窒素固定に関わる新しい電子伝達経路を進化させると、嫌気性芳香族化合物分解に関わる電子分岐型酵素が見つかる

2023年1月18日 09:57

2023年1月16日
窒素固定に関わる新しい電子伝達経路を進化させると、嫌気性芳香族化合物分解に関わる電子分岐型酵素が見つかる

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.02881-22#.Y8cnmshvATU.twitter

著者名 Nathan M. Lewis https://orcid.org/0000-0002-9749-5534, Abigail Sarne, Kathryn R. Fixen https://orcid.org/0000-0002-7261-9414 kfixen@umn.eduAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.02881-22
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オンライン・ファースト
概要
序論
結果
考察
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
ABSTRACT
窒素固定に関わる重要な酵素であるニトロゲナーゼは、フェレドキシン（Fd）またはフラボドキシン（Fld）から届けられる低電位電子を用いて二窒素ガス（N2）を還元してアンモニアを生成し、この活動の義務的産物として水素ガス（H2）を発生させる。光合成細菌Rhodopseudomonas palustrisは、Fdを還元するタンパク質を複数コードしているが、FixABCX複合体のみが窒素固定をサポートすることが示されており、R. palustris Fix-変異体は窒素固定条件下で生育不良であった。そこで、ネイティブな電子伝達鎖（ETC）をどのように窒素固定に向かわせることができるかを調べるために、窒素制限の強い選択圧を利用して、窒素固定条件下で生育するR. palustris ΔfixC株のサプレッサーを単離した。その結果、FixABCXが機能しない状態で窒素固定条件下での生育を回復させるためには、2つの変異が必要であることを見出した。一つは窒素固定に関わる主要なFdをコードする遺伝子fer1の変異であり、もう一つはNAD+依存性Fd：NADPH酸化還元酵素（Nfn）のホモログをコードするaadNの変異であった。我々は、AadNが嫌気性芳香族化合物の分解に関わる重要な酵素であるベンゾイルコエンザイムAレダクターゼへの電子伝達の役割を担っている証拠を提示した。この結果は、嫌気性芳香族化合物分解酵素が、ΔfixC抑制株では窒素固定に再利用されているというモデルを支持するものであった。
重要性 Fdのようなタンパク質電子伝達体は、特定の電子供与体や電子受容体と特定のパートナーシップを形成し、本来の電子伝達経路を互いに遮断したまま進化したという証拠が増えてきている。このため、生物学的窒素固定などのFd依存的経路を非窒素固定生物に組み込み、窒素固定に必要な高エネルギー還元力を提供することは困難である。ここでは、嫌気性芳香族化合物分解の電子供与体と窒素固定に関与するFdのアミノ酸置換により、ニトロゲナーゼへの電子伝達が可能となることを示した。本研究は、電子伝達連鎖の特異性を理解し、窒素固定のようなバイオテクノロジー的に価値のある経路のために、どのように新しい電子伝達経路が進化しうるかを理解するためのモデル系を提供するものである。
はじめに
フェレドキシン（Fds）およびフラボドキシン（Fld）は、電子供与体から電子受容体へ1個の電子を伝達する小型タンパク質電子伝達物質である。特に、Fdsは進化の過程で特定のパートナータンパク質と結合するように特化し、特定の経路に選択的に電子をシャトルできるようになった（1, 2）。Fdの結合表面の構造や電荷（3）、Fdの存在量の調節（4）、Fdの還元電位（5-7）などの重要な因子が、どのパートナータンパク質とFdが相互作用するかに影響を与える。理論的には、これらの性質を変えることで、Fdが新たなパートナータンパク質と相互作用し、電子の流れを迂回させることができるが、多くのFdにおいてこれらの性質は定義されていないため、合理的な設計は困難である。しかし、Fdsは成長に不可欠な生物学的反応において電子伝達を仲介することができるため、Fdと新しいパートナータンパク質が相互作用するような変異を選択することが可能である（2, 8）。
そのような反応の一つが、酵素であるニトロゲナーゼが触媒する生物学的窒素固定である。ニトロゲナーゼは、大量のATPとFdまたはFldから届けられる低電位の電子を利用して、大気中の窒素をアンモニアに還元し、この活動の義務的産物として水素ガスを発生させる(9)。紫色の非硫黄細菌Rhodopseudomonas palustrisでは、ニトロゲナーゼへの電子伝達には、フラビン電子分岐（FBEB）を用いて、NADHの酸化とキノンとFdまたはFldの還元をカップリングするFixABCX複合体が必要である（図1）(10-12). R. palustrisは、ピルビン酸：Fd酸化還元酵素やFd-NAD(P)+還元酵素など、他のジアゾ栄養細菌のニトロゲナーゼへの電子伝達を担うFd還元酵素を複数コードしているにもかかわらず、fixA, fixB, fixC, fixXを欠損させると窒素固定条件で激しい増殖不良となる(13-20)。R. palustrisも6つの2[4Fe-4S] Fdsをコードしており、ニトロゲナーゼへの主要な電子供与体はFd, Fer1 (Rpa4631)である(11)。Fld, FldA (Rpa2117)はFer1非存在下でも電子供与体として働くことができ、鉄が制限された条件下で役割を果たす(11)。R. palustrisは複数のFdsとFd還元酵素をコードしているので、FixABCXが不活性なR. palustrisを利用して、ニトロゲナーゼへの新しい電子伝達鎖（ETC）を可能にする変異を選択することができるだろう。
図1

図1 R. palustrisにおけるニトロゲナーゼ（N2ase）とベンゾイル-CoAレダクターゼ（BCR）への電子伝達の現行モデル。野生型ではBCRへの電子伝達は窒素固定と両立しないが、AadNのC38W置換とFer1のT11I置換により、ΔfixCでは安息香酸分解の電子伝達経路が窒素固定をサポートするようになる。点線で示したAadNの仮説的活性は、Pyrococcus furiosus由来のNAD+依存性フェレドキシン：NADPH酸化還元酵素との類似性に基づいて推測されたものである。
R. palustris ΔfixC株を用いて、窒素固定条件下でこの株の生育を回復させるサプレッサー変異体を単離した。その結果、FixABCX複合体が機能しない状態でニトロゲナーゼ活性を回復させるには、サプレッサー株の2つの変異が必要であることを見出した（図1）。1つはFer1をコードする遺伝子に、もう1つは未同定の遺伝子rpa0678に生じた変異であった。タンパク質モデリングと遺伝子解析の結果、この遺伝子がコードするタンパク質はFBEB NAD+依存性Fd:NADPH酸化還元酵素（Nfn）のホモログであり、R. palustrisの嫌気性芳香族化合物の分解に必要であることが分かった（図1）。この嫌気性芳香族化合物分解に関与することから、rpa0678をaadN for anaerobic aromatic degradation, Nfn-like proteinと改名しました。今回のデータは、2つの内在性ETCの構成要素の間にニトロゲナーゼのための新しいETCが形成されたモデルを支持し、選択的電子伝達の決定要因を研究するために使用できる系を提供するものである。
研究成果
fer1 の変異により、FixC 非存在下でのニトロゲナーゼへの電子伝達は改善されたが、十分ではない。
図 2A に示すように、R. palustris ΔfixC 株 (R. palustris ΔfixC) は窒素固定条件下で生育すると、深刻な生育障害を起こす。これは R. palustris ΔfixC が窒素固定のために必要な還元電子キャリアー（例えば Fer1 や FldA）を十分生成できないためと推測される (10, 11)。R. palustris ΔfixCのサプレッサー変異体を選択するために、この株を炭素基質として20mM酢酸を加えた窒素固定条件下で、ハロゲン電球から光を供給して数週間培養した。3つの複製液体培養のうち1つが成長し、そこからR. palustris ΔfixCのサプレッサー変異株を単離した（ここではR. palustris ΔfixCと呼ぶ）。R. palustris ΔfixCのfixAを欠損させても、窒素固定条件下で生育する能力は失われず、R. palustris ΔfixCでは残りのFix複合体は必要ないことが確認された(図2A)。ゲノム配列解析の結果、ΔfixC*は16種類の遺伝子に18個の変異を蓄積していることがわかった（表1）。そのうちの1つは、DNA修復に関わるDNAヘリカーゼであるrecQの変異であり、このことがサプレッサー株で見つかった多数の変異の原因であると考えられる（21）。ほとんどの変異は電子伝達との明らかな関連はなかったが、同定された変異の1つは、R. palustrisのニトロゲナーゼへの主要な電子供与体をコードするfer1であった。
図2

図2 窒素固定条件下でのΔfixCの生育はfixAを必要としないが、fer1T11Iは必要とする。(A) 硫酸アンモニウムを欠く最小培地（窒素固定）における野生型 R. palustris CGA753（WT）、fixC 欠損の R. palustris（ΔfixC）、ΔfixC の R. palustris suppressor（ΔfixC）、および fixA の R. palustris suppressor（ΔfixCΔfixA）と 20 mM アセテートの生育。(B) 野生型 R. palustris CGA753 (WT)、fixC 欠損型 R. palustris (ΔfixC)、R. palustris suppressor of ΔfixC (ΔfixC) 、 R. palustris suppressor of ΔfixC with a deletion in fer1 (ΔfixC* Δfer1)、 R. palustris Suppressor with a deletion in fer1 の生育状況 (Δ)・(A) palustris suppressor of ΔfixC with a deletion in fldA (ΔfixC* ΔfldA), R. palustris suppressor of ΔfixC with a deletion in fer1 and fldA (ΔfixC* Δfer1 ΔfldA) in minimal medium lack anmonium sulfate (nitrogen-fixing) with 20 mM acetate. パネルA、Bともに、データは2生物学的複製の平均値であり、エラーバーは平均値からの1標準偏差を表す。
表1
表1 全ゲノム配列決定によりΔfixC株のゲノムに見つかった変異体
遺伝子座標アミノ酸置換数遺伝子アノテーション
RPA0678 aadN C38W 硫化物デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸合成酵素
RPA0971 hupJ T76A ヒドロゲナーゼ発現・形成蛋白質候補
RPA1135 F224S プロバイトABCトランスポーター
RPA1377 F250Y グリオキサラーゼ
RPA1470 L138P ジペプチドABCトランスポーターと推定される。
RPA1496 Q63stop モノオキシゲナーゼ
RPA1542 bchN S63P 光独立型プロトコロフィライドリダクターゼ
RPA1975 N277S, M356V ツインアルギニン転流経路シグナル
RPA2153 D230G アルデヒドデヒドロゲナーゼ
RPA2193 N152S ABCトランスポーター仮説
RPA2309 G317fs 鉄キレートABCトランスポーター仮説
RPA3372 A74V ハイポーティカルタンパク質
RPA4087 A68fs ABC-2型輸送系
RPA4534 T15M ハイポテュカルタンパク質
RPA4631 fer1 T11I 2[4Fe-4S] フェレドキシン
RPA4826 recQ A205T DNAヘリカーゼ
a
「ストップは停止コドンを示す。「fsはフレームシフト変異を示す。R. palustris ΔfixC親株と異なる変化のみを示す。
fer1の変異は、スレオニン11のイソロイシンへの置換(T11I)をもたらす。R. palustris ΔfixCのfer1 T11I変異体がサプレッサー表現型に必要であるかどうかを調べるために、fer1のインフレーム欠失または野生型fer1対立遺伝子と置き換えた。どちらの株もR. palustris ΔfixCより有意に低い増殖速度を示した（表2；補足資料の図S1も参照）ことから、fer1T11I対立遺伝子はサプレッサー表現型に必要であることが示された。しかし、Fer1がない場合でも、サプレッサー株は、速度が低下するものの、まだ成長することができた。これは、Fer1がない場合、他の電子キャリアが補うことができることを示唆している。
表2
表2 窒素固定条件下におけるR. palustris株の成長速度
株平均倍加時間（時間）b 標準偏差
CGA753a 8 0.2
ΔfixC 123 35
ΔfixC 11 0.1
ΔfixC* Δfer1 37 1.1
ΔfixC* ΔfldA 11 0.9
ΔfixC* Δfer1 ΔfldA 22 0.8
ΔfixC fer1T11I 61 4.1
ΔfixC aadNC38W 30 2.4
ΔfixC fer1T11I aadNC38W 18 0.9
ΔfixC* fer1WT 25 2.5
ΔfixC* aadNWT 53 3.9
a
CGA753はanfHとvnfHに欠失があり（表S2参照）、ΔfixCの親株である。
b
値は硫安を欠く最小限の培地に20 mM酢酸を加えて培養した3つの生物学的複製の平均値である。
補足資料
図S1
R. palustris ΔfixCのfer1またはaadNにおける変異の修復は、窒素固定条件下での生育を損なう。R. palustris ΔfixC（ΔfixC*）、fer1のT11I変異を修復したR. palustris ΔfixC*（ΔfixC* fer1WT）、およびR. palustris ΔfixC* の生育は、窒素固定条件下で障害される。palustris ΔfixC* aadN の C38W 変異を修復したもの（ΔfixC* aadNWT）を、硫酸アンモニウムを欠く最小培地（窒素固定）、炭素源として 20 mM 酢酸を供給して培養した。データは3つの生物学的複製の平均値であり、エラーバーは1つの標準偏差を表す。図S1、TIFFファイル、0.29 MBをダウンロードする。
著作権 © 2023 Lewis et al.
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補足資料
表S2
本研究で使用した全菌株、プラスミド、プライマー。表S2、DOCXファイル、0.02 MBをダウンロードする。
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FixABCX複合体が存在しない状態で窒素固定条件下での生育を回復するのに十分なfer1T11I対立遺伝子をR. palustris ΔfixCに導入したかどうかを判定するために、fer1T11I対立遺伝子を導入した。図3に示すように、fer1T11I対立遺伝子はR. palustris ΔfixCにおいて窒素固定条件下での成長を回復しなかったことから、R. palustris ΔfixCの他の変異が電子伝達に必要であることが示唆された。このことから、fer1T11I対立遺伝子はサプレッサー表現型に必要ではあるが、十分ではないことが明らかになった。R. palustris ΔfixCの残りの変異の多くは機能が不明または仮説的であるため（表1）、R. palustris ΔfixC*のニトロゲナーゼへの電子伝達に関わる遺伝子の探索範囲を広げる必要があった。
図3

図3 fer1 と aadN のΔfixC対立遺伝子は、窒素固定条件下でのΔfixCの生育を可能にする。R. palustrisのΔfixCのサプレッサー（ΔfixC）、fixCの欠失を有するR. palustris（ΔfixC）、fer1T11I対立遺伝子（ΔfixC fer1T11I）をコードするR. palustrisΔfixCの成長、aadNC38W対立遺伝子（ΔfixC aadNC38W）をコードするR. palustrisΔfixC 、および R. palustrisのΔfoxCの成長を示す図である。palustris ΔfixC encoding the fer1T11I and aadNC38W alleles (ΔfixC fer1T11I aadNC38W) in minimal medium lacking ammonium sulfate (nitrogen-fixing) supplemented with 20 mM acetate. データは3回の生物学的複製の平均値、エラーバーは平均値からの1標準偏差を表す。
窒素酸化酵素はエネルギー的に高価な反応であり、1回の触媒反応に8個の低電位電子を必要とする(9, 22)。R. palustris ΔfixCでは、還元力の需要に対応するため、ETCの構成要素がより高い速度で転写されると仮定した。そこで、窒素固定条件下におけるR. palustris ΔfixCの遺伝子発現変化を野生型R. palustrisと比較するために、トランスクリプトームシーケンス（RNA-seq）解析を実施した。その結果、R. palustris ΔfixCではfldAの発現が野生型R. palustrisと比較して23倍上昇し、最も高い遺伝子発現変化を示した（補足資料のデータセットS1参照）。R. palustris ΔfixCが利用するETCにおけるFldAの役割を調べるため、fldAをインフレームで欠損させた株を構築し、窒素固定条件下での成長速度を測定した（図2Bおよび表2）。その結果、R. palustris ΔfixCが窒素固定条件下で生育するためにはFldAは必要ではなく、fer1およびfldAを欠失したR. palustris ΔfixCはfer1を欠失したR. palustris ΔfixCより成長が遅くならないのでFldAとfer1が重複しないことが分かった(図2B)。むしろ、fer1とfldAを欠損させたR. palustris ΔfixCは、fer1を欠損させたR. palustris ΔfixCと比較してわずかに成長速度が速く、FldAの存在がFer1非存在下でわずかに抑制効果を持つ可能性を示唆した（Table 2）。しかし、Fer1が存在する場合、R. palustris ΔfixCとfldAを欠失させたR. palustris ΔfixCの成長速度は区別できないため、この阻害効果は見られなかった（表2）。また、RNA-seqにより、Fdを還元することが知られている酵素をコードする他のほとんどの遺伝子は、R. palustris ΔfixCにおいて遺伝子発現が低下しているか、比較的小さな（2倍未満）変化を示していた（表S1参照）。
補足資料
表S1
R. palustris ΔfixCにおけるFd還元酵素をコードする遺伝子の転写産物の存在量の変化。表S1、DOCXファイル、0.01 MBをダウンロードする。
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補足資料
データセット S1
硫安を含まない最小培地（窒素固定培地）と20 mM酢酸で培養したR. palustris CGA753（WT）とR. palustris ΔfixC（ΔfixC*）における遺伝子発現変化。データセットS1、XLSXファイル、0.03 MBをダウンロードする。
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aadNの変異は、FixC非存在下でのニトロゲナーゼへの電子伝達にとって必要かつ十分である。
R. palustris ΔfixCのニトロゲナーゼへの電子伝達に必要な遺伝子を同定するために、ランダムトランスポゾン変異誘発戦略とメトロニダゾールの濃縮（図S2参照）を併用した（23）。メトロニダゾールは、低電位電子伝達物質、特にFdとFldによって還元されると活性化され、細胞死を引き起こす抗生物質である(24)。メトロニダゾールの濃縮に耐えるトランスポゾン変異体は、電子伝達を阻害する挿入部を持っている可能性が高い。この方法を用いて、我々は濃縮に耐えたトランスポゾン変異体を1つ同定した。この変異体は非窒素固定条件下ではR. palustris ΔfixCと同様に成長するが、窒素固定条件下では成長することができなかった。この変異体はaadNにトランスポゾンが挿入されていた(rpa0678)。R. palustris ΔfixCでは、aadNに非同義変異があり、システイン38がトリプトファンに置換されたAadNの変異体（C38W）をコードしていた（表1）。R. palustris ΔfixCのaadNC38W対立遺伝子を野生型aadNに置き換えると、窒素固定条件下で生育する能力が失われることを見出した（表2）。親株であるR. palustris ΔfixCにaadNC38W変異を導入したところ、この変異だけでR. palustris ΔfixCは窒素固定条件下で生育できるようになり、aadNC38W変異はR. palustris ΔfixCの窒素固定条件下の生育回復に必要かつ十分であることが示された。しかし、R. palustris ΔfixC aadNC38Wの成長速度はR. palustris ΔfixCよりも遅かった（図3および表2）。R. palustris ΔfixCのaadNC38W変異とfer1T11I変異を組み合わせると、成長速度が増加した（図3、表2）。このことから、AadNとFer1の変異体は、FixABCXの非存在下でニトロゲナーゼに電子を供給できる新しいETCを形成していることが示唆された(図1)。
補足資料
図S2
メトロニダゾール濃縮によるトランスポゾン変異誘発のためのワークフロー。NFM、硫酸アンモニウムを欠き、炭素源として20mM酢酸を供給した最小培地である窒素固定培地；非NFM、炭素源として20mM酢酸を供給した最小培地；Met、メトロニダゾール；Kan、カナマイシン；Tn5 ME、Tn5モザイク末。インキュベーション時間は括弧内に示す。図S2、TIFFファイル、2.44 MBをダウンロードする。
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ニトロゲナーゼ活性を定量化するために、成長中の培養物での水素生成量を測定した。水素は、ニトロゲナーゼ活性の義務的産物である(9)。これらの株は、取り込み型ヒドロゲナーゼを発現せず、他のヒドロゲナーゼもコードしておらず、窒素固定条件下でのみ水素を蓄積するため、水素生成量を測定することでニトロゲナーゼ活性を決定することができる(25)。R. palustris ΔfixC に aadNC38W アレルを導入すると、水素生産は十分に可能であったが、野生型 R. palustris または R. palustris ΔfixC と比較して水素生産量が約 50%少なかった (表 3)。しかし、R. palustris ΔfixCにfer1T11IとaadNC38Wの両アレルを導入すると、水素生産量はR. palustris ΔfixCで観察されたレベルまで回復した。このことから、機能的なFixABCX複合体がない場合、ニトロゲナーゼへの電子伝達にはこれら二つの変異だけが必要であることが確認できた（Table 3）。
表3
表3 窒素固定条件下で生育した R. palustris 株の水素（H2）生産量a
菌株名属性平均水素発生量（μmol/OD660）±SDc
fer1 aadN
CGA753b ワイルドタイプワイルドタイプ 143 ± 12
ΔfixC T11I C38W 114 ± 6.4
ΔfixC aadNC38W 野生型 C38W 58 ± 8.0
ΔfixC fer1T11I aadNC38W T11I C38W 110 ± 5.6
a
すべての株は、硫安を欠き、20mM酢酸を補充した最小限の培地で培養した。
b
CGA753 は anfH と vnfH に欠失があり（Table S2 参照）、ΔfixC の親株である。
c
値は、未接種サンプルで測定したH2を差し引いて計算した3生物学的複製の平均値である。
AadNはFd還元酵素のホモログであり、嫌気性芳香族化合物の分解に必要である。
これらのデータは、AadNC38W が R. palustris ΔfixC* のニトロゲナーゼへの電子伝達に必要であることを示しているが、R. palustris における AadN の本来の機能は不明であった。AadN の電子伝達における役割を知るために、私たちはタンパク質モデリングを用いて AadN の構造と活性について予測を行いました(26, 27)。AadNは硫化物脱水素酵素と注釈されているが、配列解析の結果、Pyrococcus furiosus由来の酵素NfnI（PfNfnI、図4A）の大小両方のサブユニットと相同性を持つことがわかった（28）。PfNfnIはNAD+依存性のFd:NADPH酸化還元酵素（Nfn）で、FBEBを使ってNADP（H）、NAD（H）、Fdプールのバランスをとり、エネルギーを節約して酸化還元バランスを保つ（図4B） (28, 29)．PfNfnIの大サブユニットと小サブユニットは別々の遺伝子でコードされているが、AadNではこれらのサブユニットが融合している（図4A）(30)。その結果、PfNfnIの補酵素結合ドメインはAadNでも保存されており、大サブユニットと小サブユニットは共に51%以上のアミノ酸の同一性を持っていることがわかった（図4A）。このことから、AadNはFBEBを行い、NAD(P)Hからの電子を利用してFdを還元している可能性が示唆された（図4B）。
図4

図4 NfnホモログであるAadNは、嫌気性芳香族化合物の分解に必要である。(A）AadNは、P. furiosus由来のNfnI（PfNfnI）およびClostridium autoethanogenum由来のパターンB Nfn（CaNfn）と相同である。PfNfnIとCaNfnの大サブユニットと小サブユニットのAadNに対するアミノ酸同一性のパーセントを、小領域（緑）と大領域（オレンジ）にわたって示す。(B）PfNfnIは、PfNfnIヘテロダイマーあたり、2つの［4Fe-4S］クラスター、1つの［2Fe-2S］クラスター、2つのフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）補因子をリゲートしている。これらの補酵素の結合ドメインのアミノ酸配列はAadNで保存されているが、AadNがPfNfnIと同じレドックスプールと相互作用しているかどうかはまだ不明である。(C) R. palustris CGA009 の aadN 周辺のゲノム領域のマップから、aadN は芳香族化合物の分解に関わる遺伝子（hba 遺伝子、シアン）の近くにあることがわかった。(D) R. palustris CGA753（WT）、aadNを欠損したR. palustris（ΔaadN）、fixCを欠損しaadNC38W対立遺伝子をコードするR. palustris（ΔfixC aadNC38W）の10 mM HCO3および5.7 mM安息香酸（B）を含む最小培地で成長した表現型。 7 mM 安息香酸 (BA), 5.7 mM 4-hydroxybenzoate (4-HB), または 5.7 mM cyclohexane carboxylate (CHC) を炭素源として添加した最小限の培地で培養した。この培養は、3つの独立した試験の代表的なものである。(E) R. palustris CGA753（WT）、fixCを欠損したR. palustris（ΔfixC）、aadNを欠損したR. palustris（ΔaadN）、R. palustrisの成長表現形質。palustrisのfixCとaadNの両方を欠損させたもの(ΔΔ)を、20 mM酢酸(AC)または5.7 mM安息香酸(BA)を加えた硫酸アンモニウム(窒素固定)を含まない最小培地で培養した。この培養は、3つの独立した試験の代表的なものである。
また、aadNは安息香酸や4-ヒドロキシ安息香酸（4-HB）などの芳香族化合物の嫌気性分解に関与する遺伝子に隣接していることがわかった（図4C）(31)。これらの化合物の嫌気性分解には、低電位FdからのATP依存的な電子伝達を行い、ベンゾイル-CoAの芳香環をシクロヘキス-1,5-ジエン-1-カルボニル-CoAに還元する酵素ベンゾイルコエンザイムA（ベンゾイルCoA）還元酵素が必要となる（図S3参照）（32〜34）。Thauera aromaticaでは、ベンゾイル-CoA還元酵素はKorABと呼ばれるFd:2-オキソグルタル酸酸化還元酵素を介して還元力を供給される(35)。R. palustrisの安息香酸分解遺伝子群のうち2株はkorABのホモログをコードしているが、嫌気性芳香族化合物分解遺伝子をコードする7株はkorABを欠損している(36)。AadNがベンゾイル-CoA還元酵素への電子伝達を担っているとすれば、korABを欠く株はaadNをコードしているはずであると推論した。R. palustris株のうち、korABを欠く6株のゲノムにはaadNが存在したが、korABをコードする2株には存在しなかった（表4）。このことから、R. palustris株は芳香族化合物分解時の電子伝達をAadNかKorABのどちらかを利用しているが、両方を利用しているわけではないことが示唆された（表4）。なお、aadNとkorABを欠くR. palustris株はHaA2株のみであり、芳香族化合物を分解できない(36)。
表4
表 4 R. palustris 株における aadN と korAB の遺伝的分布
R. palustris株 korABa aadNb
CGA009
TIE-1
DX-1
DCP3
BisB18
PS3
YSC3
BisB5
BisA53
HaA2c
a
+嫌気性芳香族分解遺伝子クラスター内に、R. palustris BisB5由来のkorA (WP_011501953.1) と80%以上のアミノ酸同一性を持つホモログを含む＋、-、ホモログが存在しない。
b
+嫌気性芳香族分解遺伝子群の中で90%以上のアミノ酸同一性を有するaadN (WP_011156245)のホモログを含む；-，ホモログは存在しない。
c
R. palustris 株 HaA2 は、芳香族化合物を分解できない。
補足資料
図 S3
R. palustrisの安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸（4-HBA）、シクロヘキサンカルボン酸（CHC）の分解経路とAadN活性の推定値。AadNの活性は、PfNfnIとの類似性から推測される。点線で示した反応は、ベンゾイル-CoA還元酵素（BadDEFG）が最初の脱芳香族化ステップの後に環構造の二度目の還元を触媒するかどうかの不確実性を表している。図 S3、TIFF ファイル、0.3 MB をダウンロードする。
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嫌気性芳香族化合物分解に必要な遺伝子に近接していること、PfNfnIと類似していること、ΔfixCのニトロゲナーゼへの電子伝達において重要であることから、AadNがベンゾイル-CoA還元酵素への電子伝達において役割を果たしていると仮定した。これを検証するために、R. palustris ΔaadN の芳香族化合物の代謝能力を調べた。安息香酸や4-HBはベンゾイル-CoAに変換され、ベンゾイル-CoA還元酵素によって還元的に脱芳香化されるが、シクロヘキサンカルボン酸（CHC）はこの脱芳香化ステップを経て同じ分解経路に入る（図S3参照）(36)。安息香酸または4-HBを唯一の炭素源として与えた場合、R. palustris ΔaadNは成長不良を示し、aadNが安息香酸および4-HBの分解に必要であることが示された（Fig. 4D）。CHCを唯一の炭素源として与えた場合、野生型R. palustrisとR. palustris ΔaadNは共に生育できたことから、AadNはCHC上での生育には必要ないことがわかった（図4D）。また、AadNのC38W置換はR. palustris aadNC38Wが芳香族炭素源で生育する能力を破壊せず（図4D）、R. palustris ΔfixC aadNC38WとR. palustris ΔfixC fer1T11I aadNC38Wは安息香酸を炭素源として窒素固定条件下で生育する（図S4参照）ことから、C38W変異体は窒素固定と嫌気性芳香族化合物分解の両方を同時にサポートできることが示された。タンパク質配列解析から得られた証拠と合わせて、AadNがベンゾイル-CoA還元酵素への電子伝達を担っていることが示唆された。
補足資料
図S4
aadNC38W対立遺伝子は、機能的なFixABCXの非存在下で窒素固定と嫌気性芳香族化合物分解の両方をサポートするのに十分である。R. palustris（WT）、fixCの欠失を有するR. palustris（ΔfixC）、aadNC38W対立遺伝子をコードするfixCの欠失を有するR. palustris（ΔfixC aadNC38W）、およびR. Palustrisの成長表現型。palustrisは、fer1T11IとaadNC38W対立遺伝子をコードするfixCを欠失したもの（ΔfixC fer1T11I aadNC38W）を、20 mM酢酸（AC）または5.7 mM安息香酸（BA）添加の硫酸アンモニウム（窒素固定）欠如最小培地に植えた。画像は、すべての成長中の培養物が定常期に達した時点で得られたもので、表示されている培養物は3つの独立した試験の代表である。図 S4、TIFF ファイル、0.69 MB をダウンロードする。
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嫌気性芳香族化合物分解のためのネイティブETCは、窒素固定から隔離されている。
R. palustris ΔfixCは窒素固定条件下で生育できないため、嫌気性芳香族化合物分解のETCと窒素固定のETCは互いに絶縁されていると思われる。この2つのETCの絶縁状態を調べるために、fixCまたはaadNのインフレーム欠失したR. palustris株を、安息香酸を唯一の炭素源とする窒素固定条件下で生育させた。その結果、aadNは非窒素固定条件下で安息香酸を用いた生育に必要であったが（図4D）、R. palustris ΔaadNは窒素固定条件下で安息香酸を炭素源として生育できた（図4E）ことから、FixABCXがaadNの欠損を補完して、窒素固定条件下の安息香酸分解を支援している可能性が示唆された。しかし、R. palustris ΔfixCは安息香酸を含む窒素固定条件下で生育できず、安息香酸分解のためのETCはニトロゲナーゼへの電子伝達を維持できないことが示された（図4E）。これらのデータは、安息香酸分解のための電子伝達が窒素固定から絶縁されており、AadNのC38W置換がその絶縁を克服してAadNがニトロゲナーゼへの電子伝達で機能するというモデルを支持するものであった。
考察
本研究では、FixABCXが存在しないR. palustrisにおいて、ニトロゲナーゼへの電子伝達を回復するような変異を同定した。細胞内の電子の流れを変え、既存の構成要素から新しいETCを形成するためには、FdまたはFldの変化が必要であると仮定した。その結果、Fer1の1つのアミノ酸置換が新しいETCにとって重要であることがわかったが、FixABCXがない状態でニトロゲナーゼへの電子伝達を支えるには不十分であった。私たちは、aadNと名付けたNfn様遺伝子の変異が電子伝達には十分であるが、fer1の変異と組み合わせると、ニトロゲナーゼへの電子伝達がより効率的になることを見いだした。このように、新しいETCの形成には、Fdの性質を変えることも重要ですが、Fdを還元する酵素を1つ変えることの方がより大きな役割を担っていることがわかりました。したがって、設計された経路を介した電子伝達を最適化するためには、Fd還元酵素とFdの両方を変更することが必要であると思われる。
また、私たちのアプローチにより、未同定のNfnホモログの新しい役割も明らかになりました。Nfnホモログは生命のあらゆる領域に存在するが、これらのホモログの多くは生理的な役割が不明である(30, 37)。AadNはNfnに関連し、Nfnの2つのサブユニットが融合したパターンB Nfnsと呼ばれる未同定のNfn酵素ファミリーに属することが配列相同性から明らかになった（30）。PfNfnIを含むパターンA Nfnは、2つの[4Fe-4S]クラスター、1つの[2Fe-2S]クラスター、2つのFAD補因子、NADPHとNAD+の結合部位を持っている（28, 38）。我々は、これらの基質と補酵素の結合部位がそれぞれAadNに保存されていることを見出し、AadNがNADPHとNAD+を用いてFBEBを行い、Fdを還元していることを示唆した。しかし、全てのNfnホモログがNfn分岐活性を示すわけではなく（39）、AadNがNfnと同じ基質を用いてFBEBを行うかどうかは、さらなる構造および酵素の解析が必要であると思われる。AadN が芳香族化合物の分解に必要であり、ベンゾイル-CoA 還元酵素への電子伝達の役割を担っている可能性が高いことを示しました。これは、パターンBのNfnの役割として初めて提案されたものであり、この発見は、Nfn様酵素が嫌気性芳香族化合物分解に還元力を供給できることを証明するものである。また、この結果は、Nfn酵素ファミリーがニトロゲナーゼへの電子伝達にも関与していることを示唆している。ジアゾ栄養細菌の中には、ニトロゲナーゼへの電子伝達に関与することが知られているFd-あるいはFld-還元酵素をコードしていないものがあるようである(40)。Nfnのホモログがニトロゲナーゼに還元力を供給できるという今回の発見は、これらのジアゾ栄養生物における窒素固定のためのETCを明らかにするのに役立つと思われる。
窒素固定と嫌気性芳香族化合物分解の絶縁体化は、電子伝達の絶縁体の複雑な性質を浮き彫りにしている。嫌気性芳香族化合物分解の鍵となる酵素であるベンゾイル-CoA還元酵素は、Fdによって運ばれる低電位の電子を必要とする(41)。R. palustrisの安息香酸分解遺伝子群はBadBと呼ばれるFdをコードしており、T. aromaticaのBadBのホモログは-587 mVという非常に低い中点電位を持つことが示されている（31, 34）。熱力学的な観点のみから、嫌気性芳香族化合物分解のためのETCはニトロゲナーゼと相性が良いことが予測される。しかし、安息香酸を添加して培養しても、R. palustris ΔfixCは窒素固定条件下で増殖できないことがわかり、ベンゾイル-CoA還元酵素のETCはニトロゲナーゼへの電子伝達をサポートできないことが示された。
私たちが観察した電子伝達の遮断は、BadBがニトロゲナーゼと相互作用できないことが一因である可能性がある。しかし、我々の結果は、AadNのアミノ酸置換によってニトロゲナーゼの活性がある程度回復し、さらにFer1のアミノ酸置換によって促進されることから、この2つの経路間の絶縁は、AadNがFer1を還元できないことにも起因するはずであることを示している。これらの変異体がどのようにしてニトロゲナーゼへの電子伝達を可能にするのかは不明であるが、AadNとFer1の間の相互作用を促進しているのであろう。AadNにおけるC38Wのアミノ酸置換は、AadNの翻訳後制御を妨げ、AadNの安定性に影響を与え、あるいはAadNのFd結合部位を変化させることによって、ニトロゲナーゼへの電子伝達を可能にする可能性がある。また、Fer1の11位のスレオニン残基は、Fer1の[4Fe-4S]クラスターの1つを配位すると予測されるシステインに隣接している。他の多くの低電位2[4Fe-4S]Fdsはこの位置にイソロイシンをコードしており、他のFdsの同様のスレオニンからイソロイシンへの置換はFdsの還元電位を下げることが示されている(5, 34, 42)。このことから、Fer1におけるT11I置換は、AadNとの相互作用を促進する理由は不明であるが、その還元電位を低下させることが示唆される。これらのアミノ酸置換がどのようにFer1やAadNの性質を変えるのか、これらのタンパク質がどのようにしてニトロゲナーゼへの新しい電子伝達経路を形成するのかを理解するために、さらなる特性解明が必要である。
本研究は、ニトロゲナーゼへの新しい電子伝達経路を可能にする選択戦略の可能性を示すものである。ニトロゲナーゼへの電子伝達が非窒素固定生物の窒素固定を工学的に行うための大きなハードルであることを考えると、このアプローチは非ネイティブのETCをニトロゲナーゼと適合するように進化させるのに有用である可能性を持っている。
材料と方法
試薬、菌体、培養方法。
すべての R. palustris 株は、12.5 mM Na2HPO4, 12.5 mM KH2PO4, 7.6 mM (NH4)2SO4, 0.1 mM Na2S2O3-5H2O, 0.015 mM p-aminobenzoic acid, および 1% のミネラル塩溶液（表 S3 参照） (43) を含む規定ミネラル媒体 (non-Nitrogen-fixing medium) において増殖させた。窒素固定条件には硫安を欠くミネラル培地を使用した。培地は、嫌気性チャンバー（雰囲気：98% N2, 2% H2, <10 ppm O2）を用いて、以前に記載したように調製した(11)。液体培地には20 mM酢酸を、寒天培地には10 mMコハク酸を炭素源として添加した。指示された場合、液体培養は 5.7 mM 安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、またはシクロヘキサンカルボン酸で培養し、10 mM HCO3 で補った (44). プレートは、GasPak EZ嫌気性菌コンテナシステムで30℃でインキュベートした（Becton Dickinson）。プレートは60Wの電球から10インチ以内に置き、液体培養物は30μmol of photons m-2 s-1 (General Electric)を供給する電球から5.5インチ以内に配置された。該当する場合、R. palustrisは100μg/mLゲンタマイシンおよび200μg/mLカナマイシンを添加して培養し、大腸菌株はゲンタマイシン（20μg/mL）を添加した37℃のリゾゲニーブロスで培養した。メトロニダゾールの濃縮には、メトロニダゾールを終濃度50 mMになるように添加した。
補足資料
表S3
ミネラルソルト溶液の成分。Table S3、DOCXファイル、0.01 MBをダウンロードする。
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R. palustrisの遺伝子操作。
興味のある各遺伝子について、対応するpJQ200SK由来の欠失ベクターまたは対立遺伝子交換ベクターを作成した（表S2参照）(45)。欠失ベクターは、遺伝子の開始コドンの上流に1kb、停止コドンの下流に1kbの配列を含んでいた。対立遺伝子交換ベクターは、目的の点突然変異の上流と下流に1kbの配列を含んでいた。構築は前述(11)と同様に行った。ベクターは大腸菌S17-1を用いたコンジュゲーションによりR. palustrisに動員された(46)。遺伝子欠失はPCRで確認した(表S2参照)。全ての対立遺伝子交換株は、サンガー配列決定（GENEWIZ, South Plainfield, NJ）により確認した。
RNA抽出、cDNAライブラリー調製、および配列決定。
R. palustrisの細胞は、培養物が0.4の光学密度（660nm）に成長した後、10mLの窒素固定培地から採取した。細胞は氷上で10分間インキュベートした後、遠心分離により回収した。細胞ペレットは液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。細胞ペレットを解凍し、1mLのQIAzol溶解試薬（Qiagen、Hilden、ドイツ）に再懸濁し、BioSpec Products BeadBeater-24（Bartlesville、OK）を用いて最大rpmで4℃、1分間ホモジナイズし、氷上で1分間冷却させた。このサイクルを4回繰り返した。miRNAeasy minikit（Qiagen）を用いてトータルRNAを単離し、TURBO DNase（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてDNAを除去した。RNAはRNeasy MiniElute Cleanup kit（Qiagen）を用いて精製・濃縮した。cDNAライブラリー構築およびライブラリー配列決定はGENEWIZ, LLC（South Plainfield, NJ）で行った。Ribo-Zero rRNA removal kit（Illumina, San Diego, CA）を用いてrRNAを除去し、NEBNext Ultra RNA Library Prep kitを用いたcDNA調製、配列決定反応および画像解析、ベースコールはIllumina HiSeq 2500 instrument（Illumina）において実行された。
遺伝子発現の差分解析
シーケンシングデータにおける品質塩基呼称は、FastQCアプリケーション（v 0.11.8; https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）を用いて解析し、TrimGalore（v0.6.2）を用いてアダプター配列を除去、処理し、デフォルトパラメータを用いてすべてのリードの検証を行いました。解析は Avadis ソフトウェアパッケージ (v3.1.1; Strand Life Sciences, Bengaluru, India) を用いて行いました。R. palustris CGA009 のゲノムにアラインメントし、R version 3.6 の DESeq2 パッケージ (47) を用いて、デフォルトのパラメータで差次的発現遺伝子を同定した。
トランスポゾン変異導入とメトロニダゾールの濃縮
大腸菌BW20767（48）およびR. palustris ΔfixCの培養物をログ相中期まで培養し、最小限の培地で2回洗浄した後、同等の濃度で混合し、10 mMコハク酸、0.2％酵母エキス、および0.5％カザミノ酸を補充した最小限の培地寒天上にプレーティングした。プレートは30℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、すべての可視バイオマスをプレートから20mM酢酸とカナマイシンを添加した液体最小培地に6時間移した。その後、Tn5変異体プールをペレット化し、20mM酢酸とカナマイシンを添加した窒素固定培地に一晩移した。メトロニダゾールを添加し、培養物を30℃で8時間インキュベートした。培養物を最小限の培地で2回洗浄し、炭素源として10mMコハク酸とカナマイシンを含む最小限の培地寒天培地にプレーティングした。およそ200個の個々のクローンを単離し、窒素固定条件下で生育する能力についてスクリーニングを行った。
Inverse PCR。
トランスポゾン変異体を20mM酢酸を含む液体最小培地で定常期まで増殖させ、Yeast/BactゲノムDNA精製キット（Qiagen）を用いてゲノムDNAを精製した。1μgのゲノムDNAを制限酵素AatIIで37℃で一晩消化し、平均1,500bpであるゲノムDNAの断片を生成した（New England Biolabs）。次に、消化産物を、37℃で1時間、Antarctic phosphataseで処理した(New England Biolabs)。PCR産物をZymogen Clean and Concentrator PCR-cleanup kit（Zymo Research, Irvine, CA）を用いて精製し、回収したDNA断片をT4 DNA ligase（New England Biolabs）を用いて結紮し、閉じた円形DNAを形成させた。円形DNA断片のライブラリーを、トランスポーザブルエレメントに特異的なフォワードおよびリバースプライマーを用いたPCRテンプレートとして用い、Phusion High-Fidelity DNA polymerase（New England Biolabs）を用いて増幅させた。PCR産物は1%アガロースゲルでの電気泳動により分離し、Zymoclean Gel DNA recovery kit (Zymo Research, Irvine, CA)を用いて精製した。精製したDNA断片は、（表S2参照）のプライマーを用いて、サンガー配列決定（GENEWIZ）を用いて配列決定した。
水素の測定
H2は、熱伝導度検出器と60/80分子ふるい5Åカラム（6フィート×1/8インチ；Supelco）を備えたShimadzu GC-2014ガスクロマトグラムを用いて定量化された。H2標準試料は3連で測定した。生育中の培養物から採取したヘッドスペースのサンプルは、生物学的三重測定と技術的二重測定で測定された。また、培養に使用した培地と同じ培地を入れた植菌していないチューブのヘッドスペースからサンプルを採取した。植菌していないチューブのヘッドスペースに含まれるH2の量は、培養中のH2の量から差し引いた。培養では、ヘッドスペースは660 nmで0.4から0.55の光学密度でサンプリングされた。培養液は、サンプリング前に短時間ボルテックスした。各サンプルのH2生成量は、サンプリング時の培養物の光学密度（660 nm）に対して正規化した。
タンパク質の配列解析。
特定のタンパク質-タンパク質アラインメントは、デフォルトパラメータを使用してConstraint Based Alignment Tool (COBALT; NCBI)を使用して生成した。タンパク質ドメインは、InterPro v.86.0 を用いて、デフォルトのパラメータで同定した(26)。KorABのホモログは、R. palustris BisB5 KorAをベイト配列としてJGI/IMG-Mで同定した。KorAのホモログ候補は、KorAと80%以上のアミノ酸同一性を持ち、嫌気性安息香酸または4-ヒドロキシ安息香酸分解に関与する遺伝子に隣接していた。AadNをベイト配列として、選択されたR. palustris株におけるホモログを同定した。AadNのホモログは90%以上のアミノ酸同一性を持ち、嫌気性安息香酸または4-ヒドロキシ安息香酸分解遺伝子に隣接していた。
統計解析。
各生育実験における異なる菌株の倍加時間は、分散分析（ANOVA; PANOVA < 0.001）を用いて比較した。また，Welchのt検定により，個々の株の平均倍加時間を比較した。同様に、正規化されたH2蓄積量は、ANOVAを用い、その後Welchのt検定で比較した。すべての統計解析は、Rバージョン4.1.1で行った。
データの入手方法
R. palustris ΔfixC*のゲノム配列データは、NCBI Sequence Read ArchiveのBioProject PRJNA858464に寄託されている。RNA-seq readsはNCBI Gene Expression OmnibusのBioProject PRJNA858255に寄託されている。KorAとAadNの配列は、それぞれアクセッション番号WP_011501953.1とWP_011156245を使用して見つけることができます。
謝辞
Jack ReddanとNicholas Haasの菌株構築への協力に感謝する。
本研究は、米国エネルギー省科学局、基礎エネルギー科学、物理生物科学プログラムによるDE-SC0020252をK.R.F.に授与することで支援された。
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