大腸癌のニッチを支配するFusobacterium nucleatumの別個のクレード
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出版：2024年3月20日
大腸癌のニッチを支配するFusobacterium nucleatumの別個のクレード
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07182-w#citeas
マーサ・ゼペダ・リベラ、サミュエル・S・マイノット、...クリストファー・D・ジョンストン 著者一覧を見る
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メトリクス詳細
要旨
Fusobacterium nucleatum（Fn）は、ヒトの口腔内に存在し、健常人の下部消化管ではほとんど見られない細菌1であるが、ヒトの大腸がん（CRC）腫瘍では濃縮される2,3,4,5。高い腫瘍内Fn負荷量は、再発、転移、および患者の予後不良と関連している5,6,7,8。ここでは、腫瘍コロニー形成を促進するFnの遺伝的因子を明らかにするために、135株のFn株（がんを発症していない個体から採取した経口株80株と、CRC患者51人の腫瘍から培養した固有のがん株55株）についてクローズドゲノムを作成した。パンゲノム解析により、CRCに濃縮された遺伝因子483個が同定された。腫瘍から分離された株は主にFn subspecies animalis（Fna）に属していた。しかしゲノム解析の結果、Fnaは単一の亜種と考えられていたが、実際には2つの異なるクレード（Fna C1とFna C2）から構成されていることが明らかになった。このうち、CRC腫瘍ニッチを支配しているのはFna C2のみである。Fna間の解析により、Fna C2に関連する195の遺伝因子が同定され、代謝能の増大と消化管への定着が示唆された。これを裏付けるように、Fna C2を投与したマウスでは腸腺腫の数が増加し、代謝産物も変化した。116人のCRC患者から採取したヒト腫瘍組織のマイクロバイオーム解析では、Fna C2が濃縮されていることが示された。62のペア検体の比較から、Fna C2のみが正常隣接組織と比較して腫瘍に濃縮されていることが示された。このことは、CRC患者627人と健常人619人の便サンプルのメタゲノム解析によってさらに裏付けられた。これらの結果を総合すると、Fnaクレードの分岐が明らかになり、ヒトCRCにおいて報告されているFn濃縮はFna C2に特異的であることが示され、CRCニッチへのFna C2の病態適応の遺伝的基盤が明らかになった。
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メイン
口腔微生物叢の一員であるFnは、新たな癌関連細菌として注目を集めている。世界的な偏りのないゲノム解析により、ヒトのCRCでは非癌性大腸組織と比較してFnが濃縮されていることが明らかになっている9。我々のグループや他の研究者らによるこれまでの研究で、Fnを高レベルに保有するCRC腫瘍患者の生存率が低いこと5、Fusobacteriumが患者の腫瘍領域にコロニー形成し、がんの進行を支持する免疫機能と上皮細胞機能を有すること10、Fusobacteriumが転移性疾患において持続すること6、Fnを標的としたマイクロバイオーム調節がこの疾患の経過を変える可能性があること6,11が示された。さらに、動物モデルや細胞モデルにおける外因性Fn感染は、この細菌ががんを促進する役割を担っていることを裏付けている6,9,10,11,12,13,14。しかしながら、Fnの遺伝子型や表現型の特徴には、株ごとにかなりのばらつきがあることが報告されている12,13,14,15,16。このような不均一性から、動物モデルや細胞モデルでFnのがん誘発表現型を再現することが困難であり16,17、一部のFn株のみが発がん能を有する可能性が提唱されている17。
ここで、ヒトCRC Fn株の包括的なコレクションを活用し、広範な比較ゲノミクスを実施することで、Fn亜種の中の選択された一群がCRCニッチを支配していることを明らかにした。In vitroおよびin vivoの機能的研究により、このクレードはCRCにおいて高い毒性を示すことが示され、CRCにおけるFnの病原性に関するその後のメカニズム研究や、標的阻害剤の開発において主要な焦点となることが期待される。
ニッチに濃縮されたFn遺伝子と亜種
古典的な微生物学的培養アプローチは、組織関連マイクロバイオームのメンバーを機能的に評価するための貴重なツールとして再浮上してきた。ここで我々は、130のヒトCRC腫瘍についてFusobacterium標的培養を実施し、そこから59人のユニークな患者から65のFusobacterium CRC関連株を得た。Fnは主に口腔内の病原体であることから、対照群として癌でない人の口腔から分離された81株のFusobacterium株を含めた。これらの口腔菌株は、American Type Culture Collection（ATCC）とKorean Collection for Oral Microbiology（KCOM）のリポジトリから入手した。PacBioロングリード1分子リアルタイム18シークエンシングを用いて、146のユニークなFusobacterium株について、エピジェネティックメチロームに対応する完全なクローズドゲノムを作成した（図1a、補足表1および2）。FnはCRC腫瘍で最も頻繁に検出される種である2,3ので、我々はこれらの55のCRC関連と80の口腔関連のFnゲノムの比較に分析を集中した。
図1：Fnニッチの特徴。
図1
a, Fusobacterium株コレクション（n = 146）の概略図とユニークな株のシーケンス戦略。SMRT、1分子リアルタイムシーケンス。 b、CRCニッチ（オレンジ）および口腔ニッチ（青）内のFusobacteriumゲノムの割合を種ごとにサブセットしたカラムグラフ。挿入図は、Fn以外のすべてのFusobacterium種（Fnec, F. necrophorum; Fu, F. ulcerans; Fp, F. pseudoperiodonticum; Fc, F. canifelinum; Fv, F. varium）を示している。Anvi'o21遺伝子クラスター（GC）有病率は、CRC関連株と口腔関連株の両方で保存されているコア（95％以上）、アクセサリー（5％以上95％未満）、レア（5％未満）の特徴を定義するために使用した（コレクションのコア、コレクション内の全株で95％以上；コレクションのクラウド、コレクション内の全株で5％以上95％未満；コレクションのレア、コレクション内の全株で5％未満）。d,CRC関連および口腔関連Fnゲノムにおけるニッチに富む遺伝子クラスターの割合。プロットボックスは25パーセンタイル、中央値、75パーセンタイルを示す。e,ニッチに富む遺伝子クラスターのKofamKOALA KEGGオルソログ解析27。 f,CRCおよび口腔ニッチ内のFnゲノムの割合を亜種ごとにグループ化したカラムグラフ。統計解析は2標本z検定（両側検定）を用いて行った。NS、有意でない。 g、正規のFn病原性因子（fadA（参考文献38,39,42）、fap2（参考文献34）、fplA（参考文献33）、radD（参考文献36,62）、aim1（参考文献35）、cmpA（参考文献36,62）、aim1（参考文献35））の遺伝子有無ヒートマップ。 35), cmpA (ref. 37) and fusolisin32)をFn亜種間で比較し、各列は個々のゲノム(Fna n = 75, Fnn n = 17, Fnp n = 33, Fnv n = 10)を表す。ヒートマップはrpoB遺伝子ベースの系統樹を用いて整理されている。各ゲノムについて、木の端点はニッチ起源（CRC（オレンジ）；経口（青））を示し、棒の色はFn亜種（Fna（赤）；Fnn（金）；Fnp（紫）；Fnv（茶））を示す。aの図はBioRender.comを用いて作成した。
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ヒトのCRC腫瘍に存在するFn株は、ヒトの口腔に由来すると予測されているが19,20、癌でない人の下部消化管（GI）微生物叢ではまれなメンバーであることから1、CRCに関連するFn株は、ヒトのCRC腫瘍でのコロニー形成を促進する遺伝的レパートリーをさらに持っていると考えられた。これを検証するために、我々は微生物パンゲノミクス21のためのオミックスデータ解析・可視化プラットフォーム（Anvi'o）ワークフローを用いて、135のFnゲノムを調べた。パンゲノミクス解析は、ある生物種に存在するすべての遺伝子（「パンゲノム」）を同定し、ほとんどのメンバー間で保存されている遺伝子内容（「コアゲノム」）と、メンバーのサブセット間で共有されている遺伝子内容（「アクセサリーゲノム」）を識別する22,23。サンプリングされたFnゲノムの数が増えるにつれて、アクセサリーゲノムのサイズが大きくなることが観察され、Fnがオープンなパンゲノムを持つという以前の提案を裏付けている24 (Extended Data Fig. 1a)。CRC（n=55）と口腔（n=80）ゲノム間の不均一なサンプリング25を考慮するため、ニッチに基づいて解析をサブセット化したところ、CRCに関連するFn株は口腔に関連する株に比べてアクセサリーゲノムが小さいことがわかった（図1c、Extended Data図1bおよび補足表1）。機能濃縮解析26により、CRC株と口腔内株でそれぞれ483個と241個の遺伝子クラスターが有意に濃縮（q < 0.05）されていることが同定された（図1dおよび補足表3）。ニッチに濃縮された724の遺伝子クラスターについて、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）オーソログ解析27を行った結果、マッピングされた遺伝子クラスター（31.2%）は、推定される代謝機能やパスウェイに主に関与していることが明らかになった（図1eおよび補足表3）。
これまでに発表された直交アプローチを用いた研究では、CRC患者の腫瘍組織と炎症性腸疾患患者の粘膜生検標本28,29（IBD）において、Fn亜種の分布に差があることが観察されている。4つのFn亜種間には十分な遺伝的異質性があり、別種への再分類が提唱されているので30、私たちは解析の解像度を亜種レベルまで高めた（Fna、Fn subspecies nucleatum（Fnn）、Fn subspecies polymorphum（Fnp）、Fn subspecies vincentii（Fnv）；Methods）。CRCにおけるFnの寄与を明らかにしようとする研究は、口腔内分離株であるFnn ATCC 25586（文献7）、泌尿生殖器分離株であるFnn ATCC 23726（文献20,31）、およびIBD患者からの分離株であるFna 7_1（文献29）をモデル株として主に行われていることは注目に値する。ここで、ニッチ別のFn亜種の割合を解析したところ、4つのFn亜種のうち、FnaのみがCRCニッチと有意に関連しており（二標本z検定、両側検定、P = 0.0232；図1f）、先行研究28を検証するものであったが、Fnnは口腔ニッチに有意に濃縮されていた（二標本z検定、両側検定、P = 0.00932；図1f）。したがって、CRCニッチにおけるコロニー形成や病原性に関連する遺伝的因子のレパートリーは、Fnnモデル株では完全には表現されないだろうと推論したところ、実際にFnn ATCC 25586にはCRCに濃縮された遺伝子クラスターが17.60％しか含まれていないことが示された（補足表3）。このことは、マウスモデルで大腸腫瘍を誘発することが示されているFna 7_1のようなFna株をメカニズム研究に使用することを支持する3。Fn亜種のパンゲノムを比較すると、Fnaのコアゲノムは他の亜種と比較して最も小さく、Fnaの遺伝的不均一性がさらに解明されていないことが示唆された（Extended Data Fig.1c）。
FnaはCRC腫瘍ニッチに濃縮されていることから、宿主のコロニー形成に重要であると以前に報告されたFn病原性因子が、他のFn亜種よりもFnaに多く存在するかどうかを検証した。FnのVa型自己トランスポーター病原性因子には、宿主組織を損傷し免疫エフェクターを不活性化するセリンプロテアーゼであるfusolisin32、宿主のホスホイノシグナル脂質に結合するホスホリパーゼ自己トランスポーターであるFplA（文献33）、宿主細胞または他の細菌種とのFnの相互作用を媒介するFap2（文献34）、Aim1（文献35）、RadD（文献36）およびCmpA（文献37）アドヘシンなどが含まれる。CRCにおけるfplA、aim1、radD、およびcmpAの役割はまだ不明であるため、包括的な解析を確実にするために、Fnゲノムコレクション全体でこれらのビルレンス因子の存在を照会した。さらなる接着因子FadA（文献38,39）は、Fnの宿主上皮細胞への接着と浸潤を媒介し40,41、最近さらに2つのFadAホモログが同定された42。以前、限られた数のFusobacteriumゲノムにおけるfadAの分布が解析され、受動的に侵入する種にはfadAが存在せず、高度に侵入する種では発生率が高いことが示唆された13が、この分布はin vivoの侵入アッセイ13,38,42,43と必ずしも一致しない。fplAとfadAはFnにおいてよく保存されているが、それらの塩基配列とアミノ酸配列はFnの亜種によって分離しており、おそらく宿主リガンドとの相互作用が変化していることを示している（Extended Data Fig.） 我々の結果は、これらの正統的な病原性因子のいずれも、他のFn亜種と比較してFnaと有意に関連していないことを示しており、CRCにおけるFnaの濃縮を促進する未知の遺伝的因子が追加されていることを示唆している（Extended Data Fig.） しかしながら、Fna株のサブセットにはfap2、cmpA、fusolisinが欠如していることが観察され、rpoB遺伝子解析の結果、これらのFna株は別個のFnaクレードを形成しているようであった（図1g）。
CRCニッチに濃縮されたFnaクレード
Fna株が2つの異なるクレードを形成しているという観察をさらに検討するために、Fn亜種タイピングに以前から用いられているハウスキーピング遺伝子の系統樹を比較した28,44。これらの単一マーカー遺伝子の解析から、2つの異なるFnaクレードが存在するという観察が支持され、Fnaクレード1（Fna C1）とFnaクレード2（Fna C2）と呼ぶことにした。これらのシングルマーカー遺伝子を超えて、Fnaクレード間のゲノムワイドな違いは、kSNP45を参照しない全ゲノム系統樹によって支持されている（図2a）。Fna C1とFna C2の関連性を定量化するために、ゲノム間の類似性のパーセンテージを測定する確立された指標である平均ヌクレオチド同一性（ANI）を、確立された95%の種の閾値と比較した46。Fnaクレード間のANIは91.61%から93.11%で、他のFn亜種間のANIと同等であった（図2b、補足表4と5）。さらに、Genes in Genomes-Map（GiG-map）ツールを用いてFnaゲノムに存在するタンパク質コード遺伝子のパターンを可視化したところ、Fna C1とFna C2にはそれぞれ異なるタンパク質コード遺伝子が存在することがわかった（図2c）。これは、Anvi'o遺伝子クラスターの有無の主成分分析（PCA）によっても裏付けられた（図2d）。特に、使用頻度の高いFna 7_1株は、Fna C2株とグループ化している（Extended Data Fig.2b）。
図2：Fnaクラードの遺伝学的およびエピジェネティックな特徴。
図2
a, kSNP45最尤全ゲノム系統樹。各Fnゲノム（n = 135）について、木の端点はニッチ起源（CRC（オレンジ）；経口（青））を示し、棒の色はFn亜種（Fna（赤）；Fnn（金）；Fnp（紫）；Fnv（茶））を示す。Fnaの中で、背景色はFnaクレード（Fna C1（緑）；Fna C2（ラベンダー））を示す。 b, ANIマトリックスのクラスター化デンドログラム。棒の色はFn亜種（Fna（赤）；Fnn（金）；Fnp（紫）；Fnv（茶））を示す。Fnaクレードは緑とラベンダーのボックスでハイライトされている。ANI値は補足表4と5に報告されている。 c, Fnゲノム全体のタンパク質コード遺伝子の含有量をGiG-mapで可視化したもの。上のバーの色はFn亜種（Fna（赤）；Fnn（金）；Fnp（紫）；Fnv（茶））を示し、ボックスの色はFnaクレード（Fna C1（緑）；Fna C2（ラベンダー））を示す。右の挿入図は、Fna C1とFna C2の間で異なるタンパク質コード遺伝子群を強調している。インタラクティブなGiG-mapデータセットはhttps://fredhutch.github.io/fusopangea/。 d, 各ゲノムにおけるAnvi'o遺伝子クラスターの有無によるPCA。色はFn亜種とFnaクレード（Fnn（金色）；Fnp（紫色）；Fnv（茶色）；Fna C1（緑色）；Fna C2（ラベンダー色））を示す。e,左：Fnaゲノム全体のメチル修飾塩基配列のPCA。楕円は95%信頼度で描かれている。PCAバイプロットのオーバーレイは、Fnaクレード分岐を駆動している上位5つのヌクレオチドモチーフを示している。右：Fnaクレード全体における各モチーフの分布を示す表。色はFnaクレード（Fna C1（緑）；Fna C2（ラベンダー））を示す。 f, Fnaクレード（Fna C1（緑）；Fna C2（ラベンダー））ごとにサブセットしたFna CRC関連ゲノムとFna経口関連ゲノムの割合を示す列グラフ。統計解析は2標本z検定（両側検定）を用いて行った。NSは有意ではない。fの図はBioRender.comを用いて作成した。
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そこで、Fnaの遺伝学的、エピジェネティック、生態学的特性を、遺伝学的に異なる2つのクレードとして再評価した。Fnaクレードのパンゲノムを比較した結果、Fna C1とFna C2のコアゲノムのサイズはほぼ同じであったが、Fna C2の方がアクセサリーゲノムのサイズが大きかった（Extended Data Fig. これと一致して、個々のゲノムのサイズと含有量を比較したところ、Fna C1株と比較して、Fna C2株は染色体のサイズが有意に大きく（Welchのt検定、両側検定、P < 0.00001、Extended Data Fig. FnaメチロームのPCA解析から、Fna C1とFna C2もエピジェネティックに異なることが示された（図2e）。このエピジェネティックな分岐に最も影響を与えているメチル修飾DNAモチーフは、GTNm6AC（100% Fna C1、0% Fna C2）、GCm6AG（100% Fna C1、0% Fna C2）、Gm6ANTC（0% Fna C1、63% Fna C2；図2eおよび補足表7）である。いずれのFnaクレードも口腔内に存在し有意差はないが、Fna C2のみがCRCニッチと有意に関連している（二標本z検定、両側検定、P < 0.00001；図2f）。我々はさらに、CRC47患者の腫瘍組織と唾液のペアサンプルから得られた、一般に入手可能な16S rRNA遺伝子配列決定データを用いて、この観察を検証した。Fnaクレードレベルの解像度を得るために、Fnaクレード特異的アンプリコン配列バリアントを同定した48（方法と補足表8）。我々の観察を支持するデータとして、Fna C2はFna C1と比較して腫瘍サンプルで有意に濃縮されていることが示された（t検定、ペア、P = 0.047；拡張データ図2g）。しかし、ペアになった口腔サンプルでは、Fnaクレード間に統計学的有意差は見られなかったことから、CRC患者の口腔内には両方のFnaクレードが存在するが、腫瘍ニッチではFna C2のみが濃縮されていることが示された（Extended Data Fig.）
ヒト下部消化管におけるFna C2の濃縮
パンゲノム解析により、Fnaは2つの異なるクレードから構成されているが、CRCニッチではFna C2のみが濃縮されていることが明らかになった。このニッチにおけるFna C1の濃度が低いのは、腫瘍コロニー形成能が乏しいか、Fna C2が持つ病原性や腫瘍支持因子が本質的に欠如しているか、あるいはFna C1が免疫クリアランスを回避できないためである可能性がある。これらの可能性を検証し、Fnaクレードに特異的な遺伝的要因を明らかにするために、我々は75のFnaゲノム（24のFna C1、51のFna C2）全てについて包括的なFnaクレード間比較解析を行った。radD、aim1、fadA2によってコードされる接着剤を含むFnの正統的な病原性因子は、Fna C2と比較してFna C1で有意に濃縮されていた（二標本z検定、両側検定、P < 0.00001；図1gおよび3a）。逆に、前述のように、fap2、cmpA、fusolisinはFna C1には存在せず、Fna C2と有意に関連している（二標本z検定、両側検定、P < 0.00001；図1gと3a）。CRCにおけるFap2の上皮31および免疫細胞49との相互作用が報告されていることから、Fna C2との関連は、このニッチにおけるFap2の接着および浸潤の可能性の増大を裏付けている。各クレードのFna株をヒト結腸癌細胞株（HCT116）と共培養した結果、Fna C1株と比較してFna C2株は癌上皮細胞への浸潤レベルが有意に高く（図3bおよびExtended Data図3a,b；Welchのt検定、両側検定、P = 0.0113）、個々の株の浸潤能および／または空気耐性に差があることが示された（Extended Data図3c）。さらに、Fnaクレードは形態学的に異なっており、Fna C2細胞はFna C1細胞よりも有意に長く（Fna C1：平均2.01μm、Fna C2：平均5.26μm）、薄い（Fna C1：平均0.39μm、Fna C2：平均0.33μm）（Extended Data Fig.） 細菌の形態は、宿主ニッチのコロニー形成や宿主の防御に対する感受性に影響を与える可能性があるため50、Fnaクレード細胞間の物理的な違いは注目に値する。
図3：Fnaクレード間の比較分析。
図3
a,Fn病原性因子を含むFnaゲノムの割合をクレードごとにサブセットした遺伝子有無の列グラフ（Fna C1（緑）；Fna C2（ラベンダー））。b, 左：代表的なFna C1（緑）株またはFna C2（ラベンダー）株と共培養した結腸癌上皮細胞（HCT116；灰色）の計算共焦点解析。スケールバー、4μm。右：細胞内にFnaを持つHCT116細胞のパーセンテージを示す棒グラフ。データは平均値±s.e.m.でプロットされている。統計解析はWelchのt検定（両側検定）を用いて行った。各ノードは遺伝子群を表し、シンテニックノードは隣接する遺伝子を表し、大きさはFnaゲノム間の相対的な存在を示し、色はパンゲノムの分割を表す（Fnaコア（赤）；Fna C1アクセサリーゲノム（緑）；Fna C2アクセサリーゲノム（ラベンダー））。白い矢印（左パネル）と長方形（右パネル）は、Fna C2関連推定eutオペロンとpduオペロンを示す。インタラクティブなPPanGGOLiNマップはhttps://fredhutch.github.io/fusopangea/。 e,f,代表的なFna C2株であるSB010において、EA（e）または1,2-PD（f）に曝露した場合、未曝露のSB010コントロールと比較して、差次的に発現した遺伝子（log2[fold change] ≥ 0.58および≤-0.58、-log10[P value] ≥ 1.30）。SB010固有の内容を強調するため、代表的なFna C1株であるKCOM 3764の同じ曝露条件下でも差次的に発現した遺伝子は削除した（Extended Data Fig.） 縦の点線は有意な遺伝子発現の閾値を示し、log2[fold change] ≥ 0.58および≤-0.58と定義した。統計解析はglmQLFTest（両側）を用いて行った。データポイントの色は、Fnaコア（赤）、Fna C1アクセサリー（緑）、Fna C2アクセサリー（ラベンダー）、またはFnaクラウド（黒；全Fna株に5％以上95％未満存在）遺伝子を示す。星印はeutおよびpduオペロン遺伝子を示す。
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私たちは、Fnaクレード固有のゲノムの内容を明らかにすることで、Fna C2がヒトの大腸ニッチに移行し、その中で生存することを可能にする、これまで知られていなかった遺伝的要因が明らかになると考えた。Fnaクレード間の優勢な遺伝的相違は、Fna C2が栄養掃去機構を高め、代謝能を向上させていることと一致している（拡張データ図3eおよび補足表9）。機能的に関連する細菌遺伝子はしばしば共制御ユニット（オペロン）を形成するため、我々はPartitioned PanGenome Graph of Linked Neighbors（PPanGGOLiN）51ツールを導入し、Fnaクレード固有の遺伝因子が推定オペロンを形成しているかどうかを評価した（図3c）。Anvi'o解析と一致して、PPanGGOLiN解析では、Fna C2シンテニックブロックが主に代謝機構と関連していることが示された（補足表10）。したがって、CRCニッチへのFna C2の病態適応は多因子的であり、正統的なFn病原性因子に加えて、代謝能力の強化によって促進される可能性がある。
我々のFnaクレード間パンゲノミクスアプローチを検証するために、エタノールアミン（EA）代謝（eut）と1,2-プロパンジオール（1,2-PD）代謝（pdu；図3d）に一致する2つのFna C2関連推定オペロンに注目した。これらのオペロンは、Fna C2特異的遺伝子量の約20%に寄与している（補足表10）。腸内病原菌は、EAと1,2-PDの直接代謝によって競争上の優位性を得るだけでなく、腸管特異性も利用している。eutとpduを介した感知は、病原性のグローバルな制御因子を活性化し、腸管ニッチ適応と一致する転写プロファイルを誘導する52。CRC患者（n = 627）と健常人（n = 619）の公開コホートから得られた便メタゲノムデータセットの解析から、eutおよびpduオペロンはCRC患者において有意に濃縮されていることが示された（二標本z検定、両側検定、eut P < 0.00001, pdu P < 0.00001; Extended Data Fig.）
Fna C2ではeutとpduが保存され、Fna C1では保存されていないことから、これらの腸関連代謝産物に暴露された後のFna細胞のグローバルなトランスクリプトーム応答を評価した。代表的なFna C1株とFna C2株をEAまたは1,2-PDに暴露した後のRNA配列決定から、両Fnaクレードともトランスクリプトームが有意に変化することが示された（Extended Data Fig.） Fna C1はeutとpduの両方を欠損していることから、Fna C1におけるEAまたは1,2-PD曝露後の有意なトランスクリプトーム変化は、これらのオペロンとは無関係であると考えられた。そこで、減法的アプローチにより、Fna C1細胞では差次的に発現（t検定、両側検定、P>0.05）しなかったFna C2細胞で差次的に発現（t検定、両側検定、P>0.05）した遺伝子に注目した。この結果から、Fna C2細胞では、eut遺伝子とpdu遺伝子がそれぞれEAと1,2-PDに応答して転写上昇することが示された（図3e,f）。
さらに、EAまたは1,2-PDに暴露したFna C2細胞は、Fn病原性因子を含むFna C2関連遺伝子の13.02%を有意に発現上昇させた。両クレードに存在するが、radDとaim1はFna C1細胞ではなくFna C2細胞においてEA存在下でアップレギュレートされた（図3e）。Fna C2細胞に特異的に存在する病原性因子は、Fna C2細胞がEA（cmpA、fusolisin、fap2）または1,2-PD（fap2；図3e,f）に暴露されると、さらにアップレギュレートされる。ヒトの上皮細胞との相互作用に重要であることが知られているFna C2関連遺伝子や病原性因子のアップレギュレーションは、ヒトの消化管への移行後、これらの分子を感知することで、口腔外ニッチ適応と一致するFna C2の転写プロファイルが誘導される可能性を示唆している。
このことから、Fna C2がどのようにして口腔外の腫瘍ニッチに移行しているのかも再考することになった。これまでの研究から、口腔内のフソバクテリアは、日常的な衛生習慣や歯科処置などの活動によって引き起こされる一過性の菌血症の際に、血流を介してCRC腫瘍に移動することが示唆されている20。転写活性のあるeutオペロンとpduオペロンが同定されたことから、Fna C2が消化管を直接通過し、その後内腔を通ってCRC腫瘍に浸潤する経路も考えられる。しかし、消化管通過が実行可能な播種経路であるためには、Fna C2は胃で遭遇する極度の酸ストレス（pH1.5-3.5；Extended Data Fig.） 優先的な増殖pHを評価したところ、両Fnaクロードは4.5以下のpHに敏感であることが確認された（Extended Data図5b）。pH5.5から8.5では、Fna C2株はFna C1株に比べて有意に高い増殖活性を示し、pH7で最大の増殖活性を示した（Extended Data Fig.） 塩基性条件下（pH9.5-10）では、Fna C1株はFna C2株に比べて有意に高い増殖活性を示し、pH10で最大の増殖活性を示した（Extended Data Fig.） また、パンゲノム解析により、すべてのFna C2に保存されているが、Fna C1には存在しないグルタミン酸依存性酸耐性（GDAR）推定系が明らかになった（Extended Data Fig.） 病原性腸内細菌と常在腸内細菌に見られるGDARシステムは、最も強力な酸抵抗性メカニズムのひとつであり53、このシステムがpH≦3で作動するために必要な成分はグルタミン酸だけである（Extended Data Fig.） 比色pH変化アッセイを用いて、Fna C1株とFna C2株存在下で、グルタミン酸からγ-アミノ酪酸への変換を試験したところ、Fna C2株存在下でこの変換レベルが有意に高いことがわかった（Extended Data Fig.）
胃通過時のpHストレスの影響をさらに模倣するために、Fna株をpH 3の模擬胃液に暴露した。しかし、補充したグルタミン酸の存在下では、Fna C2は長時間（約60分間）生存し、GDARを欠くFna C1では観察されなかった（Extended Data Fig.） 便メタゲノミックデータセットの解析から、gdarオペロンは健常人と比較してCRC患者で有意に濃縮されていることが示された（二標本z検定、両側検定、P < 0.00001；拡張データ図5h）。したがって、活性型eutおよびpduシステムに加えて、pH嗜好性および耐酸性メカニズムの違いが、Fna C2が消化管および腫瘍ニッチにアクセスする能力に寄与している可能性がある。
Fna C2は腸の腫瘍形成に影響する
Fna C2に濃縮された遺伝子クラスターは、主に代謝能の亢進と関連していたため（Extended Data Fig.3eおよび補足表10）、デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎ApcMin+/-マウスCRCモデル54のFna処理が、in vivoで腸腫瘍形成と代謝経路に影響を及ぼすかどうかを調べようとした（図4a）。Fnaクレードに特異的なアクセサリー遺伝子の割合を増やすため（Extended Data Fig. Fna C1ミックス、Fna C2ミックスまたはビヒクルコントロールを単回経口投与したところ、Fna C1およびビヒクルコントロールと比較して、Fna C2投与マウスでは腸腺腫の数が有意に増加した（Extended Data Fig. 6a,b；分散分析（ANOVA）、P = 0.0065およびP = 0.0069、それぞれ）、特に大腸において（図4b；ANOVA、P = 0.0070およびP = 0.0009、それぞれ；Extended Data Fig.） Fna C1投与マウスとビヒクルコントロールマウスとの間には、腺腫負荷に有意差はなかった。低レベルのFnは、試験期間中一貫して検出されなかった（Extended Data Fig.6d）。各投与群の腸組織について液体クロマトグラフィー質量分析計によるグローバルメタボロミクスを実施し、代謝物の比較解析を行った（補足表16）。測定された腸内代謝物の部分最小二乗判別分析により、Fna C2投与マウスは他の投与群とは異なるクラスターを形成しており、代謝プロファイルの違いが示唆された。しかし、Fna C1投与マウスとビヒクルコントロールマウスの腸内代謝物は、より類似した代謝物プロファイルを示し、一緒にクラスタリングされた（図4c）。
図4：腸管腫瘍形成と代謝に対するFna C2の影響。
図4
a, 6-8週齢のApcMin+/-マウスにストレプトマイシンおよびデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与を行い、それぞれ本来のマイクロバイオームを変化させ、大腸炎を誘発した研究の概略図。マウスには、ビヒクルコントロール（arm 1）、または3つの代表的なFna C1株（arm 2）とFna C2株（arm 3）の混合株を経口投与した。Fnaクレードに特異的なアクセサリー遺伝子の割合を高めるため、混合株を用いた（Extended Data Fig.） マウスは、15-17週齢に達した嘔吐後6週齢の終点までモニターされた。 b, 処理群別の大腸腺腫数を示すプロット（ビヒクル対照（灰色）；Fna C1処理（緑色）；Fna C2処理（ラベンダー色）；各群n = 8マウス）。データは平均値±s.e.m.でプロットした。統計解析は一元配置分散分析を用いて行った。 c, 検出された腸内代謝物の部分最小二乗判別分析（n = 1,296）。色は処理群（ビヒクル対照（グレー）；Fna C1処理（緑）；Fna C2処理（ラベンダー））を表す。aの図はBioRender.comを用いて作成した。
出典データ
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測定された1,296代謝物（拡張データ図7a-cおよび補足表16）のうち、比較解析により、Fna C1投与マウスおよびビヒクル対照マウスと比較して、Fna C2投与マウスではグルタチオン代謝およびγ-グルタミルアミノ酸経路が有意に濃縮されていることが示された（拡張データ図7a-c、8aおよび9、補足表17）。具体的には、システインやγ-グルタミルシステインを含むγ-グルタミル-システイニル-グリシン（GSH）合成前駆体レベルの有意な上昇、還元型グルタチオン（GSH）レベルの低下、GSH分解産物である5-オキソプロリンレベルの有意な上昇が観察された（Extended Data Figs.） γ-グルタミルトランスペプチダーゼ存在下での還元型グルタチオンからのγ-グルタミルアミノ酸生成と一致して、γ-グルタミルアミノ酸、システイン、グリシン、システイニルグリシンのレベル上昇も観察された（Extended Data Fig.） グルタチオンのGSH欠乏、あるいは還元型（GSH）に対する酸化型（GSSG）の比率の上昇は、酸化ストレス、炎症、腫瘍進行に対する哺乳類細胞の脆弱性を高める55。Fna C2投与マウスのGSSG/GSH比は、コントロール群およびFna C1投与群に比べ、それぞれ3.5倍および3.0倍と有意に増加し、酸化ストレスの増加を示唆した（Extended Data Fig.） γ-グルタミルトランスペプチダーゼによるGSHの代謝は、酸化促進作用を発揮することが研究で証明されている。がん細胞では、これが内因性の活性酸素種の供給源となり、酸化ストレスの持続を促進し、ゲノムの不安定性を助長する56,57。これと一致して、Fna C2投与マウスでは、シスチンやシステイングルタチオンジスルフィドを含む他の酸化ストレスマーカーのレベルが有意に上昇し、プトレシン、スペルミジン、スペルミンを含む活性酸素を消去するポリアミンのレベルが有意に低下していることが観察された（Extended Data Figs 8bと9）。注目すべきことに、我々のグループによる最近の研究で、フソバクテリウムは、がんにおけるゲノムの不安定性の最も一般的な形態のひとつである、重度の染色体異常10を有する上皮細胞と主に関連していることが示された。
酸化ストレスに対抗する役割に加え、ポリアミンはマクロファージのサイトカイン合成を阻害することで炎症を抑制することができる58。炎症の亢進と一致して、Fna C2を投与したマウスでは、N-モノメチルアルギニンとジメチルアルギニンの濃度が、他の治療群と比べて有意に高いことが観察された（Extended Data Fig.） これらの代謝産物はいずれも、抗炎症物質である一酸化窒素の合成を阻害する。さらに、プロスタグランジンA2、N-パルミトイルスフィンゴシン、N-パルミトイルスフィンガジエニンを含む、炎症性プロスタグランジンとセラミドのレベルが有意に高いことが観察された（Extended Data Fig.） セラミドはまた、がん細胞によって代謝され、腫瘍細胞のアポトーシスと増殖を抑制する59。様々な癌において癌細胞の増殖と転移を促進する他の代謝産物には、エイコサノイドがあり、Fna C1投与マウスやビヒクル対照マウスと比較して、Fna C2投与マウスでは同様に有意に増加している（Extended Data Figs.） これには、アラキドン酸のCOX2（PTGS2としても知られる）代謝による6-ケトプロスタグランジンF1-α（Extended Data Fig. 注目すべきことに、COX2はFn関連ヒト大腸腫瘍で最も発現が上昇した遺伝子の一つであると以前に報告されている3。全体として、われわれの結果は、Fna C1ではなく、Fna C2が代謝的に腸内環境を発癌促進条件へと変化させる能力を持つことを示している。
ヒトCRCコホートにおけるFna C2の濃縮
Fna C2株は、CRCニッチにおいて有意に濃縮され（図2f）、Fna C1株と比較して、我々のマウスモデルにおいて腸管腫瘍形成を増加させる（図4bおよび拡張データ図6a-c）ことから、次に、培養に依存しないアプローチにより、ヒト組織および便検体におけるこれらのFnaクレードの有病率と存在量を明らかにしようとした。治療歴のないCRC患者116人（CRCコホート1）の切除腫瘍組織と、これらの患者のうち62人の隣接正常組織について、細菌の16S rRNA遺伝子配列決定を行った（補足表18）。腫瘍組織と隣接する正常組織（n = 62患者）の間で、異なるFusobacterium種の相対存在量の割合を比較したところ、隣接する正常組織と比較して腫瘍組織で有意に濃縮されたFusobacterium種はFnだけであることが観察され（図5aおよび補足表19）、以前の報告2,60を支持した（t検定、ペア、P = 0.0022）。しかしながら、Fna C1、Fna C2、非Fna亜種のFnを含む、より高い分類学的解像度でFnを分離するためにFnaクレード特異的アンプリコン配列変異体を用いると、Fna C2のみが、対になった正常組織と比較して腫瘍で有意に濃縮されることが示された（図5a、補足表8と19；t検定、対、P = 0.0093）。FnのFna C1亜種も非Fna亜種も有意に濃縮されていないことから、ヒトCRC腫瘍におけるFnの濃縮は、以前に報告されたFna C2に特異的であることが示唆される。さらに、2つの独立した患者コホート（CRCコホート1 n = 116およびCRCコホート2 n = 86）において、CRC腫瘍組織内では、Fna C1に比べてFna C2が有意に濃縮されていることが示され（図5b、補足表20および21；t検定、対、コホート1 P = 0.0009、コホート2 P = 0.0014）、Fna株レベルでの観察結果を裏付けている（図2f）。
図5：ヒト組織マイクロバイオームおよび便メタゲノム検体中のFn。
図5
a,腫瘍組織（橙色）と隣接する正常組織（黒色）の微生物16S rRNA遺伝子配列決定を用いて、Fusobacterium種（Fg, F. gonidiaformans; Fh, F. hwasookii; Fm, F. mortiferum; Fnavi, F. naviforme; 左プロット）、およびFn亜種とFnaクレード（右プロット）の相対存在量を示すプロット（n = 62人のCRC患者）。Fnaクレードの解像度を得るために、アンプリコン配列のバリアントを使用した（Extended Data図10および補足表8）。データは平均値±s.e.m.でプロットされている。統計解析は、片側t検定（ペア）を用いて行った。 b, 2つの独立したコホート（コホート1（n=116）本研究；コホート2（n=86）BioProject PRJNA362951）から得られた患者原発性大腸腫瘍組織内のFna C1（緑）とFna C2（ラベンダー）の相対存在量を示すプロット。データは平均値±s.e.m.でプロットされている。統計解析は片側t検定、ペアーを用いて行われた。c, CRC患者と健常人の便メタゲノムデータにおけるFna C1とFna C2の検出。左のプロットは、全CRCサンプル（n = 627）と健常人サンプル（n = 619）について、標準化平均差のメタ解析とMetaPhlAn4（文献63）の種レベルのゲノムビン存在量に対するランダム効果モデルを用いて計算したFna C1（緑）とFna C2（ラベンダー）のプールされた効果量を示している。右のプロットは、同じアプローチで計算したFna C1とFna C2の効果量を示しているが、ここではFna C1がFna C2と共起しているサンプルは除外している。データは平均値±s.e.m.でプロットした。統計的有意性はWald検定（両側検定）で評価した。d,CRC患者の便メタゲノムにおけるFna C1とFna C2の存在。棒グラフはCRC患者（n = 627）の個々の便サンプルを示し、Fna C1およびFna C2の検出別に色分けされている（Fna C1検出（緑）；Fna C2検出（ラベンダー）；Fna未検出（グレー））。下の括弧は、Fna C1が単独で発生した便サンプル数（n = 5）、Fna C2が単独で発生した便サンプル数（n = 147）、Fnaクレードが共発生した便サンプル数（n = 31）、またはFnaクレードが検出されなかった便サンプル数（n = 444）を示す。a-cの図はBioRender.comを用いて作成した。
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次に、CRC患者と健常人の間でFnaクレードの有病率が異なるかどうかを調べた。そのために、CRC患者（n=627）と健常人（n=619；Extended Data Fig.） FnaはCRC患者の便サンプルの29.2％、健常人の便サンプルの4.8％で検出された（補足表23）。Fna C1とFna C2のランダム効果モデルによる標準化平均差のメタアナリシスでは、両FnaクレードともCRCと関連する有意なプールされたエフェクトサイズがあることが示された（Fna C1のエフェクトサイズ＝0.21、95％信頼区間（0.09、0.32）、P＝4.45×10-4；Fna C2のエフェクトサイズ＝0.45、95％信頼区間（0.34、0.56）、P＝5.55×10-15；図5c、拡張データ図11、補足表24）。しかしながら、Fna C2の効果量はFna C1の効果量よりも大きかった。注目すべきは、Fna C2の共発現がない場合、Fna C1はCRCと有意に関連しなかったことである（図5c、拡張データ図11、補足表25）。CRCに濃縮された微生物間の相乗的相互作用は以前に報告されているが61、Fna C1とFna C2の共存が複合的な病原効果をもたらすかどうかは明らかではない。CRC腫瘍組織における観察（補足表20および21）と同様に、我々のデータは、CRC患者の便中ではFna C1よりもFna C2の方がより多く、豊富であることを示しており（図5dおよび拡張データ図10）、さらにCRC患者の便中では健常人と比較して有意に濃縮された唯一のFnサブグループである（拡張データ図10a）。これらの培養に依存しないヒト検体解析は、Fna C2がCRCに関連する支配的なFnaクレードであるという我々の株レベルのゲノム学的発見を裏付けている（図2）。このことは、Fna C1株と比較してFna C2株の病原性および腫瘍形成能が増大していることを示す、我々のin vitro（図3）およびin vivo（図4）の知見の重要性をさらに強調するものである。
考察
次世代シーケンサーの進歩により、ヒト腫瘍組織内に細菌群集が存在することが明らかになった。がんマイクロバイオーム研究の重要な課題は、腫瘍内の微生物組成の特徴付けにとどまらず、これらの微生物が疾患に寄与しているかどうか、またどのように寄与しているかを明らかにする機能的研究へと移行することである。CRCでは、Fnは健常人の下部消化管ではほとんど検出されないにもかかわらず1、CRC腫瘍マイクロバイオーム内では濃縮されているという事実から、早くから注目され続けてきた2,60。Fn種はヒト口腔微生物叢の正常なメンバーであり、口腔からの菌株がCRC腫瘍の種になると考えられている19,20。しかし、Fnの遺伝的および表現型的な不均一性12,13,14,15が指摘されていることから、ヒト腫瘍に定着し支配的なFn株が、CRCの発症や進行に寄与する明確な遺伝的属性を有しているかどうかという未解決の疑問が生じた。ヒトCRCおよび非癌経口Fn株の大規模培養、塩基配列決定および比較ゲノム解析を通じて、我々はFnのCRCに濃縮された明確な遺伝因子を明らかにした。さらに、これらのCRC濃縮因子は、Fnaの特定のクレード内に優位に存在することを同定した。このことは、Fnaが2つの異なるクレードに分岐していることの発見にも反映されている： 口腔内に限定されるFna C1と、ヒトCRC腫瘍ニッチを支配するFna C2である。注目すべきは、CRC動物モデルにおいて、Fna C2のみが腫瘍を誘発し、酸化ストレスを増加させる方向に腸の代謝を変化させたことである。さらに、Fnaクレード間の比較ゲノム解析により、CRCニッチへのFna C2の病態適応を累積的に生み出す遺伝的要素が明らかになった。Fna C1をFna C2の比較対象グループとして用いることの有用性を踏まえ、我々は、Fnaパンゲノミクスデータセットの探索を可能にするインタラクティブなウェブサイトを作成し、The Fusobacterium Pangenome Atlasと命名した（https://fredhutch.github.io/fusopangea/）。これらの研究結果を総合すると、Fna C2はFnの中でも特に病原性の高いサブグループであり、CRCにおけるメカニズム研究や治療薬設計の主要な焦点となることが明らかとなった。
方法
CRC患者の腫瘍組織からのFusobacterium株の分離
フソバクテリウム菌株は、北米およびヨーロッパのCRC患者から採取した腫瘍組織標本から、既述の方法6で分離した。簡単に述べると、組織切片をメスでミンチにし、7％または10％の脱脂ウマ血液（DHB; Lampire Biological Laboratories, Fisher Scientific）にホサマイシン、バンコマイシン、ノルフロキサシンをそれぞれ3、4、1μg ml-1（Sigma Aldrich）で添加した選択的潔癖性嫌気性寒天（FAA）プレート（Oxoid, Thermo Fisher Scientific）にスプレッドプレーティングした。プレートを37℃の嫌気条件下で培養し（AnaeroGen Gas Generating Systems、Oxoid、Thermo Fisher Scientific）、2日ごとに増殖の有無を検査した。コロニーを摘出し、ストリーク精製した後、16S rRNA遺伝子ユニバーサルプライマー（342Fおよび1492R）を用いて、前述6と同様に選択した細菌コロニーに対してコロニーPCRを実施した。コロニーPCR産物をサンガー配列決定に供し、BLASTnによる微量配列解析で菌種の同一性を確認した。培養物はトリプティックソイブロス（TSB）と40％グリセロールに懸濁し、-80℃で保存した。
Korean Collection for Oral MicrobiologyおよびATCCアンプルからのFusobacterium株の分離
Korean Collection for Oral Microbiology（KCOM）コレクションからのフソバクテリウム株は、前述44 のように口腔から分離した。ATCCおよびKCOMのアンプルから分離した菌株を、ビタミンK1および5％脱脂ヒツジ血（Becton Dickinson社製）を添加したSchaedler寒天プレート、および7％DHB（Lampire Biological Laboratories社製、Fisher Scientific社製）を添加したFAAプレート（Oxoid社製、Thermo Fisher Scientific社製）上で培養した。プレートはBactron600嫌気チャンバー（Sheldon Manufacturing社製）で37℃、5～7日間培養した。培養液は、ビタミンK1と30％グリセロールを加えたシェードラー・ブロスに懸濁し、-80℃で保存した。
高分子ゲノムDNA抽出
フソバクテリウム株は、10％DHB（Lampire Biological Laboratories、Fisher Scientific）を添加したFAAプレート（Oxoid、Thermo Fisher Scientific）上で、37℃の嫌気条件下（AnaeroGen Gas Generating Systems、Oxoid、Thermo Fisher Scientific）で48～72時間培養し、CRC関連株用のプレートには、さらにホサマイシン、バンコマイシン、ノルフロキサシンをそれぞれ3、4、1μg ml-1（Sigma Aldrich）で添加した。MasterPure Gram Positive DNA Purification Kit（Epicentre, Lucigen）を用いて高分子量ゲノムDNAを抽出した。2枚のプレートの細胞を1.5mlの1×PBSに懸濁し、遠心分離で回収した。ペレットは製造元の説明書に従って処理されたが、DNAの剪断を防ぐため、試薬の容量を2倍にし、ボルテックス工程を省くなどの修正を加えた。高分子ゲノムDNAは、Qubit蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量した。
PacBio1分子リアルタイムシーケンスとゲノムアセンブリ
ミネソタ大学ゲノミクスセンターのPacBio Sequel装置（Pacific Biosciences社製）またはPacBio Sequel II装置（Pacific Biosciences社製）を用いて、1分子リアルタイムシーケンス18を行った。シーケンスリードはPacific Biosciences社のSMRTAnalysis pipeline v.9.0.0.92188内のMicrobial Assembly pipelineを用いて処理した。必要に応じてFlye assembler v.2.8を用いて追加アセンブルを行った(https://github.com/fenderglass/Flye)。
フソバクテリウム種のタイピング
Fusobacteriumゲノムは種レベルまでサブタイプ分けされ、Fnゲノムはさらに個々のマーカー遺伝子の累積スコアに基づいて亜種レベルまでサブタイプ分けされた。Fusobacterium のタイピングには、16S rRNA 遺伝子、rpoB 遺伝子、亜鉛メタロプロテアーゼ遺伝子など、以前から用いられているマーカー遺伝子を用いた30。それぞれの完全なクローズドゲノムから、まず3つのマーカー遺伝子を個別に解析し、種または亜種の分類を行った。各マーカー遺伝子は単離され、BLASTnを用いて解析され、同一性パーセントでトップヒットしたものが記載された。それぞれの可能性のある種または亜種について、一致する亜種の結果の数を、存在するマーカー遺伝子の数で割った信頼度スコアが計算された。各ゲノムについて、最終的な分類は最も高い信頼度スコアによって決定された。この解析結果を補足表1に示す。系統分類はさらにGTDB-Tk (ref. 64; https://github.com/Ecogenomics/GTDBTk)を用いて検定し、補足表2に示した。
パンゲノム解析
パンゲノム解析は、Anvi'oワークフロー21、PPanGGOLiNツール51およびGiG-mapツール（https://github.com/FredHutch/gig-map）を用いて、135のFnゲノムのFnパンゲノムを特徴付け、51のFnaゲノムのFnaパンゲノムを特徴付けた。Fnゲノムについては、Anvi'oの閾値をminbit 0.9、MCL 2に設定し、PPanGGOLiNの閾値を同一性90%、カバレッジ90%に設定した。Fnaゲノムでは、Anvi'oのしきい値をminbit 0.9、MCL 7に設定し、PPanGGOLiNのしきい値を90%の同一性と90%のカバレッジに設定した。両ゲノムセットとも、GiG-mapはデフォルト設定で実行した。PPanGGOLiNのアラインメント機能を用いて、得られたAnvi'o遺伝子クラスターを対応するPPanGGOLiNノードにマッピングした。サンプリングゲノム数の増加に伴うパンゲノムのサイズを評価するために、FnとFna Anvi'o由来のパンゲノムを、それぞれ1〜135ゲノムと1〜75ゲノムから、10,000までの組み合わせで独立にサンプリングするか、さもなければランダムに10,000回サブサンプリングした。このアプローチは、必要に応じてニッチとクレードごとにサブセットされた。
ゲノム樹状図
個々の遺伝子およびタンパク質配列は、MUSCLEクラスタリングアルゴリズムを用いてMEGA X（文献65）でアラインメントされ、そこから最尤デンドログラムが作成された。kSNP3（文献45）のk-merサイズは13で、コアk-merの割合は0.217となり、我々のコレクション中の135のFnゲノムの最尤系統樹を作成するために用いられた。最終的な画像は、interactive tree of life tool, v.5 (ref. 66)を用いて作成した。
Fnカノニカル病原性因子の同定
FnゲノムのコレクションにおけるFn正統性ビルレンス遺伝子の存在を問い合わせるために、我々はOperon Contextualization Across Prokaryotes to Uncover Syntenyツール（https://github.com/FredHutch/octapus）を使用し、同一性のしきい値の最小パーセンテージは60%であった。
Fn遺伝的防御システムとプロファージの同定
Prokaryotic Antiviral Defense Locator67を用い、Phage Search Tool Enhanced Release68,69ツールを用いて、生得的な細菌防御システムの存在を調べた。
PCA
Fn Anvi'o由来の遺伝子含量のPCAは、statsパッケージv.3.6.2のR prcomp関数を用いて、遺伝子クラスター存在-不在マトリックス上で行った。Fnaのメチル化ヌクレオチドモチーフのPCAは、Rのfactoextraパッケージv.1.0.7のPCA関数を用いて、メチル化モチーフの有無行列（補足表7）上で行った。
FnとHCT116の共培養アッセイ
ヒト結腸癌上皮細胞株HCT116はATCCから購入した。この細胞株は認証されていない。マイコプラズマ検査は、MycoProbe Mycoplasma Detection Kit（R＆D Systems）を用いて行った。HCT116細胞は、10%(v/v)ウシ胎児血清(Sigma)を添加したL-グルタミン(Corning)入りマッコイズ5Aで培養し、37℃、5%CO2でインキュベートした。HCT116細胞を、各ウェルの底にガラス製カバースリップ（Nunclon Delta Surface、Thermo Scientific社製）を敷いた6ウェルプレートに1ウェル当たり1.25×106個播種し、16時間接着させた。Fna C1（SB048, KCOM 3363 and KCOM 3764）株およびFna C2（SB001, SB010 and KCOM 2763）株の再懸濁培養液をマッコイズで調製した。細菌膜を5 µg ml-1 FM 4-64FX（Molecular Probes）で染色した。各菌株を100:1の感染倍数でウェル中でHCT116細胞と共培養した。これらの細菌と真核生物の共培養を、5% CO2中、37℃で3時間インキュベートした。各菌株の連続希釈液を調製し、10％DHB（ヘモスタット、フィッシャーサイエンティフィック社製）を添加したFAAプレート（オキソイド、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に各希釈液50μlをプレーティングすることにより、時間（T）＝0、T＝1.5、T＝3時間で細菌の生存率を評価した。プレートをBactron600嫌気チャンバー（Sheldon Manufacturing社製）内で37℃、コロニーを数えるまで2日間培養した。培養後、ウェルをPBSで4回洗浄し、穏やかに振り混ぜながら、付着していない細菌とHCT116細胞を除去した。細胞をPBS中4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定した。固定後、細胞をPBSで3回洗浄し、PBS中0.2%(v/v) Triton X-100で室温で4分間透過処理した。細胞をPBSで3回洗浄した後、NucBlue Fixed Cell Stain ReadyProbes（Invitrogen）とActinGreen 488 ReadyProbes（Invitrogen）をそれぞれ1mlあたり2滴ずつ滴下し、DNAとアクチンを室温で20分間染色した。処理後、細胞がカバースリップ上に残っていることを目視で確認するため、解剖顕微鏡を用いた。サンプルはLeica SP8共焦点レーザー顕微鏡（Leica）で観察し、画像を取得した。各共培養のzスタック3枚を、63×オイルレンズと以下のパラメーターを用いて撮影した： 解像度1,024×1,024、ピクセルサイズ100.21 nm、速度600、ズームファクター1.9、zステップ0.3 mm。
細胞内Fnを決定するための計算解析
Fna C1株（SB048、KCOM 3363、KCOM 3764）またはFna C2株（SB001、SB010、KCOM 2763）と共培養したHCT116細胞の細菌-真核共培養の共焦点zスタックをImarisにインポートした。測定はすべて、生物学的複製ごとに3つの異なるz-スタックで実施した。Imaris では、FM 4-64FX 膜ステインの蛍光を用いて細菌表面のボリュームを作成した（表面の詳細 0.223mm、最大球の直径 0.5mm を用いたバックグラウンドサブトラクション）。真核細胞検出ツールは、核染色とアクチン染色を用いて細胞を定義し、識別するために使用した。核はシードポイントで分割した。検出された真核細胞は、細胞表面マスクを作成するためにエクスポートされた。細胞内細菌細胞を定義するために、細菌表面を真核細胞表面までの最短距離（真核細胞膜までの距離-0.0000001分）で分類した。この新しい分類は、新しい「細胞内細菌細胞」表面としてエクスポートされた。細胞内細菌を有する真核細胞の数を評価するため、真核細胞表面マスクで定義されたオブジェクトと「細胞内細菌細胞」表面マスクで定義された内部オブジェクトの数をカウントした。細胞内Fna細菌細胞を有するHCT116細胞のFnaクレード別割合の統計的比較は、GraphPad Prism v.7.0 software（GraphPad Software）を用いてWelchのt検定を適用することにより行った。
細胞の長さと幅の測定
Fna C1株およびFna C2株の細胞寸法は、FijiとBioformats Plugin（Leica.lifファイルのインポートに必要）を用いて測定した。まず、Analyze、Set Scale、Set 1 mmの順で、9.979ピクセル（ピクセルサイズ100.21 nm）になるように画像のスケールを設定した。その後、フリーハンドの直線ツールを使って、各細胞膜染色上の最も明るい点から測定値を取り込んだ。Fnaクレードごとの細胞長および細胞幅の統計的比較は、GraphPad Prism v.7.0 software（GraphPad Software）を用いてWelchのt検定を適用することにより行った。
RNA配列決定
Fn株SB010およびKCOM 3764を、10％DHB（Fisher Scientific）を添加したFAAプレート（Oxoid, Thermo Fisher Scientific）上で培養した。プレートはBactron600嫌気チャンバー（Sheldon Manufacturing社製）内で37℃で2日間培養した。その後、FAA＋10％DHBプレートで培養し、Bactron600嫌気チャンバー内で37℃、2日間培養した。細胞をTSB（Becton Dickinson）に再懸濁し、600 nmの光学密度（OD600nm）が0.5になるように標準化した。培養液を各条件ごとに3倍に分割し、嫌気条件下、37℃で4時間培養した： TSBブロス単独、50mMの1,2-PD（Fisher Scientific）と20nMのビタミンB12（Fisher Scientific）を添加したTSB、または15mMのEA（Fisher Scientific）と20nMのビタミンB12を添加したTSBで、嫌気条件下、37℃で4時間培養した。SB010はさらに、20 nMのビタミンB12を添加したTSB中で、同じ条件下でインキュベートした。細胞を8,000 r.p.m.で5分間ペレット化し、1×PBSで1回洗浄した後、同じ条件で再度ペレット化した。その後、細胞をRNAlater（Thermo Fisher）で1回洗浄し、再度ペレット化した後、上清をすべて除去してから-80℃で保存した。RNAをRNeasy Extraction Kit（Qiagen）を用いて抽出し、RiboZero Plus rRNA depletionでイルミナ鎖状RNAライブラリー調製を行った。RNAライブラリーは最小リードカウント1,200万ペアエンドリードまで配列決定した。
マウスモデル実験
多発性腸管新生物（ApcMin+/-）マウスを購入した（Jackson Laboratory、系統番号002020）。6-8週齢の雌性マウスを、それぞれ3つの治療群からなる2つの実験試験に用いた。マウスは治療群に無作為に割り付けられた。マウスは、ストレプトマイシン（2 mg ml-1; Sigma Aldrich）で7日間飲水処理した後、1.5％デキストラン硫酸ナトリウム（MP Biomedical）で7日間飲水処理し、大腸炎を誘発し、大腸腫瘍を促進した。その後、Fna株を経口投与する前に24時間通常の水をマウスに与えた。処置群1のマウスにはそれぞれ200μl容量のPBSビヒクルコントロールを、処置群2のマウスにはそれぞれ200μl容量の1×109 Fnaクレード1（Fna C1）細胞を、処置群3のマウスにはそれぞれ200μl容量の1×109 Fnaクレード2（Fna C2）細胞を投与した。Fna C1スラリーはKCOM 3363株、KCOM 3764株およびSB048株の等量混合で、Fna C2スラリーはSB001株、SB010株およびKCOM 2763株の等量混合であった。Fnaクレード特異的遺伝子の割合をより多く捕捉するために、単一菌株の代表ではなく、菌株ミックスを選択した。Fna株は10% DHB（Fisher Scientific）を添加したFAAプレート（Oxoid, Thermo Fisher Scientific）上で増殖させた。プレートはBactron600嫌気チャンバー（Sheldon Manufacturing社製）中、37℃で2-3日間培養した。続いて、FAA＋10％DHBプレートでFna株を調製し、Bactron600嫌気チャンバー内で37℃、2日間培養した。各Fna株について、細胞をPBSに再懸濁した。各Fna C1株と各Fna C2株の細胞を等しく混合するために、OD600nm = 1における各菌株のコロニー形成単位/mlで標準化したOD600nmを基準として、菌株ミックスを容量別に調製した（Fna C1: KCOM 3363 6.71 × 107, KCOM 3764 7.27 × 107, SB048 1.97 × 108; Fna C2: SB001 7.61 × 107, SB010 5.00 × 108, KCOM 2763 1.82 × 108）。マウスは15～17週齢の終点（経口摂取後6週間）までモニターした。Fred Hutchinson Cancer Center Animal Care and Use Committeeは、すべての実験プロトコルを承認した（IACUC PROTO202100004）。すべての動物実験は関連する倫理ガイドラインに従った。マウスは12時間明期/12時間暗期サイクルで飼育され、温度（65-75°F（約18-23℃））および湿度（40-60％）が制御された。腫瘍の最大サイズは触知可能な腫瘍の数に依存し（腫瘍1個、最大直径2cm；腫瘍2個、最大直径1.5cm；腫瘍3個以上、獣医師の判断のもとで最大）、これらの限界を超えることはなかった。全マウス（各群 n = 8）の腸切片を病理学的に盲検で腸腺腫負荷量を評価した。治療群による腸腺腫負荷量の差を評価するため、GraphPad Prism v.7.0 software（GraphPad Software）を用いて一元配置分散分析を適用し、P値を算出した。
腸内メタボローム解析
メタボロームプロファイリングは、メタボロミクスプロバイダーであるMetabolon社により、第2回マウス試験のマウス（n = 4）の腸管組織切片について超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析を用いて実施した。Metabolonが使用するグローバルディスカバリーパネルには、真核生物由来と細菌由来の代謝物を含む70の主要パスウェイにおける5,400以上の代謝物が含まれる。代謝パスウェイの濃縮解析はMetabolonによって行われた。検出された代謝物に対する部分最小二乗法による判別分析やヒートマップクラスタリングなどのさらなる解析は、MetaboAnalyst70 v.5を使用してサンプル正規化データに対して行われました。
マウス糞便DNA抽出および定量PCR
Zymo Quick-DNA Microprep Kit（Zymo Research社製）を用い、メーカーの指示に従ってマウスの糞便サンプルからDNAを抽出した。フソバクテリウム属のDNAを増幅するために、カスタムTaqManプライマーとプローブのセット（Integrated DNA Technologies社製）を前述のように使用した71。フソバクテリウム属のサイクル閾値（Ct）値は、各反応におけるマウス糞便ゲノムDNAの入力量に対して正規化し、96ウェル光学PCRプレートにおいて、1×最終濃度TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）およびフソバクテリウム属TaqManプライマーおよびプローブを含む20μl反応で、少なくとも二重にアッセイした。陽性コントロールと非テンプレートコントロールは各定量PCRランに含まれた。フソバクテリウムのコピー数は、純粋なFna C1およびFna C2 DNAをインプットして標準曲線を作成した後に推定した。DNAの増幅と検出は、QuantStudio 3 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて、以下の反応条件で行った： 95 °C で 10 分間、95 °C で 15 秒間、60 °C で 1 分間のサイクルを 40 回繰り返した。Ct は自動設定（Applied Biosystems）を用いて算出した。TaqManアッセイ用のプライマーとプローブの配列は以下の通りである： フソバクテリウム属フォワードプライマー、5′-AAGCGCGTCTAGGTGGTTATGT-3′；フソバクテリウム属リバースプライマー、5′-TGTAGTTCCGCTTACCTCTCCAG-3′；フソバクテリウム属FAMプローブ、5′-CAACGCAATACAGAGTTGAGCCCTGCATT-3′。
Biolog PM10表現型マイクロアレイプレート
Biolog PM10プレートと対応するIF-0aおよびIF-10b溶液を、4℃で一晩、嫌気条件下で予備還元した（AnaeroGen Gas Generating Systems、Oxoid、Thermo Fisher Scientific）。Fna 株は、10% DHB（Fisher Scientific）を添加した FAA プレート（Oxoid, Thermo Fisher Scientific）上で増殖させた。プレートは、Concept1000嫌気チャンバー（BakerRuskinn）内で37℃、24時間培養した。この同じ嫌気条件下で、Fna細胞を2mlの還元前IF-0aに懸濁し、Biologが推奨するOD600nm=0.179に全サンプルで正規化した。0.75mlの標準化菌懸濁液と11.25mlのミックスB（100mlのあらかじめ還元したIF-10bと1.2mlの色素ミックスD、および11.18mlのあらかじめ還元した滅菌水）を最終容量12mlになるように合わせて最終懸濁液を調製した。PM10プレートの各ウェルに100μlの最終懸濁液を加えた。その後、PM10プレートを室温で10分間好気的条件に平衡化し、嫌気的、水素を含まない条件下で37℃で24時間インキュベートした（AnaeroGen Gas Generating Systems、Oxoid、Thermo Fisher Scientific）。プレートを画像化し、プレートリーダー（Biotek）を用いて590 nmの吸光度を定量した。
グルタミナーゼアッセイ
Fna株を、10% DHB（Fisher Scientific）を添加したFAAプレート（Oxoid, Thermo Fisher Scientific）上で、Concept1000嫌気チャンバー（BakerRuskinn）中、37℃で2日間培養した。滅菌綿棒を用い、2.5％酵母エキス（Becton Dickinson）および0.4 mg ml-1 L-システイン（Alfa Aesar）を添加したTSB（Becton Dickinson）に細胞を再懸濁した。各菌株について、OD600nm = 1に標準化した培養液0.75 mlを7830 r.p.m.でスピンダウンし、細胞ペレットを1 mlのGls溶液に懸濁した。Gls溶液は、0.2gのL-グルタミン（Sigma Aldrich）、0.01gのブロモクレゾールグリーン（Sigma Aldrich）、18gの塩化ナトリウム（Sigma Aldrich）、0.6mlのTriton X-100（Sigma Aldrich）および200mlの脱イオン水を含む。Gls溶液はpHを3.1に調整した後、フィルター滅菌する。上清を平底96ウェルプレートに移し、プレートリーダー（Biotek）を用いて600 nmの吸光度を測定した。
模擬胃液中での耐酸性
Fna株を、10％DHB（Fisher Scientific）を添加したFAAプレート（Oxoid, Thermo Fisher Scientific）上で、Concept1000嫌気チャンバー（BakerRuskinn）中、37℃で1～2日間培養した。細胞を、2.5％酵母エキス（Becton Dickinson）および0.4 mg ml-1 L-システイン（Alfa Aesar）を添加した50 ml TSB（Becton Dickinson）に懸濁した。細胞は液体培養で、Concept1000嫌気チャンバー（BakerRuskinn）内で37℃、25時間培養した。すべての菌株は、5 mlのTSB、pH 3の模擬胃液（Biochemazone）、またはpH 3の10 mMグルタミン酸（Sigma Aldrich）を添加した模擬胃液中でOD600nm = 1に標準化した。プレートはConcept1000嫌気チャンバー（BakerRuskinn）で37℃、3日間嫌気培養した。
患者検体
解析に含まれるすべての患者の腫瘍組織は、大腸腺がんと診断されたものである。患者コホート1では、患者は腫瘍検体の採取と解析についてインフォームド・コンセントに署名した。この研究のための患者検体の使用は、プロトコル番号RG 1006552、1005305、1006664および1006974のもと、Fred Hutchinson Cancer Center Institutional Review Boardによって承認された。患者の年齢、性別、民族性は検体採取の選択基準ではなかった。微生物培養については、治療歴のない原発性CRC腫瘍を優先した。患者コホート2については、BioProject PRJNA362951の検体を使用した。
細菌の16S rRNA遺伝子配列決定
DNAは、前述6に従って患者組織から抽出し、ZymoBIOMICS Service - Targeted Metagenomic Sequencing（Zymo Research）で処理した。細菌V3-V4 16SリボソームRNA遺伝子ターゲットシークエンシングを実施した。V3-V4ターゲティングプライマーは、高感度を維持しながら16S遺伝子の最良のカバレッジを提供するようにZymo Research社によってカスタムデザインされた。これらは、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅する一般細菌16S rRNA遺伝子プライマー341F（CCTACGGNGGCWGCAG）と805R（GACTACHVGGTATCTAATCC）に基づいている。増幅は、細菌配列のみが増幅されるように高いアニーリング温度で行われた。抽出コントロールが含まれ、ライブラリー調製（42サイクルまで実行）中に増幅は見られなかった。シーケンスライブラリーはAccuBIOME Amplicon Sequencing Kit（Zymo Research社製）を用いて調製し、PCRキメラ形成を防ぐためにリアルタイムPCR装置でPCR反応を行った。アンプリコンライブラリーはZymo Research社のSelect-a-Size DNA Clean & Concentratorでクリーンアップし（200塩基対以上の断片は残す）、TapeStationで定量し、正規化してプールした。最終ライブラリーを定量PCRで定量し、v3試薬キットを用いてIllumina MiSeqでシーケンスした（600サイクル）。シーケンシングは10%以上のPhiXミックスを用い、ペアエンドモードで行った。生シーケンスリードはTrimomatic-0.33（文献72）でトリミングした。Fnaクレード特異的アンプリコン配列バリアントは、プロバイダーのCosmosIDによってデザインされた。すべてのFna C1株とFna C2株の16S rRNA遺伝子配列を提供した。Fna C1の16S配列はFnvと密接に分岐しているため（Extended Data Fig.2a）、Fnvを検出しないFna C1アンプリコン配列バリアントの特異性を確保するため、さらにすべてのFnv株の16S rRNA遺伝子配列を提供した。これらの16S rRNA遺伝子配列とSILVA 138.1 SSU Ref. NR99バージョン、およびDADA2バージョンのspecies training setを使用した。まず、提供された配列と一致するSILVAデータベース内のすべての配列をSILVAから削除した。次に、カスタム配列がSILVAデータベースファイルに追加され、その中で種名が提供されたメタデータ情報（Fna C1、Fna C2またはFnv）に基づいて付加された。このデータベースの解析を、--FW_primer CCTACGGRSGCAGCA、--RV_primer GACTACHVGGGTATCT、--trunc_qmin 20、--trunc_rmin 0.2、--max_ee 6、--min-frequency 1、--picrust、--dada_ref_tax_customの各パラメーターを用いて、nf-core AmpliSeqパイプラインで実行した。
公開されているショットガンメタゲノムサンプルを用いたCRCとの関連におけるFnaクレードのメタ解析
各FnaクレードとCRCとの関連を調べるために、9つの一般公開されているコホート（補足表22）から、合計627人のCRC患者と619人の健常人について、MetaPhlAn4（参考文献63; https://github.com/biobakery/biobakery/wiki/metaphlan4）を用いてショットガン便メタゲノムサンプルをプロファイリングし、バイオプロジェクト番号PRJNA549513でNational Centre for Biotechnology Information（NCBI）で公開されている我々のFnaゲノムから作成したFnaクレード特異的データベースと比較した。各Fn亜種およびFnaクレード（Fna C1: SGB6013, Fna C2: SGB6007, Fnn: SGB6011, Fnp: SGB6001, Fnv: SGB6014）について、別個の種レベルのゲノムビン（SGB）73を同定することができた。各SGBは、arcsin-squared-root-transformed SGB abundance ~ study condition + C(sex) + age + BMI + sequencing depth of sampleという形の通常の最小二乗モデルに適合するサンプル条件と関連付けられた。標準化平均差 = (t × (n1 + n2))/(sqrt(n1 + n2) × sqrt(n1 + n2 - 2))、ここでtは対応する変数のtスコア、n1はゼロクラスのサンプル数、n2は1クラスのサンプル数、n1 + n2 - 2はモデルの自由度である。対応する標準誤差は，次のように計算された： s.e. = sqrt(((n1 + n2 - 1)/(n1 + n2 -3)) × (4/(n1 + n2)). × x (1 + (((標準化平均差)2)/8)))。統計的有意性は両側Wald検定により評価した。効果量はプールされ、Paule-Mandel異質性推定量76を用いたランダム効果メタ解析75を用いて解析された。メタアナリシスの統計的有意性は、平均効果がゼロであるという帰無仮説のzスコアとして計算された75。P値はすべてBenjamini-Yakuteli法で補正した。
公開メタゲノムサンプルにおける推定eut、pdu、gdarオペロンのマッピング
健常人と比較してCRC患者における推定eut、pduおよびgdar系オペロンの存在を評価するために、9つの公開コホートからショットガン便メタゲノムサンプルをプロファイリングした（補足表22）。メタゲノムサンプルは、Bowtie2（バージョン2.4.5、-sensitiveパラメータ）77を用いて、Fna SB010 eut、pdu、gdarオペロンに対してマッピングした。オペロン内の各遺伝子のカバレッジの広さと深さは、CMSeqツールのbreadth_depth.pyスクリプト（パラメータ --minqual 30 --mincov 1）78を用いて評価した。検出された遺伝子はカバー率の閾値が50%を超えていた。eutおよびpduの結果では、推定オペロンはFna SB010オペロン構造に対してeutおよびpdu遺伝子の存在率が90%の閾値を持っていた。gdarの結果では、推定オペロンはFna SB010オペロン構造に対してgdar遺伝子の100%の存在という閾値を有していた。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
本研究の全ゲノムがNCBIのBioProject accession number PRJNA549513で、全メチロームがRestriction Enzyme Database (REBASE)で入手可能。RNA配列決定実験の生シーケンスデータはBioProjectアクセッション番号PRJNA937266でNCBI Sequence Read Archiveリポジトリから入手可能。16S rRNAシーケンス実験の生シーケンスデータは、BioProjectアクセッション番号PRJNA1064180のNCBI Sequence Read Archiveリポジトリで入手可能。ソースデータは本論文とともに提供される。
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謝辞
本研究は、Fred Hutch/University of Washington Cancer Consortium（P30 CA015704）のExperimental Histopathology Shared Resource、Fred Hutch/University of Washington Cancer Consortium（P30 CA015704）のComparative Medicine Shared Resource、Fred Hutch/University of Washington Cancer Consortium（P30 CA015704）のCellular Imaging Shared Resourceの支援を受けた。Fred Hutchinson Cancer CenterのScientific Computing Infrastructureは、Office of Research Infrastructure Programsの助成金S10OD028685を受けた。本書で報告された研究は、R01 DE027850およびR21 DE033533（いずれもC.D.J.へ）、R00 CA229984-03（S.B.へ）の米国国立がん研究所、R01 DE027850およびR21 DE033533の米国国立衛生研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health）、R00 CA229984-03（S.B.へ）の米国国立がん研究所（National Cancer Institute）から助成を受けた。 B.へ）、フレッド・ハッチンソンがんセンターからのスタートアップ資金（S.B.とC.D.J.へ）、W.M.ケック研究財団からの支援（S.B.とC.D.J.へ）、ワシントン研究財団ポストドクトラルフェローシップ（M.Z.-R.へ）。 R.へ）、韓国政府が資金提供する国立研究財団のバイオ・医療技術開発プログラム（2013M3A9B8013860および2017M3A9B8065844；J.-K.K.へ）。微生物学および細胞培養のサポートにA. BaryiamesおよびC. Becker、解析のサポートにM. StepanovicaおよびA. McGlinchey、ディスカッションにD. Raftery、病理学のレビューにC. WatsonおよびA. Koehne、動物実験の支援にE. Cromwell、S. Masunaga、A. J. Santo、J. RiveraおよびU. Demirkol、指導にH. M. Johnstonに感謝する。図1a、2f、4a、5a-cおよびExtended Data図5a、d、g、6aの画像はBioRender.comを用いて作成した。
著者情報
著者ノート
これらの著者は本研究を共同で監修した： Susan Bullman、Christopher D. Johnston
著者および所属
米国ワシントン州シアトル、フレッド・ハッチンソンがんセンター、ワクチン・感染症部門
Martha Zepeda-Rivera、Heather Bouzek、Dakota S. Jones、Ying Wu、Elsa F. McMahon & Christopher D. Johnston
フレッド・ハッチンソンがんセンター、共有リソース、データコア、シアトル、WA、USA
Samuel S. Minot
米国ワシントン州シアトル、フレッド・ハッチンソンがんセンター、ヒト生物学部門
Hanrui Wu、Kaitlyn D. LaCourse、Andrew G. Kempchinsky、Susan Bullman
イタリア、トレント、トレント大学、計算・細胞・統合生物学部
アイター・ブランコ＝ミゲス、パオロ・マンギ、ニコラ・セガタ
大韓民国、光州、朝鮮大学校、歯学部、口腔微生物学韓国コレクションおよび口腔生化学科
パク・スンナン、イム・ユン、クク・ジュンギ
ワシントン大学生物統計学部（米国ワシントン州シアトル
エイミー・D・ウィリス
フォーサイス研究所（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
ショーン・L・コットン、スーザン・C・ヨスト、フロイド・E・デューハースト
米国マサチューセッツ州ボストン、ダナファーバー癌研究所病理部
エワ・シチンスカ
米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学歯学部、口腔医学・感染・免疫学科
フロイド・E・デュハースト
貢献
M.Z.-R.、S.B.、C.D.J.が研究を計画し、論文を執筆した。S.B.、E.S.、K.D.L.、A.G.K.が患者組織標本を処理した。M.Z.-R.、K.D.L.、S.C.Y.、S.-N.P.、Y.K.L.、J.-K.K.およびS.B.は微生物の分離および培養を行った。M.Z.-R.、D.S.J.、S.L.C.、C.D.J.がDNA分離、ゲノム配列決定、ゲノムアセンブルを実施した。M.Z.-R.、S.S.M.、H.B.、H.W.およびD.S.J.は、ゲノムおよびメチロームに関するパンゲノム解析を実施した。A.B.M.とP.M.は、便メタゲノム解析とメタ解析を行った。M.Z.-R.は、RNAシーケンス実験と解析を実施した。K.D.L.は、共培養アッセイとその後の顕微鏡を用いた細胞浸潤解析を実施した。M.Z.-R.、K.D.L.、Y.W.およびA.G.K.は、マウス試験およびマウス試料の下流処理を実施した。M.Z.-R.は代謝物データの解析を行った。E.F.M.はBiolog PM10プレートを用いたグルタミナーゼアッセイと表現型解析を行った。M.Z.-R.、A.D.W.、S.B.が統計解析を行った。M.Z.-R.、F.E.D.、N.S.、S.B.およびC.D.J.は資金を獲得し、計算およびウェットラボ実験を監督した。すべての著者が論文を読み、編集を行い、最終版に貢献した。
対応する著者
Susan BullmanまたはChristopher D. Johnstonまで。
倫理申告
競合利益
S.B.はGlaxoSmithKline社およびBiomX社のコンサルタントである。C.D.J.は、Series Therapeutics社およびAzitra社から助言を受けた。S.B.は米国特許出願No. ブロード研究所とダナファーバーがん研究所が提出したPCT/US2018/042966の発明者であり、CRC治療のためのフソバクテリウムのターゲティングをカバーしている。S.B.、C.D.J.およびM.Z.-R.は米国特許出願番号の発明者である。F053-0188USP1/22-158-US-PSP（フレッド・ハッチンソンがんセンター提出）の発明者であり、がん関連微生物の調節をカバーしている。K.D.L.は現在NanoString Technologies社に勤務している。残りの著者は、競合する利害関係はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature誌は、Cynthia Sears氏、および本著作の査読に貢献した他の匿名の査読者に感謝する。
追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。
図表
図1 ニッチおよび亜種ごとのFn遺伝的特徴。
a, Fnパンゲノムのサイズをコアゲノム（95%以上）（黒）とアクセサリーゲノム（95%未満）（灰色）で分けたもの。データは中央値±s.d.でプロットされている。 b. CRC関連（オレンジ）および口腔関連（青）のニッチ起源別に分割したFnパンゲノムのサイズと、それぞれのコアゲノムおよびアクセサリーゲノムのラベル。データは中央値±s.d.でプロットした。 c. FnパンゲノムをFn亜種、Fna（赤）、Fnn（金）、Fnp（紫）、Fnv（茶）ごとに分割し、それぞれのコアゲノムとアクセサリーゲノムをラベルした。データは中央値±s.d.でプロットした。 d-e,d,fadAおよびe,fplAのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の最尤樹状図。各ゲノムについて、ツリーの端点はFn亜種を示す；Fna（赤）、Fnn（金）、Fnp（紫）、Fnv（茶）。 f, Fna（赤）、非Fna（黒）亜種でサブセットされた、Fnウイルス性因子を含むFnゲノムの割合をカラムグラフで示す。統計解析は2標本Z検定（両側検定）を用いて行った。NSは有意ではない。
Extended Data 図2 Fnaクレードの系統学とゲノム学。
a, Fn単一マーカー遺伝子、16 S rRNA、rpoB、亜鉛プロテアーゼ、nusAおよびnusGの最尤系統樹。各ゲノム（n = 135）について、木の端点はニッチ起源、CRC（オレンジ）または経口（青）を示し、棒の色はFn亜種（Fna（赤）、Fnn（金）、Fnp（紫）、Fnv（茶））を示し、背景色はFnaクレード（Fna C1（緑）およびFna C2（ラベンダー））を示す。ボックスはFnaクレード、Fna C1（緑）とFna C2（ラベンダー）をハイライトしている。n = 24 Fna C1ゲノムと51 Fna C2ゲノムの10,000ランダムサブサンプリング。データは中央値±s.d.でプロットした。 d, クレードごとのFnaパンゲノムサブセットの構成。Anvi'o遺伝子クラスター（GC）有病率を用いて、Fna C1株とFna C2株の両方で保存されているコア（95％以上）、アクセサリー（5％以上95％未満）、レア（5％未満）の特徴を定義した（「Fna core」（全Fna株で95％以上）、「Fna cloud」（全Fna株で5％以上95％未満）、「Fna rare」（全株で5％未満）、または各クレードの株でユニーク。また、各クレードの株について、"Fna cloud"（全Fna株の5％以上95％未満）、"Fna rare"（全Fna株の5％未満）、"unique "のいずれかを示す。プロットボックスは25パーセンタイル、中央値、75パーセンタイルを示す。e,列グラフはFna C1（n=24）とFna C2（n=51）の染色体サイズ。データは平均値±s.e.m.でプロットされている。統計解析はWelchのT検定、両側検定を用いて行った。 f, 列グラフは、生得的細菌遺伝的防御システムを含むFnaゲノムの割合を、Fnaクレード、Fna C1（緑）とFna C2（ラベンダー）でサブセットしたもの。統計解析は2標本Z検定（両側検定）を用いて行った。g,大腸腺癌患者39名の唾液（円）または腫瘍生検（三角）サンプルにおけるFna C1（緑）とFna C2（ラベンダー）の相対存在量のパーセントを示すグラフ47。データは平均値±s.e.m.でプロットした。統計解析はWelchのT検定（ペア）を用いて行った。NSは有意ではない。
Extended Data 図3 Fnaクレード間の形態学的およびゲノム学的差異。
ヒト大腸がん細胞（HCT116）と共培養した代表的なFna C1株とFna C2株。癌上皮細胞（灰色）と細胞内細菌細胞（Fna C1緑；Fna C2ラベンダー）の独立したマスクが作成された。マスクは、細胞内Fnaを持つHCT116細胞のパーセンテージを計算するために使用した（図3b）（Methods参照）。スケールバーは20μm。c, 細菌の耐好性は、共培養の開始時、中間点、終了時の連続希釈プレーティングにより評価した。グラフは、各菌株の開始点に対して標準化した、ミリリットルあたりの細菌コロニー形成単位を示す。破線は1に等しい標準化を示す。d,棒グラフは共焦点顕微鏡画像から測定したFna細胞の長さと細胞の幅を示し、Fna C1（緑）またはFna C2（ラベンダー）のFnaクレードごとにサブセットした。データは平均値±s.e.m.でプロット。統計解析はWelchのT検定（両側検定）を用いて行った。 e, Fnaクレードに濃縮された遺伝子クラスターのKofamKOALA KEGG27オルソログマッピング。
Extended Data 図4 腸内代謝産物に対するFnaクレードのトランスクリプトーム応答。
a,棒グラフは、推定eutおよびpduオペロンが検出されたCRC患者または健常対照者の便メタゲノムサンプルの割合を示す。統計解析は2標本Z検定（両側検定）を用いて行った。b-c、代表的なFna C1株（KCOM 3764）および代表的なFna C2株（SB010）の、(b)エタノールアミン（EA）または(c)1,2-プロパンジオール（1,2-PD）暴露下における、それぞれの未暴露対照と比較した差次的発現遺伝子（対数変換したフォールド変化≥0.58および≤-0.58、-log10(p-value)≥1.30）。d,ビタミンB12を単独で曝露したSB010において、未曝露のコントロールと比較して発現が異なる遺伝子（対数変換したフォールド変化≥0.58および≤-0.58、-log10(p-value)≥1.30）。すべての差次発現遺伝子にラベルを付けた。b-dについて、縦の点線は有意な遺伝子発現の閾値を示し、log2変換した倍数変化≥0.58および≤-0.58と定義した。統計解析はglmQLFTestを用いて行い、両側。データポイントの色は、PPanGGOLiNによって遺伝子がFnaコアゲノム（赤）、Fna C1関連アクセサリーゲノム（緑）、Fna C2関連アクセサリーゲノム（ラベンダー）のいずれに分類されたかを示す。
Extended Data 図5 Fnaクレード間のpH嗜好性と耐酸性の違い。
b, 代表的なFna C1株（緑）とFna C2株（ラベンダー）について、Biolog PM10プレートで測定した増殖活性をプロットしたもの。データは二重プレート間の正規化平均値としてプロットされている。各pHにおける統計解析はWelchのT検定（両側検定）を用いて行った。c, FnaパンゲノムのPPanGGOLiN51マップ。各ノードは遺伝子群を表し、シンテニックノードは隣接する遺伝子を表し、サイズはFnaゲノム全体の相対的な存在を示し、色はFna C1-関連アクセサリーゲノム（緑）およびFna C2-関連アクセサリーゲノム（ラベンダー）のエレメントを表す。白矢印はグルタミン酸依存性酸抵抗性（gdar）オペロンを示す。e, 代表的なFna C1株およびFna C2株存在下での、グルタミンからグルタミン酸への変換（黄色から緑色）およびグルタミン酸からγ-アミノ酪酸（GABA）への変換（緑色から青色）を示すpH変化を測定する比色アッセイの定性的および定量的測定。データは平均値±s.e.m.でプロットし、ANOVAを用いて統計解析を行った。 g, pH 3の模擬胃液（SGF）、またはpH 3で10 mMのグルタミン酸を添加したSGFに曝露し、pHストレスの影響を試験した実験の概略図。プレートは、代表的なFna C1株と代表的なFna C2株について、1時間の暴露の結果得られた増殖を、pH～6.7のトリプシン性大豆ブロス（TSB）対照と比較して示している。 h, 棒グラフは、推定gdarオペロンが検出されたCRC患者（オレンジ）または健常対照（黒）からの便メタゲノムサンプルの割合を示している。統計解析は2標本Z検定（両側検定）を用いて行った。コホートのサンプルサイズは各パネルの下部に示した。a,d,gの図はBioRender.comを用いて作成した。
Extended Data Fig. 6 Fna投与マウスにおける腸腺腫負荷と糞便中フソバクテリウム負荷。
a, ApcMin+/-マウスにビヒクルコントロール（Arm 1）、または代表的なFna C1株（Arm 2）およびFna C2株（Arm 3）をそれぞれストレプトマイシンおよびデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与後に経口投与し、本来のマイクロバイオームを除去し、大腸炎を誘発した試験の概略図。b-c、bは小腸と大腸を合わせた腺腫数、cは小腸の腺腫数を、ビヒクル対照（灰色）、Fna C1処理（緑色）、Fna C2処理（ラベンダー色）という処理群別にプロットしたもの。データは平均値±s.e.m.でプロットした。d,フソバクテリウム標的qPCRは、嘔吐1日後（PG）から試験終了時点までの糞便ペレットに対して行った。各サンプルにおけるFnの存在は、検出限界（D.L.）を1Fnコピーとして、糞便DNA1ngあたりのFnコピーとしてプロットした。各サンプルは3連で実施し、検出可能なシグナルを持つ2連以上のサンプルを含む。aの図はBioRender.comを用いて作成した。
ソースデータ
Extended Data 図7 Fna投与マウスにおける腸内代謝物の変化。
散布図は、a, コントロールと比較したFna C2処理マウス、b, Fna C1処理マウスと比較したFna C2処理マウス、およびc, コントロールと比較したFna C1処理マウスの1,296の検出代謝物について、代謝分類別に色分けした倍数変化を示す。上位5つの代謝物にはラベルが付けられている。下のプロットは、すべての濃縮パスウェイの濃縮スコアを示している。棒グラフは代謝分類によって色分けされている。
Extended Data 図8 Fna投与マウスにおける代謝物の変化。
a, プロットは、-log10(p-value)による治療群間の代謝物レベルの対数変換された倍数変化を示す。点は代謝分類によって色分けされた個々の代謝物を示す。点線は有意な遺伝子発現の閾値を示し、log2変換したfold change≧0.58および≦-0.58（縦線）、-log10(p-value)≧1.30（横線）と定義した。統計解析は、片側T検定を用いて自然対数変換した値で行った。 b, 試験群間の上位50代謝物のクラスターヒートマップ。個々のサンプルを代謝物プロファイルの類似性でグループ化したデンドログラム。c, グルタチオン代謝経路の模式図。 d, 各治療群、ビヒクルコントロール（グレー）、Fna C1処理（グリーン）、Fna C2処理（ラベンダー）について、酸化型（GSSG）と還元型（GSH）のグルタチオンレベルの比率を示すプロット。データは平均値±s.e.m.でプロット。統計解析は一元配置分散分析を用いて行った。
Extended Data Fig. 9 Fna C2投与マウスで有意に変化した腸内代謝物。
個々の特徴的な代謝物のプロットで、有意に変化した代謝物が10を超える代謝カテゴリーを示す。各プロットは、Fna C1投与マウスと比較したFna C2投与マウスの対数変換対数変化と、コントロールマウスと比較したFna C2投与マウスの対数変換対数変化を示す。破線は有意に変化した代謝物の閾値を示し、log2変換したfold change（FC）≧0.58および≦-0.58と定義した。右上の四角は、Fna C1投与マウスおよびコントロールマウスと比較して、Fna C2投与マウスで有意に上昇した代謝物を示す。左下の四分円は、Fna C1投与マウスおよびコントロールマウスと比較して、Fna C2投与マウスで有意に低下した代謝物を示す。各四分円の上位代謝物にはラベルを付けた。
Extended Data 図10 ヒト便メタゲノムにおけるFn亜種とFnaクレードの検出。
a, CRC患者（n = 627）または健常対照者（n = 619）の便サンプルにおける各Fn亜種およびFnaクレードの相対存在量のパーセントをプロットしたもの。データは平均値±s.e.m.でプロットし、統計解析は一元配置分散分析を用いて行った。 b-k,サンプルは、(b-k)個々のコホートと(k)プール結果の両方でプロットした。各パネルにおいて、一番上のプロットは、各サンプルにおけるFna C1（緑）とFna C2（ラベンダー）の相対存在量のパーセントを示している。データは平均値±s.e.m.でプロットし、WelchのT検定（ペア）を用いて統計解析を行った。下図は、CRC患者の便サンプルと健常対照者の便サンプルのうち、Fna C1とFna C2が検出されたサンプルの割合を示している。データは平均値＋s.d.でプロットし、統計解析は2標本Z検定（両側検定）を用いて行った。コホートのサンプルサイズは各パネルの下部に示した。
Extended Data 図11 ヒト便メタゲノムにおけるFnaのメタ解析。
以前に発表されたCRC患者と健常対照者の独立したコホートからの便メタゲノムデータにおけるFna C1とFna C2の検出を個々のコホートごとにプロットしたもの。左プロットは、標準化平均差のメタ解析とMetaPhlAn463種レベルのゲノムビン（SGB）存在量に関するランダム効果モデルを用いて、全サンプル（CRC n = 627、健常対照 n = 619）にわたって算出したFna C1とFna C2の効果量を示す。右のプロットは、Fna C1がFna C2と共起するサンプルを除外し、同じアプローチで計算したFna C1とFna C2の効果量を示している（CRC n = 596、健常対照 n = 616）。データは平均値±s.e.m.でプロットした。統計的有意性はWald検定、両側で評価。p値はすべてBenjamini-Yakuteli法で補正した。
補足情報
補足情報
補足表1-25の凡例。
報告概要
補足表
補足表1-25.
ソースデータ
ソースデータ Fig.
ソースデータ 拡張データ 図6
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Zepeda-Rivera, M., Minot, S.S., Bouzek, H. et al. 大腸癌ニッチを支配するFusobacterium nucleatumの別個のクレード。Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07182-w
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受領
2023年2月19日
受理
2024年02月08日
出版
2024年3月20日
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https://doi.org/10.1038/s41586-024-07182-w
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大腸癌を引き起こす可能性のある細菌の亜種を絞り込む
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