腸内細菌と口腔内細菌の人から人への感染風景
公開日：2023年1月18日
腸内細菌と口腔内細菌の人から人への感染風景
Mireia Valles-Colomer, Aitor Blanco-Míguez, ...Nicola Segata 著者一覧を見る
Nature (2023)この記事を引用する
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指標詳細
概要
ヒトのマイクロバイオームは、人体の不可欠な構成要素であり、いくつかの健康状態の共同決定因子である1,2。しかし、対人関係が個人のマイクロバイオームの遺伝的構成や集団内および集団間での伝播をどの程度形成しているかは、まだほとんど分かっていない3,4。今回、9,700以上のヒトメタゲノムと計算機による菌株レベルのプロファイリングを活用し、個人間での広範な菌株共有（1,000万インスタンス以上）が、母子感染、世帯内感染、集団内感染という異なるパターンで検出されました。母親から乳児への腸内細菌叢の伝播は、乳児期にはかなり安定しており（共有種間で同じ菌株が約50％（菌株共有率））、高齢になっても検出可能なままであった。一方、口腔マイクロバイオームの伝播は、ほぼ水平的に起こり、同居期間によって促進された。同居者間での菌株共有はかなり進んでおり、腸内細菌叢と口腔内細菌叢の菌株共有率の中央値は12%と32%であった。同居してからの期間は、年齢や遺伝的要素よりも菌株共有に影響を与えていた。さらに、細菌株共有は、種レベルのプロファイルよりも宿主の集団構造をよく再現していた。最後に、異なる分類群は、感染様式を問わず効率的な拡散者として現れ、宿主外生存能力に関連する異なる予測される細菌表現型と関連していた。今回明らかになった微生物の伝播の程度は、ヒトのマイクロバイオーム研究5、特に非感染性の微生物関連疾患に関する研究との関連性を強調するものである。
主な内容
私たちのゲノムは両親から受け継がれ、生涯を通じて安定しており、ヌクレオチドの変異の蓄積は限定的である。一方、私たちの微生物補体（ヒトマイクロバイオーム）の遺伝子構成は、出生時に播種され、時間とともに変化し、高い時間変動と個人化を示します6,7。食事やライフスタイルなどの要因が、ヒトのマイクロバイオームの構成を変化させることはよく知られていますが1,2,8、ヒトの体外で増殖できる微生物はごくわずかであるため、ほとんどの微生物は他の個体から獲得する必要があります3,4。実際、ヒトの腸内における微生物のコロニー形成は、その大部分が母親からの伝達によって行われている9,10,11,12,13,14。しかし、母親からの伝達だけでは、成人で見られる微生物の大きな多様性を説明することはできない。マイクロバイオームの構成要素がどのように個体によって獲得・伝達され、集団の中で拡散していくのか、そしてそれが個人のマイクロバイオームの遺伝子構成をどのように形成していくのかは、特にヒトにおいてはほとんど未解明であり15,16、現時点では予備的な知見が得られるにとどまっている11,17。これまでのところ、正確にデザインされた研究の数や規模が限られていること、また、微生物の特定株、すなわち種内の遺伝的変異を一貫して包括的にプロファイリングすることが困難なことが、研究の妨げになっています。
菌株は、ヒトのマイクロバイオームを構成する個人固有の構成要素である18,19。これらの菌株は、種内でゲノム的にも機能的にも大きく異なる可能性があり、そのプロファイリングは、微生物の伝播と、重複する一連の種に向けたマイクロバイオームの収束とを区別するために必要な前提条件である。マイクロバイオーム伝播の特徴を明らかにすることは、ヒトのマイクロバイオームの複雑さに対する理解を深めるとともに、現在非伝染性と考えられている疾患や状態にマイクロバイオーム伝播が付加する「伝染性」の要因に対処するのに役立つ可能性があります5。ここでは、マイクロバイオーム伝播の状況を包括的に説明するために、複数のシナリオにおける個人間のマイクロバイオーム株共有のパターンを特徴付け、定量化します。
マイクロバイオーム伝播のプロファイリング
人から人へのマイクロバイオーム伝播の様式を解明するために、我々は、改良された菌株レベルプロファイリングメタゲノムツールを用いて解析された、家族関係がわかっている大規模なメタゲノムデータセット2、9、10、12、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34（n = 31）に対して統合解析を実行しました（方法論参照）。これらのデータセットのうち8件は、アメリカ（アルゼンチン、コロンビア、アメリカ）、アフリカ（ギニアビサウ）、アジア（中国）、ヨーロッパ（イタリア）の異なる地理的地域と宿主の生活習慣から、この研究のために新たに配列決定されたものである。アフリカ（ガーナ、タンザニア）およびヨーロッパ（イタリア）における他の3つの研究9,34をさらに拡大し、合計978の便および1,929の唾液サンプルを収集しました（補足表1および2）。このコレクションは、9,715のマイクロバイオームサンプル（便7,646、唾液2,069）および宿主情報のキュレーションからなり、母子ペア、世帯員、成人双子ペア、村、集団間での伝播を評価することが可能です。31のデータセットは、5大陸20カ国から収集された多様なライフスタイルのヒトメタゲノムを含んでおり、サイズは異なりますが（図1a、b、拡張データ図1a、補足表2）、統合セットにより、グローバルレベルでの個人間マイクロバイオーム伝播パターンの特定が容易になりました。
図1: 人から人へのマイクロバイオーム株伝播を調査するためのメタゲノム解析フレームワーク。
図1
a, SGBフレームワークに基づく調査の概要とデータセット（Methods）。b, 腸内サンプルの全体的な種レベルの構造（Aitchison距離に関する主成分分析、1人当たり1つのランダムサンプル、n = 4,840）。サンプルは国別に色分けし、形状は年齢を示す。 c, 低頻度の高感染種であるB. bifidum (SGB17256) (Methods) の系統樹（補足表9）で、株の遺伝的多様性と同一個体のサンプル間および異なる個体間の共有株を示している。各関係タイプについて、系統共有の1例を強調表示した。株共有の事例に関わる木の葉はデータセットごとに色分けされており（拡張データ図1b）、その形状は親族関係を反映している。下図は、2つの時点で採取した個体（6ヶ月未満の間隔、「同一個体」）および無関係な個体（「異なる個体」、拡張データ図3および方法）における種の対の中心nGDの分布で、系統同一性を推測する方法論の適切性を確認するものです。d,e, B. animalis (SGB17278) (d) と、ヒト腸管メタゲノムまたはマウスサンプルおよび発酵食品から再構成したMAGから再構成したS. thermophilus, S. salivarius and S. vestibularis (SGB8002) (e) 株とのペアワイズnGDの分布40. ヒトにおける B. animalis の存在は市販の食事製品の摂取と関連している（Extended Data 図 4a）が、S. thermophilus、S. salivarius および S. vestibularis 株のサブセットのみが発酵食品の摂取と関連している（Extended Data 図 4b）。 f, 関係タイプ間の個人間株共有率（共有株数／共有 SGB 数×100%）。すべての比較は統計的に有意である（Kruskal-Wallis test, n = 26,218, χ2 = 11,420, P < 2.2 × 10-16, post hoc Dunn tests, Padj < 0.05; Supplementary Table 7）。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位と上位四分位を、中心線が中央値を、ひげが四分位範囲（IQR）の1.5倍まで伸びていることを表している。上部の数字は、株共有イベントが検出されなかったペアの割合である。
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メタゲノム解析による微生物株伝播の推定では、通常、株は個人の腸内で少なくとも数ヶ月間持続するが、直接または間接的な伝播がない限り、無関係な個人で見つかることはほとんどないという有効な仮定を利用する19,35,36,37,38。ここでは、まず菌株レベルのプロファイリング手法39 （Methods） を改良し、さらに菌株追跡を改良して、菌株の同一性を種特異的に定義した（Extended Data 図2）。菌株境界は、4カ国からの1,500以上の縦断的サンプルにおいて、同一個体の縦断的菌株保持と無関係な個体のnGD分布を最もよく分離する正規化系統距離（nGD）の閾値を特定することによって設定した20,22,27,28,31（ユーデン指数により5％未満の偽陽性の可能性、すなわち無関係な個体が共有する同一菌株、順列ANOVA (PERMANOVA), n ≥ 50組、R2 = 0.)。 75 to 1%, P < 0.001; Fig. 1c, Extended Data Fig.3, Supplementary Table 3 and Methods). このようなnGDに基づく閾値は、メタゲノム・サンプル中の検出可能な種の多くに典型的に見られるやや低い平均カバレッジ（平均カバレッジ＝7.2×）や、連結したマーカー遺伝子のアラインメントの長さが限られている（平均トリミングアラインメント長＝74,348 nt）状態で構築した系統樹によく適合している。さらに、このアプローチでは、生の一塩基変異（SNV）率や遺伝的類似性を考慮した場合には得られない、系統樹が提供する進化モデルに関する情報を利用している。
マイクロバイオームプロファイリングは、214,000以上のメタゲノム集合ゲノム（MAG）と約138,000の分離ゲノム39のリポジトリで定義された培養代表種（既知種レベルゲノムビン（kSGBs））を補完する、1,022のまだ培養されていない無名種（未知種レベルゲノムビン（uSGBs）と呼ばれる）にも展開された。uSGBsは、検出されたすべての種レベルのゲノムビン（SGBs）の37％を構成し、特に非西洋化社会からの腸内メタゲノム（99％の有病率、全体の相対存在量の中央値42％、方法）において、非常に広く存在することが分かった（腸および口腔メタゲノムの86％、それぞれ17％と10％の相対存在量中央値、）。腸内メタゲノムでは646株（補足表4）、口腔内メタゲノムでは252株（補足表5）、両環境で24株のSGBがプロファイリングされました。開発した計算手法は、あらゆるメタゲノムデータセットからの菌株伝播の推定に利用できるよう公開されている（Methods and Code availability）。
例として、Bifidobacterium bifidum（SGB17256）- 感染を評価した646の腸内SGBの1つ - 1,298の腸内マイクロバイオームサンプル（全便サンプルの17％）でプロファイリングに成功した。その結果、6ヶ月以内に採取された同一人物の2つのサンプルの87%で同一のB. bifidum株が検出され、株間のnGDは明確な二峰性分布（系統的距離がゼロに近い最初のピークが共有株を示す）を示した（図1c）。全体として、13,278例の個人間共有B. bifidum株が、大多数の母親とその子供の間で確認され（潜在的感染よりも検出された株共有の割合、すなわちSGB感染率＝0.93；方法）、また世帯員の間でも確認された（SGB感染率＝0.73）。
直接的な伝播と間接的な獲得や共獲得を区別することは、縦断的なサンプリングや特定の環境（例えば、母親から新生児）でのみ可能であるが、市販の発酵食品から得られた微生物のMAGsまたは分離ゲノムと高い類似性（SNV率0.0015以下）を持つ株を各SGBで識別して廃棄し、共通の食事源から得られる菌株共有を検出できる機会を最小化した40 (Methods)．食品微生物相の調査はまだ不十分であるため、食品から腸へのコロニー形成はまれであると考えられているが、他の菌株や種が食品ソースに由来する可能性がある40。このフィルタリングにより、腸内サンプル中のほとんどの Bifidobacterium animalis (SGB17278) 株 (278 株、全体の 94%; Fig. 1d, Extended Data Fig. 4a, Supplementary Table 6 and Methods) がダウンストリーム解析から除外され、その起源が市販の食事製品にあると推定された20。実際、除外されたサンプルの 98% 以上が欧米化されたデータセットからのものであり、一方、市販のプロバイオティクスがあまり入手できない地域からの非欧米化データセットからは、わずか 6 株（非欧米化サンプルの 0.07% 未満）しか検出されていません。同じ基準で、Streptococcus thermophilus、S. salivarius、S. vestibularis（SGB8002）を含む他の7つのSGBから、食品由来のMAGに系統的に近い 540株を除外した（19株を除外；図1e、拡張データ図4bおよび補足表6）。これらの除外を行った結果、腸内サンプルでは約635万件、口腔内サンプルでは約491万件の異なる個人間での菌株共有が検出されました。
腸内細菌叢の伝播の概要
まず、人間関係における一般的な腸内細菌叢の株共有パターンを評価した。個人間株共有率を、2人の個人間で共有されている株の数を、共通してプロファイリングされているSGBの数で正規化したものと定義した（株レベルでプロファイリングされた646個のSGBのうち；Methods参照）。その結果、6ヶ月未満の間隔でサンプリングした被験者では、菌株の持続性が高いことが確認された20,22,27,28,31（菌株共有率中央値87％）、また、報告されていない摂動やサンプル誤表記の可能性から、検出菌株の経時的重複がない個体がわずか0.5％と、非常に少ないことがわかった。同居している母親とその0～3歳の子供との間で最も高い菌株共有率が検出され（菌株共有率の中央値34％）、次いで同じ世帯の4歳以上の個人（12％）、非同居の成人双子（8％）、同じ村の非同居成人（8％）となっている。成人双生児間の株共有は母親からの持続的な共有感染によるものと考えられるが、同じ村の個人間の株共有は身体的交流や共有環境による水平伝播によるものと思われる。一方、同居していない個体は、同じ集団と異なる集団の研究コホート（以下、「集団」）の異なる村において、最小限の株共有率（中央値0％）を示した（Kruskal-Wallis検定、n = 26,218, χ2 = 11,420, P < 2.2 × 10-16, Post hoc Dunn検定、調整P値（Padj）< 0.05; 図1fおよび補足表7）。この非常に有意なパターンは、検出可能な菌株を1つも共有していない個体の割合によって確認される。母-子ペアのわずか4％が菌株共有イベントを検出しなかったのに対し、同じ集団内の明らかな個人間接触を持たないペアの82％、異なる集団内の最大97％の個体が菌株を共有していない（図1f）。このように、個人間の菌株共有は、共有する環境や血縁関係に基づく社会的距離の勾配に従っており、種レベルの微生物分岐で観察される勾配よりも著しく強い（β多様性指標、クラスカル・ワリス検定とポストホックダン検定、Padj < 0.05; 拡張データ図4bと補足表8）。全体として、我々の統合的な分析は、単一個人の腸内細菌叢を形成する上で、人と人との直接的な相互作用と社会的交流ネットワークの関連性を強調するものであった。
広範な母子感染
母子間のマイクロバイオーム伝播はこれまでにも報告されており9,10,11,29,32,41、今回の拡大サンプルセット（母子711組からの3,598サンプル、うち新規便636サンプル、図1a）では、これまでに報告されたパターンをさらに一般化できるようになった。その結果、菌株共有率と子供の年齢の間に顕著な負の相関があることがわかった（スピアマンの検定、n = 448、ρ = -0.52, P < 2.2 × 10-16; Kruskal-Wallis 検定, χ2 = 156, P < 2.2 × 10-16; Fig. 2a）にもかかわらず、年齢とともに母子共有種数が増加し（中央値：生後1年で17種、3年で37種、18年で57種）、子種に他種由来の種が蓄積されていることが示唆された。生後1年間で、乳児と母親のマイクロバイオームで見つかった種の半分の株を母親と共有しており（株共有率）、乳児で検出された株の16％が母親由来と推定される（Extended Data Fig. 6a and Supplementary Table 10）。最初の数日後、菌株共有率は有意でないもののわずかに減少した9,12（1日、1週間、1年後の菌株共有率中央値はそれぞれ65%、50%、47%、ポストホックダン検定、Padj ≥ 0.05, Supplementary Table 10）。離乳後の身体的親密性の低下と乳児の運動活動の拡大42 に伴い、緊張共有率は1-3歳では27%に低下した（図2a）。母子間負担率は3歳以降に安定し（18歳まで19％、30歳まで14％；図2a）、世帯員間負担率（12％；図1f）に近づいた。出生時の十分な株共有は、母親のマイクロバイオームが乳児の腸に相当程度播種されていることを裏付けるが、株共有は高齢者（50～85歳）においても有意であり、非同居の母子ペアは、無関係の母親よりも有意に多くの株を共有していた（16%対8%、 Wilcoxon順位和検定、n = 17,177, r = 0.09, P = 4.1 × 10-35、拡張データ図6b)。これは、出生時に長期間にわたって行われる母親の微生物刷り込みと、その後の社会環境の共有による株伝達が複合的に作用した結果であると思われる。
図2: 腸内細菌叢の母子共有。
図2
a, 母子間の株共有率（左軸；箱ひげ図および灰色でない点）は減少し、一方、子供における種の豊富さ（右軸；灰色の点）は子供の年齢の関数として増加する（14か国17データセット）。子孫のStrainPhlAnによってプロファイリングされたSGBの数の中央値は、豊かさの代理として使用されている（右軸）。Kruskal-Wallis test, n = 448, χ2 = 156, P < 2.2 × 10-16, post hoc Dunn tests; NS, not significant (Padj ≥ 0.05); 他の比較はすべて有意（補足表10）。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位と上位四分位を、中心線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びていることを表している。b, 生後1年間の母子間SGB透過性の分布。 c, 生後1年間に母子間透過性が高い33種のSGB（SGB透過性＞0.5、母子間透過性が非母子間透過性より有意に高い；方法）のパネルで、特定のデータセット（西洋化-ライフスタイルステータスで分離）および他の年齢区分での透過性（transmiss.）を示している。NS、カテゴリーにおける有意でないSGBの透過性（母子ペア間および非血縁母子ペア間の透過・非透過SGBの数に関するχ2検定、補足表16）。少なくとも3つの伝播の可能性がある比較（少なくとも3つの母子ペアが共有する種）のみを示し、伝播の可能性が3つ以下の比較には点を付した。有病率は、SGBが検出された母子サンプルの割合として定義されている。本研究で得られた新規のデータセットにはアスタリスクを付している。灰色のSGB名は、5%の個体間nGDの菌株同一性閾値を使用している（補足表4）。B. cellulosilyticus-timonensis, Bacteroides cellulosilyticus and Bacteroides timonensis; Bacteroides uniformis-rodentium, Bacteroides uniformis and Bacteroides rodentium; B. pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum; B. ovatus-xylanisolvens-caecimuris.-, B.acteroides caecimuris.
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母親の腸内細菌叢の伝播に影響を及ぼす可能性のある要因としては、ライフスタイルや出産形態が挙げられる14,29。新たに配列決定された非西洋化集団は、母親（Wilcoxon rank-sum test, n = 721, r = -0.37, P = 7.4 × 10-24）およびその子孫（Padj < 0.05, 拡張データ図6）の両方で、西洋化に伴う微生物多様性の減少43、44、45がよく立証されていることを補強するものであった。 05、拡張データ図6cおよび補足表11）、ほとんどの年齢区分で母子間の株共有率に差は見られなかった（Wilcoxon順位和検定、3-18歳を除くすべての年齢区分でPadj≥0.05、補足表12）。実際、西洋化社会と非西洋化社会では、同数の菌株が母体感染していた（Wilcoxon rank-sum test, Padj ≥ 0.05 for all age categories except on 3-18 years; Supplementary Table 13）。したがって、非西洋化集団における高いマイクロバイオーム多様性は、母親によるマイクロバイオーム菌株の伝達によって維持されているのではなく、より多くの個体との密接な相互作用によって獲得されている可能性があるようである。一方、出産形態と母子間の菌株共有の関連性を生後早期に確認した。経膣分娩の乳児（1歳まで）は母親との菌株共有率が有意に高かった（Wilcoxon rank-sum test, Padj < 0.05; 拡張データ図6dおよび補足表14）。しかし、年齢とともに減少する分娩形態の乳児のマイクロバイオームへの影響46と同様に、3歳以降は差が検出されなかった（n = 56, r = 0.2, Padj = 0.18; Supplementary Table 14）。したがって、経膣分娩は、人生の早い時期に母親の伝達を通じて明らかな腸内マイクロバイオームの刷り込みをもたらすが、ライフスタイルの違い（衛生および建築環境の衛生レベルの相違を含む）は、マイクロバイオームの伝達率に実質的に影響を与えないことがわかった。
母親から子供への伝播（菌株共有が減少する前の1歳までの子供で定義、図2a）は種によって大きく異なるが（図2b）、SGBの伝播性はデータセット間でむしろ一貫しており（ペアワイズ・スピアマンの検定、ρ = 0.59-0.83, Padj < 0.05; 補足表15）、種の伝播性は微生物に特有の特徴であることが明らかとなった。10個のデータセット中の高伝達性SGB（SGB51％、伝達率0.5以上、母子感染率が非母子感染率より有意に高い；Methods）はすべて特徴ある種（kSGB）に属し（カイ2乗検定、n＝33、Padj＜0.05；図2cおよび補足表16）、ほとんどがBacteroides属とBifidobacterium属（それぞれn＝16（48％）とn＝5（15％）のSGB；図2c）であることがわかった。例えば、Bacteroides vulgatus（SGB1814）とBifidobacterium longum（SGB17248）は、すべての西洋化データセットにおいて、母親と乳児の間で有意に感染することが検出された（カイ二乗検定、Padj < 0.05、非西洋化データセットでは感染性を評価するほど普及していない；図2c、補足表16と方法論参照）。一方、乳児から検出された他のSGB、例えばRoseburia intestinalis（SGB4951）は、13人の子供と102人の母親から検出されたが、母子感染は極めて稀であった（Supplementary Table 9）。高率に母子感染するSGBは、母親と高齢の子供との間で徐々に共有されなくなることがわかったが（図2c、補足表16）、母親と同居していない高齢者（50〜85歳）でも、52％の高率母子感染SGBの有意な感染性が検出された（図2c、補足表16）。
同居が感染を促進する
世帯員間の腸内細菌叢の類似性はよく知られているが45,47,48,49、菌株レベルの分解能がないため、ほとんどの研究では、より高い分類レベルでの類似性が微生物の伝播を反映しているか、むしろ同様の条件（例えば、遺伝学や食事）による調節なのかを結論づけることはできなかった。腸内細菌の水平伝播を調べるために、我々は4大陸の8つの集団から212世帯の883人の同居人（4歳まで）の間で菌株共有を評価した（図1a）。この集団は、農村部における伝統的な自給自足から17、23、30、34、発展途上大都市における混雑状況23、中規模工業化豊か都市27まで驚くほど多様なライフスタイルを有している。同棲している世帯の方が、同棲していない世帯よりも、人対人の歪み共有率が有意に高い（11％～71％）世帯が多かった（64％、ウィルコクソン順位和検定、Padj < 0.05； 中央値で28％～778％、異なる世帯間と比べて増加、図3aおよび補足表17）。種レベルのマイクロバイオームの類似性（β多様性指標、拡張データ図4b）については、同居している個体と同居していない個体の間でより弱い差が見られた（3％～9％の増加、クラスカル・ワリス検定およびポストホックダン検定、Padj < 0.05、補足表8）。個人間の歪み共有は世帯間で大きく異なるが（Kruskal-Wallis検定、n = 1,632, χ2 = 223, P = 2.8 × 10-45）、西洋的なライフスタイルとの関連はわずかであり（Wilcoxon rank-sum test, n = 1,632, r = -0.22, P = 2.2 × 10-18）、環境・社会変数の影響は限定的と思われる。同居者間の菌株共有率は年齢とともに低下し（4歳未満 vs 4歳以上のWilcoxon rank-sum検定、n = 1,843, r = -0.12, P = 1.3 × 10-7）、幼少期のコロニー形成抵抗性は低いと考えられた6, 32. 一方、非家系由来株（世帯員の誰とも共有していない株と定義）は、累積暴露量の増加に伴って予想通り年齢とともに増加した（4歳未満 vs 4歳以上でWilcoxon rank-sum test, r = 0.20, P = 4.9 × 10-8）。
図3：世帯内および世帯間の腸内細菌叢の伝達。
図3
a, 少なくとも4人の同居人がいる72世帯（n = 883）における一対の個人間株共有率（共有株数/共通するSGB数×100％）。破線は同じ村の異なる世帯の個人間の共有率の中央値を示す。灰色で塗りつぶした箱は、世帯内歪み共有率が同一集団の世帯間共有率より有意に高くない世帯を示す（Wilcoxon rank-sum two-sided test, Padj ≥ 0.05; Supplementary Table 17）。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位と上位四分位を、中心線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びている。本研究で得られた新規のデータセットにはアスタリスクを付している．ポストホックダン両側検定，n = 282，***Padj < 10-4 (補足表18)．箱ひげ図では，箱の縁が下位四分位と上位四分位を，中心線が中央値を，ひげがIQRの1.5倍までを示す．d, 世帯内SGBの透過性のヒストグラム。 e, 世帯内SGBの透過性が高い21種（SGB透過性＞0.5、世帯内透過性が世帯間透過性より著しく高い）のパネルで、特定のデータセットと非同棲成人双生児における透過性を示している。NS、カテゴリーにおける有意でないSGBの伝達性（世帯ペア間および異なる世帯のペア間のSGBの伝達および非伝達の数に関するカイ二乗検定；補足表20）。少なくとも3つの伝播の可能性がある比較（少なくとも3組の同居ペアが共有する種）のみを示し、伝播の可能性が3つ以下の比較には点を付けた。有病率は、SGBが検出されたサンプルの割合として定義されている。本研究で得られた新規のデータセットにはアスタリスクを付している。灰色のSGB名は、5%の個体間nGDの菌株同一性閾値を使用している（補足表4）。S. thermophilus-salivarius-vest., S. thermophilus, S. salivarius and S. vestibulari.。
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次に、親子間、兄弟間、パートナー間の菌株共有について、親族関係が判明している4つの集団で評価した。すべての家族関係は、異なる世帯の比較に比べて有意に高い株共有率を示したが（ポストホックダン検定、n = 282、Padj < 0.05; 図3bおよび補足表18）、それらの間に有意差は検出されなかった。4歳以上の子どもでは、母親と父親の株共有率はほぼ同じであり、パートナー間よりも遺伝的に関係のある若い（つまり、コロニー形成が進んでいない）兄弟間での株共有率がわずかに高かった（ただし有意ではない）。同居が後年の菌株共有にどの程度影響するかを評価するために、過去に同居していた非同居の成人双子（英国で発表された3つの横断的データセット2、25、33から1,734サンプル）のメタゲインを分析した（一卵性双生児と二卵性双生児の両方を含む）。双子ペア間の系統共有は、離れて暮らした年数（スピアマンの検定、n = 708, ρ = -0.30, P = 9.2 × 10-15）と年齢（一般化線形モデル (GLM), n = 648, β = -0.58, P = 7.1 × 10-18; 図3c）に応じて有意に減少した。また、一卵性双生児は二卵性双生児に比べ、同居後数十年で系統共有率が高く、過去の同居の影響を超えた中程度の遺伝的効果が見られた（ウィルコクソン順位和検定、Padj < 0.05; 拡張データ図7および補足表19）。最後に、双子が離れて暮らした年数を除算すると、年齢に関連した株共有がより緩やかに減少すること（GLM、n = 648、β = -3.9 × 10-3, P = 0.02）から、成人におけるマイクロバイオームの伝播に同居が影響し、遺伝学や年齢よりも大きな数量効果があるという証拠がさらに示されました。したがって、成人の双子における菌株共有は、両親からの共有伝播の長期的な影響というよりも、過去の同居の結果である可能性がある。
10種類の細菌属からなる21種のSGB（評価対象SGBの4％）は、世帯員間で高度に伝播した（SGB伝播率＞0.5、世帯内伝播率が世帯間伝播率より有意に高い；図3d、e、補足表20および方法）。母子感染とは対照的に、世帯内SGB感染率はデータセット間で一貫しておらず（ペアワイズ・スピアマンの検定、Padj ≥ 0.05; 補足表21）、西洋風生活と非西洋風生活の間でSGB感染率に大きな違いが見られ（図3e）、両者のマイクロバイオーム構成の相違と一致していた30,45,50,51。高感染性SGBの大部分（38％）は、属する種（n = 1）または属（n = 7）に対して特徴的な分離株またはゲノム（uSGBs）を持たない種であった。家庭内で感染率の高いBifidobacteriumとBacteroidesのほとんどは、母親から子供への感染率が高い種と一致しており（図2c、3e）、これらは感染様式に関わらず効率的に伝播することを示唆している。一方、Bifidobacterium angulatum（SGB17231）は、家庭内で優先的に伝播することが明らかにされた。また，世帯内で伝播性の高い菌株は，離れて暮らす双子ペアでも共有される傾向があり（伝播性の高い21菌株の94％；図3eおよび補足表20），伝播菌株の一部残存性が示唆された．
集団に沿った微生物伝播
村内の非同居者は、腸内細菌叢の無視できない菌株共有を示したが、同じ世帯のメンバーよりも著しく低い割合だった（Kruskal-Wallis検定、7データセットでn = 1,132 サンプル、χ2 = 1,721, P < 2.2 × 10-16; Post hoc Dunn 検定、 Padj < 0.05; 拡張データ図8a、補足 表22）。村内の菌株共有率は集団内で大きく変動していたが（図4a）、67％の村で、同じ村の異なる世帯の個人は、異なる村の個人よりも菌株共有率が有意に高かった（Wilcoxon rank-sum test, Padj < 0.05; Supplementary Table 23）（7集団中5つの村で調査済み）。このように、人から人へのマイクロバイオームの伝播は、より離れた接触者間の相互作用によっても起こり、集団構造の影響を受ける可能性がある4,17。実際、我々は、集団内および集団間のマイクロバイオーム株伝播が、種の共有（種の共有ネットワークにおけるユークリッド距離に関するPERMANOVA、n = 951、R2 = 46%、P = 10-2；図4bおよび方法）よりも顕著に強い程度で、ホスト集団構造を再現することを見いだした（種の共有ネットワークのユークリッド距離に関するPERMANOVA、n = 951、R2 = 11%、P = 10-2； Extended Data 図8b）。
図4: 村と集団に沿った腸内細菌叢の伝達。
図4
a, ある村の異なる世帯における個人間菌株共有率（n = 1,132）。破線は、同じデータセットの異なる村の個人間の株共有率の中央値を示す。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位と上位四分位を、中央線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びていることを表している。灰色で塗りつぶしたボックスは、村内と村間の個人間菌株共有率に有意な差がないことを示す（Wilcoxon rank-sum two-sided test, Padj ≥ 0.05; Supplementary Table 23）。 b, 集団構造を示す世帯データセットにおける個人の腸内細菌叢菌株共有教師なしネットワーク。c, 異なる世帯の個人間で高度に伝播したSGB（SGB伝播率＞0.5、集団内伝播率が集団間伝播率より有意に高い）、および特定のデータセットにおけるこれらのSGBの伝播率（西洋化状況によって分類）。NS、カテゴリーにおける有意でないSGBの伝播性（世帯間ペア間および異なるデータセットにおけるペア間のSGBの伝播および非伝達の数に関するカイ二乗両側検定；補足表24）。少なくとも3つの感染の可能性がある比較（少なくとも3組のペアが共有する種）のみが表示され、3つ未満の感染の可能性がある比較は点で表示されている。有病率は、SGBが検出されたサンプルの割合として定義される。本研究で得られた新規のデータセットにはアスタリスクが付されている。
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4種のSGB（0.8％）のみが全体として高い集団内伝播性を示したが（SGB伝播性＞0.5、集団間伝播性より集団内伝播性が有意に高い；図4c、補足表24および方法）、集団内種伝播性はデータセット間で非常に一貫性があった（データセットごとのSGB集団内伝播性に関するペアワイズ・スピアマン検定、ρ＞0、Padj＜0.05；補足表25）。3つの高伝達性SGBは、ヒトマイクロバイオームのメンバーとして知られている。B. angulatum（SGB17231、有病率4％）、Streptococcus parasanguinis（SGB8076、日和見病原体代表52、16％）、S. thermophilus, S. salivarius and S. vestibularis（SGB8002、プロバイオティクス53としてよく使われる株を一部含む、37％）であり、健康関連種と潜在的病原種がともに効率的に拡散しうることが示唆される。また、Ruminococcaceae科の未同定種も高感染SGBのひとつであった（SGB15073、有病率1％）。S. thermophilus, S. salivarius, S. vestibularis, B. angulatumも家庭内で高感染していたが、S. parasanguinisとSGB15073が非同居者間で特異的に高感染していることから（図2c、3e）、異なる伝播メカニズムが示唆された。
ほとんどが口腔内水平伝播
口腔内細菌株は、唾液を直接媒介とすることができるため、腸内細菌株よりも個人間で容易に伝播すると考えられるが54、個人間の口腔内細菌株伝播については、まだ十分に調査されていない17,54,55。我々は、米国の家庭で新たに配列決定された1,929のメタゲノム（USAデータセット）と、フィジー諸島の集団から公開された140の唾液メタゲノム17を用いて、252のSGBの株レベルのプロファイリングにより口腔内菌株共有パターンを評価した（Methods）。その結果、腸内細菌群の菌株共有と同様に、共有環境や血縁関係による菌株共有率の勾配が検出された。同棲している個体の口腔内菌株共有率の中央値は32%であったが、同じ集団や異なる集団の非同棲個体はそれぞれ3%と0%を共有していた（クラスカル・ウォリス検定、N = 2,069, χ2 = 41,317, P < 2.2 × 10-16; Fig.5 a）。このように、同居者は非同居者に比べて口腔内の菌株共有率が10倍高く、種レベルのマイクロバイオームの類似度が0.5倍未満であるのとは対照的であり（拡張データ図5bおよび補足表26）、世帯員間の菌株伝達が、類似条件やライフスタイルによる種レベルのマイクロバイオーム収束よりも遺伝子マイクロバイオーム組成の強いドライバーとなっていることが示唆される。また、同じ世帯のメンバーで1つの菌株を共有していないのは0.5%未満であり、集団内ペアの18%、集団間ペアの65%とは対照的である。このことは、細菌口腔菌株の個人間伝播が腸内マイクロバイオーム伝播よりも頻繁に起こることを示している（Fig. 1f）。
図5：口腔内マイクロバイオームの伝播
図5
a, 関係性間での個人間株共有率（共有株数/共通するSGB数×100%）（n = 2,069）。すべての比較は、特に断らない限り統計的に有意である（Kruskal-Wallis検定、n = 26,218, χ2 = 11,420, P < 2.2 × 10-16, Post hoc Dunn 両側検定、Padj < 0.05; 補足表28）。b, 母-子および父-子の共有率（共有株数／共通するSGB数×100%）（n = 2,069） （左軸；箱ひげ図および非灰色点）および子で検出されたSGB数の中央値（右軸；灰色点）. ポストホックダン両側検定、補足表29。すべての比較は、特に断りのない限り、多重検定補正後に統計的に有意である。箱ひげ図では、箱の縁が下位四分位と上位四分位を、中心線が中央値を、ひげがIQRの1.5倍まで伸びていることを表している。c, 同居する個人間の系統共有率は正の相関がある（スピアマンの両側検定、母子・父子：n = 637, ρ = 0.52, P < 2.2 × 10-16; 母子・パートナー：n = 611, ρ = 0.21, P = 1.2 × 10-7; 父子・パートナー：n = 611, ρ = 0.38, P < 2.2 × 10-16 ）。破線は対角線で、母子間系統連鎖率と父子間系統連鎖率は等しい。d, 年齢区分や4歳以上の世帯員の間で、母子間で高度に感染するSGBの持続性（SGB感染率が0.5以上、世帯内感染率が世帯間感染率より有意に高い）。Ca.、Candidatus。
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年齢と親族関係に関連する明確なパターンが浮かび上がった：腸内細菌群のパターンとは対照的に、口腔内菌株共有率は子孫の年齢とともに増加した（スピアマンの検定、n = 658、ρ = 0.15、P = 1. 9 × 10-4（母-子孫、n = 643、ρ = 0.24、P = 7.1 × 10-10（父-子孫））、特に3歳以降に増加した（Kruskal-Wallis test, χ2 = 31, P = 1.7 × 10-7 for mother-offspring, χ2 = 58, P = 2.4×10-13 for father-offspring）． 4 × 10-13 for father-offspring, post hoc Dunn tests, Supplementary Table 27）、子供の口腔内マイクロバイオームにおける微生物種の蓄積の増加と一致した（1歳までの母親と子供の共有種中央値49、父親と子供の共有種55から18歳までの母親と子供の共有種中央値85、父親と子供の共有種86；スピアマンの検定、n = 658, ρ = 0. 21, P = 6.2 × 10-8; 図5b)。しかし、母親との関係（30%）や父親との関係（24%）よりも、パートナーとの関係（中央値38%）の方が、より親密な関係を反映してか、やや高い系統共有率であった54。母子間の共有率は、年齢層を超えて父子間の共有率よりも高い傾向があり（ポストホックダン検定、Padj < 0.05; 付表29）、母乳育児による接触や刷り込みの結果である可能性がある。しかし、両者の共有率は年齢が上がるにつれてわずかに増加するものの（1歳未満6％→18歳未満8％；図5b）、それぞれの親と別々に共有している株の方がさらに多かった（母親で17～21％、父親で13～17％）。全体として、親からの菌株の伝達は、幼少期の口腔マイクロバイオーム形成に特に影響を与えるものではなく、むしろ接触期間に依存する水平伝播様式を利用しているように思われる。
家族内の口腔内菌株の伝播は、世帯によって大きく異なり（0～75％）、サンプルサイズが異なる2つのデータセットに基づいてライフスタイルとの関連について結論を出すことはできませんが、評価したすべてのタイプの親族関係において、世帯内の菌株共有の間に有意な相関を見出しました（図5c）。母子世帯の系統共有率は父子世帯の系統共有率（スピアマンの検定、n = 637、ρ = 0.52、P < 2.2 × 10-16）、パートナーの系統共有率（スピアマンの検定、n = 611、ρ = 0.21 、P = 1.2×10-7） と相関していました。また、父子間の緊張共有率は、パートナー間の緊張共有率と相関していた（スピアマンの検定、n = 611、ρ = 0.38、P < 2.2 × 10-16）。このことから，密接に相互作用している家庭は，血縁関係にかかわらず，同居するすべての人々の間で経口的な菌株の伝播に有利であると思われる．
次に，親子間および世帯間の口腔内細菌種伝播性を評価した（補足表30）．16属18種（うち半数はuSGB）は，母親と1歳までの乳児の間で有意に高い共有率を示した（評価した全SGBの19％，SGB伝達率＞0. 5、母子間より母子内が有意に高い；図5d）、その中には2つのPrevotella属（Prevotella histicola (SGB1543) および Prevotella pallens (SGB1564) ）とほとんど未同定の2つの放線菌（SGB17132 および SGB17167；補足表31）が含まれていた。1歳までのSGBの感染率は1-3歳（スピアマンの検定、n＝95、ρ＝0.73、P＜2.2×10-16）および3-18歳（n＝95、ρ＝0.78、P＜2.2×10-16）で強い相関を示したが、3歳以上の感染率は5人しかいなかった。 2 × 10-16）、第1（1年まで）と第2（1〜3年）の年齢ビンの間で5種だけが高伝達として持続し、第3（3〜18年）の年齢ビンまで持続し、さらに最大68種が現れた（図5dおよび補足表31）。これらの68種の後発種は、持続する3種の高家内感染SGBを含む、有意に高い家内感染性（評価したSGB全体の28％；補足表32）を示した70種（uSGB28種を含む）と高い一致を示した。一方、同居していない個体間で高い感染率を示した種はなかった（補足表30）。このように、特徴の乏しい3種のSGBは、一貫して強い経口感染の可能性を示していた。Actinomyces sp. ICM47 (SGB17167), Candidatus Saccharibacteria bacterium TM7 (SGB19822), and a uSGB of the family Flavobacteriaceae (SGB2532) （図5dおよび拡張データ図9）.
感染様式に関連する表現型
腸内細菌種の伝播性は、多様なライフスタイルを持つ地理的に離れたデータセット間で非常に一貫していた（Spearmanの検定、Padj < 0.05; 母子間：71％、集団内：75％の有意な関連性。75%の有意な関連；補足表15、21、25、伝達性の推定値は0〜100%の範囲）。同時に、腸内細菌種は特定の様式で優先的に感染することが多かった56（23％のSGBは1つ以上の様式で高度に感染した；図2c、3e、4c）。一方、感染モード間で高度に感染した経口SGBは、ほぼ重なり合っていた（図5d）。種の伝達性は、集団における相対的な存在量の中央値や有病率のいずれもその伝達性と正の相関を示した（スピアマンの片側検定、Padj ≥ 0.05; 補足表33）ため、伝達の集団作用モデルには主に従わないようであった。
有病率と伝播性の間に直接的な関係がないことは、異なる様式による種の伝播性が特定の形質であることと一致する。そこで次に、環境中の持続性に関連する表現型特性3,4が、我々が検出したパターンをよりよく説明できるかどうかを検討した。株レベルでプロファイリングした腸内細菌群の58％および口腔内細菌群の24％はまだ培養されていないため、ゲノム配列に基づいて細菌の表現型を推定した（Methods）。予測された表現型は、実験的に決定された形質がある場合、90％以上の一致を示した（補足表34および方法）。腸内細菌と口腔内細菌の伝播様式は、特定の表現型と関連していた（図6）。一般に除菌・消毒剤57に対する耐性が高いグラム陰性菌は、腸内母体および家庭への伝播性が向上し（SGB伝播性の第1対第4四分位値に関するウィルコクソン順位和検定、n = 35, r = -0.59, Padj = 2.0 × 10-3 および n = 213, r = -0.40, Padj = 2.2 × 10-8, respectively）、家庭内口移しが増加（n = 126, r = -0.22, Padj = 0.04 ）していることが明らかになった。長距離の腸内集団内伝播には、より強力な環境生存メカニズム、すなわち耐空性と胞子形成が必要であった（n = 268, r = 0.16, Padj = 0.03 および n = 280, r = 0.10, Padj = 0.04, respectively）。プロファイリングされた腸管SGBの10%未満が酸素耐性と予測されたのに対し、経口SGBの66%以上が酸素耐性であり、耐空性は経口SGBの感染性とは関連がなかった（図6）。最後に、乳児の腸内に頻繁に生息するが不安定な運動性の種58は、運動性のないSGBよりも母親から子供への感染頻度が低く（n = 35, r = -0.43, Padj = 0.03）、運動性と病原性の関連性を考えると有益である可能性がある59。全体として、我々の結果は、環境中での生存を促進する微生物の表現型特性が、少なくとも部分的に人から人への腸内細菌叢の伝播ダイナミクスを調節することを示唆しているが、口腔内細菌叢の伝播については顕著に弱い関連が見いだされた。
図6：腸内・口腔内の種の伝播性と表現型特性の関連性。
図6
SGBの表現型はTraitar60を用いて推定した（Methods）。SGBの透過性と予測される表現型の間の関連性は、各伝達様式および環境について、最も高い透過性を示すSGBの25％についてWilcoxon rank-sum 両側検定で評価し、最も低い透過性を示すSGBの25％と比較した。色はWilcoxon r統計量を表し、有意なPadj値は黒（Padj < 0.05）、それ以外はグレーで示した。
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結論
多様な集団におけるマイクロバイオーム伝播の統合的なマルチコホート研究により、これまで見過ごされていた広範な個人間伝播が示された。このことは、すでに示唆されている仮説3,4,5,16を裏付け、長期間にわたって密接に接触している個人間での微生物株の移転が、マイクロバイオームの個人の遺伝的構成、ひいては代謝や宿主-微生物相互作用の潜在能力を形成する主要因であることを明らかにするものであった。予想通り、生後1年間は母親と乳児の腸内細菌群の間で株の共有率が最も高かったが9,10,12,29,32（中央値50％）、同居中の個人間でも、共有株は腸および口腔内細菌群の種の12％と32％をそれぞれ占めた（図1fおよび図5a）。このような効果は、たとえ成人期になってから相互作用が始まったとしても、密接な物理的相互作用によって誘発される可能性があり（パートナー間の腸内・口腔内菌株共有率はそれぞれ13%と38%、図3bと5a）、双子が離れて暮らして30年後には、最初の約30%の菌株共有率が約10%に減少しており、長期間のうちに部分的に可逆的であることが分かりました（図3c）。この結果は、社会的相互作用がマイクロバイオームの形成に無視できない影響を及ぼすことを明らかにしたものであり、これはマイクロバイオーム関連疾患に関与する可能性があるため、ヒトマイクロバイオーム研究における個人間株伝播の検討を必要とする。
一方、ライフスタイルの違いは、マイクロバイオーム感染ダイナミクスにほとんど影響を及ぼさないことが分かりました。食事、医療施設や医薬品へのアクセス、衛生状態などの特徴に基づいて、西洋化または非西洋化と緩く定義された集団におけるマイクロバイオーム構成の大きな違いにもかかわらず（方法）、垂直および水平方向の株共有率が驚くほど似ていることが分かりました。この知見の頑健性を確認するためには、より大規模で多様なコホートと参加者のライフスタイルや文化的慣習に関するより詳細なメタデータが必要であるが、今回の結果は、異なる集団における類似した微生物のコロニー形成抵抗性が、感染事象の内在率よりも持続的コロニー形成に重要である可能性を示唆しているのかもしれない。また、非西洋化社会で観察される微生物の豊かさ34,43は、他の世帯員からの感染促進によるものではなく、むしろ微生物の多様性を支える食事や生活習慣だけでなく、環境との相互作用の結果であることが示唆された。
特に高い感染率を示す種（図 2c、3e、4c、5d）は、ゲノムおよび表現型の特徴をより深く理解するための出発点となり、その結果、感染メカニズムが明らかになるはずである。本研究は、人から人へのマイクロバイオーム伝播が直接的であるかどうか、またその方向性を明らかにすることはできませんでしたが、ヒトにおけるマイクロバイオーム伝播の系統的な概要を提供しました。ヒトの日常的な社会的交流ネットワークの変化（例えば、家庭の変化に伴うもの）や他の社会的動物における変化をモデル化した特定の研究デザインを用いれば、人から人へのマイクロバイオーム伝播やその方向性についてさらなる洞察を得ることができるだろう。私たちが用いた改良型菌株追跡法は、これまで培養されていなかった種の菌株レベルのプロファイリング39と、系統的距離に基づく種固有の菌株の定義を含んでおり、80万株以上に相当する大量のサンプルに対応することができました。しかし、今後、より深いシーケンシング、ロングリード技術、あるいは単一細胞アプローチによって全ゲノム解像度を持つ研究が行われれば、これらの知見をさらに明確にし、洗練されたものにできるかもしれない。全体として、我々の結果は、現在非感染性と考えられているいくつかの疾患や状態は再評価されるべきであり5、感染性と社会的ネットワーク構造を考慮することで、将来のマイクロバイオーム調査や調節アプローチの設計が改善されるという仮説を補強するものである。
研究方法
メタゲノムデータセット
健常母子、世帯、双子ペア、村、集団間のマイクロバイオーム伝播を評価できるメタデータを持つ31のヒトメタゲノムデータセット（合計：5.17×1011リード、平均：5.32×107リード/サンプル）から合計9,715サンプル（つまり、同居情報）を本研究に組み込むために選択しました（補足表1および2）。また、被験者内の菌株保持率を評価し、菌株同定の種特異的な操作定義を設定するために、被験者内の菌株保持率を評価するために、少なくとも2つのサンプルが6ヶ月未満の間隔で採取され、介入（抗生物質や薬物治療、特定の食事など）が行われていない健康な個人から少なくとも15人のサンプルで、公開されている便ショットガンメタゲノムデータセットを含めた。 25件のデータが公開されていたが、そのうち3件はこの研究で14（フェレッティP_1989）、32（ガーナデータセット34）および61（タンザニアデータセット34）サンプルに拡大されていた。新たに含まれるサンプルは、元の出版物に記載されたプロトコルに従って収集・処理された。さらに、8つのデータセット（合計：2,800サンプル）は、以下に述べるように、本研究の文脈において、同様の方法を用いて新たに収集し、配列決定しました（ただし、サンプル処理、DNA抽出、配列決定ライブラリー調製の違いは、系統共有を推測するために用いる系統間距離に直接影響を与えません）。
一貫したメタデータの収集と整理
サンプルおよび被験者の識別子、時点、被験者の年齢、性別、出産形態（経膣分娩または帝王切開）、家族の識別子、家族関係、双子の接合性および双子が離れた年齢、村、国に関するメタデータは、リソースに含まれている場合は curatedMetagenomicData 3.0.0 (ref. 61) から、それ以外は論文の補足資料または特定のリポジトリから取得した。新規に配列決定されたサンプルを含むすべてのメタゲノムのメタデータは、curatedMetagenomicDataのフォーマットで整理され、補足表2に掲載されています。パートナーは、世帯を共有している夫婦と定義した。集団は、地理的な観点ではなく、西洋化されたライフスタイルの採用としてみなされる西洋化状況（西洋化または非西洋化）に基づいて分類され、一般的に高度に加工された食品（脂肪分が多く、複合炭水化物が少なく、精製糖と塩分が豊富）に富む食事の摂取、医療・医薬品へのアクセス、衛生・公衆衛生状態、家畜への接触の減少、人口密度の増加として定義されました。この分類は、研究に含まれる集団が上記の基準でどのように異なるか、また、原著論文でサンプルがどのように報告されているかという入手可能な情報に基づいている。この2分類には明らかな限界があることを認めつつ62、人から人へのマイクロバイオーム伝播と宿主のライフスタイルの関連性を洞察することができる。
新規に配列決定されたメタゲノムデータセット
アルゼンチンデータセット
アルゼンチンの農村部（Villa Minetti, Esteban Rams, Pozo Borrado, Las Arenas, Cuatro Bocas, Logroño, Montefiore and Belgrano; Santa Fe province; 補足表2）の母親（16-37歳）およびその1歳未満の乳児13人（ここでは非西洋化集団として考慮）が本研究に参加しました。DNAはQIAamp DNA stool kit (Qiagen)を用いて糞便サンプルから製造者の指示に従い抽出した。配列決定ライブラリーは、Nextera DNA Flex Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、メーカーのガイドラインに従って調製した。シーケンシングはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで製造元のプロトコールに従って行った。
コロンビアのデータセット
コロンビアのカリブ地域のワユ族コミュニティ（Etkishimana、Koustshachon、Paraiso、Invasión、Tocomana、Warruptamana、Wayawikatのコミュニティ、補足表2）-ここでは非西洋化集団と見なす-の母親（15～40歳）とその生後6カ月未満の乳児12人を研究に参加させた。便サンプルからのDNA抽出は、Master-Pure DNA extraction Kit (Epicentre)を用い、製造元の指示に従い、以下の修正を加えた。サンプルをリゾチーム (20 mg ml-1) とムタノライシン (5 U ml-1) で37℃、60分間処理し、ビーズレーター FastPrep 24-5G Homogenizer (MP Biomedicals) により6 m s-1 で1分間直径3μmガラスビーズを用いて細胞を破壊するという予備段階を経た。DNAの精製は、DNA Purification Kit (Macherey-Nagel) を用いて、メーカーの説明書に従って行った。DNA濃度はQubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies)を用いて測定し、さらに解析を行った。Nextera DNA Flex Library Preparation Kit (Illumina)を用いて、製造者のガイドラインに従ってシーケンスライブラリを調製した。配列決定は、Illumina NovaSeq 6000プラットフォームで、製造元のプロトコルにしたがって実施した。
中国_データセット
Qidong市（中国江蘇省）の116人の非老年者と百寿者（女性97人、男性19人、94-105歳）およびその子孫231人（女性79人、男性152人、50-85歳）を登録した（ここでは西洋人集団と見なす）63。参加者は全員、登録時に大きな病気を患っていなかった。新鮮な便サンプルが上海第十病院で採取され、採取後-20℃で保存された。DNAはEZNA Stool DNA Kit (Omega Bio-tek)を用いて、メーカーの説明書に従って抽出された。DNAの完全性とサイズは1%アガロースゲル電気泳動で評価し、DNA濃度はNanoDrop (Thermo Fisher Scientific)で決定した。DNAライブラリーは、TruSeq DNA Sample Prep v2 Guide (Illumina) に従って、2μgのゲノムDNAと平均500bpのインサートサイズで構築された。ライブラリーの品質はDNA LabChip 1000 Kit (Agilent Technologies)で評価した。配列決定は、Illumina HiSeq 4000プラットフォームで150 bpペアエンドリード長で実施した。
中国_2データセット
中国の農村部（中国北西部、陝西省ビン県）の母親8人と1歳未満の乳児19人が、大規模研究（ClinicalTrials.gov NCT02537392）の一部として登録され、ここでは非西洋化集団と見なした。DNAはQIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen)で抽出し、エタノールで沈殿させた。配列決定ライブラリーはNextera DNA Flex Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、メーカーのガイドラインに従って調製した。シーケンシングはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで製造元のプロトコールに従って行った。
ギニアビサウデータセット
ブバケ島（ギニアビサウ、ビジャゴス諸島）の74世帯の342人のボランティア（0～85歳）-ここでは非西洋化集団と見なす-から、以前の研究64の一部としてサンプルを収集しDNA抽出を行った。簡単に言うと、サンプルは基準研究所で-20℃に冷凍保存された。ホモジナイズと洗浄の後、DNeasy PowerSoil PROキット（Qiagen）を用いてDNAを抽出し、カスタム修正を加えた64。シーケンスライブラリーは、Nextera DNA Flex Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、製造者のガイドラインに従って調製した。シーケンシングはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで製造元のプロトコールに従って実施した。
イタリア_1データセット
イタリア、トレントのサンタキアラ病院に、4人の母親（37-46歳）とその子供8人（0-2歳）が登録され、彼らはここでは西洋人集団と見なされている。母親の便は、出産時または出産直後に病院スタッフが糞便採取管（Sarstedt社製）を用いて採取した。乳児の便サンプルは母親が採取し、採取時に-20℃で凍結し、1週間以内に-80℃の施設に移動した。合計48検体が採取された（補足表2）。DNAはPowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories）を用いて、HMPプロトコル（Human Microbiome Project Consortium）65に記載されているように抽出し、予備加熱工程（65℃ 10分、95℃ 10分）を追加した。DNAは10 mM Tris pH7.4で回収し、Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) フルオロメーターを用いて、製造者の指示に従って定量した。NexteraXT DNA Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、製造者のガイドラインに従ってシーケンスライブラリーを調製した。シーケンシングはIllumina HiSeq 2500プラットフォームで実施した。
イタリア_2データセット
合計19人の母親（30～47歳）と37人の健康な子供（0～11歳）が、イタリア、ジェノバのIRCCS Istituto Giannina Gasliniに大規模研究の一部として登録され、ここでは西洋人集団とみなしている。便サンプルはDNA/RNAシールド糞便採取チューブ（Zymoresearch）に採取し、DNA抽出まで-80℃で保存した。DNA抽出はDNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen）を用いて、製造元の手順に従って行った。DNA濃度はNanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher scientific)を用いて測定し、-20 °Cで保存した。NexteraXT DNA Library Preparation Kit（Illumina）を用いて、製造元のガイドラインに従ってシーケンスライブラリーを調製した。シーケンシングはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで製造元のプロトコールに従って行った。
米国データセット
SPARKコレクションのNYゲノムセンターコホートの646家族からの合計1,929の唾液サンプル（Western IRB（https://www.wcgirb.com/）、プロトコル追跡番号。WIRB20151664、ここでは欧米人集団とみなす）を解析対象とし、母親640サンプル（22～55歳）、父親631サンプル（23～67歳）、正常発育中の子供658サンプル（0～18歳）から構成される。唾液はOGD-500キット（DNA Genotek）を用いて採取し、DNAはChemomagic MSM1/360 DNA抽出装置を用いて抽出し、PreventionGenetics (Marshfield) で110ulのTEバッファに溶出させた。配列決定ライブラリーは、Illumina DNA PCR-Free Library Prep kit（Illumina）を用いて、製造者のガイドラインに従って調製した。シーケンスはIllumina NovaSeq 6000プラットフォームでS2/S4フローセルを用い、メーカーのプロトコールに従って実施した。
メタゲノム前処理と品質管理
新たに配列決定した便サンプルは、https://github.com/SegataLab/preprocessing に記載されているパイプラインを使用して前処理を行った。メタゲノムリードの品質管理を行い、低品質リード（品質スコア<Q20）、断片化したショートリード（<75 bp）、2塩基以上のあいまいなリードはTrim Galore（v0.6.6）で除去しました。Bowtie2（v2.3.4.3）66 で -sensitive-local パラメータを使用して汚染DNAと宿主DNAを同定し、phiX 174 Illumina spike-in およびヒト関連リード（hg19 human genome release）を確実に除去することができました。残った高品質リードをソート・分割し、各メタゲノムについて標準的なフォワードリード、リバースリード、アンペアリードを出力ファイルとして作成しました。
新たに配列決定した唾液サンプルは、https://github.com/SegataLab/preprocessing に記載されているパイプラインのカスタムバージョンを使用して前処理を行いました。メタゲノムリードの品質管理を行い、低品質リード（品質スコア<Q20）、断片化したショートリード（<75 bp）、2塩基以上の曖昧なリードを除去しました。Bowtie2（v2.3.5.1）66 の「end-to-end」グローバルモードで汚染DNAと宿主DNAを同定し、ヒト関連リード（hg19）を確実に除去することができました。残った高品質なリードをソート・分割し、各メタゲノムについて標準的なフォワードリード、リバースリード、アンペアリードの出力ファイルを作成しました。
便および唾液サンプルのリード統計（リード数、塩基数、サンプルあたりのリード長最小値および中央値）の詳細を補足表2に示す。300万リード以上のメタゲノムが解析に含まれ（n = 7,646 stool, n = 2,069 oral）、シーケンスの深さが不十分なメタゲノムは除外された（n = 97 stool, n = 0 oral）。
拡張されたSGBデータベース
160,267個のMAGと75,446個の単離株のシーケンスゲノムを含むカスタムデータベースをref.30から取得しました。30から取得し、本研究で拡張したイタリアの母子データセット9からの184のMAG、イタリアの百寿者67からの1,439のMAG、非西洋化集団の個人の便サンプルから得られた3,584のMAG34、2, 985 ヒト以外の霊長類の便試料から得た MAG68、牛のルーメンから得た MAG69、マウス試料から得た MAG14,097 70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83, シロアリの MAG1,235 (PRJNA365052, PRJNA365053,PRJNA365054,PRJNA365049,PRJNA365050.PRJNA36003, PRJNA36004,PRJNA36006, PRJNA36007), シロアリの MAG2,577, 3,840,000, 4,940,000, 4,000,000個を集めたもの。PRJNA365051、PRJNA405700、PRJNA405701、PRJNA405702、PRJNA405782、PRJNA405783、PRJNA366373、PRJNA366374、PRJNA366375, PRJNA366251、PRJNA405703、PRJNA366252、PRJNA366766、PRJNA366357、PRJNA366358、PRJNA366361、PRJNA366362、PRJNA366363。PRJNA366255、PRJNA366256、PRJNA366257、PRJNA366253、PRJNA405704、PRJNA366254、PRJNA405781）、以前のカタログ84から利用できるMAGは7，760、NCBI GenBankからは2，137、参照ゲノム数は63，142である（https: を参照）、NCBI GenBankから63,142の参照ゲノム（//github. com/SegataLab/MetaRefSGBを参照）。イタリアの母子保健データセットと非ヒト宿主のMAGはMEGAHIT85で、イタリアの百寿者データセットと非西洋化集団のものはmetaSPAdes86で、いずれもデフォルトパラメータを用いてアセンブルを行った。
新たに追加されたMAGについては、メタゲノム解析において以下のプロトコルを採用した。1,500塩基以上のアセンブルコンティグをMetaBAT287を用いてMAGにビニングした。全ゲノムの品質管理はCheckM version 1.1.3 (ref. 88)で行い、中・高品質のゲノム（完全度≧50%、汚染度≦5%）のみをデータベースに収録しました。ゲノムのオープンリーディングフレームのアノテーションには、Prokka version 1.12 および 1.13 (ref. 89) を使用しました。コーディング配列は、UniRef90データベース（バージョン201906）に対してDiamond検索（バージョン0.9.24）91を行い、セントロイド配列との平均配列同一性が90%以上で、セントロイド配列の80%以上をカバーしていればUniRef90 IDを付与し、UniRef90 cluster90に割り当てました。どのUniRef90クラスタにも割り当てられなかったタンパク質配列は、Uniclust90基準に従ってSGB内でMMseqs292を使用してデノボクラスタリングした93。
ゲノムは、ref.30に記載されているように、遺伝的多様性が5％以下の種レベルゲノムビン（SGBs）、属レベルゲノムビン（GGBs、距離15％）および家族レベルゲノムビン（FGBs、距離30％）にクラスタリングされた。30. MAGは、PhyloPhlAn 3 (文献94)のサブルーチンである「phylophlan_metagenomic」を適用し、ゲノム間の全ゲノム平均塩基同一性をMash95で計算してSGBに割り振った。ゲノムとの遺伝的距離が5%以下のSGBがない場合、平均連鎖の割り当てと階層的クラスタリングに基づいて、新しいSGBを定義した（デンドログラムではゲノム間の遺伝的距離5%を許容する）。また、新規のGGBやFGBがまだ定義されていない場合は、同様の手順でSGBを割り当てた。
SGBの分類学的割り当てとkSGBおよびuSGBの定義
少なくとも1つの参照ゲノムを含むSGB（kSGBs）には、多数決に従って参照ゲノムの分類を種レベルまで割り振りました。参照ゲノムが存在しないSGB（uSGB）は、対応するGGB（属レベルまで）に参照ゲノムが存在する場合はその分類を、対応するFGB（科レベルまで）に参照ゲノムが存在する場合はその分類を割り当てました。FGBに参照ゲノムが存在しない場合、'phylophlan_metagenomic'で提供されるSGBのMAGに最も近い参照ゲノム100個までを対象に多数決を適用して門を割り当てました。本研究で株レベルでプロファイリングしたSGBの分類学上の位置付けは、補足表3および4に示す。
メタゲノムサンプルの種レベルのプロファイリング
種レベルのプロファイリングは、MetaPhlAn 4（参考文献38,39）を用いて、デフォルトパラメータとカスタムSGBデータベースで全9,715サンプルに対して行いました。5 MAG未満のuSGBは、アセンブリアーテファクトまたはキメラ配列の可能性があり、プロファイリングの普及率の閾値に達しないとして廃棄されました。SGBコア遺伝子は、SGBのゲノムの少なくとも半分（つまり「コア度」50%）に存在する、既存のUniRef90またはde novoクラスタ化遺伝子ファミリー（Uniclust90クラスタリング手順に従う93）内のオープンリーディングフレームとして定義されました。コア遺伝子は、少なくとも800個のコア遺伝子を検索できる最も高いコアネス閾値を選択することによって、さらに最適化された。次に、各SGBのコア遺伝子をスクリーニングして、他のSGBでの存在を確認することにより、マーカー遺伝子を同定した。これは、まずコア遺伝子を150 ntの断片に分割し、Bowtie2 (version 2.3.5.1; -sensitive option)を用いて全SGBのゲノムに対して断片をアライメントする手順で行われた66。マーカー遺伝子は、他のSGBのゲノムの少なくとも99%に断片が見つからないコア遺伝子と定義された。マーカー遺伝子が10個未満のSGBについては、あるSGBの200個以上のコア遺伝子が他のSGBのゲノムの1%以上に出現することをコンフリクトと定義し、そのSGBのコンフリクトを全て検索してコンフリクトグラフを作成した。各紛争グラフは、可能なすべてのマージシナリオを検索し、マージされるSGBの数を最小化し、検索されるマーカーの数を最大化するために、紛争に対する最適なマージを得るために、繰り返し処理された。最後に、各SGBについて、まずそのユニークさ、次にその大きさ（大きい方から）から最大200のマーカー遺伝子を選択し、それでも10マーカーに満たないSGBは廃棄された。マージされた腸と口腔のSGB（SGB_group）は、それぞれ補足表3および4にあります。得られた330万個のマーカー遺伝子（SGBあたり189±34マーカー遺伝子（平均±s.d.））を、MetaPhlAnおよびStrainPhlAnプロファイリングの新しい参照データベースとして使用した。
メタゲノムサンプルの菌株レベルプロファイリング
StrainPhlAn438,39では、カスタムSGBマーカーデータベースを用い、パラメータ "marker_in_n_samples 1 -sample_with_n_markers 10 -phylophlan_mode accurate -mutation_rates" で菌株プロファイリングを実施した。ノイズを減らすため、20サンプル以上で検出されたSGBと、10マーカー以上のデータセット（StrainPhlAnの-print_clades_only引数）で少なくとも10%のサンプルだけを選択して、株レベルのプロファイリングを行った（便と口腔サンプルでそれぞれn = 646とn = 252 SGBs）。大多数のSGB（n = 481/646腸内SGBおよびn = 148/252口腔内SGB）で合計200個のマーカー遺伝子が利用可能であった。SGB間の平均カバレッジは1.3×であった。発酵食品に由来する可能性のあるSGBについては、ref.40で組み立てたMAGの塩基配列を"-r "パラメータを用いて追加した。40のMAGの配列をパラメータ"-r "で追加した。StrainPhlAnを用いた株レベルプロファイリングにより、アセンブリーに基づくアプローチ（完全性90%以上、汚染度5%未満を高品質MAGと定義；上記の「拡張SGBデータベース」のセクションで報告したアセンブリー方法）と比較して、多くのサンプルで種間の株共有を評価できた（SGBあたりの株レベルプロファイル中央値355、四分位範囲（IQR）= [185, 806] vs SGBあたりの高品質MAG中央値69、IQR= [7, 60])．
ストレインシェアリングイベントの検出
株共有事象を検出するために、まず、3大陸の4カ国（ドイツ、カザフスタン、スペイン、米国）から発表された5つの便メタゲノムデータセットにおいて、同一個体の縦列株保持（同一株）と非関連個体（異なる株）のnGD分布を最適に分離するSGB固有の正規化系統距離（nGD）の閾値を設定した20,22,27,28,31。nGDは、StrainPhlAnによって作成された系統樹において、少なくとも1%の変動がある位置のマーカー遺伝子アラインメントに基づいて構築された樹木の総枝長で正規化した葉間枝長として算出されました。6ヶ月以内の間隔で採取された少なくとも50組の同一個体の便から検出されたSGB（n = 145 SGB；ある個体について、菌株レベルでプロファイリングでき、かつ時間的に最も近い2つのサンプルを選択した）について、Ydenの指数の最大化に基づいてnGD閾値を定義し、誤検出率の境界として、無関係な個人が同じ株を共有する割合を5％で制限した（拡張データFig.3）。1つの個体に少なくとも6ヶ月間、頻繁に株が存在するという仮定は、縦断セットにおける系統間距離の分布によって支持される：すべての種について、これは0に近いnGDでピークを持ち（拡張データ図3）、個体間サンプル比較で観察されたものよりも顕著に高い。50個体未満の近縁ペア（n = 501）と口腔内サンプル（n = 252）から検出されたSGBについては、種固有のnGDを信頼性をもって推定できないため、無関係な個体のnGD分布の3パーセンタイルに相当するnGDが用いられた。この値は、少なくとも50個の同一個体比較を行ったSGBのユーデン指数を最大化するnGDに対応する個体間nGD分布の中央パーセンタイルである。このように、3つの閾値セットは、同じ原理、すなわち腸内細菌叢における株の個人特異性と持続性を技術的に定義したものであり、nGD値に有意差を生じさせなかった（Kruskal-Wallis検定、χ2 = 2.34、P = 0.31）。 nGDの閾値も門によって有意な差はなく（Extended Data Fig.10b）、便と口腔サンプルで設定した閾値は同程度であった（nGD差の中央値=0.006）。もし、偽発見率の制限として、無関係な個体が同じ株を共有する割合を5%に制限しなければ、結果として、これらの38のSGBのパーセンタイルは中央値8.2%（範囲=[5.2-22.3%]）でしかない（補足表4）。株同一性の閾値を設定するために含めた5つのデータセットの代わりに、単一のメタゲノムデータセットを使用した場合、多くの場合、十分な縦方向のサンプルが得られず（＜50の同一個体のペア）、いくつかの変動が観察された（拡張データ図10c）、これは、利用できる最大のサンプルセットを使用することを支持するものであった。
全体として、nGD閾値が対応するSNV率の中央値は0.005であり、Illumina HiSeqおよびNovaSeqプラットフォーム96による推定0.1%以上のシーケンスエラー率以下である（補足表4）。nGDの閾値は、いくつかのSGB（n = 646のうち16、すなわち2.5％）、主に非常に低い遺伝的変異を包含するもの（例えば、B. animalis SGB17278）で0というSNV率に相当した。発酵食品から得られた微生物のMAGを含むSGBツリーにおいて、食品のMAGと高い類似性（PhyloPhlAn 3（https://github.com/biobakery/phylophlan/wiki#mutation-rates-table）、すなわちヌクレオチドが異なる位置の数をアライメントの長さで割ったSNV率が0.0015以下）を持つ菌株を同定し廃棄した（補表6）。B. animalis（SGB17278）については、その系統的多様性をよりよく評価するために、7つの公開マウスメタゲノムデータセット73, 75, 97, 98, 99, 100, 101でプロファイリングされた62株を追加している。StrainPhlAn で作成した樹木と SGB 特有の nGD の閾値を StrainPhlAn4 の strain_transmission.py スクリプト（-threshold 引数）で使用した（https://github.com/biobakery/MetaPhlAn/blob/master/metaphlan/utils/strain_transmission.py）。また，ペアごとのnGDが株同一性閾値以下のものを株共有イベントと定義した．nGD の中央値は，系統樹の nGD の中央値で割った値として定義した．その理由は、(1)メタゲノムサンプルは、シークエンス深度の閾値を超えた後でも、種に対するカバレッジがかなり低く（平均カバレッジ=7.2×、中央値=0.69、IQR= [0.14, 3.09]）、特にノイズが加わるため、SNV率ではなく、系統間距離に基づく株の同一性の閾値を選択したことである。 09]）がSNV率の推定に特にノイズを加えること、（2）いくつかのSGBのマーカー遺伝子のアライメントの長さが限られており（平均トリムアライメント長=74,348 nt、中央値=70,879、IQR= [42,513, 104,347] ）SNV率をむしろ信頼できないものにすること、（3）系統樹から得られる進化モデル（例えば、同義塩基と非同義塩基変化の識別）の貴重な情報であること、である。
我々は、新しい種特異的株同一性の閾値と、いくつかの以前の出版物やバージョン4以前のStrainPhlAnバージョンで使用されていたnGD = 0.1の閾値（つまり、最低10%の系統間距離を同一株とみなす）を比較した（参考文献9、32、102）。その結果、従来の閾値では母子間の株共有率は中央値で44％であったのに対し、今回の方法では50％となり、偽陽性となりやすい無関係の母親と乳児の間の株共有率が低くなっていることが分かった。3.5% 対 4%であった。このことは，種特異的株同一性閾値が，一致した母子間でより多くの株共有事象を同時に検出し，無関係な母子間でより少ない株共有事象を検出するため，より優れた性能を持つことを裏付けている．
さらに無関係なデータに対する種特異的株同一性閾値の再現性を評価するため、糞便マイクロバイオーム移植（FMT）を受けた患者の独立したデータセットを使用した。我々は、種特異的な閾値を設定するために、介入を行わず、縦断的なサンプリングを行った公開メタゲノムコホートを使用したので、我々は、株の伝播が予想される異なる環境として、完全に独立したFMTデータセットを検証に使用した。FMT では，健康なドナーの菌株の一部が患者に移植されるが，ドナーの元のサンプルの菌株の一部が介入後も残存する．我々は、メタアナリシスの一部として分析された FMT103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123 を受けた患者の 25 の異なるコホートから 1,371 サンプルを対象とした124. この評価では，縦断的サンプルのセットで行ったのと同様に，次の 2 つの状況における同一 SGB からの株の nGD 距離の分布の分離を評価した：(1) 株が同一人物のサンプル，FMT ドナーとその FMT 後の受領者のもの， (2) 株が異なる FMT トライアド（ドナーからのサンプル，FMT 前の患者のもの，FMT 後の患者のもので規定）に属するサンプルのもの。この解析は，Ianiroらの研究でもプロファイリングされた95のSGBのそれぞれについて実施した。(1)のサンプル間のペアワイズ系統間距離（nGD）値が種特異的株同一性閾値（独立縦断データセットで定義）以下のものを真陽性，(2)のサンプルが閾値以下のものを偽陽性，(2)のサンプルが閾値以上のものを真陰性，(1)が閾値以上のものを偽陰性とみなし，(3)のサンプルが真陽性とした．その結果，今回定義した種特異的株同一性閾値を用いたStrainPhlAn4は，同一個体またはFMTトライアドに属する株と異なるFMTトライアドに属する株の識別に非常に優れた性能を示した：中央値recall = 0.97, IQR = [0.95,0.99], precision = 0.72 [0.67,0.82], F-score = 0.97 [0.96,0.98] (Supplement Table 35)。
個人間株共有率とSGBの伝播性の評価
個人間株共有率は，2人の個人間で共有されている株数をStrainPhlAnでプロファイリングされた共有SGB数で割った値（共有株数/共有SGB数）で算出した．1人の個人に対して複数のサンプルが得られた場合、任意の時点で菌株またはSGBの共有が検出された場合、菌株またはSGBの共有があったものとみなすこととした。堅牢な計算を行うため、個人間の菌株共有率は、2人の個人間で少なくとも10個のSGBが共有されている場合にのみ評価した。縦断的データセットにおける2時点間の同一個体の株保持率を評価する際にも、同じ計算を行った。子孫による菌株獲得率（Extended Data Fig. 6a）は、子孫でプロファイリングされた菌株のうち、母親と共有している菌株の割合、つまり母親由来と推定される菌株の割合として定義された。この計算を厳密に行うため、母子間で少なくとも10個のSGBが共有されている場合のみ、子による菌株獲得率を評価した。StrainPhlAn36,38,39 は，各生物種の優勢株をプロファイリングしているため，2つのサンプル間で共有されている菌株の総数は，0からプロファイリングされた共有SGBの総数の範囲となるが，菌株共有率および子孫の菌株取得率は0から1の間の境界となる．
SGBの伝播性は，StrainPhlAn4による株レベルプロファイルの存在に基づき，SGBについて検出された株共有イベントの数を，潜在的な株共有イベントの総数で割ったものと定義された．1人の個人に対して複数のサンプルがある場合、任意の時点で株共有が検出された場合、株共有があったものとみなす。堅牢な計算を行うため、SGBの伝達性は、複数のデータセットで少なくとも10の潜在的な株共有イベントを持つSGBのみ、単一のデータセットの計算では少なくとも3の潜在的な株共有イベントを持つSGBについて評価された。データセット間のSGB透過性の一致を評価するため、透過性を評価した少なくとも10個のSGBを持つデータセット間でスピアマンの相関（Rのcor.test関数（https://www.R-project.org/））を実行した。透過性の高いSGBは、SGB透過性＞0.5で、グループ間よりグループ内の透過性が有意に高いものと定義した（カイ二乗検定、Padj < 0.05）。SGBの透過性とトリミングした配列の長さとの間には，有意な関連は見られなかった（スピアマンの検定，ρ = 0.06，P = 0.13）．
母子感染（母親と1歳までの子供の間で定義）、世帯感染（同居している個体の間で定義）、集団内感染（血縁関係のない集団の非同居個体の間で定義）の3つの主要な感染様式で株の共有を評価した。
種レベルのβ多様性と順序付け
マイクロバイオーム組成データの適切な解析のために、MetaPhlAnによって得られた種レベルの存在量マトリックスは、CoDaSeq Rパッケージ（v0.99.6）のcodaSeq.clr機能125を用いて、ゼロの帰属のために各分類群について検出された最小比例存在量を使って中心対数比率変換された。Aitchison距離に関する主成分分析プロットは、個体ごとにランダムに選択した1サンプル（n = 4,840 gut samples, n = 2,069 oral samples）を用いて、phyloseq (v1.28.0)126 の ordinate と plot_ordination functionで作成した。種レベルの類似度と菌株共有率を比較するため、vegan Rパッケージ（v2.5-7）で計算したベータ多様性指標（Aitchison距離、Bray-Curtis非類似度、Jaccard二元距離）を類似度指標（1 - （距離または非類似度））に変換した。
菌株共有ネットワーク
R パッケージ ggraph (v2.0.5), igraph (v1.2.6)127, tidygraph (v1.2.0) を用いて、共有株および共有種に基づく教師なしネットワークを可視化し、 個体（ノード）間の 5 以上の共有株または 50 以上の共有種による接続（エッジ）をストレスレイアウトで表示し、その結果を表 示した。
菌種表現形質のアノテーション
実験的に決定された細菌の表現型は、Microbe Directory v2.0 (ref. 128) から取得し、NCBI分類学的識別子によってkSGBにマッチングさせた。種の伝達性3との関連が以前から仮説されている表現型形質を、50％コア遺伝子（拡張SGBデータベースで利用可能なゲノムの50％に存在する遺伝子）上でTraitar（バージョン1.1.12）60を用いてすべてのSGBについて予測した。phypatとphypat + PGL classifiers（後者は表現型の獲得と喪失に関する進化的情報を追加で含む）のアノテーションが一致するものだけが保持された。SGBの伝達性と微生物の表現型との関連は、25％の最も伝達性の高いSGBと25％の最も低いSGBについて、Wilcoxon rank-sum検定で評価された。
統計解析
統計解析とグラフ表示は、vegan (version 2.5-7), phyloseq (v1.28.0)126, QuantPsyc (v1.5), ggplot2 (v3.3.3), ggpubr (v0.4.0) and corrplot (v0.84) パッケージを使ってRで実施した。多重検定の補正（Benjamini-Hochberg 手順、Padj）は必要に応じて適用し、有意性はPadj < 0.05で定義した。特に指定がない限り、すべての検定は両側であった。メタデータ変数と距離行列の間の関連は、veganのadonis関数を用いたPERMANOVAによって評価された。2群間の差はWilcoxon rank-sum検定で評価した。2つ以上のグループについては、ポストホックダン検定付きのクラスカル・ワリス検定が用いられた。相関はSpearmanの検定で評価した。潜在的な交絡因子を除外しながら変数間の相関を評価するために、glm R function (Gaussian, link = identity)を用いてGLMを適合させた。標準化されたGLM回帰係数は、lm.beta R関数（QuantPsyc Rパッケージ）を用いて計算された。有意性は、ネストしたGLMに対して対数尤度（カイ二乗）検定を行うことにより評価した。
倫理的コンプライアンス
すべての研究手順は、関連するすべての倫理的規制に準拠している。手順はヘルシンキ宣言を遵守して実施された。アルゼンチンのコホートの倫理的承認は、倫理・安全委員会（CEySTE）、CCT Santa Fe、アルゼンチン（29112019）により与えられた。コロンビアのコホートは、Universidad Metropolitana, Colombiaの研究生命倫理委員会（NIT 890105361-5）により承認された。China_1データセット研究プロトコルは、同済大学医学部上海第十病院倫理委員会（SHSY-IEC-pap-18-1）、China_2は中国西安交通大学健康科学センター倫理委員会（2016-114）により承認された。ギニアビサウの研究は、ギニアビサウ公衆衛生省保健倫理国家委員会（Comitê Nacional da Ética na Saude）（076/CPES/INASA/2017）およびロンドン大学衛生熱帯医学倫理委員会（参照番号22898）により承認された。Italy_1データセット研究プロトコルは、イタリア・トレントのサンタキアラ病院倫理委員会（51082283、2014年7月30日）およびイタリア・トレント大学倫理委員会、Italy_2はイタリア・リグーリア地域倫理委員会（006/2019）により承認されている。米国データセットに対する倫理的承認は、西部IRB（https://www.wcgirb.com/）により、プロトコル追跡番号WIRB20151664で付与された。すべての成人参加者、および成人以外の参加者の両親から書面によるインフォームドコンセントを取得した。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご覧いただけます。
データの入手方法
アルゼンチン、コロンビア、中国_2、ギニアビサウ、イタリア_1、米国のショットガンメタゲノミクスデータは、European Nucleotide Archiveのアクセッション番号PRJEB45799で入手可能である。China_1データセットの配列データは、NCBI Sequence Read Archiveデータベースでアクセッション番号PRJNA613947で公開されています。Italy_2データセットの配列データは、NCBI Sequence Read Archiveデータベース（accession PRJNA716780）に掲載されている。メタデータは、Supplementary Table 2およびcuratedMetagenomicData61の最新リリースに掲載されている。
コードの入手方法
本研究で開発・使用したすべてのソフトウェアと閾値は、MetaPhlAn4パッケージ39（StrainPhlAn4と、種特異的株同一性閾値を用いた株伝播推論用スクリプトを含む）、オープンソースコードは http://segatalab.cibio.unitn.it/tools/metaphlan で利用可能であり、 https://github.com/biobakery/MetaPhlAn で公開されている。また、Bioconda (https://anaconda.org/bioconda/metaphlan) およびPIP (https://pypi.org/project/MetaPhlAn) 経由でも入手可能である。菌株の共有を評価するために行った手順を説明したチュートリアルは、https://github.com/biobakery/MetaPhlAn/wiki/Strain-Sharing-Inference で入手できます。
参考文献
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謝辞
すべての研究参加者のコミットメントに感謝します；SPARK収集データで親切なサポートを受けたSimons FoundationsのN. Volfovsky, P. Feliciano and A. Packer；メタゲノムライブラリを配列決定したトレント大学のLaBSSAH-CIBIO Next Generation Sequencing Facility (V. de Sanctis, R. Bertorelli, P. Cavallerio and C. Valentini)に感謝します。この研究は、European Research Council (ERC-STG project MetaPG-716575 and ERC-CoG microTOUCH-101045015) から N.S. に、EMBO ALTF 593-2020 から M.V.-C. に支援を受けています。また、この研究は、MIUR 'Futuro in Ricerca' (助成番号 RBFR13EWWI_001) からN.S.に、欧州H2020プログラム (ONCOBIOME-825410 プロジェクト、MASTER-818368 プロジェクト、IHMCSA-964590) から N.S. に一部助成を受けて行われたものです。N.S.には米国国立衛生研究所国立がん研究所（1U01CA230551）、N.S.には国際ロンバルディア賞2019、E.D.とN.S.にはサイモンズ財団（賞ID 648614）、MCCには欧州研究会議（ERC-STGプロジェクト Mami-639226）から提供されたものです。
著者情報
著者名および所属
トレント大学CIBIO学部、トレント、イタリア
Mireia Valles-Colomer、Aitor Blanco-Míguez、Paolo Manghi、Francesco Asnicar、Leonard Dubois、Davide Golzato、Federica Armanini、Fabio Cumbo、Kun D. Huang、Serena Manara、Giulia Masetti、Federica Pinto、Michal Punčochář、Liviana Ricci、Moreno Zolfo、Manta Selma-Royo、Michele Filosi、Adrian Tett、Enrico Domenici ＆ Nicola Segata
イタリア、ミラノ、IEO欧州腫瘍学研究所実験腫瘍学部門
エリサ・ピペルニ、ニコラ・セガータ
ロンドン大学衛生熱帯医学大学院感染症学部臨床研究部門（英国・ロンドン
オリビア・ファラント、アドリアナ・ゴンカルベス、アンナ・ラスト
スペイン、バレンシア、パテルナ、農芸化学・食品技術・国家研究評議会（IATA-CSIC）研究所
マルタ・セルマ・ロヨ＆マリア・カルメン・コラード
産業乳製品研究所（CONICET-UNL）、国立リトラル大学工学部、アルゼンチン、サンタフェ
アナ・G・ビネッティ
メトロポリターナ大学栄養・運動研究グループ（コロンビア、バランキヤ
ジミー・E・ベセラ
西安交通大学健康科学センター公衆衛生学部（中国・西安市
韓 碧
国立医学研究所タンガ医学研究センター タンザニア・タンガ
ジョン・ルシング
クワメ・ンクルマ科学技術大学熱帯医学共同研究センター（ガーナ、クマシ
ジョン・アムアシー
イタリア、ジェノバ IRCCS Istituto Giannina Gaslini、腫瘍学ユニット
Loredana Amoroso
英国ロンドン大学キングス・カレッジ双生児研究・遺伝疫学科
Alessia Visconti、Claire M. Steves、Mario FalchiおよびTim D. Spector
ウィーン大学微生物学・環境システム科学センター（オーストリア・ウィーン
エイドリアン・テット
同済大学医学部上海第十人民病院（中国・上海市
Qian Xu, Nan Qin & Huanlong Qin（チアン・シュー、ナン・チン、ファンロン・チン
リアルバイオ・ゲノミクス研究所（中国・上海
Qian Xu & Nan Qin
ベルンハルト・ノヒト熱帯医学研究所（ドイツ・ハンブルグ
ユルゲン・メイ＆ダニエル・アイバッハ
IRCCS Istituto Giannina Gaslini（イタリア・ジェノバ）腫瘍学実験治療研究室
Maria Valeria Corrias & Mirco Ponzoni
イタリア・ナポリ・フェデリコ2世大学農学部
エドアルド・パゾッリ
マイクロソフト研究財団 計算システム生物学センター(COSBI) イタリア・ロヴェレート
エンリコ・ドメニチ
寄稿
M.V.-C.とN.S.は、本研究の構想および設計を行った。A.B.-M., F. Asnicar, F.C. はStrainPhlAn, PhyloPhlAn, 拡張SGBデータベースに関するソフトウェア開発に貢献した。P.M., D.G., F. Armanini, F.C., K.D.H., S.M., G.M., F.P., E. Piperni, M. Punčochář, L.R., M.Z., O.F., A.G., M.S.-R., A.G.B., J.E.B., B.H., J.L., J.A., L.A., A.V.,C.M.S.,M. Falchi, M. Filosi,A.T, A.L., Q.X., N.Q., H.Q., J.M., D.E., M.V.-C., M. Ponzoni, E. Pasolli, T.D.S., E.D. and M.C.C. はコホートの募集に参加し、および/またはメタデータとメタゲノムデータ取得に寄与した。L.D.とM.V.-C.は系統共有推算のためのチュートリアルを開発した。F. Armanini は、新規データセットに対する DNA 抽出とショットガンシーケンスライブラリーの調製を行った。F. Asnicar、P.M.、M.Z.はメタゲノムデータセットの前処理と品質管理を行った。M.V.-C.とN.S.は解析を行い、データを解釈し、原稿を執筆した。すべての著者が原稿の重要な改訂を行い、最終版の投稿を承認した。
連絡先
Mireia Valles-ColomerまたはNicola Segataに連絡すること。
倫理に関する宣言
利益相反
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
査読
査読情報
Natureは、この論文の査読に貢献した匿名査読者に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。
Extended Data 図と表
Extended Data 図1 データの概要。
A) 種レベルの順序付け（Aitchison距離のPCoA、N = 2,069サンプル）は、検討した口腔マイクロバイオームサンプルによって広がる全体的なマイクロバイオームの多様性を反映しています。サンプルは国ごとに色分けされ、形状は年齢を表している。B) 図1cの系統樹におけるサンプルのカラーコードは、それらが属するデータセットを表しています。
Extended Data 図2 株共有のワークフロー。
本原稿で菌株共有を評価するために使用したワークフロー。
Extended Data 図3 種特異的な菌株の運用定義。
腸内メタゲノム縦断データセットで最も一般的な25のSGBについて、同一個体（緑）と非関連個体（紫）の遺伝的距離を比較したもの。菌株同一性の閾値は、ユーデン指数（黒色破線）、または非関連個体比較の5％値（赤色破線）として設定し、1が5％を超えた場合（例：Parabacteroides merdae [SGB1949] ）に設定した。中央値 nGD：正規化した系統間距離を系統樹の中央値 nGD で割ったもの。各ヒストグラムのNは、各SGBが株レベルでプロファイリングされた同一個体比較の数に相当する。
Extended Data 図4 食品から発見された菌株を含む種の系統樹。
A) StrainPhlAn（Methods）で作成したBifidobacterium animalis（SGB17278）の系統樹。ヒト腸管メタゲノムから再構成した株、マウスサンプルからの株（灰色の点）、発酵食品32から再構成したMAG（黄色の点）などを含む。マウスで見つかった株とは異なり、ヒト由来株の94%は発酵食品から得られたMAGに対して≦0.0015一塩基変異（SNV）率であり（方法）、ヒトにおけるこの種の存在が市販の食事製品の消費と関連していることを示唆しており、結果としてさらなる分析から除外された（水平グレイバー）。B) Streptococcus thermophilus-salivarius-vestibularis (SGB8002) を StrainPhlAn (Methods) で生成した系統。ヒト腸管メタゲノムから再構成された株を、発酵食品から再構成された MAG とともに含む（黄色の点）。ヒト腸内で見つかった株のサブセットのみが、発酵食品の摂取と関連していることが示唆される。拡大サブツリー（「発酵食品サブツリー」）の葉のみが、発酵食品から得られたMAGに対して≤0.0015一塩基変異（SNV）率であり（方法）、結果としてさらなる分析から除外された。
Extended Data 図5 関係性を超えた株および種レベルの類似性。
A) 同一世帯の個人間（「世帯内」）と、同一集団の異なる村の無関係な非同居者（「集団内」）および異なる集団の個人（「集団間」）の腸内マイクロバイオーム株共有率と種レベルの類似性指標（Aitchison類似性、Bray-Curtis類似性、Jaccard二元類似性）を比較した。系統共有率との比較のために、種レベルの比較は類似度指数（1 - 距離または非類似度）で描かれている。すべての比較は有意である（Padj<0.05, Kruskal-Wallis tests with Post-hoc Dunn tests, Table S8）。株共有率に続く社会的距離に基づく勾配は、種レベルの類似性指標で観察される勾配よりも顕著に強い（表S8）。箱：下部および上部四分位値、中線：中央値、ひげ：1.5×IQR。1.5×IQR。B) 口腔マイクロバイオーム菌株の共有率と種レベルの類似性指標（Aitchison、Bray-Curtis、Jaccardの2値類似性）を、同じ世帯の個人間（「世帯内」）と、同じ集団の異なる村（「集団内」）および異なる集団の個人（「集団間」）で非同居の非血縁者間の比較。系統共有率との比較のために、種レベルの比較は類似度指数（1 - 距離または非類似度）で描かれている。すべての比較は有意である（Padj<0.05, Kruskal-Wallis tests with Post-hoc Dunn tests, Table S28）。箱：下位および上位四分位、中線：中央値、ひげ：1.5×IQR。1.5×IQR。
Extended Data Fig. 6 母から子への腸内細菌叢の伝達。
A) 子の系統獲得率は、子の年齢の関数として減少する傾向がある。子孫による菌株獲得率は、子孫でプロファイリングされた菌株のうち、母親と共有している菌株の割合として定義され、あらかじめ定義された年齢区分で14カ国17データセットについて計算された。Kruskal-Wallis test, Chi2=65, P = 3.57e-12, Post-hoc Dunn tests, NS は Padj≥0.05 に相当、その他の比較はすべて有意（表 S10）. 箱：下位および上位四分位、中線：中央値、ひげ。1.5 × IQR。新規のデータセットにはアスタリスクを付けた。B) 先輩個体と非同居の母親との間の系統共有率と、無関係の母親と子供のペア間の系統共有率との比較。Wilcoxon rank-sum test, N = 17,177, r = 0.09, P = 4.1e-35. 箱：下位および上位四分位値、中線：中央値、ひげ：1.5×IQR。1.5×IQR. C) 欧米化集団と非欧米化集団の子供の年齢区分における、観察された豊かさ（MetaPhlAnで検出されたSGBの数）。Wilcoxon rank-sum tests, N = 721, ***Padj <0.001 and **Padj<0.01, Table S11. 箱：下位および上位四分位値、中線：中央値、ひげ：1.5×IQR。1.5 × IQR. D) 経膣分娩児と帝王切開児の年齢区分における母子間の系統共有率。Wilcoxon rank-sum test, **Padj<0.01, NS Padj≥0.05, Table S14. 箱：下位および上位四分位値、中線：中央値、ひげ：1.5×IQR。1.5 × IQR。
Extended Data 図7 成人双生児における腸内細菌叢の株分け。
同居から数十年後の二卵性・一卵性双生児の腸内細菌叢菌株共有率。Wilcoxon rank-sum test, N = 708, **Padj<0.01, *Padj<0.05, NS Padj≥0.05, Table S19. 箱：下位および上位四分位値、中線：中央値、ひげ。1.5 × IQR。
Extended Data 図8 個人間の腸内細菌種と菌株の共有率。
A) 世帯員間（世帯内）、同じ村の異なる世帯の個人（村内）、同じ集団の異なる村の個人（集団内）、異なる集団（集団間）の腸内細菌叢の株共有率の密度分布。B) 世帯データセットの教師なしネットワークによる腸内細菌叢種共有。線幅は共有種の数に比例する。50種以上の共有種を持つ接続のみ表示されている。
Extended Data 図9 口腔内サンプルにおける高感染性SGBs。
口腔内メタゲノムで一貫して有意に高発現している3つのSGBの同族（緑）-異族（紫）遺伝的距離比較。菌株同一性の閾値は、無関係な個々の比較の3パーセンタイルとした（破線）。
Extended Data 図10 株同一性閾値の評価。
A) 便サンプルでプロファイリングした646種のSGBについて、使用した菌株の定義ごとに、菌株同一性の閾値として使用した中心nGD（正規化系統樹距離÷系統樹の中央nGD）（個体間分布のパーセンタイルに相当する）。パーセンタイルの違いにより、nGD値に有意差はない（Kruskal-Wallis test, Chi2=2.34, P = 0.31）。箱：下位および上位四分位、中線：中央値、ひげ。1.5×IQR. B) nGD閾値（正規化系統間距離を系統樹のnGD中央値で割った値）の系統別分布、統計的に有意な関連は見られなかった（Kruskal-Wallis検定、Chi2=6.6、P = 0.25）. 箱：下位および上位四分位、中線：中央値、ひげ：1.5×IQR。1.5 × IQR。C) 縦断的データセット（N = 145 SGBs profiled in at least 50 same-individual pairs）で流行しているSGBsのそれぞれについて、単一データセットで計算したStrain identity threshold (percentile of interindividual nGD distribution) と研究で用いたthreshold (determined on all samples) とを比較した結果。
補足情報
補足情報
このファイルには、補足表1～35（表は別途提供）への案内と、菌株の共有を評価するために行った手順を説明するチュートリアルへのリンクが含まれています。
報告書の概要
補足表
補足表1～35：詳しい説明は補足情報ドキュメントをご覧ください。
権利と許可
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この記事の引用
Valles-Colomer, M., Blanco-Míguez, A., Manghi, P. et al. The person-to-person transmission landscape of the gut and oral microbiomes.（腸内および口腔内マイクロバイオームの個人間感染ランドスケープ）。Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05620-1
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受付終了
2021年7月14日
受理済
2022年12月02日
公開日
2023年1月18日発行
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