリスクARGは新生子豚で最も多かった。また、ランクIにはテトラサイクリン、アミノグリコシド、MLS耐性ARGが含まれていた。全成長段階におけるハイリスクARGの上位50を図6Cに示す。その結果、テトラサイクリンおよびアミノグリコシド耐性遺伝子、特にaph(3)-III、tetM、tetO、tet40、sul3、qnrSおよびdfrA 14を含むクラスター2は、F0およびF1初期豚の間で同様のパターンを示し、これらのARGが母豚の世代から伝達される可能性を示した。しかし、rmtB、ermT、tetW、ermC、mphA、aph(3)、sul1、erm(39)は新生子豚では濃縮されていたが、F0世代では欠損していた（クラスター1）こともわかった（図6C）。成長期および仕上げ期には、健康リスクがわずかに増加したが、これはaad(9)、tet32、tetL、aadEおよびvgaA（クラスター4）の存在量が増加したことに起因している可能性がある（図6C）。

図6
図6
ブタの成長段階別のARG健康リスク評価。(A）各グループにおけるランクリスクARGの分布。(B）各グループにおけるランクIリスクARGの多さ。(C）存在量に基づくランクIリスクARGサブタイプの同定上位50。異なる色のクラスタは、成長段階間で異なるランクIリスクARGサブタイプのパターンを意味する。

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考察
本研究では、比較的包括的なメタゲノム解析を実施し、猪、母豚、新生仔豚、離乳仔豚、保育仔豚、肥育仔豚、仕上げ仔豚のF0世代を含む、異なる成長段階にわたる豚のマイクロバイオームのARGプロファイルを探索した。我々は、豚のマイクロバイオームにおける異なる成長段階間のARGの組成と分布を系統的に特徴付けた。合計で、21の異なるARGタイプに属する829のARGサブタイプが検出された。アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、MLS系がブタ検体で最も多く検出されたARGタイプであった。17タイプに属する合計134のコアARGサブタイプは全サンプルで共有され、異なる成長段階に関連するARGパターンを示した。さらに、ARG、腸内細菌叢、およびMGEsの関連から、ARGと腸内細菌叢との関連が示唆され、大腸菌が主な宿主微生物である可能性が示唆された。興味深いことに、ほとんどの場合、母豚のF0世代の優占ARGが乳児子豚に伝播する可能性があり、これは腸内細菌伝播と関連している可能性があることがわかった。最後に、養豚場の各成長段階における抗生物質耐性の脅威を評価することで、リスクの高いARGの早期警告が得られる。

豚の腸内細菌叢における抗生物質耐性菌の動態
これまでの研究で、豚の糞便レジスト-ムは農場によって異なることが明らかにされており、これは立地、飼育条件、気象気候、環境が異なることに起因している可能性がある[3, 26]。ARG型は主にテトラサイクリン、アミノグリコシド、MLSに対する耐性を付与していた。本研究では、全生育ステージの糞便レジストームのARG型の大部分も、テトラサイクリン、アミノグリコシド、MLS、多剤耐性に属することを見出した。乳牛の糞便レジストームに焦点を当てた研究では、レジストームの動的な変化が食餌の変遷と密接に関連していることが示唆された [27]。さらに、ヒトの研究では、小児、成人、高齢者における年齢別の抗菌薬が同定され、年齢層と各年齢段階で使用される抗菌薬との関連が強調されている [28]。このように、豚のマイクロバイオームにおいて、異なる成長段階間で存在量と濃度が異なるARGプロファイルは、本研究における食餌、抗菌薬使用および年齢が原因である可能性がある。

離乳期以降、豚はテトラサイクリンとアミノグリコシドに耐性があるようであった。テトラサイクリン系抗菌薬は肥育期および離乳期以降の豚の呼吸器系の治療に最も多く使用されており、離乳期以降にテトラサイクリン系抗菌薬の使用量が増加することが示唆された[29]。さらに、哺育期、肥育期、仕上期の糞便ARGは、養豚場での疾病予防にもよく使用されるクロラムフェニコールに耐性を示した。ARGの総量が減少しているにもかかわらず、豚の生涯を通じてARGサブタイプの数が全体的に増加していることが観察され、ARGの豊富さが年齢とともに増加していることが懸念された。

ステージに関連するARGサブタイプから、多剤耐性を付与する耐性遺伝子がF0世代の母豚サンプルでより豊富であることがわかった。これは、母豚における抗生物質の長期使用、特に分娩中の使用に起因している可能性がある。豚の生産における抗生物質投与は、哺乳期と離乳後の経口投薬が最も一般的であった。豚の段階を考慮すると、最も使用されたのは子豚と離乳期のコリスチンであり、肥育豚の消化管疾患のためのタイロシンであった[30, 31]。Pleuromutilinは母豚と子豚の呼吸器感染症によく使用された [32]。異なるARGサブタイプは異なる成長段階で濃縮されたが、共起パターンは、各モジュール内のハブおよび関連する共起ARGが、異なる成長段階内で共有される可能性のあるいくつかの特定の細菌分類群に保有されている可能性があることを明らかにした。

腸内細菌叢の構成がARGの発生に寄与した
本研究では、新生児から離乳後2週間までの腸内微生物の多様性（Shannon index）の増加が認められ、先行研究[27]と一致した。ブタの腸内では、微生物叢の多様性と糞便レジストームは低かったが、ARGの存在量は高く、抗生物質治療を受けた患者の腸内と一致していた[33]。しかし、リッチネス指標（観察された種の数）は実験終了まで増加し続けた。これらの結果は、抗生物質の投与が細菌の多様性を低下させ、ARBの濃縮を促進し、AMRレベルの上昇をさらに加速させる可能性を示唆している。

ヒトに関連する病原体、特に抗生物質耐性を持つ可能性のある病原体については、さらなる懸念がある。ARGサブタイプと強い関連を示した細菌種は、潜在的なARGキャリアとみなされるかもしれない[34]。例えば、ヒトや動物の腸管に生息する病原体である大腸菌は、最も多くのARGを保有し、多剤耐性、フルオロキノロン耐性、マクロライド耐性を示すことが報告されている[35, 36]。また、大腸菌に関連するARGは、テトラサイクリンやその他の抗生物質に耐性を示すこともわかった。赤痢菌もまた、ヒトや動物に下痢性疾患を引き起こす主要な病原体である[37]。我々のデータでは、赤痢菌の種（S. dysenteriaeとS. flexneri）が、大腸菌と同様のARGの大部分と関連していることが示され、これらの関連ARGがヒトや動物に健康被害を及ぼすリスクがあることが示された。

また、いくつかのARGは複数の細菌によって保有されていることもわかった。tet(32)遺伝子はクロストリジウム関連菌で同定された。ここで、tet(35)はクロストリジウム属菌と関連していることがわかり、クロストリジウム様菌株もtet(35)のキャリアーである可能性が示唆された。アミノグリコシド耐性遺伝子であるaphやaadはコリネバクテリウム属に関連することが判明した。アミノグリコシド系抗生物質は、病原性コリネバクテリウム感染症の治療に用いられる第二選択薬または補完的抗生物質である[38]。したがって、アミノグリコシド系抗生物質の長期使用はAMRリスクを高めると考えられた。一方、L. helveticusやL. kefiranofaciensのような乳酸菌関連種もARGsキャリアとして同定され、養豚におけるプロバイオティクスの使用には注意が必要であることが示唆された。

F0からF1への潜在的ARGs伝播パターンは細菌伝播と関連するかもしれない
本研究におけるもう一つの重要な発見は、ブタにおける「母子間」ARGs伝播の可能性を見出したことである。ヒトの研究では以前、母子間の細菌感染事象が報告されている[23]。また、ARGを保有する母親の腸内細菌が、出生後数日の間に新生児に移行することも証明されている[22, 23]。本研究では、新生子豚の大腸菌関連ARGは母豚のサンプルと同様であった。母豚のサンプルでは非常に豊富であった大腸菌は、本研究では新生児では豊富であったが、離乳後には段階的に減少した。これらの結果は、母豚の優勢ARGのF0世代が乳児子豚に伝播し、それが大腸菌などの腸内細菌伝播パターンと関連している可能性を示唆している。しかし、大腸菌の直接分離とARGの同定は、我々の仮説を支持するためにまだ更なる確認が必要である。

aph(3)-III、aac(6)-I、aph(2)-II、tet(M/O/G)のような高リスクARGがF0世代と新生子豚で検出されたが、他のステージではほとんど検出されなかったことから、垂直遺伝も示唆された。母子間」ARGs伝播の検討は、母体伝播と乳児のARGsプロファイル変化への寄与の理解に近づき、母体の抗生物質使用に焦点を当てることを可能にした。しかし、さらなる研究でARGsや微生物獲得パターンを確認するためには、より大規模でバランスのとれたコホートが必要である。

各成長段階における抗生物質耐性の脅威の評価
豚の耐性遺伝子に関する現在の研究は、主に組成や存在量に基づいているが、ARGの健康リスクも考慮すべきである[25, 39, 40]。ヒト関連濃縮度、遺伝子移動度、宿主病原性を考慮することにより、ARGの健康リスクを評価するオミックスベースのフレームワークを開発した研究がある[25]。その結果、21.3％のARGが最も健康リスクが高く、特にβ-ラクタム薬耐性と多剤耐性を持つことが示された。これらのうち、aph(3)-I、aac(3)-II、tetQ、tetL、aph(6)-I、aph(2)-IIなどの高リスクARGは、世界保健機関（WHO）でも特定されており、これらのARGは病原菌の多剤耐性をもたらす可能性が最も高い「現在の脅威」である可能性があると警告している。イノシシと母豚のF0世代は繁殖によく使われ、2年間飼育されてきた。F0世代のイノシシと母豚が、抗生物質の長期使用によって最も高い健康リスクを示したことは妥当である。これまでの研究で、動物への曝露が、相互に関連するヒトのレジストームやマイクロバイオーム組成の潜在的な決定因子となる可能性があることが明らかにされている[14]。養豚場の各成長段階における抗生物質耐性の脅威を評価することで、リスクの高いARGを早期に警告することができる。言い換えれば、これらの健康リスクの高いARGは、簡便な方法（例えば、定量的PCR）でリスクを評価するための潜在的なマーカーにもなる。

結論として、ブタのARGプロファイルは成長段階に関連したパターンを示したが、これは部分的には食餌と腸内細菌叢の変化に起因する。いくつかのARGはF0世代と新生子豚で共起しており、遺伝性が示唆された。これらのARGは容易に人獣共通感染症病原体に移行する可能性があるため、養豚場におけるARGの健康リスクにはもっと注意を払うべきである。総合すると、この比較的包括的な研究は、生涯にわたる豚のマイクロバイオームにおけるARGプロファイルの主要な概要を提供し、ARGのリスクと抗生物質の世代間影響を無視すべきではないことを強調している。

材料と方法
研究デザインとサンプル収集
養豚場は中国浙江省杭州市臨安区（30°14′10″N 119°42′55″E）にある。本研究では18頭の猪と18頭の母豚をF0世代として使用した。そして、合計18のサンプル（平均体重に基づいて各F0ファミリーから1匹の子豚）がF1として同定された（Fig.S1）。これらの豚のうち、18頭の雄豚を、新生児期（d 2 ~ 3）、2つの離乳期（離乳1週間はd 26、離乳2週間はd 35）、保育期（d 49 ~ 50）、肥育期（d ~ 120）および仕上げ期（d ~ 180）を含む異なる成長段階にわたってペアにした。各段階の終わりに直腸スワブを採取した。関連サンプル情報を表S3に示す。

メタゲノム配列決定
E.Z.N.A.®DNAキット（Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA）を用い、製造者の指示に従って全144検体の微生物DNAを抽出した。メタゲノム配列決定ライブラリーは、Shanghai Biozeron Biological Technology Co. Ltd.（中国、上海）で行った。(Ltd.（中国、上海）で行った。すべてのサンプルはIllumina Novaseq 6000 (Illumina, Inc.San Diego, California USA)でシーケンスした。Adaptor contaminantsと低品質リードはTrimomatic（V 0.32）[41]で除去した。宿主DNAの除去にはBwa2を用いた。参照ゲノムはSus scrofaゲノムアセンブリSscrofa11.1。宿主ゲノムのコンタミネーションや低品質のデータが除去されたリードはクリーンデータと呼ばれ、さらなる解析に使用される。

細菌分類群、ARGおよびMGEのアノテーション
ARGの定量化には、リードをARG解析パイプラインARGs-OAP v2.0の入力として使用し、SARG v2.0参照データベース[42, 43]によるARGの検出を統合した。ARGは16 S rRNA遺伝子の数で正規化し、16 S rRNA遺伝子あたりのコピー数で表した。本研究におけるARGタイプおよびサブタイプの関連情報を表S4-S5に示す。MGEsの定量には、公開されているMGEsデータベースを参照した[44]。このデータベースには278の異なる遺伝子と2000以上の参照配列が含まれている。遺伝子構造と進化的関係に基づいて全遺伝子を分類した。移動遺伝子ユニットはtypeとsubtypeの2つのレベルに分けられ、typeは移動遺伝子ユニットのタイプ（プラスミド、インテグロンなど）、subtypeは特定の遺伝子（intI1、tnpAなど）である。また、MGEは16 S rRNA遺伝子の数で正規化した。本研究におけるMGEのタイプおよびサブタイプの関連情報を表S6-S7に示す。分類学的分類のために、リードはKraken2 (v2.0.7)でNCBI分類学的IDとカスタマイズされた完全ゲノムk-merデータベース[45]を用いてクリーニングされた。分類結果は、さらにBracken 2.0[46]で解析した。

ARGの健康リスク評価
ARGの健康リスク評価は、以下の観点から[25]が提案した基準に従って評価した：(1)ヒト関連環境における濃縮度、(2)遺伝子移動度、(3)宿主病原性における存在度。ARGは次の4つのランクのARGに分類された：(1) ランクIV（最低リスク）： (2)ランクIII：1つ目の基準は満たすが2つ目の基準は満たさないARG、(3)ランクII：1つ目と2つ目は満たすが3つ目は満たさないARG、(4)ランクI（最高リスク）： 3つの基準をすべて満たすARG。

統計解析
統計解析はR（バージョン4.0.2）で行った。Bray-Curtisに基づく主座標分析（PCoA）を用いて、細菌群集のβ多様性とグループ間のARG分布を決定した。プロクラステス分析は、細菌種、ARGおよびMEGプロファイル内のサンプル分離の一致性を評価するために使用した。ARGタイプのスピアマン相関係数を用いて相関を分析した。ネットワークの可視化は、Cytoscape 3.8.2とGephi 0.9.2を用いて行った[47]。

データの入手
メタゲノムデータはNGDC (https://ngdc.cncb.ac.cn/, GSA No.CRA010380)で公開されている。

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謝辞
該当なし。

資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（31972999）、農産物の品質と安全性に対する生物的および化学的脅威を管理するための国家重点実験室（2010DS700124-ZZ1905）、浙江省重点研究開発プログラム（2022C02049）、ウォルマート財団（UA2020-152、UA2021-247）および中国博士研究員科学基金（2021M702905）の助成を受けた。

著者情報
著者情報
Lingyan MaとYuanyuan Songは同等に本研究に貢献した。

著者および所属
浙江省農業科学院農産物安全栄養研究所農産物の品質と安全性に対する生物的・化学的脅威管理国家重点実験室、杭州、310021、中国

馬玲燕、宋元元、柳文涛、陳旭寧、楊華、王文、蕭英平

浙江理工大学生物工程学院、杭州、310032、中国

Yuanxiang Jin

貢献
Lingyan Ma、Yuanyuan Song：調査、データ管理、原稿執筆。Wentao Lyu：監修、形式分析、執筆。Qu Chen：調査。Xingning Xiao：ソフトウェア、可視化。Yuanxiang Jin：調査。楊華、王文：監修、執筆・校閲・編集。蕭英平：検証、資金獲得。

責任著者
Yingping Xiaoまで。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

倫理的承認と参加同意
すべての動物実験は、浙江省農業科学院のInstitutional Animal Care and Use Committee（2018ZAASLA20）の承認を得た。

出版に関する同意
該当なし。

追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

電子補足資料
下記は電子補足資料へのリンクです。

補足資料1
補足資料2
補足資料3
補足資料4
補足資料5
補足資料6
補足資料7
権利と許可
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この記事を引用する
Ma, L., Song, Y., Lyu, W. et al. Longitudinal metagenomic study reveals the dynamics of fecal antibiotic resistome in pigs throughout the lifetime. anim microbiome 5, 55 (2023). https://doi.org/10.1186/s42523-023-00279-z

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受理
2023年6月20日

受理
2023年11月02日

出版
2023年11月08日

DOI
https://doi.org/10.1186/s42523-023-00279-z

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キーワード
抗生物質耐性遺伝子
感染
腸内細菌叢
健康リスク
成長段階
豚

動物マイクロバイオーム
ISSN: 2524-4671

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